avaliação da função da fibrilina-1 na trombogênese...

i

CATHERINE NATÁLIA PEREIRA

Avaliação da Função da Fibrilina-1 na

Trombogênese Arterial.

Análise Proteômica.

Campinas

2015

vii

RESUMO

Fibrilina-1 (FBN-1) é um importante componente da rede de microfibrilas da matriz

extracelular (MEC). As microfibrilas estão presentes nas fibras elásticas que são

responsáveis pela resiliência de tecidos como pulmões, pele e grandes vasos. Mutações no

gene da fibrilina-1 estão associadas à Síndrome de Marfan, doença autossômica dominante,

caracterizada por uma desordem do tecido conjuntivo. Pacientes com esta Síndrome

apresentam anomalias no sistema esquelético e trato cardiovascular.

Dados da literatura relacionam a menor quantidade de FBN-1 na MEC com a

atividade exacerbada do TGF-β promovendo a quase totalidade das alterações fenotípicas

encontradas. Estudos preliminares em nosso laboratório com camundongos que possuem

menor quantidade de FBN-1 de um camundongo normal tem demonstrado que necessitam

do dobro do tempo para a formação de trombo em um modelo de trombose arterial. As

plaquetas tem fundamental importância neste processo, quando são ativadas secretam

várias moléculas que determinam a formação dos trombos. Realizamos um estudo

comparativo do proteoma de plaquetas e da artéria aorta de camundongos selvagens e

deficientes em FBN-1, através da técnica de eletroforese bidimensional (2DE) juntamente

com a espectrometria de massas a fim de encontrar diferenças no perfil proteico que

justificassem tais sintomas.

Diversas proteínas plaquetárias foram encontradas apenas no grupo controle, como

endoplasmina, fator de von Willebrand, calpaína, dentre outras; assim como a proteína

vinculina foi encontrada apenas no grupo deficiente em FBN-1. Todas as proteínas

encontradas podem ser de grande interesse para o esclarecimento a respeito do maior tempo

de formação de trombo e os sintomas relacionados à Síndrome de Marfan.

ix

ABSTRACT

Fibrillin-1 (FBN-1) is an important microfibril network component of extracellular

matrix (ECM). Microfibrils are present in elastic fibers responsible for tissues resiliency,

such as lungs, skin and great vessels. Mutations in fibrillin-1 gene are associated with

Marfan Syndrome, a dominant autosomal disease characterized by connective tissue

disorder. Patients with this syndrome show abnormalities in skeletal system and

cardiovascular tract, aorta dilatation and aneurysms.

Literature data relate less FBN-1 in the ECM with TGF-β heightened activity,

promoting almost all the phenotypic alterations. Preliminary studies in our laboratory

demonstrated that mice containing half amount of FBN-1 presented prolonged thrombosis

time when compared to wild-type mice submitted to an arterial thrombosis model. Platelets

are important in this process, when activated they release several molecules and factors

which determine thrombi formation. We conducted a comparative proteome study of

platelet and aorta from wild-type against FBN-1 deficient mice by two-dimensional

electrophoresis (2DE) coupled with mass spectrometry in order to find some differences in

protein profile that could justify such symptoms.

Several platelet proteins were found only into control group, as endoplasmin, von

Willebrand factor, calpain; as well as vinculin was found only in the FBN-1 deficient

group. All proteins found may have great interest for understanding the prolonged

thrombus formation time, and symptoms related to Marfan Syndrome.

xi

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ………………………………………………………….……..

1.1 Matriz extracelular e Fibras elásticas .........................................................

1.2 Rede de microfibrilas e Fibrilina-1 .............................................................

1.3 Síndrome de Marfan ………………………………………………...........

1.4 Modelo Fotoquímico de Indução de Trombo..............................................

1.5 Plaquetas.......................................................................................................

1.6 Proteômica ………………………………………………………………....

1.7 Eletroforese de duas dimensões em gel de poliacrilamida...........................

1.8 Identificação de Proteínas por Espectrometria de Massas............................

1.8.1 Q-ToF (Quadrupolo – Tempo de voo)..............................................

1.9 Limitações e vantagens da 2DE-MS................................................................

2. OBJETIVOS..........................................................................................................

2.1 Objetivo Geral ............................................................................................

2.2 Objetivos Específicos..................................................................................

3. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................

3.1 Preparação das Amostras.............................................................................

3.1.1 Animais...........................................................................................

3.1.2 Tratamento com Losartan................................................................

3.1.3 Coleta de sangue de Camundongos................................................

3.1.4 Lavagem de Plaquetas......................................................................

3.1.5 Extrato Proteico de Artéria Aorta...................................................

3.1.6 Coleta de Sangue de Pacientes com Síndrome de Marfan..............

3.1.7 Dosagem de proteínas – Método de Bradford................................

3.2 Eletroforese de duas dimensões em gel de poliacrilamida...........................

3.2.1 Isoeletrofocalização - Primeira dimensão…………………….......

3.2.2 SDS-PAGE - Segunda dimensão………...........................……….

3.3 Análise de Imagem 2D................................................................................

3.4 Identificação de Proteínas por Espectrometria de Massas..........................

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO..........................................................................

4.1 Padronização da Técnica 2DE.....................................................................

4.2 Análise Proteômica de Plaquetas - Intra Grupos..........................................

4.2.1 Grupo Controle – Camundongos Selvagens………………..…......

4.2.2 Grupo Controle tratado com Losartan 15 mg...................................

4.2.3 Grupo Controle tratado com Losartan 30 mg...................................

4.2.4 Grupo Deficiente em Fibrilina-1.......................................................

4.2.5 Grupo Deficiente em Fibrilina-1 tratado com Losartan 15 mg........

4.2.6 Grupo Deficiente em Fibrilina-1 tratado com Losartan 30 mg........

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xii

4.3 Análise Proteômica Comparativa de Plaquetas - Inter Grupos.......................

4.3.1 Grupo controle x Controle tratado com Losartan 15 mg...................

4.3.2 Grupo controle x Controle tratado com Losartan 30 mg...................

4.3.3 Grupo deficiente em FBN-1 x deficiente em FBN-1 tratado com

Losartan 15 mg.................................................................................51

4.3.4 Grupo deficiente em FBN-1 x deficiente em FBN-1 tratado com

Losartan 30 mg.................................................................................

4.3.5 Controle x Deficiente em FBN-1....................................................

4.3.6 Controle x Deficiente em FBN-1 tratado com Losartan 15 mg......

4.3.7 Controle x Deficiente em FBN-1 tratado com Losartan 30 mg......

4.3.8 Spots Selecionados - Controle x Deficiente em FBN-1.................

4.4 Análise Proteômica de Aorta………………………………………....…..…...

4.4.1 Grupo Controle................................................................................

4.4.2 Grupo Deficiente em Fibrilina-1......................................................

4.5 Análise Proteômica Comparativa de Aorta....................................................

4.5.1 Grupo Controle x Grupo Deficiente em fibrilina-1.........................

4.5.2 Spots Selecionados..........................................................................

4.6 Análise Proteômica de Plaquetas Humanas...................................................

5. CONCLUSÃO.......................................................................................................

6. PERSPECTIVAS.................................................................................................

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..............................................................

8. ANEXO..................................................................................................................

52 53

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56

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78

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xiii

“É exatamente disso que a vida é feita: De momentos!

Momentos pelos quais temos que passar,

sendo bons ou não, para o nosso próprio aprendizado, por algum motivo.

Nunca se esquecendo do mais importante: Nada na vida é por acaso”

Chico Xavier

xv

Aos meus pais, Teresinha e Milton Wonei,

e irmãos, Milton e José Henrique,

pelo amor e apoio em todas as horas.

xvii

AGRADECIMENTOS

Aos meus pais, Teresinha e Milton Wonei, pelo amor, carinho, incentivo, apoio

emocional e financeiro, pois sem vocês não seria quem eu sou hoje nem chegaria onde

cheguei. Ao meu irmão mais velho, Milton César, pelo exemplo, incentivo e por ser minha

fonte inspiradora dês do vestibular até hoje. Ao meu irmão mais novo, José Henrique, pelo

carinho, pelos bons momentos de descontração e exemplo de pessoa, líder e humano.

Ao Prof. Claudio, por ser mais que um professor, um verdadeiro “pai científico”, pela

confiança, por todo conhecimento, pelo exemplo de profissionalismo, paciência e toda

ajuda dês da minha iniciação científica, e apoio emocional nas horas difíceis.

Ao Prof. Camillo, por ter abraçado meu projeto com toda dedicação como se fosse

dele também, pela atenção, colaboração, por todas as dicas em proteômica, pela

prestatividade e dicas de “papers”.

Ao Prof. Daniel Martins, por toda ajuda, auxílio e dicas sobre a técnica de

proteômica. Mesmo com um oceano de distância, tudo via e-mail durante minha iniciação

científica, sem nem nos conhecermos. E ainda até hoje, ao longo do mestrado, por toda

ajuda e correções da dissertação, com toda humildade e disposição.

À Dra. Mariane Flores, pela paciência e por ter me ensinado toda parte prática da

técnica de proteômica, por ter colocado “mãos à obra” em pleno domingo.

À Denise Machado, por me ensinar os primeiros passos num laboratório de pesquisa,

quando entrei na IC sem saber absolutamente nada.

Ao técnico do nosso laboratório, Neto, por estar sempre disposto a nos ajudar, por

correr atrás dos materiais e reagentes com toda disposição, mesmo que em cima da hora e

pelo “papo cabeça” na hora do café.

xviii

Aos colegas de lab, Guilherme, Tallita, Danielle, Camila, Bruna, Gabriela; e as que já

saíram do lab, Talitinha e Izabela, pela ajuda experimental e por tornar os dias de trabalho

mais leves e descontraídos.

À Profa. Cristina, por ser tão atenciosa e disposta a nos ajudar.

À Andreia, da secretaria de pós-graduação, pela paciência e ajuda com os

documentos e serviços burocráticos.

À CnpQ e FAPESP pelo auxílio financeiro.

Ao programa de pós graduação de Biologia Funcional e Molecular do Instituto de

Biologia da UNICAMP.

A toda minha família e amigos que de alguma forma fizeram parte dessa jornada.

xix

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1.1 Eletromicrografia de tecido rico em fibra elástica (aorta) em desenvolvimento.

A – Visão geral do tecido rico em fibra elástica. B e C – Presença de uma região mais

eletrondensa, a elastina, e a rede de microfibrila. B – Corte longitudinal e C – Corte

transversal (Davis, 1994)........................................................................................................2

Figura 1.2 Estrutura molecular da Fibrilina-1 e LTBPs.........................................................4

Figura 1.3 Perfil de formação de trombos em Camundongos MAGP-/- (em cima) e

camundongos selvagens (em baixo) (Werneck et al., 2008)...................................................8

Figura 1.4 Comparação do tempo de oclusão trombótica após a indução fotoquímica de

trombo na artéria carótida direita de camundongos selvagens e de mg∆/+

, ambos os grupos

foram tratados com losartan e captopril. WT + PLA: selvagem + placebo; WT + LST:

selvagem + losartan 30mg; WT + CAPT: selvagem + captopril 30mg; mg∆/+

+ PLA:

deficiente em fibrilina-1 + placebo; mg∆/+

+ LST: deficiente em fibrilina-1 + losartan 30mg

e mg∆/+

+ CAPT: deficiente em fibrilina-1+ captopril 30mg.................................................9

Figura 1.5 Microscopia eletrônica de varredura de plaquetas discoides não ativadas (A) e

ativadas com ADP (B). Observe as extensões filopodiais finas e a forma irregular das

plaquetas ativadas, x 5000 (Zucker & Nachmias, 1985)......................................................10

Figura 1.6 Perfil bidimensional de um gel da 2DE. Plano cartesiano onde os pontos

representam os spots, que são teoricamente proteínas purificadas da célula ou tecido em

questão...................................................................................................................................15

Figura 1.7 Espectro de massas dos peptídeos trípticos. Cada um dos picos numerados

representa uma proteína. Modificado do original (Cheng & Wei, 2014).............................18

Figura 3.1 Fluxograma do tratamento de camundongos C57BL/6 e Fbn-1 mgΔ/+ com 4

semanas de idade, com Losartan nas concentrações 15 e 30 mg/Kg/dia, por 4

semanas.................................................................................................................................27

Figura 3.2 Esquema experimental de obtenção de Plaquetas. O sangue foi centrifugado a

2300 xg, 10 segundos/mL, obtém-se o PRP. PRP foi centrifugado a 2200 xg por 4 min,

obtendo-se o PPP. Pellet de plaquetas foi congelado a -80ºC……………………..……….28

Figura 3.3 Artéria aorta de camundongos para extração de proteínas e análise do

proteoma................................................................................................................................29

Figura 3.4 Equipamentos utilizados para a primeira dimensão da eletroforese. IGphor (GE-

Healthcare Life Science), à esquerda. Strip holder 18 cm, à direita.....................................31

xx

Figura 3.5 Cuba de eletroforese de duas dimensões, Amersham Biosciences. Corrida da

segunda etapa, segunda dimensão do gel..............................................................................32

Figura 4.1 2D-PAGE do conteúdo plaquetário de camundongos selvagens não tratados.

Coloração por impregnação por Nitrato de Prata. A1 e A2 representam duplicatas da

mesma amostra proteica, assim como B1 e B2, C1 e C2. Padrão de peso molecular à

esquerda, pI no topo..............................................................................................................37

Figura 4.2 Gel de poliacrilamida bidimensional do conteúdo proteico das plaquetas de

camundongos selvagens não tratados. A e B representam duplicatas da mesma amostra.

Coloração por Coomassie Blue-G. Padrão de peso molecular à esquerda, pI no topo da

figura.....................................................................................................................................38

Figura 4.3 Gel de poliacrilamida bidimensional. Gel controle 1, proteínas de plaquetas de

camundongos selvagens não tratados com Losartan.............................................................40

Figura 4.4 Gel de poliacrilamida bidimensional. Gel referência do grupo controle tratado

(Controle 15/1). Proteínas de plaquetas de camundongos selvagens tratados com Losartan

15mg/Kg/dia..........................................................................................................................41

Figura 4.5 Gel de poliacrilamida bidimensional, referência do grupo controle tratado


30 mg/Kg/dia.........................................................................................................................43

Figura 4.6 Gel de poliacrilamida bidimensional. Referência do perfil proteico das

plaquetas de camundongos deficiente em fibrilina-1 não tratados com Losartan (mgΔ/+

1)...........................................................................................................................................44


plaquetas de camundongos deficiente em fibrilina-1 tratados com Losartan 15 mg (mgΔ/+

15/1)......................................................................................................................................46

Figura 4.8 Gel de poliacrilamida bidimensional. Padrão do perfil proteico das plaquetas de

camundongos deficiente em fibrilina-1 tratados com Losartan 30 mg (mgΔ/+

30/1)......................................................................................................................................47

Figura 4.9 Resumo experimental para comparações proteômicas entre os diversos grupos.

O gel referência de cada grupo foi selecionado para comparações entre os demais géis

referências dos outros grupos. ..............................................................................................49

Figura 4.10 Análise proteômica comparativa entre Controle 1, à esquerda, e o grupo

controle tratado com Losartan 15 mg (Controle 15/1), à direita, pelo Melanie. Pontos verdes

representam spots semelhantes encontrados nos dois geis. Pontos vermelhos representam

spots presentes em apenas um dos géis.................................................................................50

xxi




spots presentes em apenas um dos géis.................................................................................51

Figura 4.12 Análise proteômica comparativa entre o grupo deficiente em fibrilina-1

(mgΔ/+), à esquerda, e o grupo deficiente em fibrilina-1 tratado com Losartan 15 mg

(mgΔ/+ 15/1), à direita, pelo Melanie. Pontos verdes representam spots semelhantes

encontrados nos dois geis. Pontos vermelhos representam spots presentes em apenas um

dos géis..................................................................................................................................52





dos géis..................................................................................................................................53

Figura 4.14 Análise proteômica comparativa entre o grupo controle (Controle 1), à

esquerda, e o grupo deficiente em fibrilina-1 não tratado com Losartan (mgΔ/+), à direita,

pelo Melanie. Pontos verdes representam spots semelhantes encontrados nos dois geis.

Pontos vermelhos representam spots presentes em apenas um dos géis...............................54


esquerda, e o grupo deficiente em fibrilina-1 tratado com Losartan 15 mg (mgΔ/+ 15/1), à

direita, pelo Melanie. Pontos verdes representam spots semelhantes encontrados nos dois

geis. Pontos vermelhos representam spots presentes em apenas um dos géis......................55




geis. Pontos vermelhos representam spots presentes em apenas um dos géis......................56

Figura 4.17 Gel do grupo controle. Setas em preto indicam os spots significantemente

diferentes e selecionados para a espectrometria de massas. ..............................................57

Figura 4.18 Gel do grupo deficiente em fibrilina-1 não tratado com Losartan (mgΔ/+).

Setas em preto indicam os spots significantemente diferentes e selecionados para a

espectrometria de massas......................................................................................................58

Figura 4.19 Spot 1: Endoplasmina e spot 2: Fator de von Willebrand, expressos no grupo

controle (esquerda) e em menor quantidade no grupo deficiente em FBN-1 (direita).........59

Figura 4.20 Sequência de acontecimentos na ativação plaquetária. (A) A adesão

plaquetária na superfície íntima vascular lesionada é mediada pela fixação do fator de von

Willebrand em seu receptor da membrana plaquetária GpIb. (B) As plaquetas se fixam

também na parede do vaso danificado mediante a ligação dos receptores de colágeno

xxii

(COL) ao colágeno subendotelial. Outros estimulantes plaquetários como trombina e

adrenalina se fixam aos seus recptores específicos. (C) Em resposta a esses diferentes

estímulos, plaquetas aderidas se ativam e liberam tromboxano A2 (TXA2) e adenosina

difosfato (ADP), que se fixam aos seus receptores plaquetários respectivos e amplificam o

processo de ativação. (D) A agregação plaquetária é mediada pela ligação de fibrinogênio

(FIB) ao seu receptor nas plaquetas circulantes, que dão lugar a formação de pontes de

fibrinogênio. O receptor FIB se forma mediante o acoplamento de GpIIb/IIIa na membrana

das plaquetas ativadas (Braunwald, 2006)............................................................................62

Figura 4.21 Spot 3: Fator de coagulação X, presente sob transformações pós traducionais

(círculo à esquerda), expressos no grupo controle (esquerda) e em menor quantidade no

grupo deficiente em FBN-1 (direita).....................................................................................64

Figura 4.22 Spot 6: Calpaína subunidade I, expressa no grupo controle (esquerda) e em

menor quantidade no grupo deficiente em FBN-1 (direita). Dados não disponíveis sobre o

spot 7 e sobre o spot sem numeração (à direita, no grupo FBN-1).......................................66

Figura 4.23 Spot 8: Adenilil Ciclase, expressa no grupo controle (esquerda).....................67

Figura 4.24 Spot 9: α-sinucleina 1; spot 10: Proteassoma β6; spot 11: Peroxiredoxina 2;

spot 12: dados não disponíveis. Todos expressos no grupo controle (esquerda)………......68

Figura 4.25 Spot 13: Vinculina, mais expressa no grupo deficiente em FBN-1 (direita),

menos expressa no grupo controle (esquerda)......................................................................71

Figura 4.26 Imagem 3D da proteína Vinculina, muito mais expressa no grupo deficiente

em FBN-1 (direita), em comparação com o grupo controle (esquerda). Imagem obtida pelo

programa Melanie…………………………………………………………………….........72

Figura 4.27 Desenho esquemático do complexo Vinculina-actina-citoesqueleto, associado

com Integrinas. Modificado do original (Mierke, 2009).......................................................73

Figura 4.28 Gel referência do proteoma da artéria aorta de camundongos selvagens, grupo

controle (Controle 1).............................................................................................................76

Figura 4.29 Gel referência do proteoma da artéria aorta camundongos deficientes em

fibrilina-1 (mgΔ/+ 1).............................................................................................................77

Figura 4.30 Análise proteômica comparativa de aorta. Gel do grupo controle, à esquerda,

como o gel do grupo deficiente em FBN-1, à direita. Pontos verdes representam spots

semelhantes encontrados nos dois geis. Pontos vermelhos representam spots presentes em

apenas um dos géis................................................................................................................79

Figura 4.31 Análise proteômica comparativa do extrato proteico de aorta do grupo

controle. Setas numeradas indicam os spots significantemente diferentes e selecionados

para a espectrometria de massas...........................................................................................80

xxiii


deficiente em fibrilina-1. Setas numeradas indicam os spots significantemente diferentes e

selecionados para a espectrometria de massas......................................................................81

Figura 4.33 Spot 7: Albumina Sérica. Spot 8: Proteína do choque térmico (do inglês Heat

shock cognate 71 kDa protein). Grupo controle à esquerda, grupo deficiente em FBN-1 à

direita.....................................................................................................................................83

Figura 4.34 Spot 9: Annexin A1. Spot 16: Triose-fosfato isomerase. Grupo controle à

esquerda, grupo deficiente em FBN-1 à direita....................................................................84

Figura 4.35 Spot 17: Miosina cadeia leve 4. Spot 18: Translationally-controlled tumor

protein. Spot 19: Miosina regulatória cadeia leve 2. Grupo controle à esquerda, grupo

deficiente em FBN-1 à direita...............................................................................................85

Figura 4.36 Gel de poliacrilamida bidimensional do proteoma de plaquetas humanas,

voluntários sem a Síndrome de Marfan................................................................................88


pacientes com a Síndrome de Marfan...................................................................................89

Figura 4.38 Prévia da análise proteômica comparativa de plaquetas humanas. Voluntários

sem a Síndrome de Marfan à esquerda, pacientes com a Síndrome à direita.......................90

xxv

LISTA DE TABELAS

Tabela 4.1 Comparação dos géis do grupo controle, “n=5”. Num matches é o número de

spots encontrados aos pares. A semelhança dos géis está representada pela % matches.

Dados obtidos pelo programa Melanie.................................................................................40

Tabela 4.2 Comparação dos géis do grupo controle tratado com Losartan 15 mg, “n=4”.

Num matches é o número de spots encontrados nos dois géis comparados. A semelhança

dos géis comparados está representada pela % matches. Dados obtidos pelo Melanie........42



dos géis comparados está representada pela % matches. Dados obtidos pelo Melanie........43

Tabela 4.4 Comparação dos géis do grupo deficiente em fibrilina-1, “n=3”. Num matches é

o número de spots encontrados nos dois géis comparados. A semelhança dos géis

comparados está representada pela % matches. Dados obtidos pelo

Melanie..................................................................................................................................45

Tabela 4.5 Comparação dos géis do grupo deficiente em fibrilina-1 tratado com Losartan

15 mg, “n=4”. Num matches é o número de spots encontrados nos dois géis comparados. A

semelhança dos géis comparados está representada pela % matches. Dados obtidos pelo

Melanie..................................................................................................................................46


30 mg, “n=4”. Num matches é o número de spots encontrados aos pares nos dois géis

comparados. A semelhança dos géis comparados está representada pela % matches. Dados

obtidos pelo Melanie.............................................................................................................48

Tabela 4.7 Resumo dos dados das comparações inter grupos. Num matches representa o

número de spots pareados. A semelhança entre cada gel é representada por %

matches..................................................................................................................................56

Tabela 4.8 Proteínas encontradas nas análises proteômicas de plaquetas. Dados obtidos por

espectrometria de Massas......................................................................................................59

Tabela 4.9 Dados obtidos pelo programa Melanie sobre a Endoplasmina, spot 1, em

relação a área e volume, comparando-se os grupos controle e deficiente em FBN-

1.............................................................................................................................................60

Tabela 4.10 Dados obtidos pelo Melanie sobre o Fator de Von Willebrand, spot 2, em

relação a área e volume, comparando-se os grupos controle e deficiente em FBN-

1.............................................................................................................................................61

xxvi

Tabela 4.11 Dados obtidos pelo programa Melanie sobre a proteína Vinculina, spot 13, em

relação a área e volume, comparando-se os grupos controle e deficiente em FBN-1.…......72

Tabela 4.12. Comparação dos géis do extrato proteico de aorta do grupo controle, “n=4”.

Num matches é o número de spots encontrados nos dois géis comparados. % matches é a

semelhança dos géis. Dados obtidos pelo Melanie...............................................................76

Tabela 4.13 Comparação dos géis do extrato proteico de aorta do deficiente em fibrilina-1,

“n=4”. Num matches é o número de spots encontrados nos dois géis comparados. A


Melanie..................................................................................................................................78

Tabela 4.14 Proteínas encontradas nas análises proteômicas de aorta. Dados obtidos por

espectrometria de massas.………………………………………………………………….82

1

1. Introdução

1.1 Matriz extracelular e Fibras elásticas

A matriz extracelular é um biopolímero complexo, exclusiva dos animais, que une as

células, confere resistência e flexibilidade aos tecidos e permite a comunicação intercelular,

desempenhando papéis na organogênese e na hemostase (Hubmacher & Apte, 2013). É

constituída por colágenos, fibras elásticas, proteoglicanas e glicoproteínas (Craft et al.,

2010).

As fibras elásticas são importantes componentes da matriz extracelular de estruturas

ou órgãos que estão submetidos ao constante estresse mecânico, tais como pulmão, pele e

grandes vasos. Através da análise ultra-estrutural, é possível identificar dois componentes

bem distintos: uma rede de microfibrilas com diâmetro de aproximadamente 12 nm

entremeada por uma substância mais elétron-densa e amorfa formada pela elastina (Figura

1.1) (Baldwin et al., 2013).

A fibra elástica madura se constitui a partir da deposição de tropoelastina, molécula

que tem como principal característica a presença de domínios hidrofóbicos alternados por

domínios de reações cruzadas (cross-link) ricos em lisina e tem massa molecular de

aproximadamente 70 kDa. Na matriz extracelular, a tropoelastina se auto agrega num

processo denominado coacervação, onde domínios hidrofóbicos de diferentes moléculas se

alinham, formando o agregado, que por sua vez são covalentemente ligados através da ação

de enzimas do tipo lisil oxidases sobre os resíduos de lisina dos domínios de reações

cruzadas, formando a elastina (Halper & Kjaer, 2014).

Há algum tempo, muitos pesquisadores tem demonstrado a importância de moléculas

da matriz extracelular não só como parte de um arcabouço estrutural, mas também na

2

determinação do destino das células circunvizinhas através da regulação da ação de fatores

de crescimento que influenciam os mais diferentes processos celulares, desde a

diferenciação até a proliferação (Halper, 2014).

Figura 1.1 Eletromicrografia de tecido rico em fibra elástica (aorta) em desenvolvimento.

A – Visão geral do tecido rico em fibra elástica. B e C – Presença de uma região mais

eletrondensa, a elastina, e a rede de microfibrila. B – Corte longitudinal e C – Corte

transversal (Davis, 1994).

1.2 Rede de microfibrilas e Fibrilina-1

As microfibrilas são constituídas por vários componentes dos quais se destacam as

fibrilinas, que são os componentes majoritários, e outras moléculas como as MAGPs

(“Microfibril-Associated GlycoProtein), fibulinas, entre outras (Lannoy et al., 2014).

As microfibrilas são filamentos que apresentam de 10 a 12 nm de diâmetro, que em

análises por microscopia eletrônica de extratos obtidos de tecidos ricos em microfibrilas é

possível identificar uma estrutura semelhante a um colar de “contas” com periodicidade de

3

aproximadamente 54 nm, enquanto que o comprimento do monômero de fibrilina é de

aproximadamente 160 nm (Lin et al., 2002).

As fibras elásticas e as microfibrilas são organizadas em tecidos específicos e estão

dispostas de acordo com as exigências mecânicas e a função do sistema de órgãos

individuais. Na pele, as microfibrilas estão dispostas desde a membrana basal da derme até

a derme reticular, a qual permanece paralelamente com as fibras elásticas e confere

elasticidade e resiliência à pele. Na aorta, as microfibrilas se associam com a elastina na

camada média para formar as lâminas concêntricas que separam a camada muscular lisa.

Nos olhos, as microfibrilas exercem função de ancoragem, fazendo a ligação entre o

cristalino e o corpo ciliar (Shinaoka et al., 2013) (Hanlon et al., 2015).

As fibrilinas são glicoproteínas de alto peso molecular, aproximadamente 340 kDa

(Ramirez & Sakai, 2011). Até o momento, foram caracterizadas três membros das

fibrilinas: 1, 2 e 3 (figura 1.2). Onde a principal diferença entre elas é estrutural. A fibrilina-

1 apresenta um domínio rico em prolina no éxon 10, enquanto que na fibrilina-2 este

domínio é rico em glicina e na fibrilina-3 alternam-se domínios ricos em prolina ou glicina.

Ambas as fibrilinas 1 e 2 apresentam em seu éxon 37 um sítio de ligação de integrina, RGD

(“arginina-glicina-ácido aspártico”), enquanto na fibrilina 2 há um sítio adicional no éxon

24 (Werneck et al., 2004).

Estas isoformas apresentam distribuições distintas, mas que algumas vezes coincidem

em determinados momentos nos tecidos durante o desenvolvimento e na fase adulta, sendo

que a isoforma mais encontrada em humanos adultos é a fibrilina-1, enquanto que a

fibrilina-2 aparece mais abundantemente nos estágios de desenvolvimento embrionário. A

fibrilina-1 apresenta 47 domínios EGF-like, sendo que 43 deles são do tipo que ligam

4

cálcio, que é importante por manter o correto enovelamento destes domínios e apresentam

também 7 domínios TB-like. Fibrilina-3 é o membro da família que foi menos estudado e

pouco se sabe sobre sua função (Handford, Downing, Reinhardt, & Sakai, 2000) (Kielty B.

C. A. Y. M. et al., 2005).

Figura 1.2 Estrutura molecular da Fibrilina-1 e LTBPs.

A molécula de fibrilina-1 apresenta alto grau de homologia com as LTBPs, proteínas

que pertencem a mesma família e que ligam TGF (LTBP – do inglês Latent TGF-β Binding

Protein) (Pereira et al., 1993). Citocinas da família do TGF-β são sintetizados e secretados

por quase todas as células para a matriz extracelular como um grande complexo latente,

formado por duas moléculas de TGF-β ligadas ao peptídeo que confere latência ao TGF-β

(LAP- Latency associated peptide) e a uma das isoformas de LTBP (LTBP 1, 3 e 4)

(Zilberberg et al., 2013). A similaridade estrutural entre LTBP e fibrilina-1 sugere que

FBN-1 poderia proporcionar um sítio de ligação para o complexo latente de TGF-β. Sendo

5

assim, FBN-1 participaria do controle da sinalização dessa citocina, estabilizando o

complexo latente, mantendo o TGF-β na sua forma inativa (Hayes et al., 2014).

1.3 Síndrome de Marfan

Indivíduos que apresentam mutações no gene da fibrilina-1 e consequentemente

menor quantidade desta molécula na matriz extracelular apresentam a Síndrome de Marfan,

doença hereditária autossômica dominante, caracterizada por uma desordem sistêmica do

tecido conjuntivo (Judge, D. P., 2006). Tem como principais manifestações clínicas as

dilatações, aneurismas e rompimentos na aorta proximal, representando assim as principais

causas de óbitos desses pacientes. Além de deslocamento do cristalino, comprometimentos

pulmonares e crescimento exacerbado dos ossos, dígitos e membros. Dados

epidemiológicos demonstram a incidência de 2 a 3 casos a cada 10.000 nascimentos e tem

um impacto significativo na diminuição da expectativa de vida destes pacientes (Kumar &

Agarwal, 2014).

Não há nenhum método de diagnóstico molecular rápido e eficiente, porém a

identificação precoce de pessoas portadoras desta doença é bastante importante. Nos

Estados Unidos, o número de óbitos resultantes desta doença foi reduzido com a cirurgia de

reconstrução do tronco aórtico, evitando assim a principal causa de morte, o que faz com

que os pacientes diagnosticados tenham expectativa de vida de uma pessoa normal (Judge

& Dietz, 2008) (Caruana, Sheppard, & Li, 2014).

A patogênese da Síndrome de Marfan foi inicialmente explicada pela menor

quantidade e maior fragmentação das fibras na pele e na aorta (Judge & Dietz, 2008).

6

Sakai e colaboradores (Sakai et al., 1986) foram os pioneiros em identificar a

fibrilina-1 como o principal componente das microfibrilas presente em todos os tecidos

acometidos nos pacientes com Síndrome de Marfan.

O gene da fibrilina-1 contem 65 éxons (235 kb) que codificam uma glicoproteina de

aproximadamente 340 kDa. A maioria das mutações identificadas em pacientes com a

Síndrome ocorre em um dos 47 domínios EGF-like, muitas delas alterando o espaçamento

entre os resíduos de cisteína presentes nestes domínios, que são importantes no correto

dobramento da cadeia ou alterando resíduos importantes na interação com cálcio

(Reinhardt, Ono, & Sakai, 1997). Estas perturbações levam ao aumento da degradação

proteolítica da molécula podendo culminar com a menor quantidade depositada na matriz

extracelular (Beene et al., 2013).

Atualmente, acredita-se que a haplo-insuficiência, ou seja, metade da produção da

molécula normal é crítica para a expressão clínica da doença (Judge & Biery, 2004). Há

evidências que as microfibrilas tem papel crítico na regulação de citocinas, que são

moléculas que afetam o desenvolvimento de tecidos, bem como a homeostase, regulando a

atividade celular, como proliferação, migração, capacidade de síntese e apoptose (F.

Ramirez & Rifkin, 2003).

Alterações na estrutura da fibrilina-1 ou na sua quantidade poderiam aumentar os

níveis de TGF-β ativos, influenciando nas alterações fenotípicas da Síndrome de Marfan.

Dados da literatura dão suporte à hipótese de que mutações no gene da fibrilina-1 levam a

atividade exacerbada de TGF-β. Esta atividade exacerbada, quando estabelecida em

camundongos por mutação no gene da fibrilina-1, leva ao aparecimento de determinados

sinais clínicos encontrados na Síndrome de Marfan, como os rompimentos e aneurismas

7

aórticos. O tratamento de camundongos modelos de síndrome de Marfan com antagonistas

do TGF β, como o anti hipertensivo Losartan, bloqueador dos receptores AT1 de

angiotensina II, leva a prevenção destes sintomas (Habashi et al., 2006) (Franken et al.,

2015).

1.4 Modelo Fotoquímico de Indução de Trombo

A trombose arterial é a causa mais comum de morte no mundo moderno, sendo

causada principalmente pela ruptura ou instabilidade de uma placa aterosclerótica que

forma um coágulo local, impedindo o fluxo sanguíneo e resultando em infarto do miocárdio

ou em acidente vascular cerebral. Eventos trombóticos são mais graves quando ocorrem nas

artérias coronária ou carótida, as quais são propensas a doenças ateroscleróticas. Vários

fatores podem contribuir para que ocorra a trombose arterial, são os chamados fatores de

risco como a diabete mellitus, o tabagismo, a hipertensão e a hiperlipidemia (Owens &

Mackman, 2010).

Werneck e colaboradores (Werneck et al., 2008) demonstraram a importância da

MAGP-1, componente estrutural das microfibrilas, no processo de formação de trombos em

um modelo fotoquímico de trombose arterial em camundongos.

Neste modelo, camundongos tem a formação de trombos disparada por uma lesão do

endotélio provocada por espécies reativas de oxigênio formadas in situ, resultantes da

excitação do corante Rosa de Bengala pela luz laser. O fluxo sanguíneo é medido desde a

injeção do corante na veia caudal lateral até o momento em que o trombo leva a oclusão do

vaso (tempo de oclusão). O tempo de oclusão nos camundongos deficientes em MAGP-1

foi de 99 min enquanto que os animais selvagens, este tempo foi de 57 min (figura 1.3).

8

Aparentemente, MAGP-1 participa no processo por interagir com moléculas que fazem

parte do trombo, como fibrinogênio e fator de von Willebrand (Werneck et al., 2008).

Figura 1.3 Perfil de formação de trombos em Camundongos MAGP-/- (em cima) e

camundongos selvagens (em baixo) (Werneck et al., 2008).

Estendo esse modelo de formação de trombos em camundongos deficientes em

FBN-1, nosso grupo demonstrou que o tempo de oclusão (formação de trombos) em

camundongos deficientes em fibrilina-1 (mgΔ/-) é mais que o dobro do que em

camundongo selvagem, 124 minutos e 58 minutos, respectivamente (figura 1.4). Já com o

tratamento de Losartan, nosso grupo também demonstrou que os animais deficientes em

FBN-1 restabelecem o tempo normal de formação do trombo, adquirido com a dose de 30

mg/Kg/dia de Losartan (dados ainda não publicados).

9

WT +

LST

WT +

CAPT

mg/+

+ L

ST

mg/+

+ C

APT

0

50

100

mg/++ PLA

WT+PLA

Tem

po /

min

Figura 1.4 Comparação do tempo de oclusão trombótica após a indução fotoquímica de

trombo na artéria carótida direita de camundongos selvagens e de mg∆/+

, ambos os grupos

foram tratados com losartan e captopril. WT + PLA: selvagem + placebo; WT + LST:

selvagem + losartan 30mg; WT + CAPT: selvagem + captopril 30mg; mg∆/+

+ PLA:

deficiente em fibrilina-1 + placebo; mg∆/+

+ LST: deficiente em fibrilina-1 + losartan 30mg

e mg∆/+

+ CAPT: deficiente em fibrilina-1+ captopril 30mg.

1.5 Plaquetas

As plaquetas são componentes cruciais para que ocorra a hemostase, sua principal

função é a formação de coágulos, ou trombos, por isso também são chamadas de

trombócitos. Classificadas como corpúsculos citoplasmáticos anucleados, são originadas a

partir da maturação de megacariócitos produzidos na medula óssea (Clemetson, 2012).

No organismo humano, 70% das plaquetas estão na circulação, enquanto 30% estão

no baço. A concentração normal pode variar de 150.000 e 400.000 u/µL de sangue.

Possuem uma forma discoide complexa e tem a propriedade de modificar sua morfologia

quando ativadas (figura 1.5). Sua estrutura é formada por uma membrana bilaminar que

contem várias invaginações com um sistema canalicular aberto e ligado intracelularmente a

um sistema tubular denso, formando uma rede de interconexão através da célula (complexo

A B C

10

membrânico) para facilitar a secreção dos grânulos de armazenamento, conhecidos como

grânulos-α, que contém fator IV plaquetário, PDGF (“platelet-derived growth factor”),

fibrinogênio, fibronectina, inibidor I do ativador de plasminogênio (PAI I), fatores V, VIII

e Fator de von Willebrand; e corpos densos, que contem histamina, epinefrina, serotonina,

ADP, cálcio (Smith & Murphy, 2014).

B

Figura 1.5 Microscopia eletrônica de varredura de plaquetas discoides não ativadas (A) e

ativadas com ADP (B). Observe as extensões filopodiais finas e a forma irregular das

plaquetas ativadas, x 5000 (Zucker & Nachmias, 1985).

Quando o sistema vascular é de alguma forma lesionado, as plaquetas interagem com

os componentes da matriz extracelular expostos na parede do vaso sanguíneo, modificam

sua estrutura e liberam seu conteúdo, assim os receptores de adesão das plaquetas se ligam

11

ao fator de von Willebrand (vFW) e ao colágeno, moléculas estas que regulam a adesão

plaquetária com o objetivo de formar um agregado de plaquetas que se ligará ao

fibrinogênio para formar o "plug" hemostático (Broos, De Meyer, Feys, Vanhoorelbeke, &

Deckmyn, 2012).

Possui um citoesqueleto composto de filamentos cruzados de actina, ligados a

superfície interna da dupla membrana lipídica. Uma de suas funções é regular a forma da

plaqueta em repouso/ativada e interagir com os receptores transmembrânicos, que são as

glicoproteínas receptoras: GP Ib-V-IX, receptor para FvW; GP IIb-IIIa, as mais abundantes

que reconhece as quatro moléculas de adesão, fibrinogênio, fibronectina, vitronectina, e

FvW; GP Ia, IIa e GP VI, receptores de colágeno. A ativação plaquetária através da cascata

de fosforilação proteica intracelular leva a sua contração e liberação do conteúdo das

organelas plaquetárias (Smith & Murphy, 2014).

As plaquetas estão envolvidas em inúmeras patologias importantes, como a

trombose arterial, e por isso esses fragmentos citoplasmáticos são vistos como possível alvo

terapêutico para o desenvolvimento de novos antitrombóticos (Patel, Hartwig, & Jr, 2005).

Dados da literatura sugerem que microfibrilas ricas em fibrilina são importantes

suportes físicos para a adesão e agregação de plaquetas demonstrando ter função

trombogênica em condições dinâmicas in vitro. Considerando a distribuição destas

microfibrilas na parede dos vasos, principalmente dos grandes vasos como a aorta, a FBN-1

pode ser importante, juntamente com outras moléculas da região sub-endotelial, na

modulação da resposta das plaquetas diante da lesão do vaso sanguíneo (Ross et al., 1998).

12

1.6 Proteômica

Os diversos projetos de sequenciamento genômico têm lançado novas percepções

sobre os mecanismos de funcionamento celular responsáveis pela regulação da fisiologia

dos organismos sequenciados através de uma descrição mais detalhada do genoma e

também da descoberta de novos genes.. A determinação dos níveis de mRNA codificados

por esses genes e das proteínas, em diferentes condições é de extrema importância, visto

que as informações genéticas ainda não são suficientes quando estudadas isoladamente

(Gregorich & Ge, 2014).

A fim de descrever todo o perfil proteico codificado por esses genes, os

pesquisadores cunharam o termo Proteoma, como sendo o complemento proteico do

genoma (Wasinger et al., 1995), o conjunto de proteínas e variantes de proteínas que podem

ser encontrados numa célula específica quando esta está sujeita a um certo estímulo. A

análise do proteoma é cada vez mais importante e informativa para a compreensão da

função da sequência genômica (O’Brien & Palsson, 2015). Sendo assim, a proteômica visa

o estudo das várias propriedades das proteínas como sua sequência, atividade e estrutura.

Permite determinar quais proteínas são condicionalmente expressas, seus níveis de

expressão, sua distribuição dentro de uma célula e a ocorrência de modificações pós

traducionais. Com isso, a proteômica assume um papel cada vez maior nas pesquisas sobre

os mecanismos de regulação celular e suas interações em sistemas biológicos (Richards &

Coon, 2015).

As informações geradas pela proteômica são complementares aos dados de genoma e

transcriptoma por focar no produto final do genoma, que é a proteína. Ainda tem-se

observado que em muitos casos não existe uma correlação direta entre a expressão do

13

mRNA e o nível proteico, sendo necessária sua avaliação experimental (O’Brien & Palsson,

2015).

As diferentes aplicações da proteômica tornaram-se possíveis através da integração e

do avanço de diferentes técnicas de química analítica e da bioinformática, que permitiu

gerenciar, analisar e integrar os diversos dados.

A combinação da eletroforese em duas dimensões em gel de poliacrilamida (2D-

PAGE) - também conhecida como eletrofores bidimensional (2DE) – com a identificação

de proteínas por espectrometria de massas (MS) foi a metodologia fundadora e carro-chefe

da proteômica por anos. A 2DE permite a separação de milhares de proteínas de uma

amostra em um único gel, enquanto que a MS e a identificação dos genes que as produzem

(Cole & Clench, 2015).

1.7 Eletroforese de duas dimensões em gel de poliacrilamida

A 2DE é uma técnica sensível para o processo de separação de misturas complexas de

proteínas, um dos métodos fundamentais da proteômica. Está baseada na separação através

do ponto isoelétrico das proteínas e sua massa molecular (Westermeier, 2014).

O primeiro passo, a primeira dimensão, é a separação das proteínas pelo seu ponto

isoelétrico (pI) através da focalização isoelétrica (IEF). Ao longo de uma tira de gel de

poliacrilamida contendo um gradiente de pH é aplicado um potencial elétrico, tornando

uma extremidade mais positiva e a outra mais negativa. Dessa forma, quando uma mistura

proteica é aplicada nesse gel, cada proteína irá migrar até alcançar a região de pH igual ao

seu pI. O pI pode então ser definido como o valor de pH específico no qual a proteína

14

permanece em uma posição estacionária, onde sua carga total é zero (Westermeier & Görg,

2011).

O segundo passo, é a solubilização das proteínas contidas no gel da primeira

dimensão em tampão contendo SDS e a sua separação por eletroforese do tipo SDS-PAGE,

baseada na massa molecular das proteínas, consistindo assim a segunda dimensão

(O’Farrell, 1975). Assim, separa-se as proteínas de peso molecular idêntico que diferem no

valor de seus pI, ou proteínas com valores de pI semelhantes mas que apresentam pesos

moleculares distintos (Reed & Densmore, 2013).

O resultado final dessas duas separações é um perfil de pontos ou spots, que podem

ser visualizados por técnicas de coloração pós-eletroforéticas, como prata amoniacal, prata

coloidal ou Coomassie Blue. Cada spot representa, teoricamente, uma proteína e cujo

volume é proporcional à sua quantidade. Esse perfil bidimensional (2D) segue um sistema

cartesiano no qual tem-se o pI no eixo X e massa molecular no eixo Y (figura 1.6). A alta

resolução da 2DE resulta do fato da primeira e segunda dimensões serem baseadas em

parâmetros independentes (pI e massa molecular das proteínas) (Reed & Densmore, 2013).

É possível analisar as imagens dos géis 2DE através de programas especializados,

capazes de digitalizar essas imagens. Tais programas permitem a detecção dos spots e sua

quantificação relativa, bem como estimativas sobre pI e massa molecular de cada spot,

indispensáveis para o armazenamento dos dados coletados e análises comparativas de géis

2D.

Esta técnica permite a separação de milhares de proteínas simultaneamente,

possibilitando a verificação de alterações dos níveis de expressão das proteínas envolvidas

com um determinado fenômeno biológico. Estas informações adicionam uma visão ampla a

15

respeito de mudanças e conjuntos de proteínas que podem estar atuando em um

determinado evento biológico. Através da 2DE é possível ainda visualizar algumas

modificações pós-traducionais através da mobilidade eletroforética alterada de alguns

conjuntos de proteínas (Dowsey et al., 2010).

Figura 1.6 Perfil bidimensional de um gel da 2DE. Plano cartesiano onde os pontos

representam os spots, que são teoricamente proteínas purificadas da célula ou tecido em

questão.

Apesar das conhecidas limitações que apresenta; tais como a exclusão de proteínas

muito pequenas (< 6000 Da), muito grandes (250000 Da), muito ácidas (pI < 3.5), muito

básicas (PI > 9) e muito hidrofóbicas (Gygi et al, 2010); a 2DE ainda figura como uma das

técnicas disponíveis e amplamente utilizadas em estudos relacionados à análise quantitativa

16

de misturas complexas de proteínas expressas entre duas ou mais amostras (Polunina et al.,

2014) (Anderson, 2014).

Porém, uma das mais severas limitações dos estudos de proteoma utilizando a

eletroforese bidimensional ainda é a dificuldade de detecção de proteínas de baixa

abundância, o que pode reduzir as chances de identificação de proteínas regulatórias,

geralmente pouco expressas, e que em muitos casos são consideradas como a parte mais

interessante do estudo de um proteoma (Santucci, Bruschi, Ghiggeri, & Candiano, 2014).

Ao longo dos anos, a 2DE foi sofrendo gradativos avanços a fim de contornar essas

limitações, dentre os quais a introdução dos géis com gradientes de pH imobilizados para a

IEF, em substituição aos sistemas de pH formados por anfólitos carreadores. Além disso,

outro grande obstáculo enfrentado, em especial nas separações de proteínas de membranas,

tem sido as dificuldades na solubilização dessas moléculas para as etapas da eletroforese

em função de sua natureza hidrofóbica, o que compromete a separação e a resolução final

da 2DE (Magdeldin et al., 2014). Porém, com o progresso na área proteômica, novos

reagentes têm sido introduzidos para o aperfeiçoamento na preparação das amostras, nas

solubilizações das proteínas de membrana, entre eles agentes caotrópicos, detergentes e

agentes redutores, além de novas estratégias para o processo de separação com o objetivo

de minimizar a perda de proteínas e a baixa resolução da segunda dimensão (Martins de

Souza et al., 2008).

Com os avanços das técnicas de imagem, introduziu-se a eletroforese em gel de

imagem diferencial bidimensional (2D-DIGE), desenvolvida para aumentar a sensibilidade

e reprodutibilidade da 2DE tradicional (May et al, 2012). Nessa técnica pode-se utilizar até

três amostras proteicas distintas, marcadas com fluoróforos antes que a corrida

17

eletroforética seja realizada simultaneamente num mesmo gel. Sendo assim, as variações

gel-a-gel devido às limitações da 2DE clássica são facilmente corrigidas, minimizando o

erro das corridas e otimizando o tempo de trabalho (Magdeldin et al., 2014). As proteínas

em cada amostra são covalentemente marcadas com diferentes corantes fluorescentes de

cianina (Cy) que não tem qualquer efeito sobre a migração relativa de proteínas durante a

eletroforese. As proteínas que são comuns entre as amostras aparecem como spots com uma

proporção fixa de sinais de fluorescência, enquanto que as proteínas que diferem entre as

amostras têm diferentes proporções de fluorescência (Minden, 2012).

Com um sistema de imagem apropriado, a 2D-DIGE é capaz de detectar com

segurança amostras que contenham o mínimo de 0,2 fmol de proteína (1 femtomole =

0,000001 nanomole) e diferenças proteicas de até aproximadamente 15%, ao longo de um

intervalo de concentração de mais ou menos 20.000 fold. A técnica combinada com análise

de imagem digital melhora a avaliação estatística da variação do proteoma, levando de 2 a 3

dias para ser concluída (Minden, 2012).

2D-DIGE permite a quantificação precisa de alterações no proteoma, incluindo

modificações pós-traducionais e expressão de isoformas de uma proteína. Apesar dos

recentes avanços em MS e as limitações ainda não solucionados de 2DE (proteínas

hidrofóbicas, de alto peso molecular e com pIs extremos), DIGE ainda é um dos métodos

mais abrangentes para estudar variações em proteínas intactas (Arentz et al, 2014).

1.8 Identificação das Proteínas por Espectrometria de Massas

Após a separação das proteínas pela 2DE e a detecção dos spots, é necessário realizar

uma análise mais detalhada de cada um destes spots, que consiste em identificar o gene

18

responsável por sua produção. Para isso, destaca-se a técnica de espectrometria de massas

(MS).

A análise dos spots detectados é realizada de forma que a proteína contida em cada

spot extraído do gel 2DE é submetida a um processo de digestão “in gel” com tripsina,

obtendo-se assim os seus peptídeos.

No espectrômetro de massas, os peptídeos são ionizados, separados segundo suas

razões massa/carga (m/z) e então detectados. Em diferentes tipos de espectrômetros de

massa os processos de ionização e separação ocorrem por diferentes princípios físicos.

Todos os instrumentos geram espectros de massa que são tipicamente representados como

um gráfico de duas dimensões contendo valores de m/z no eixo x e intensidade relativa dos

picos no eixo y, representando a abundância relativa das proteínas na amostra (figura 1.7)

(Walther & Mann, 2010).

Figura 1.7 Espectro de massas dos peptídeos trípticos. Cada um dos picos numerados

representa uma proteína. Modificado do original (Cheng & Wei, 2014).

19

Cada peptídeo é representado como um conjunto de isótopos, podendo ser observados

pelos espectros gerados em instrumentos de alta resolução, consequência do fato de que

1.1% dos carbonos naturalmente existentes são do tipo pesado, 13C. Como os peptídeos

contêm grandes quantidades de átomos de carbono, uma porção significativa dos peptídeos

irão conter 13C (e um valor de massa aumentado em 1 unidade de massa comparado ao íon

contendo apenas 12C), ou dois 13C (e um valor de massa aumentado em 2 unidades de

massa comparado ao íon contendo apenas 12C), e assim por diante. A escala do eixo x do

espectro é definida pelo usuário e tipicamente ajustado entre 500 e 3000 Da, a região de

massa mais utilizada para análise de peptídeos por MS (Walther & Mann, 2010)

Existem diversos tipos de espectrômetros de massas, como o SIMS (Espectrômetro

de Massa por Ionização Secundária), o TIMS (Espectrômetro de Massa de Ionização

Térmica), o LA-ICP-MS (espectrômetro de massa por ionização acoplada por plasma com

ablação a laser), e os mais utilizados em proteômica que são MALDI-ToF (“Matrix

Assisted Laser Desorption Ionization – Time of Flight”, Ionização e dessorção a laser

assistida por matriz - Tempo de voo), Q-Tof (“Quadrupole – Time of Flight”, Quadrupolo –

Tempo de voo), Orbitrap e Triplo-Quadrupolos. Listados abaixo estão os utilizados por este

trabalho.

1.8.1 Q-ToF (Quadrupolo – Tempo de voo)

A complexidade do genoma pode gerar proteínas que contenham peptídeos

semelhantes, dificultando sua identificação precisa por PMF, visto que essa “impressão

digital” pode ser encontrada em mais de uma proteína. Isso eventualmente acontece nas

análises do proteoma de mamíferos para algumas proteínas. Nestes casos, mais dados da

20

proteína são necessários para a sua identificação. Assim, equipamentos híbridos

(conhecidos como MS/MS), que contém mais de um analisador em série, tornaram-se

máquinas poderosas na resolução de dados das moléculas analisadas. Estes espectrômetros

permitem selecionar no espectro de massas peptídeos para que estes sejam fragmentados

numa câmara de colisão. Os fragmentos, dos mais diferentes tamanhos, desde o peptídeo

até um simples aminoácido têm as massas medidas e então a sequência de aminoácidos do

peptídeo é resolvida, gerando um dado muito mais robusto à identificação da proteína

(Gevaert & Vandekerckhove, 2000).

Um dos equipamentos utilizado em estudos de proteoma é o Q-ToF, onde os

espectros podem ser adquiridos em modo MS/MS. Na primeira análise ocorre a obtenção

do PMF e na segunda análise é medida a massa de fragmentos dos peptídeos selecionados,

gerando a sua sequência de aminoácidos. Diferentemente dos espectrômetros de massa do

tipo MALDI-ToF, no Q-ToF a ionização das moléculas de peptídeos ocorre por

eletronebulização (ESI – electrospray ionization). Na análise por ESI a amostra de

peptídeos é dissolvida em um solvente volátil. O ESI pode encontrar-se prontamente

acoplado a um sistema de separação por cromatografia líquida. A amostra então passa por

um estreito tubo capilar metálico, ao qual é aplicada uma voltagem, sendo gerado um

aerossol de analito e solvente. Com a evaporação do solvente originam-se íons, sob pressão

atmosférica. Os íons são subsequentemente submetidos a alto vácuo, acelerados através de

um campo elétrico para o analisador de massas do espectrômetro e separados de acordo

com sua razão m/z. Seu analisador chamado de quadrupolo/ToF encontra-se acoplado ao

sistema de ESI. Basicamente o Q-ToF é capaz de gerar espectros de fragmentos de íons

através de determinados íons precursores selecionados. Assim, íons que possuem certa

21

relação m/z são selecionados em um primeiro analisador de massas, fragmentados em uma

célula de colisão e as massas do fragmento de íon são “lidas” por um analisador do tipo

ToF. Dessa forma, os peptídeos são fragmentados e à medida que eles passam pelas

câmaras de colisão de íons, as sequências das proteínas são obtidas (Aebersold & Goodlett,

2001). O desenvolvimento de analisadores de massa em sequência (tandem) levou a um

grande aumento na resolução e sensibilidade do método, tornando-o uma ferramenta

obrigatória nas análises estruturais e químicas de peptídeos e proteínas. Os espectrômetros

de massas atuais permitem selecionar uma só molécula ionizada, fragmentá-la e através da

análise das massas dos fragmentos conhecer a estrutura da molécula original, permitindo

determinar, por exemplo, a sequência de aminoácidos de um peptídeo ou uma alteração

química específica em algum resíduo de aminoácido (Patterson & Aebersold, 2003).

1.9 Limitações e vantagens da 2DE-MS

As limitações da 2DE guiaram o desenvolvimento de metodologias comumente

conhecida como Shotgun Proteomics. Estudar um proteoma de interesse por Shotgun

consiste basicamente em analisar o proteoma por sistemas que integram cromatografia

líquida (LC) e MS em tandem (LC-MS/MS) (Martins-De-Souza, 2014). Atualmente a

metodologia de Shotgun tem diversas vertentes, sendo a mais amplamente usada chamada

bottom-up proteomics (Nogueira & Domont, 2014). Nesta, a quantificação de proteínas se

dá pela marcação com isótopos estáveis ou label-free, que são métodos mais precisos do

que a quantificação dos volumes dos spots de géis 2DE (Martins-de-Souza et al, 2010). Por

outro lado, entre as desvantagens de bottom-up proteomics está a falta de informação direta

em proteínas intactas, suprida pela 2DE. A detecção de proteínas hidrofóbicas e com baixa

22

concentração, dependendo do tipo de preparação da amostra e aquisição MS, também

podem ser limitantes (Martins-de-souza, 2014).

O princípio básico bottom-up shotgun proteomics consiste em digerir todo proteoma

de interesse e fraciona-lo num sistema de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC),

acoplado a um espectrômetro de massas (LC-MS). Os dados resultantes são analisados

através de algoritmos que reconstroem as sequências proteicas com base nas massas de

todos os peptídeos medidos e fragmentados. Esta técnica tem se desenvolvido nos últimos

10 anos, hoje em dia um experimento LC-MS é capaz de revelar de 3000 a 7000 proteínas

em uma hora, o que só seria possível com semanas de trabalho se utilizada a 2DE-MS

clássica (Martins-de-souza, 2014).

A taxa de produção de dados na proteômica, bem como a complexidade deste

conjunto de informações, tem aumentado gradativamente à medida que novas técnicas e

abordagens surgem e se desenvolvem. Ao mesmo tempo, a descoberta de diversas

modificações proteicas sob determinadas condições tem-se mostrado algo bastante

promissor para se elucidar patogenias, visando o desenvolvimento de novos diagnósticos e

tratamentos terapêuticos. Dessa forma a proteômica clínica surge com o objetivo de se

obter diagnósticos mais precoces e precisos, melhores estratégias terapêuticas e melhor

avaliação de prognósticos. Com o objetivo final de identificar novos alvos terapêuticos,

drogas e vacinas (Hanash, 2004).

23

2. Objetivos

2.1 Objetivo Geral

O objetivo geral deste projeto, nosso desafio científico, é estudar a função da

fibrilina-1 no processo de formação de trombo arterial.

2.2 Objetivos Específicos

2.2.1 Análise proteômica comparativa de plaquetas provenientes de

camundongos selvagens e deficientes fibrilina-1.

As plaquetas são fragmentos citoplasmáticos extremamente especializados e possuem

grande capacidade de armazenar diferentes substâncias importantes para o processo de

trombogênese em seus compartimentos (Patel et al., 2005) (Mitsios et al., 2010) (Carisey &

Ballestrem, 2011). Considerando os nossos dados preliminares e a possível influência da

excessiva ativação do TGF-β nos animais mgΔ/+, será realizada a análise proteômica do

conteúdo das plaquetas provenientes de diferentes grupos experimentais de camundongos,

através de géis 2DE e espectrometria de massas. O objetivo é verificar quantitativamente o

conteúdo das plaquetas obtidas de animais selvagens e compará-lo ao conteúdo das

plaquetas obtidas dos animais deficientes em fibrilina-1, procurando alterações que possam

estar relacionadas ao maior tempo de formação dos trombos em nosso modelo de estudo.

2.2.2 Verificar a influência do Losartan no perfil proteico dos géis 2DE de

plaquetas de camundongos selvagens e deficientes em fibrilina-1.

Levando em consideração nossos resultados preliminares, do qual o tratamento com

Losartan restabelece o tempo de oclusão nos animais deficientes em FBN-1, estenderemos

24

as análises proteômicas comparativas aos géis de plaquetas dos animais deficientes em

FBN-1 tratados e não tratados com Losartan. O objetivo é verificar se o perfil proteico com

o tratamento de Losartan se assemelha ao perfil controle, ou seja, identificar possíveis

proteínas que o Losartan possa influenciar direta ou indiretamente, responsáveis pelo

restabelecimento do tempo de formação de trombo.

2.2.3 Análise proteômica comparativa do extrato proteico da artéria aorta de

camundongos selvagens e deficientes em fibrilina-1.

Na Síndrome de Marfan, uma das regiões mais afetadas do sistema vascular é a aorta,

levando a dilatações ou aneurismas que quase sempre são fatais. Pilop e colaboradores

(Pilop et al., 2009) fizeram um estudo do proteoma da aorta média de pacientes com e sem

a Síndrome de Marfan, a fim de obter informações moleculares sobre os mecanismos que

levam à dilatação da aorta.

A partir desse trabalho, resolvemos analisar o extrato proteico das aortas dos nossos

camundongos deficientes em FBN-1, modelo para a Síndrome de Marfan, buscando

alterações no perfil proteico que justifiquem tais sintomas clínicos e/ou fatores que possam

justificar o maior tempo de formação de trombo nesses animais.

2.2.4 Análise proteômica de plaquetas de pacientes portadores da Síndrome de

Marfan.

O diagnóstico para a Síndrome de Marfan ainda é feito de forma clínica,

majoritariamente, levando em conta aspectos físicos do paciente. Em 1986, na reunião

25

Internacional de Distúrbios Hereditários do Tecido Conjuntivo, estabeleceu-se uma série de

critérios em relação ao diagnóstico da doença (D. P. Judge, 2006).

Não há publicado na literatura científica nenhum estudo sobre o proteoma de

plaquetas de pacientes com Síndrome de Marfan, nem do proteoma do plasma sanguíneo

dos mesmos. Sendo assim, nosso objetivo é verificar alterações no conteúdo plaquetário

desses pacientes e tentar estabelecer um padrão, um marcador molecular para o diagnóstico

dessa doença, que ainda é feito de forma clínica.

26

3. Material e Métodos

3.1 Preparação das Amostras

3.1.1 Animais

Utilizou-se camundongos selvagens da linhagem C57BL/6 com idade entre 8-12

semanas, obtidos pelo Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica (CEMIB), da

Universidade Estadual de Campinas, SP. E camundongos Deficientes em FBN-1 (Fbn-1

mg∆/+) com idade entre 8-12 semanas, matriz obtida da Profa. Dra. Lygia Pereira Castro,

ICB, USP, São Paulo, mantida em cruzamentos em nosso biotério (Departamento de

Bioquímica da Unicamp). Os camundongos deficientes em fibrilina-1 são heterozigotos,

seguindo o modelo mgΔ, onde os éxons 19-24 do gene Fbn1 foram substituídos através de

recombinação homóloga por um cassete de expressão do gene de resistência a neomicina.

Dessa forma, nossos animais heterozigotos não apresentam alterações fenotípicas, enquanto

que os homozigotos sobrevivem por algumas poucas semanas após o nascimento e morrem

devido às alterações cardiovasculares (Pereira et al., 1999) (Pereira et al., 1997).

Os camundongos foram mantidos em temperatura de 22± 1°C em ciclo de claro-

escuro de 12h, com livre acesso à água e à ração, utilizadondo dieta padrão (Nuvilab

CR1®).

Este trabalho está de acordo com os Princípios Éticos de Pesquisa com Animais,

aprovado pelo Comitê Institucional de Ética em Pesquisas com Animais, protocolo número

1774-1 (anexo I).

27

3.1.2 Tratamento com Losartan

Considerando que os animais deficientes em FBN-1 apresentam uma excessiva

ativação de TGF-β e que o tratamento com o Losartan leva à diminuição dessa ativação,

camundongos selvagens C57BL/6 (grupo controle) e deficientes em fibrilina-1 (Fbn1

mg∆/+) com 4 semanas de idade foram tratados com o fármaco Losartan, gentilmente

cedido pelo Dr. J. E. Krieger, do INCOR em São Paulo, SP, pelo período de 4 semanas.

Este fármaco foi administrado via oral por gavagem nas concentrações 15 mg/kg/dia e 30

mg/kg/dia (Figura 3.1), de acordo com Habashi (Habashi et al., 2006).

Figura 3.1 Fluxograma do tratamento de camundongos C57BL/6 e Fbn-1 mgΔ/+ com 4

semanas de idade, com Losartan nas concentrações 15 e 30 mg/Kg/dia, por 4 semanas.

3.1.3 Coleta de sangue de Camundongos

Os animais com 8 semanas de idade, pesando de 20 a 25 g, tratados e não tratados

com Losartan, foram anestesiados com uma mistura de Ketamina (Agener 10%, 1,2 mL/Kg

- Dopalen) e Xilasina (Anesedan Vetbrands, 0,8 mL/Kg – Agener União), utilizando

seringa U-100 (29G x 13mm) intramuscular.

28

O sangue foi coletado do coração por punção cardíaca, utilizando agulha 26G (13 x

0,45 mm) numa seringa (1,0 mL/cc) contendo anticoagulante ACD-A (BD Vacutainer) na

proporção de 1:6 (Gibbins & Mahaut-smith, 2004).

O sangue recém coletado foi colocado em eppendorf de 2,0 mL (Zufferey, Fontana,

Reny, & Nolli, 2012) e centrifugado a 2300 xg, 10 segundos por mL de sangue (Centrifuge

eppendorf 5810R) (O’Neill et al., 2002), obtendo-se dessa forma o plasma rico em

plaquetas (PRP) (Figura 3.2).

O PRP foi coletado em eppendorf cônico e centrifugado a 2200 xg, 4 minutos/mL,

obtendo-se o pellet de plaquetas. O sobrenadante (plasma pobre em plaquetas - PPP) foi

retirado e congelado a -80ºC.

Figura 3.2 Esquema experimental de obtenção de Plaquetas. O sangue foi centrifugado a

2300 xg, 10 segundos/mL, obtém-se o PRP. PRP foi centrifugado a 2200 xg por 4 min,

obtendo-se o PPP. Pellet de plaquetas foi congelado a -80ºC.

3.1.4 Lavagem de Plaquetas

As plaquetas são ressuspendidas em tampão Tyrode (NaCl, KCl, NaHCO3,

NaH2PO4, MgCl2 . 6 H2O, CaCl2 . 6 H2O, HEPES, D(+) glicose) contendo heparina (10

U/mL), prostaglandina (0,5 µM) e Apyrase (0,02 U/mL) (O’Neill et al., 2002) (Gibbins &

Mahaut-smith, 2004).

29

O ressuspendido foi incubado por 10 minutos no banho a 37º C e centrifugado a

1900 xg (2 minutos para 0,5 – 1,0 mL; 3 minutos para 2,0 – 3,0 mL). O pellet agora

formado foi congelado a -80º C (Gibbins & Mahaut-smith, 2004).

Para o uso, as plaquetas foram retiradas do freezer e deixadas à temperatura

ambiente por 5 minutos. Em seguida, foram ressuspendidas em 100 µL de tampão simples

Tiouréia (uréia 7M; tiouréia 2M; DTT 70 mM; chaps 4%) e incubadas por uma hora à

temperatura ambiente, para lise.

3.1.5 Extrato Proteico de Artéria Aorta

A artéria aorta proveniente de camundongos selvagens e deficientes em fibrilina-1

foram retiradas e dissecadas após a coleta de sangue (Figura 3.3). Aproximadamente 1 mg

de aorta foi incubado em Tampão simples Tiouréia (uréia 7M; tiouréia 2M; DTT 70 mM;

chaps 4%) por 2 horas em banho de gelo para extração proteica (Pilop et al., 2009) (Liao et

al., 2008) (Martins-de-Souza et al., 2009).

Figura 3.3 Artéria aorta de camundongos para extração de proteínas e análise do proteoma.

30

3.1.6 Coleta de Sangue de Pacientes com Síndrome de Marfan

O sangue de pacientes com Síndrome de Marfan foi coletado por enfermeiras do

Hospital de Clínicas da Universidade Estadual de Campinas, cedido voluntariamente e em

colaboração com a Prof. Dra. Vera Lúcia Gil da Silva Lopes, da Faculdade de Ciências

Médicas da Unicamp.

Em nosso laboratório, o sangue recém coletado foi centrifugado a 250 xg, 16 min/15

mL (Centrifuge eppendprf 5810R) para se obter o plasma rico em plaquetas (PRP). O PRP

foi transferido para um eppendorf cônico e centrifugado a 2200 xg por 16 min/10 mL

(Gibbins & Mahaut-smith, 2004). O sobrenadante, plasma pobre em plaquetas, foi retirado

e congelado a -80ºC e o pellet de plaquetas foi lavado como descrito na sessão 3.4.

3.1.7 Dosagem de proteínas – Método de Bradford

As amostras do extrato proteico plaquetário e das aortas foram quantificadas pelo

método de Bradford. Utilizou-se a curva padrão de BSA (BSA 0,5 mg/mL; 0,25 mg/mL;

0,125 mg/mL; 0,065 mg/mL), em triplicata, em placa de 96 poços e a leitura da absorbância

foi realizada a 595nm no leitor de ELISA modelo Synergy 2 (Biotek), em reagente de

Bradford de acordo com o manual do fabricante.

3.2 Eletroforese de duas dimensões em gel de poliacrilamida – 2D-PAGE

Toda técnica de 2D-PAGE foi realizada em colaboração com o Prof. Dr. José Camillo

Novello do Instituto de Biologia da Unicamp, em seu laboratório na Genônica e

Proteômica, inicialmente com ajuda e treinamento da Dra. Mariane Flores Nascimento

31

(Flores-Nascimento et al., 2012) e do Dr. Daniel Martins de Souza (Martins-de-Souza,

2012).

3.2.1 Isoeletrofocalização - Primeira dimensão

Aproximadamente 500 µg de proteína total foi aplicada em strips de pH 4-7 18 cm

(para plaquetas) e pH 3-10 18 cm (para aorta) (GE healthcare), em Tampão Tiouréia (uréia

7M, tiouréia 2M, DTT 70 mM, Chaps 4%, BPB, anfólito 2%), num volume final de 350 µL

(Martins-De-Souza et al., 2010).

A corrida foi realizada utilizando o equipamento IGphor (GE- Healthcare Life

Science) (Figura 3.4) nos parâmetro: 12 horas de hidratação, 1 hora 200 V, 1 hora 500 V, 1

hora 1000 V, e 8000 V até que se acumule 70000 V (Healthcare, n.d.).

Figura 3.4 Equipamentos utilizados para a primeira dimensão da eletroforese. IGphor (GE-

Healthcare Life Science), à esquerda. Strip holder 18 cm, à direita.

3.2.2 SDS-PAGE - Segunda dimensão

As strips são incubadas sob agitação em Tampão de Equilíbrio (uréia 6 M, Tris HCl

pH 8,8, glicerol 30%, SDS 2%, DTT 0,25%/IAA 0,62%) e encaixadas em gel de

poliacrilamida 12,5%. A corrida foi realizada nos parâmetros: 60 V, 400 mA por 1 hora;

32

600 V, 35 mA por gel em cuba acoplada a fonte Electrophoresis Power supply- EPS601-

Amersham Biosciences (Healthcare, n.d.) (Maguire & Fitzgerald, 2003). Padrão de peso

molecular utilizado - Precision Plus Protein – Dual Color Standard, Bio-Rad (Figura 3.5).

Figura 3.5 Cuba de eletroforese de duas dimensões, Amersham Biosciences. Corrida da

segunda etapa, segunda dimensão do gel.

Terminada a corrida, o gel é deixado overnight em fixador (ácido fosfórico 2%,

etanol 30%) e em seguida é corado com Coomassie Blue-G (USB 32812 100GM) (ácido

fosfórico 10%, sulfato de amônio 10%, metanol 20%, traços de Coomassie Blue-G), por no

mínimo 48 horas (Michele, Freson, & Geet, 2014) (Liebler, n.d.) (Becker, 2007).

3.3 Análise de Imagem 2D

Géis corados foram digitalizados (Image Quant 150), analisados e comparados pelo

programa Melanie 5.0 (Geneva Bioinformatics (GeneBio) S.A., Swiss Institute of

Bioinformatics, Geneva, Switzerland), seguindo o manual do usuário impresso e também o

obtido na internet (Melanie 7.0 2D Gel Analysis Software, n.d.), a fim de encontrarmos

diferenças na quantidade de algumas proteínas na comparação entre os grupos de estudo

(Winkler et al., 2008) (Rosengren et al., 2003).

33

Todos os géis obtidos foram submetidos a ajustes de imagem para melhor

visualização dos spots e redução da interferência do backgroud na quantificação dos spots.

Este procedimento permite maior precisão na identificação do volume total e relativo dos

spots, auxiliando nas análises comparativas entre géis de diferentes amostras.

Estas imagens processadas foram usadas para a análise e determinação das massas

moleculares e pontos isoelétricos (pI) aparentes dos spots contidos nos géis. A

quantificação dos spots foi realizada analisando-se o volume (área x intensidade) de cada

spot e normalizando-se os valores encontrados de volume de cada spot dividido pela soma

do volume de todos os spots contidos no gel, gerando assim uma relação de porcentagem de

cada spot em relação à totalidade (Melanie 7.0 2D Gel Analysis Software, n.d.). Dessa

forma foi possível compararmos os diferentes géis e verificar diferenças na expressão de

proteínas através da análise das imagens dos mesmos.

3.4 Identificação de Proteínas por Espectrometria de Massas

Spots apresentando diferenças significativas de expressão foram retirados

manualmente do gel, submetidos à digestão in gel com tripsina e submetidos à

espectrometria de massas, em colaboração com a Profa. Dra. Adriana Paes Leme,

Laboratório de Espectrometria de Massas do Laboratório Nacional de Biociências - LNBio

- CNPEM/ SINCROTRON (Q-Tof Ultima acoplado ao UPLC nanoAccquity, Waters)

(Aragão et al., 2012).

Para análise proteica, uma alíquota de 4,5 µL de proteínas resultante da digestão

peptídica foi separada pela columa C18 (100 mm6100 mm) RP-nanoUPLC (nanoAcquity,

Waters) acoplada ao espectrômetro de massas Q-Tof Premier (Waters) com uma fonte de

34

nanoelectrospray num fluxo de 0,6 mL/min. O gradiente foi de 2-90% de acetonitrila em

0,1% de ácido fórmico por 10 minutos. A voltagem do nanoelectrospray foi estabelacida

em 3,5 kV, voltagem de cone de 30 V e a temperatura da fonte foi 100 µC. O instrumento

foi operado no modo “Top-Three”, no qual um espectro é adquirido seguido por MS/MS

dos três picos detectados mais intensos. Após a fragmentação MS/MS, o íon foi colocado

na lista de exclusão por 60 segundos e para análise dos peptídeos clivados endógenos, foi

usada a exclusão em tempo real (Aragão et al., 2012).

Os espectros foram adquiridos usando o programa MassLynx v.4.1 e os dados brutos

foram convertidos num formato de lista de pico (mgf) sem somar os scans pelo programa

Mascot Distiller v.2.3.2.0, 2009 (Matrix Science Ldt.) contra Human_Uniprot012014

release22_01_2014; 88479 sequences; 35079223 residues (para plaquetas humanas) e

IPImouse_v3.86; 58667 sequences; 26399545 residues (para camundongos), usando o

equipamento Mascot v.2.3.01 (Matrix Science Ltd.), com carbamidometilação como

modificação fixas, oxidação de metionina como modificação variável, uma clivagem de

tripsina perdida e tolerância de 0,1 Da para ambos os íons precursores e fragmentos

(Aragão et al., 2012).

35

4. Resultados e Discussão

4.1 Padronização da Técnica 2DE

A princípio, realizou-se géis de poliacrilamida bidimensionais (2D-PAGE) com strips

na primeira dimensão de pH 3-10, para se ter uma visão geral e mais ampla das proteínas

contidas nas amostra do conteúdo plaquetário. Toda padronização da técnica foi realizada

com plaquetas de camundongos selvagens devido à facilidade de obtenção dos animais,

sem se prender ao tratamento com Losartan, ao mesmo tempo em que se padronizava a

coleta de sangue dos mesmos.

De acordo com a segunda dimensão, foi possível observar spots (proteínas) mais

concentrados entre as porções ácida (+) e neutra do gel. Dados da literatura mostram

diversas análises proteômica de plaquetas utilizando-se strips de pH 4-7 muito bem

estabelecidas, onde compreende-se a grande maioria de spots nessa faixa de pH (García et

al., 2004).

A partir dos resultados preliminares dos géis de pH 3-10, reforçados pelos dados da

literatura, decidimos utilizar strips de pH 4-7. Dessa forma, reduzimos o intervalo de pH,

onde esperaríamos encontrar spots amplamente espalhados pelo gel, como um “zoom” na

região compreendida entre pH 4-7.

É de extrema importância padronizar a técnica e os géis, a fim de se obter géis

reprodutíveis, ou seja, o mais similar possível entre eles. Dados da literatura e do manual do

usuário do programa Melanie sugerem que uma porcentagem de semelhança superior à

85% entre géis de mesma natureza (mesmo grupo), com um “n” de no mínimo 3 géis por

grupo é o ideal (Melanie 7.0 2D Gel Analysis Software, n.d.) (Cagney & McRedmond,

36

2008). Assim, minimizando os erros de manipulação das amostras e da técnica, as

diferenças encontradas serão devido às limitações e variações da própria técnica.

Inicialmente, coramos os géis por impregnação de Nitrato de Prata (AgNO3) (figura

4.1). Essa técnica de impregnação combina alta sensibilidade, numa baixa faixa de

nanogramas de peptídeos (1-10 ns/spot), enquanto que utiliza equipamentos e produtos

químicos muito simples e baratos (Wray et al., 1981). A técnica foi escolhida levando-se

em conta a necessidade de consistência e sensibilidade que ela proporciona ao detectar

peptídeos. É o método colorimétrico mais sensível existente, porém de difícil quantificação visto

que a intensidade da coloração é saturável, depende do tempo de revelação, e não oferece grande

linearidade entre a intensidade do spot e a quantidade de uma determinada proteína, tornando difícil

uma comparação mais precisa, especialmente entre diferentes géis (RABILLOUD, 1999). Sendo

assim, é uma técnica de difícil reprodutibilidade, ainda mais quando se utilizam vários

grupos experimentais que necessitam alta reprodutibilidade.

Como podemos observar na figura 4.1, todos os géis são do mesmo grupo

experimental (camundongos selvagem - grupo controle), mas é nítida a baixa

reprodutibilidade e a diferença entre eles. Observam-se muitas manchas e baixa

similaridade que dificulta a análise proteômica e a detecção de spots pelo programa

Melanie. Por isso, abortamos a impregnação por AgNO3 e definimos a coloração por

Coomassie Blue-G coloidal (figura 4.2) como definitiva (O’Farrell, 1975). É um método de

coloração mais demorado (48 horas no mínimo), porém é mais fiel e reprodutível, como

pode ser observado já nos primeiros géis realizados (figura 4.2).

37

pI4,0____________________________7,0

Figura 4.1 2D-PAGE do conteúdo plaquetário de camundongos selvagens não tratados.

Coloração por impregnação por Nitrato de Prata. A1 e A2 representam duplicatas da

kD

250

150

100

75

50

37

25

20

15

38

mesma amostra proteica, assim como B1 e B2, C1 e C2. Padrão de peso molecular à

esquerda, pI no topo.

Definiu-se a quantidade de 500 µg de proteínas total para cada gel de poliacrilamida

12,5%, a partir de dados publicados na literatura científica e manuais dos fabricantes dos

reagentes utilizados. Estabeleceu-se o acúmulo de 70.000 volts para a corrida da primeira

dimensão, sendo suficiente para a isofocalização das proteínas em seus respectivos pontos

isoelétricos. (Rabilloud, 2002)

pI 4,0_________________________7,0 pI 4,0_______________________7,0

Figura 4.2 Gel de poliacrilamida bidimensional do conteúdo proteico das plaquetas de

camundongos selvagens não tratados. A e B representam duplicatas da mesma amostra.

Coloração por Coomassie Blue-G. Padrão de peso molecular à esquerda, pI no topo da

figura.

kD

250

150

100

75

50

37

25

20

39

4.2 Análise Proteômica de Plaquetas - Intra Grupos

As primeiras análises e comparações dentro dos mesmos grupos, apresentadas e

discutidas a seguir, foram realizadas com o objetivo de verificar se os géis estão

padronizados e são reprodutíveis dentro de cada grupo experimental. Tomou-se o máximo

de cuidado com variações na manipulação da técnica para minimizar desvios no perfil

proteico apresentados nos géis.

4.2.1 Grupo Controle – Camundongos Selvagens

Assim que todos os parâmetros foram estabelecidos e após os géis terem apresentado

alta similaridade, pode-se considera-los reprodutíveis (quando apresentam taxa de

semelhança superior a 85% devidamente analisados no programa Melanie).

Os géis das proteínas de plaquetas de camundongos selvagens não tratados com

Losartan servem como o gel referência (padrão) para todas as análises comparativas pelo

programa Melanie. A figura 4.3 mostra o gel referência do grupo controle (controle 1) –

proteínas de plaquetas de camundongos selvagens – ou seja, o melhor gel realizado, com o

maior número de spots e melhor qualidade.

Foram realizados cinco géis desse grupo (n=5). Todos com porcentagem de

semelhança superior a 85% (chegando a 92,53%) comparados com o gel referência do

grupo e número de spots em torno de 155 (tabela 4.1). Dessa forma, fechamos o grupo com

um número bom de géis reprodutíveis e padronizados. As poucas diferenças encontradas

podem ser devido às limitações e pequenas variações da técnica, ou ainda fragmentos

proteicos, degradados durante o manuseio na preparação da amostra.

40

pI 4,0______________________________________________________________7,0

Figura 4.3 Gel de poliacrilamida bidimensional. Gel controle 1, proteínas de plaquetas de

camundongos selvagens não tratados com Losartan.

Tabela 4.1 Comparação dos géis do grupo controle, “n=5”. Num matches é o número de

spots encontrados aos pares. A semelhança dos géis está representada pela % matches.

Dados obtidos pelo programa Melanie.

Gel Ref x Gel 2 Num

matches

% matches

Controle 1 x Controle 2 151 92,35




41

4.2.2 Grupo Controle tratado com Losartan 15 mg

A fim de verificar se o fármaco Losartan influencia no resultado dos géis e nas

análises proteômicas, atuando como falso positivo, realizamos géis do conteúdo proteico

das plaquetas do grupo controle (animais selvagens) tratados com Losartan nas

concentrações 15 e 30 mg/Kg/dia durante quatro semanas. A figura 4.4 mostra o gel padrão

do grupo controle tratado com Losartan na dosagem 15 mg (Controle 15/1).

pI 4,0______________________________________________________________7,0

Figura 4.4 Gel de poliacrilamida bidimensional. Gel referência do grupo controle tratado


15mg/Kg/dia.

42

Foram feitos quatro géis desse grupo tratado (n=4; Controle 15/1, 15/2, 15/3, 15/4),

todos reprodutíveis e com porcentagem de semelhança superior a 85% comparados

(chegando a 95,15%) com o gel referência do grupo. Em número de spots encontrados aos

pares encontramos em torno de 150 – 160 pares (tabela 4.2).



dos géis comparados está representada pela % matches. Dados obtidos pelo Melanie.

Gel Ref x Gel 2 Num

matches

% matches

Controle 15/1 x Controle 15/2 167 95,15



4.2.3 Grupo Controle tratado com Losartan 30 mg

Da mesma forma que o grupo anterior, a fim de verificar se o fármaco Losartan

influencia no resultado dos géis e nas análises proteômicas, realizamos géis das proteínas

das plaquetas do grupo controle (animais selvagem) tratados com Losartan na concentração

30 mg/Kg/dia durante quatro semanas (Figura 4.5).

Neste grupo, foram realizados cinco géis (n=5, Controle 30/1, 30/2, 30/3, 30/4, 30/5),

todos reprodutíveis e com porcentagem de semelhança superior a 85%, comparados com o

gel referência do grupo (Controle 30/1). Em número de spots, encontramos em torno de 140

– 180 pares (tabela 4.3).

43

pI 4,0_______________________________________________________________7,0

Figura 4.5 Gel de poliacrilamida bidimensional, referência do grupo controle tratado


30 mg/Kg/dia.



dos géis comparados está representada pela % matches. Dados obtidos pelo Melanie.

Gel Ref x Gel 2 Num matches % matches





44

4.2.4 Grupo Deficiente em Fibrilina-1

Finalmente, realizamos três géis (n=3, mgΔ/+ 1, mgΔ/+ 2 e mgΔ/+ 3) do extrato

proteico das plaquetas do grupo Deficiente em fibrilina-1. Todos os géis apresentaram no

mínimo 89% de semelhança, comparado com o gel referência desse grupo (Figura 4.6).

Foram encontrados em torno de 139 spots aos pares (tabela 4.4).

pI 4,0______________________________________________________________7,0


plaquetas de camundongos deficiente em fibrilina-1 não tratados com Losartan (mgΔ/+ 1).

45

Tabela 4.4 Comparação dos géis do grupo deficiente em fibrilina-1, “n=3”. Num matches é

o número de spots encontrados nos dois géis comparados. A semelhança dos géis

comparados está representada pela % matches. Dados obtidos pelo Melanie.

Gel Ref x Gel 2 Num

matches

% matches

mgΔ/+ 1 x mgΔ/+ 2 139 89,00

mgΔ/+ 1 x mgΔ/+ 3 130 93,00

4.2.5 Grupo Deficiente em Fibrilina-1 tratado com Losartan 15 mg

Da mesma forma que anteriormente, com intuito de verificar a influência do

Losartan, realizamos géis bidimensionais do extrato proteico das plaquetas de

camundongos deficientes em fibrilina-1, tratados com Losartan 15 (figura 4.7) e 30

mg/Kg/dia durante quatro semanas.

Realizamos quatro géis do grupo tratado com 15 mg (n=4, mgΔ/+ 15/1, mgΔ/+ 15/2,

mgΔ/+ 15/3 e mgΔ/+ 15/4) e a porcentagem de semelhança entre eles foi em torno de 90%.

O número de spots variou de 130 a 160 (tabela 4.5). Como posto anteriormente, diferenças

devido às limitações da técnica e da preparação da amostra são comuns de acontecer e

deve-se levar em conta, com cautela, ao avaliar esses dados.

46

pI 4,0_______________________________________________________________7,0


plaquetas de camundongos deficiente em fibrilina-1 tratados com Losartan 15 mg (mgΔ/+

15/1).


15 mg, “n=4”. Num matches é o número de spots encontrados nos dois géis comparados. A


Melanie.

Gel Ref x Gel 2 Num

matches

% matches

mgΔ/+ 15/1 x mgΔ/+ 15/2 144 90,28

mgΔ/+ 15/1 x mgΔ/+ 15/3 165 92,17

mgΔ/+ 15/1 x mgΔ/+ 15/4 132 86,00

47

4.2.6 Grupo Deficiente em Fibrilina-1 tratado com Losartan 30 mg

Segundo dados preliminares do nosso grupo, o tratamento com o Losartan na

dosagem 30 mg/Kg/dia é o responsável pelo reestabelecimento do tempo normal de

formação de trombo, no modelo fotoquímico em camundongos deficientes em FBN-1.

Realizamos quatro géis do grupo tratado com Losartan 30 mg (n=4, mgΔ/+ 30/1,

mgΔ/+ 30/2, mgΔ/+ 30/3 e mgΔ/+ 30/4), onde a porcentagem de semelhança foi superior a

85% (figura 4.8). O número encontrado de spots pareados variou de 170 a 180 (tabela 4.6).

pI 4,0______________________________________________________________7,0

Figura 4.8 Gel de poliacrilamida bidimensional. Padrão do perfil proteico das plaquetas de

camundongos deficiente em fibrilina-1 tratados com Losartan 30 mg (mgΔ/+ 30/1).

48


30 mg, “n=4”. Num matches é o número de spots encontrados aos pares nos dois géis

comparados. A semelhança dos géis comparados está representada pela % matches. Dados

obtidos pelo Melanie.

Gel Ref x Gel 2 Num

matches

% matches

mgΔ/+ 30/1 x mgΔ/+ 30/2 171 86,36

mgΔ/+ 30/1 x mgΔ/+ 30/3 187 86,57

mgΔ/+ 30/1 x mgΔ/+ 30/4 171 87,46

4.3 Análise Proteômica Comparativa de Plaquetas - Inter Grupos

As primeiras análises e comparações dentro dos mesmos grupos foram realizadas

com o objetivo de padronização e reprodutibilidade. Dessa forma, quando compararmos os

géis referências entre grupos distintos, as diferenças no perfil proteico poderiam ser mais

fiéis e prováveis de ser verdadeiras.

Dentro de cada grupo escolheu-se o melhor gel, aquele que representaria com maior

qualidade e fidelidade o perfil proteico do grupo estudado. Este é considerado o gel

referência do grupo, onde será comparado com os géis referência dos outros grupos. A

figura 4.9 mostra o esquema, um resumo utilizado para as comparações entre os grupos de

natureza diferente.

Ao todo foram realizadas sete comparações inter grupos:

1) Grupo controle (Controle 1) X grupo controle tratado com Losartan 15 mg (Controle

15/1)

2) Grupo controle (Controle 1) X grupo controle tratado com Losartan 30 mg (Controle

30/1)

49

3) Grupo deficiente em FBN-1 (Nocaute 1) X grupo deficiente em FBN-1 tratado com

Losartan 15 mg (mgΔ/+ 15/1)

4) Grupo deficiente em FBN-1 (mgΔ/+ 1) X grupo deficiente em FBN-1 tratado com

Losartan 30 mg (mgΔ/+ 30/1)

5) Grupo controle (Controle 1) X grupo deficiente em FBN-1 (mgΔ/+ 1)

6) Grupo controle (Controle 1) X grupo deficiente em FBN-1 tratado com Losartan 15

mg (mgΔ/+ 15/1)

7) Grupo controle (Controle 1) X grupo deficiente em FBN-1 tratado com Losartan 30

mg (mgΔ/+ 30/1)

Figura 4.9 Resumo experimental para comparações proteômicas entre os diversos grupos.

O gel referência de cada grupo foi selecionado para comparações entre os demais géis

referências dos outros grupos.

4.3.1 Grupo controle x Controle tratado com Losartan 15 mg

A figura 4.10 ilustra a comparação proteômica do gel referência do grupo controle

com o gel referência do grupo controle tratado com Losartan 15 mg. Os pontos verdes em

cima dos spots representam os pontos proteicos semelhantes, encontrados aos pares nos

dois géis comparados pelo programa Melanie. Os pontos em vermelho representam spots

encontrados em apenas um dos géis e ausente no outro, ou seja, não está em pares. A

porcentagem de semelhança dessa comparação foi de 92,21%, compreendendo um total de

50

160 spots pareados, ou seja, presentes aos pares (pontos verdes). Sendo considerados géis

semelhantes.

Não encontramos nenhuma diferença significativa a ponto de afirmar que o Losartan

estaria influenciando o perfil proteico do gel. É possível que o Losartan na dosagem 15 mg

não influencie no resultado das análises proteômicas no grupo tratado. Diferenças

encontradas podem ser ligadas às limitação da própria técnica e sua manipulação.




spots presentes em apenas um dos géis.

4.3.2 Grupo controle x Controle tratado com Losartan 30 mg

A figura 4.11 ilustra a comparação proteômica do gel do grupo controle com o gel do

grupo controle tratado com Losartan 30 mg/Kg/dia, pelo programa Melanie. A

porcentagem de semelhança foi de 90,80%, compreendendo um total de 163 spots

semelhantes pareados, ou seja, presentes em ambos os géis (pontos verdes).

51




spots presentes em apenas um dos géis.

Como no grupo anterior, não encontramos nenhuma diferença significativa a ponto de

afirmar que o Losartan estaria influenciando o perfil proteico do gel, sendo considerados

géis semelhantes. Diferenças encontradas podem ser ligadas ao manuseio das amostras e da

própria técnica.

4.3.3 Grupo deficiente em FBN-1 x deficiente em FBN-1 tratado com Losartan

15 mg

A figura 4.12 ilustra a comparação proteômica do gel referência do grupo deficiente

em FBN-1 com o gel do grupo deficiente em FBN-1 tratado com Losartan 15 mg. A

porcentagem de semelhança foi de 89,37%, compreendendo um total de 143 spots

pareados, presentes em ambos os géis (pontos verdes).

52





dos géis.


na dosagem 15 mg estaria influenciando o perfil proteico do gel. Sendo assim, é possível

que o Losartan não influencie no resultado das análises proteômicas no grupo tratado.

Diferenças encontradas podem ser ligadas às limitação da própria técnica.

4.3.4 Grupo deficiente em FBN-1 x deficiente em FBN-1 tratado com Losartan

30 mg/Kg/dia

A figura 4.13 ilustra a comparação proteômica do gel do grupo deficiente em FBN-1

com o gel do grupo deficiente em FBN-1 tratado com Losartan 30. A porcentagem de

semelhança foi de 89,49%, compreendendo um total de 132 spots pareados, presentes em

ambos os géis.

53


na dosagem 30 mg/Kg/dia estaria influenciando diretamente o perfil proteico do gel. É

possível que o Losartan não esteja revertendo o perfil proteico encontrado no grupo

controle, embora seja essa dosagem responsável pelo reestabelecimento do tempo normal

de formação de trombos, segundo dados do nosso grupo. Diferenças encontradas podem ser

ligadas ao manuseio e preparação das amostras.





dos géis.

4.3.5 Controle x Deficiente em FBN-1

Finalmente, a figura 4.14 mostra a comparação do perfil proteico do grupo controle e

do grupo deficiente em FBN-1. A comparação pelo programa Melanie nos indica uma

porcentagem de semelhança de apenas 80,6%, inferior ao considerado pela literatura como

gel semelhante, e 123 spots pareados. Foi encontrado um perfil proteico significantemente

54

diferente - spots em menor ou maior quantidade - como mostrado nas setas em preto das

figuras 4.15 e 4.16.


esquerda, e o grupo deficiente em fibrilina-1 não tratado com Losartan (mgΔ/+), à direita,

pelo Melanie. Pontos verdes representam spots semelhantes encontrados nos dois geis.

Pontos vermelhos representam spots presentes em apenas um dos géis.

4.3.6 Controle x Deficiente em FBN-1 tratados com Losartan 15 mg

A figura 4.15 mostra a comparação do perfil proteico do grupo controle e do grupo

deficiente em FBN-1 tratado com 15 mg. A comparação pelo programa Melanie nos indica

uma porcentagem de semelhança de apenas 79,12%, inferior ao considerado pela literatura

como gel semelhante, e 125 spots pareados. Tal comparação se assemelha à anterior,

sugerindo que o Losartan não é capaz de reverter o perfil proteico controle.

55




geis. Pontos vermelhos representam spots presentes em apenas um dos géis.

4.3.7 Controle x Deficiente em FBN-1 tratados com Losartan 30 mg

A figura 4.16 mostra a comparação do perfil proteico do grupo controle e do grupo

deficiente em FBN-1 tratado com 30 mg. A comparação pelo programa Melanie nos indica

uma porcentagem de semelhança de apenas 79,61%, inferior ao considerado como gel

semelhante, e 123 spots pareados. Tal comparação se assemelha à anterior, sugerindo que o

Losartan não é capaz de reverter o perfil proteico controle.

56




geis. Pontos vermelhos representam spots presentes em apenas um dos géis.

A tabela 4.7 resume os dados das comparações entre os grupos.

Tabela 4.7 Resumo dos dados das comparações inter grupos. Num matches representa o

número de spots pareados. A semelhança entre cada gel é representada por % matches.

Gel Ref 1 Gel Ref 2 Num

matches

%

matches

Controle 1 Controle 15/1 160 92,21

Controle 1 Controle 30/1 163 90,80

mgΔ/+ mgΔ/+ 15/1 143 89,37

mgΔ/+ mgΔ/+ 30/1 132 89,49

Controle 1 mgΔ/+ 123 80,60

Controle 1 mgΔ/+ 15/1 125 79,12

Controle 1 mgΔ/+ 30/1 123 79,61

4.3.8 Spots Selecionados - Controle x Deficiente em FBN-1

Com base nas análises comparativas da sessão 4.3.5, ilustradas pelas figuras 4.17 e

4.18, selecionamos alguns spots para serem caracterizados por Espectrometria de Massas,

em colaboração com a Doutora Adriana Paes Leme, do Centro de Biologia Molecular

Estrutural- LNLS. A identificação das proteínas com quantidades diferentes entre os grupos

57

controle e mgΔ/+ é de extrema importância para a correlação de suas funções com o maior

tempo de formação de trombos em camundongos deficientes em fibrilina-1. A tabela 4.8

resume as proteínas caracterizadas por espectrometria de massas deses dois grupos

comparados.

pI 4,0_______________________________________________________________7,0

Figura 4.17 Gel do grupo controle. Setas em preto indicam os spots significantemente

diferentes e selecionados para a espectrometria de massas.

kD

250

150

100

75

50

37

25

20

15

58

pI 4,0_______________________________________________________________7,0

Figura 4.18 Gel do grupo deficiente em fibrilina-1 não tratado com Losartan (mgΔ/+).

Setas em preto indicam os spots significantemente diferentes e selecionados para a

espectrometria de massas.

Como ilustrado na figura 4.19, encontramos maior quantidade da proteína

representada pelo spot 1 no grupo controle, e em menor quantidade no grupo fibrilina-1.

Dados da análise pelo programa Melanie indicam uma área de 15,31 mm2, um volume de

259,56 (intensidade de pixels) e uma porcentagem de volume 1,40% para o spot no gel do

grupo controle, contra uma área de 3,15 mm2, um volume 20,45 (intensidade de pixels) e

uma porcentagem de volume de 0,17% para o mesmo spot no grupo deficiente em fibrilina-

kD

250

150

100

75

50

37

25

20

15

59

1 (tabela 4.9). Sua identificação pela espectrometria de massas revelou ser a proteína

Endoplasmina, também chamada de 94kDa glucose-regulated protein or GRP94 (1).

Tabela 4.8 Proteínas encontradas nas análises proteômicas de plaquetas. Dados obtidos por

espectrometria de Massas.

Spot Proteína Massa Molecular

Teórica (kDa) pI Teórico

Cobertura da

Sequência (%)

Num de

peptídeos Score

Expressão

1 Endoplasmina 92,7 5 34 100(52) 1810 WT

2 Fator de von

Willebrand 322,66 5,31 10 72(44) 1426 WT

3 Fator X de

Coagulação 55,4 5,5 8 5(3) 88 WT

4, 5, 7,

12 dados não disponíveis . . . . . .

6 Calpaína sub I 28,55 5,41 27 30(13) 337 WT

8 Adenilil Ciclase 51,87 7.16 25 54(39) 1568 WT

9 α-sinucleina 1 14,47 4,74 61 54(42) 2145 WT

10 Proteassoma sub β6 25,59 4,97 22 12(7) 208 WT

11 Peroxiredoxina 2 21,93 5,2 39 9(5) 1113 WT

13 Vinculina 117,215 5,77 50 146(99) 3995 FBN-1

Figura 4.19 Spot 1: Endoplasmina e spot 2: Fator de von Willebrand, expressos no grupo

controle (esquerda) e em menor quantidade no grupo deficiente em FBN-1 (direita).

A1 A2

60

A Endoplasmina é considerada uma proteína do choque térmico (do inglês “heat

shock 90kDa protein), constituinte do retículo endoplasmático, ligante de Ca2+

. Faz parte de

um grupo de proteínas induzidas pelo choque térmico. Os membros mais importantes desse

grupo constituem uma classe de proteínas envolvidas no dobramento e desdobramento de

outras proteínas. Sua expressão é aumentada quando as células são expostas a elevadas

temperaturas ou outros tipos de estresse (Maio., 1999).

Greening e colaboradores realizaram um estudo comparativo entre o proteoma de

membrana e citoesqueleto de plaquetas humanas contra as proteínas do plasma. Essa

relação nos dá uma base para identificação e classificação das proteínas que são

seletivamente adquiridas do plasma pelas plaquetas, como a endoplasmina, albumina

sérica, L-lactase desidrogenase, fibrinogênio, multimerina 1; das proteínas que são

endógenas às plaquetas, como actina, actinina, filamina, tropomiosina, trombospondina-1,

etc (Greening & Simpson, 2010). Sendo assim, a endoplasmina pode estar sendo menos

expressa ou ainda pode estar sendo adquirida do plasma no grupo deficiente em FBN-1 de

forma menos eficiente que no grupo controle (onde apresentaria uma aquisição normal),

talvez por alguma deficiência nos componentes que a transportam para dentro da plaqueta.

Seu papel em plaquetas parece não estar muito bem elucidado até o presente momento.

Tabela 4.9 Dados obtidos pelo programa Melanie sobre a Endoplasmina, spot 1, em

relação a área e volume, comparando-se os grupos controle e deficiente em FBN-1.

Grupo Área Volume %

Volume

Controle 15,31 259,56 1,40

mgΔ/+ 3,15 20,45 0,17

61

A proteína representada pelo spot 2 (figura 4.19) está mais expressa no grupo

controle e em menor quantidade no grupo deficiente em FBN-1. Foi identificada como o

Fator de von Willebrand. Dados da análise pelo Melanie indicam uma área de 4,25 mm2,

um volume de 66,36 (intensidade de pixels) e uma porcentagem de volume 0,35% para o

spot no gel do grupo controle, contra uma área de 6,9 mm2, um volume 24,32 (intensidade

de pixels) e uma porcentagem de volume de 0,20% para o mesmo spot no grupo deficiente

em fibrilina-1 (tabela 4.10).

Tabela 4.10 Dados obtidos pelo Melanie sobre o Fator de Von Willebrand, spot 2, em



Volume

Controle 4,25 66,36 0,35

mgΔ/+ 6,9 24,32 0,20

A presença de múltiplos spots de uma mesma proteína no gel, como é o caso do Fator

de von Willebrand (4 isoformas no gel) pode indicar a presença de modificações pós-

traducionais, ocorrência de variações alélicas de uma mesma proteína, variação

isoenzimática ou eventos provenientes do splicing alternativo (Gion et al., 2005)

Fator de von Willebrand é uma proteína multimérica de 2813 aminoácidos. Passa por

extensivas modificações pós-traducionais incluindo a remoção de sequências propeptídeos,

dímeros e eventuais geração de multímeros. Recentes estudos sobre sua estrutura indicam

que enquanto o domínio A para plaquetas e colágeno forma estruturas globulares, uma série

de domínios repetitivos na direção C-termial proporcionando flexibilidade e aumento de

seu comprimento em condições de estresse no vaso sanguíneo (Lillicrap, 2013).

62

FvW é sintetizado nas células endoteliais (armazenado nos corpos de Weibel–Palade)

e nos megacariócitos, precursores das plaquetas (armazenado nos grânulos-α das

plaquetas). É secretado para o plasma e para a matriz extracelular. No plasma, os

multímeros do FvW são submetidos à clivagem por uma metaloprotease denominada

ADAMTS-13 (disintegrin-like and metalloprotease with trombospondin type 1 motifs),

limitando a formação do trombo plaquetário (Bryckaert et al., 2014).

Tem duas funções principais: mediar a adesão das plaquetas ao subendotélio

lesionado, funcionando como uma ponte entre receptores da plaqueta (glicoproteína Ib e

glicoproteína IIb/IIIa) e o subendotélio lesionado. E formar um complexo com o fator VIII,

protegendo-o contra degradação e inativação, mantendo os níveis plasmáticos do fator VIII

(uma proteína pro-coagulante) numa taxa ideal. Para que ocorra a adesão às plaquetas é

necessário a presença de grandes multímeros do FvW (Bryckaert et al., 2014).

Figura 4.20 Sequência de acontecimentos na ativação plaquetária. (A) A adesão

plaquetária na superfície íntima vascular lesionada é mediada pela fixação do fator de von

Willebrand em seu receptor da membrana plaquetária GpIb. (B) As plaquetas se fixam também na parede do vaso danificado mediante a ligação dos receptores de colágeno

http://pt.wikipedia.org/wiki/Plaquetas

63

(COL) ao colágeno subendotelial. Outros estimulantes plaquetários como trombina e

adrenalina se fixam aos seus recptores específicos. (C) Em resposta a esses diferentes

estímulos, plaquetas aderidas se ativam e liberam tromboxano A2 (TXA2) e adenosina

difosfato (ADP), que se fixam aos seus receptores plaquetários respectivos e amplificam o

processo de ativação. (D) A agregação plaquetária é mediada pela ligação de fibrinogênio

(FIB) ao seu receptor nas plaquetas circulantes, que dão lugar a formação de pontes de

fibrinogênio. O receptor FIB se forma mediante o acoplamento de GpIIb/IIIa na membrana

das plaquetas ativadas (Braunwald, 2006).

Já é claro que a interação entre FvW/GPIb - IX - V é a ligação ao receptor

predominante que inicia a adesão de plaquetas. A liberação do FvW dos grânulos-α requer

ativação das plaquetas. Onde houver injúria vascular, plaquetas são recrutadas aos

componentes da matriz extracelular subendoteliais, via receptores específicos de plaquetas

envolvidos na adesão e agregação (figura 4.20). Interação e a sinalização entre FvW/GpIb-

IX-V induz ativação plaquetária, convertendo a maioria das integrinas aIIbb3 em receptores

de alta afinidade para os domínios C4 do FvW. Esse passo é essencial para adesão estável e

para a subsequente reorganização do citoesqueleto levando as plaquetas a se espalharem ao

FvW (Casari et al., 2013).

Deficiências quantitativas ou qualitativas no fator de von Willebrand estão associados

com hemostasia anormal que pode ser manifestado através de sangramentos ou

complicações trombóticas. Diversos estudos epidemiológicos revelam que o aumento nos

níveis de FvW pré-dispõe as complicações aterotrombóticas (Casari et al., 2013).

Sendo assim, diante de toda informação já conhecida sobre o FvW, fica claro que a

menor ocorrência dessa proteína no grupo deficiente em FBN-1 pode estar relacionada com

o maior tempo de oclusão, nesse grupo. Sendo a ligação das plaquetas ao FvW um dos

primeiros e principais eventos para adesão, as plaquetas se fixariam com mais dificuldade

no vaso lesionado, indo de acordo com o mostrado pelo nosso grupo, onde há formação e

64

desprendimento do trombo por um longo período, ate que finalmente, cerca do dobro do

tempo normal, ocorre oclusão total, que pode estar sendo compensada pela ligação ao

colágeno.

O spot número 3 (figura 4.21) foi identificado como o Fator de Coagulação X,

também chamado de Fator de Stuart-Prower. Embora o programa Melanie não tenha

disponíveis os dados de área e volume, esse fator aparece nos géis do grupo controle e em

menor quantidade nos géis do grupo deficiente em FBN-1.

Figura 4.21 Spot 3: Fator de coagulação X, presente sob isoformas ou transformações pós

traducionais (círculo à esquerda), expressos no grupo controle (esquerda) e em menor

quantidade no grupo deficiente em FBN-1 (direita).

O fator de coagulação X está presente nas vias intrínseca e extrínseca da coagulação

sanguínea. Quando ativado forma um complexo com o fator V ativado, plaquetas e cálcio,

B1 B2

65

que ativa o fator de coagulação II (protrombina) e leva a formação de trombina. A trombina

por sua vez, desencadeia a formação de fibrina, a partir do fibrinogênio (Ernest Beutler, et

al., 2000).

Essa proteína pode ser de extrema importância para nosso estudo, sua ausência no

grupo FBN-1 poderia ser um dos responsáveis pelo maior tempo de formação de trombo e

trombos menos estáveis, em comparação com camundongos selvagens, já que a cascata de

coagulação nos animais deficientes em FBN-1 estaria parcialmente comprometida.

O spot número 6 foi identificado sendo a proteína Calpaína I (figura 4.22). Segundo

as análises do Melanie, essa proteína está em menor quantidade no grupo deficiente em

FBN-1. No grupo controle sua área é de 5,6 mm2, volume 20,93 (intensidade de pixels) e

porcentagem de volume de 0,11%.

As calpaínas representam uma família bem conservada de proteases de cisteína

dependentes de cálcio. A atividade da calpaína in vivo é altamente regulada pelas

calpastatinas. As calpastatinas inibem especificamente as calpaínas, não inibindo outras

proteases de cisteína, através de suas interações com vários sítios das calpaínas (Pasquet et

al, 1996).

Nas plaquetas, as proteases dependentes de Ca2+

(Calpaína I e II) fragmentam a

proteína ligadora de actina e talina, contribuindo para a reorganização do citoesqueleto

necessária para agregação plaquetária (Dachary-Prigent J et al, 1995). Adicionalmente, as

calpaínas participam da expressão da atividade de procoagulantes e na formação de

microvesículas que secretam fosfatidil serina (PS). O desprendimento dessas

microvesículas está relacionado com perturbações do citoesqueleto da membrana

plaquetária, especialmente a hidrólise de proteínas ligadoras de actina (ABP) mediada por

66

calpaína e a ruptura da associação dos filamentos de actina com a superfície da membrana

(Fujimoto T, Fujimura K, 1991). Sendo assim, a reorganização do citoesqueleto para a

seguinte agregação plaquetária pode estar em parte prejudicada pela menor quantidade de

Calpaína no grupo deficiente em FBN-1.

Figura 4.22 Spot 6: Calpaína subunidade I, expressa no grupo controle (esquerda) e em

menor quantidade no grupo deficiente em FBN-1 (direita). Dados não disponíveis sobre o

spot 7 e sobre o spot sem numeração (à direita, no grupo FBN-1).

O spot 8 foi identificado como a proteína Adenilil ciclase, presente no grupo controle.

Apesar de aparecer pequenos vestígios no grupo deficiente em FBN-1, não é suficiente para

que o programa Melanie reconheça como um ponto proteico, como ilustrado na figura 4.23.

C1 C2

67

Esse spot tem uma área de 6,7 mm2, volume 47,29 (intensidade de pixels) e porcentagem de

volume de 0,25%. Esses mesmos dados são nulos para o grupo FBN-1, pois o Melanie não

o reconhece como proteína.

Figura 4.23 Spot 8: Adenilil Ciclase, expressa no grupo controle (esquerda).

O spot número 9 (figura 4.24) é a proteína α-sinucleina 1, presente no grupo controle

e em menor quantidade no grupo FBN-1, como mostrado na figura 4.24. No gel, dados da

análise pelo Melanie indicam uma área de 7,6 mm2, volume 48,01 (intensidade de pixels) e

porcentagem de volume 0,26% no grupo controle. Enquanto esses mesmos dados são nulos

para o grupo FBN-1. Da mesma forma, os spots de número 10, 11 e 12 também estão

presentes apenas no grupo controle e ausentes no grupo FBN-1. Embora apareçam

D1 D2

68

pequenos vestígios no gel do grupo FBN-1, os parâmetros estabelecidos e padronizados não

são suficientes para que se enquadre como pontos proteicos.

Figura 4.24 Spot 9: α-sinucleina 1; spot 10: Proteassoma β6; spot 11: Peroxiredoxina 2;

spot 12: dados não disponíveis. Todos expressos no grupo controle (esquerda).

A α-sinucleína é uma proteína de 140 aminoácidos e é altamente conservada entre as

espécies de vertebrados. Ela não possui uma sequência de sinal, sugerindo que é uma

proteína intranuclear. Muitos estudos sugerem que o mau dobramento da proteína α-

sinucleína está associado com diversas doenças neurodegenerativas, como na degeneração

E1 E2

F1 F2

69

seletiva dos neurônios na doença de Parkinson e demência do corpo de Lewy (Cooper et

al., 2007).

Entretanto, em plaquetas, Reheman et al. (Reheman et al., 2010) sugere que a α-

sinucleína inibe a liberação de grânulos-α in vitro. O autor postula que camundongos

deficientes em multimerina1 e α-sinucleína apresentam adesão plaquetária diminuída e

formação de trombo deficiente em locais de vaso com injúria (a formação de trombo foi

reestabelecida com a transfusão de multimerina 1). Isso ocorre devido a deficiência de

multimerina 1, uma proteína de adesão armazenada em plaquetas e células endoteliais, que

dão suporte à adesão plaquetária e também se ligam ao colágeno aumentando a adesão

plaquetária ao colágeno dependente do fator de von Willenbrand, assim como ao aumento

dos grânulos-α decorrentes da deficiência de α-sinucleína (Reheman et al., 2010). Dados do

nosso grupo, em relação à formação de trombos menos estáveis no grupo deficiente em

FBN-1, grupo que não apresenta α-sinucleína, parecem ir de acordo com o proposto por

Reheman.

O spot 10 foi identificado como o Proteossoma subunidade β6 (figura 4.24). Dados

do Melanie mostram que sua área corresponde a 6,15 mm2, volume 22,79 (intensidade de

pixels) e porcentagem de volume de 0,12% no grupo controle, no grupo FBN-1 não foi

detectado.

O proteossoma é um complexo proteico capaz de degradar praticamente qualquer

proteína. O proteossoma 26S é constituído por um complexo catalítico central denominado

20S, preso nas suas duas extremidades laterais a complexos regulatórios 19S. O complexo

20S, por sua vez é formado por 2 anéis alfa e 2 anéis beta na sequência alfa-beta-beta-alfa,

cada um formado por 7 subunidades distintas, sendo os anéis alfa estruturais e os beta

70

catalíticos. Diferentes subunidades beta realizam diferentes clivagens proteicas

(Ciechanover, 1998)

Klockenbusch (Klockenbusch et al., 2014) em análises proteômicas encontrou quase

todos os membros do proteossoma 26S e alguns componentes do imunoproteossoma, como

o β5i. Seus estudos bioquímicos confirmaram a atividade catalítica da subunidade 20S,

assim como seus componentes foram montados dentro do complexo proteossômico em

plaquetas. Também verificou que plaquetas contém toda maquinaria necessária para gerar

os peptídeos do MHC I. Sugerindo novas funções para plaquetas, particularmente em

relação à inflamação e imunidade, além de sua função hemostática (Klockenbusch et al.,

2014).

Mas não apenas isso, inibidores de proteossoma demonstraram ser capazes de inibir a

agregação plaquetária (Avcu et al., 2007).

Perturbações farmacológicos ou genéticas na atividade do proteossoma, em

megacariócitos humanos e de camundongos, inibem a formação de pro-plaquetas (um

estágio precursor das plaquetas). A inibição farmacológica foi revertida em megacariócitos

quando tratados com bortezomib, in vitro. Quando a inibição da atividade foi mantida, no

caso da deleção genética de Psmcl (uma subunidade essencial do proteossomo 26S),

megacariócitos não formaram plaquetas e os camundongos com tal deleção tiveram

trombocitopenia (redução do número de plaquetas no sangue) severa e morreram dias após

o nascimento. Esses dados sugerem que o proteossoma esteja envolvido na trombopoiese e

estágios finais da formação de plaquetas (Shi et al., 2014)

Identificamos a Peroxirredoxina 2, representada pelo spot 11 (figura 4.24), com área

7,31 mm2, volume 75,54 (intensidade de volume) e porcentagem de volume 0,4%, de

71

acordo com o Melanie, no grupo controle. Peroxirredoxinas são uma classe de tiol

peroxidases que degradam hidroperóxidos de água. São sensíveis à oxidação, e é suposto

que elas também atuam como sensores redox. O acúmulo de peroxirredoxina oxidadas pode

indicar rompimento da homeostase celular redox (Poynton & Hampton, 2014).

Finalmente, encontramos a Vinculina (Vcl), representada pelo spot 13, mais expressa

no grupo deficiente em FBN-1 (figura 4.25).

Figura 4.25 Spot 13: Vinculina, mais expressa no grupo deficiente em FBN-1 (direita),

menos expressa no grupo controle (esquerda).

A análise pelo Melanie indica que no gel do grupo controle a Vinculina tem área 5,03

mm2, volume 46,12 (intensidade de pixels) e porcentagem de volume 0,25%. Enquanto que

no gel do grupo deficiente em FBN-1, sua área corresponde a 10,84 mm2, volume 198,40

(intensidade de pixels) e porcentagem de volume de 1,6% (tabela 4.11). A figura 4.26 foi

retirada das análises do programa Melanie e ilustra a imagem 3D do spot da Vinculina nos

G1 G2

72

géis dos dois grupos estudados para termos uma ideia da proporção da quantidade da

proteína presente em cada grupo.

Tabela 4.11 Dados obtidos pelo programa Melanie sobre a proteína Vinculina, spot 13, em



Volume

Controle 5,03 46,12 0,25

mgΔ/+ 10,84 198,40 1,6

Figura 4.26 Imagem 3D da proteína Vinculina, mais expressa no grupo deficiente em

FBN-1 (direita), em comparação com o grupo controle (esquerda). Imagem obtida pelo

programa Melanie.

A função da Vinculina em plaquetas ainda é desconhecida (Mitsios et al., 2010).

Nachmias sugere que em plaquetas, assim como em células nucleadas, a Vinculina serve

como uma proteína de ligação entre a actina filamentosa do citoesqueleto e a matriz

extracelular, pelo menos em parte. Tal conexão entre o meio exterior e o interior parece

necessária para plaquetas, conhecida como capacidade de exercer tensão sobre as

73

superfícies. Em reposta a uma superfície apropriada, a Vinculina se liga nas terminações de

cada feixe de actina numa estreita relação de aderência com a membrana de cada plaqueta

(Nachmias & Golla, 1991) (Koteliansky et al.,1984).

Em células nucleadas, Vinculina atua como uma proteína reguladora da transmissão

da força contrátil e das funções mecânicas da célula. Tem a capacidade de perceber as

propriedades mecânicas do meio extracelular, estabelecendo uma conexão física entre meio

externo e o citoesqueleto, promovendo rigidez mecânica e transmissão da força contrátil.

Sendo considerada assim, uma proteína mecano-regulatória e mecano-acopladora. Interage

com Integrinas, através da Talina ou da Paxilina para receber estímulos da matriz extra

celular, assim como se conecta a Actomiosina e Actina do citoesqueleto (figura 4.27)

(Mierke, 2009) (Zemljic-harpf et al., 2010).

Figura 4.27 Desenho esquemático do complexo Vinculina-actina-citoesqueleto, associado

com Integrinas. Modificado do original (Mierke, 2009).

74

Mitsios e colaboradores (Mitsios et al., 2010) sugere que a Vinculina tenha funções

diferentes em células nucleadas e em plaquetas. Em seus estudos ele demonstra que Vcl

não é essencial para a formação de trombo em resposta à injúria na artéria carótida, nem

para polimerização e reorganização de actina, nem para retração do coágulo de fibrina, nem

para secreção de grânulos-α, nem desenvolve uma superfície pro-coagulante (Mitsios et al.,

2010).

Acreditamos que o excesso de Vinculina pode estar relacionado com a formação de

trombos menos estáveis e mais embolizáveis. Alta concentração de Vcl poderia não

permitir a organização precisa e exata do complexo intracelular para fixação de integrinas

(talina, paxilina) e a posterior resposta extracelular. Vinculina em excesso poderia

“sequestrar” as proteínas necessárias para o complexo, formando complexos incompletos e

menos eficientes.

A validação da proteína Vinculina por immunoblotting ainda está em andamento para

futura publicação dos resultados encontrados.

4.4 Análise Proteômica de Aorta

A técnica 2D-PAGE foi muito bem padronizada para plaquetas. Expandimos essa

mesma técnica para analisarmos o extrato proteico de artérias aorta de camundongos

selvagens (grupo controle) e camundongos deficientes em fibrilina-1. Aproveitamos

praticamente os mesmo parâmetros utilizados para plaquetas. Pequenos ajustes foram

necessários em relação à preparação da amostra e a corrida da primeira dimensão. (Pilop et

al., 2009) (Liao et al., 2008).

75

Decidimos avaliar o conteúdo proteico desse material em busca de possíveis proteínas

ausentes, com modificações pós-traducionais ou até mesmo com expressão diferenciada,

que poderiam estar influenciando na instabilidade de fixação do trombo na parede do vaso

em animais deficientes em FBN-1. Talvez o conteúdo da própria parede do vaso esteja

comprometido nesses animais com características da Síndrome de Marfan, e não somente o

conteúdo das plaquetas. Poderiam até se somar as diferenças do conteúdo plaquetário e da

parede do vaso, como um efeito sinérgico, contribuindo ambos para a instabilidade da

formação do trombo e o maior tempo de oclusão.

4.4.1. Grupo Controle

Foram realizados quatro géis do extrato proteico de aortas de camundongos selvagem

(n=4, Controle 1, 2, 3 e 4). Todos apresentaram porcentagem de semelhança superior a

85% (chegando a 90%) comparados com o gel referência do grupo (figura 4.28). Foi

encontrado um número de spots em torno de 130 (tabela 4.12). Dessa forma, fechamos o

grupo com um número bom de géis reprodutíveis e padronizados. As poucas diferenças

encontradas podem ser devido às pequenas variações da técnica, ou ainda fragmentos

proteicos, degradados durante o manuseio na preparação da amostra.

76

pI 3,0_____________________________________________________________10,0

Figura 4.28 Gel referência do proteoma da artéria aorta de camundongos selvagens, grupo

controle (Controle 1).

Tabela 4.12. Comparação dos géis do extrato proteico de aorta do grupo controle, “n=4”.

Num matches é o número de spots encontrados nos dois géis comparados. % matches é a

semelhança dos géis. Dados obtidos pelo Melanie.

Gel Ref x Gel 2

(código)

Num

matches

% matches




kD

250

150

100

75

50

37

25

20

15

77

4.4.2. Grupo Deficiente em Fibrilina-1

Foram realizados quatro géis do extrato proteico de aorta de camundongos deficientes

em fibrilina-1 (n=4, mgΔ/+ 1, mgΔ/+ 2, mgΔ/+ 3 e mgΔ/+ 4), todos reprodutíveis e

padronizados, com porcentagem de semelhança superior a 85%, quando comparados ao gel

referência do grupo (mgΔ/+ 1, figura 4.29) e número de spots encontrados foi em torno de

154 (tabela 4.13).

pI 3,0_____________________________________________________________10,0

Figura 4.29 Gel referência do proteoma da artéria aorta camundongos deficientes em

fibrilina-1 (mgΔ/+ 1).

kD

250

150

100

75

50

37

25

20

15

78

Tabela 4.13 Comparação dos géis do extrato proteico de aorta do deficiente em fibrilina-1,

“n=4”. Num matches é o número de spots encontrados nos dois géis comparados. A


Melanie.

Gel Ref x Gel 2

(código)

Num

matches

% matches

mgΔ/+ 1 x mgΔ/+ 2 156 86,67

mgΔ/+ 1 x mgΔ/+ 3 154 85,40

mgΔ/+ 1 x mgΔ/+ 4 150 85,00

4.5 Análise Proteômica Comparativa de Aorta

Como feito para plaquetas, dentro de cada grupo já padronizado e reprodutível,

escolhemos o melhor gel para ser o gel referência e assim compará-lo com os outros géis

referência a fim de encontrar spots com maior ou menor quantidade no proteoma das

aortas.

4.5.1 Grupo Controle x Grupo Deficiente em Fibrilina-1

A figura 4.30 ilustra a comparação proteômica do gel referência do grupo controle

com o gel referência do grupo deficiente em fibrilina-1. Os pontos verdes em cima dos

spots representam os pontos proteicos semelhantes, presentes nos dois géis comparados

pelo programa Melanie. Os pontos em vermelho representam spots encontrados em apenas

um dos géis e ausente no outro. A porcentagem de semelhança dessa comparação foi de

71,38%, compreendendo um total de 116 spots presentes aos pares (pontos verdes).

79

F ig ura 4 .2 7

Figura 4.30 Análise proteômica comparativa de aorta. Gel do grupo controle, à esquerda,

como o gel do grupo deficiente em FBN-1, à direita. Pontos verdes representam spots

semelhantes encontrados nos dois geis. Pontos vermelhos representam spots presentes em

apenas um dos géis.

Foi encontrado um perfil proteico significantemente diferente. Apesar da grande

quantidade de spots diferentes, representados pelos pontos vermelhos, alguns spots nos

chamaram mais atenção e foram selecionados para a identificação por espectrometria de

massas. Esses spots selecionados estão ilustrados nas figuras 4.31 e 4.32, pelas setas

numeradas.

80

pI 3,0______________________________________________________________10,0


controle. Setas numeradas indicam os spots significantemente diferentes e selecionados

para a espectrometria de massas.

kD

250

150

100

75

50

37

25

20

15

81

pI3,0_______________________________________________________________10,0


deficiente em fibrilina-1. Setas numeradas indicam os spots significantemente diferentes e

selecionados para a espectrometria de massas.

4.5.2. Spots Selecionados

Com base nas análises comparativas da sessão 4.5.1, ilustradas pelas figuras 4.31 e

4.32, selecionamos alguns spots para serem identificados por Espectrometria de Massas, em

colaboração com a Doutora Adriana Paes Leme, Centro de Biologia Molecular Estrutural-

LNLS, resumidos na tabela 4.15.

kD

250

150

100

75

50

37

25

20

15

82

Tabela 4.14 Proteínas encontradas nas análises proteômicas de aorta. Dados obtidos por

espectrometria de massas.

O spot 8 foi identificado como a proteína do choque térmico (“Heat shock cognate 71

kDa”) e a análise pelo Melanie mostra área de 3,64 mm2, volume 20,80 (intensidade de

pixels) e porcentagem de volume de 0,16% para o grupo controle; em contrapartida para o

grupo deficiente em FBN-1, área 10,78 mm2, volume 291,74 (intensidade de pixels) e

porcentagem de volume de 1,3% (figura 4.33).

O spot 9 foi identificado pela espectrometria de massa como a proteína Anexina

(figura 4.34), presente no grupo deficiente em fibrilina-1. A análise pelo Melanie indicou

uma área 8,09 mm2, volume 66,69 (intensidade de pixels) porcentagem de volume 0,31%.

No grupo controle, o programa não identificou um spot semelhante.

Spot

Proteína

Massa

Molecular

Teórica (kDa)

pI Teórico

Cobertura

da Sequência

(%)

Num

peptídeos

Score

Expressão

7 Albumina 70700 5.75 18% 18 (8) 418 FBN-1

8 Proteína choque térmico 71 68964 5.37 19% 20(16) 743 FBN-1

9 Anexina a1 38995 6.97 14% 8 (4) 127 FBN-1

15 Queratina I, citoesqueletal 10 57178 5.00 3% 3(2) 159 FBN-1

16 Triose-fosfato isomerase 18100 5.39 8% 1(1) 86 FBN-1

17 Miosina cadeia leve 4

(Fragmento) 21233 4.96 23% 5(2) 109

Wt

18 Proteína de tumor controlada

traducionalmente 19564 4.76 8% 1(1) 113

Wt

19 Miosina regulatóriacadeia

leve 2 19609 4.76 16% 3(2) 68

Wt

27 Hemoglobina β-1 15944 7.12 15% 2(2) 122 Wt

28 Queratina I, citoesqueletal 10 57178 5.00 2% 1(1) 75 FBN-1

83

Figura 4.33 Spot 7: Albumina Sérica. Spot 8: Proteína do choque térmico (do inglês Heat

shock cognate 71 kDa protein). Grupo controle à esquerda, grupo deficiente em FBN-1 à

direita.

Anexina é o nome comum de um grupo de proteínas celulares, descritas na década de

1980. Ligam-se a membrana fosfolipídicas e são dependentes de cálcio. Nos seres

humanos, as anexinas estão localizadas dentro da célula. No entanto, algumas anexinas

(anexina A1, anexina A2 e anexina A5) também podem ser encontradas fora do ambiente

celular, como por exemplo, no sangue (2).

A1 A2

http://pt.wikipedia.org/wiki/Prote%C3%ADna

http://pt.wikipedia.org/wiki/Fosfol%C3%ADpido

http://pt.wikipedia.org/wiki/C%C3%A9lula

84

Figura 4.34 Spot 9: Annexin A1. Spot 16: Triose-fosfato isomerase. Grupo controle à

esquerda, grupo deficiente em FBN-1 à direita.

O spot 16 (figura 4.34) foi identificado como a Triose-fosfato isomerase. Dados do

Melanie indicam uma área de 13,9 mm2, volume de 68,07 (intensidade de pixels) e

porcentagem de volume de 0,32% no grupo deficiente em FBN-1. No grupo controle não

foi encontrado um spot semelhante.

A triose-fosfato isomerase é uma enzima que cataliza a interconversão reversível

de diidroxiacetona fosfato e D-gliceraldeido-3-fosfato. Esta enzima desempenha um papel

importante na glicólise, sendo essencial para uma produção eficiente de energia. É

encontrada em todos os organismos em que se fez rastreio de enzimas,

B1 B2

C1 C2

http://pt.wikipedia.org/wiki/Enzima

http://pt.wikipedia.org/wiki/Diidroxiacetona_fosfato

http://pt.wikipedia.org/w/index.php?title=Gliceraldeido-3-fosfato&action=edit&redlink=1

http://pt.wikipedia.org/wiki/Glic%C3%B3lise

85

incluindo mamíferos, insetos, e também em fungos, plantas e bactérias (Marzzoco &

Torres, 2007).

O spot 17 (figura 4.35) foi identificado como Miosina cadeia leve. O programa

Melanie indicou área 12,29 mm2, volume 115,161 (intensidade de pixels) e porcentagem de

volume 0,8%. Essa proteína está presente no grupo controle e em menor quantidade no

grupo deficiente em FBN-1.

Figura 4.35 Spot 17: Miosina cadeia leve 4. Spot 18: Translationally-controlled tumor

protein. Spot 19: Miosina regulatória cadeia leve 2. Grupo controle à esquerda, grupo

deficiente em FBN-1 à direita.

A miosina é uma ATPase que se movimenta ao longo da actina responsável

pela contração muscular. Ela é uma enzima mecanoquímica, isto é, converte a energia

química em mecânica e por isso é também chamada de proteína motora. Nos movimentos

D1 D2

http://pt.wikipedia.org/wiki/Mam%C3%ADfero

http://pt.wikipedia.org/wiki/Insecto

http://pt.wikipedia.org/wiki/Fungo

http://pt.wikipedia.org/wiki/Planta

http://pt.wikipedia.org/wiki/Bact%C3%A9ria

http://pt.wikipedia.org/wiki/ATPase

http://pt.wikipedia.org/wiki/Actina

http://pt.wikipedia.org/wiki/Contra%C3%A7%C3%A3o_muscular

http://pt.wikipedia.org/wiki/Enzima

86

gerados por esses elementos, a miosina é o motor, os filamentos de actina são os trilhos e o

ATP, o combustível. Estudos de seqüência de DNA mostram mais de 10 classes

de genes para miosina. Entretanto, três são os mais conhecidos: miosina I, miosina II, e

miosina V. A estrutura molecular de todas mostra uma "cabeça", onde se encontra o sítio de

ligação com ATP e com a actina, sendo o local de geração de força; um "pescoço", que

regula a atividade da "cabeça" ligando-se à calmodulina outra proteína reguladora

semelhante; uma "cauda" que contém sítios de ligação que determina se a molécula vai se

ligar à membrana plasmática ou a outras caudas para formar um filamento grosso

(Marzzoco & Torres, 2007).

Miosina e tropomiosina promovem afinidade pela actina. Em células não musculares,

miosina II é regulada pela fosforilação da cadeia leve regulatória pela miosina quinase

cadeia leve e Rho quinase. Estudos comparando a regulação dependente de tropomiosina da

isoforma II de miosina de células musculares estriadas e lisas e as respectivas isoformas

teciduais de tropomiosina mostram que ambas influenciam na regulação dos filamentos de

actina (Barua et al., 2014).

O spot 19 foi identificado como a proteína regulatória de miosina cadeia leve (figura

4.35). As análises do Melanie mostram área 10,78 mm2, volume de 74,84 (intensidade de

pixels) e porcentagem de volume de 0,58%. As cadeias leves são suas menores subunidades

que se ligam próximo às cabeças das cadeias pesadas de miosina. As cadeias leves de

miosina possuem peso molecular de aproximadamente 20 kDa e geralmente há um par

essencial e um par regulador de cadeias leves associado a cada cadeia pesada. Muitas

cadeias leves de miosina que se ligam ao cálcio são consideradas proteínas semelhantes à

calmodulina.

http://pt.wikipedia.org/wiki/DNA

http://pt.wikipedia.org/wiki/Gene

http://pt.wikipedia.org/w/index.php?title=Miosina_I&action=edit&redlink=1

http://pt.wikipedia.org/w/index.php?title=Miosina_II&action=edit&redlink=1

http://pt.wikipedia.org/wiki/Calmodulina

http://www.lookfordiagnosis.com/mesh_info.php?term=cadeias+pesadas+de+miosina&lang=3

http://www.lookfordiagnosis.com/mesh_info.php?term=cadeias+leves+de+miosina&lang=3

http://www.lookfordiagnosis.com/mesh_info.php?term=cadeias+leves+de+miosina&lang=3

http://www.lookfordiagnosis.com/mesh_info.php?term=peso+molecular&lang=3

87

Ainda são necessárias mais análises e mais estudo para correlacionar essas proteínas

com os dados apresentados pelo nosso grupo, a fim de encontrar uma relação com o maior

tempo de oclusão dos trombos em camundongos deficientes em FBN-1.

A respeito dos spots 10, 11, 12, 13, 14, 20, 21, 22, 23, 24, 25 e 26 não foram

encontrados dados relevantes, podendo ser fragmentos proteicos degradados em

decorrência da preparação ou obtenção da amostra.

4.6 Análise Proteômica de Plaquetas Humanas

Extendemos as análises para plaquetas humanas em colaboração com a Prof. Dra.

Vera Lúcia Gil da Silva Lopes, da Faculdade de Ciências Médicas da Unicamp, para

obtenção de plaquetas de pacientes com Síndrome de Marfan.

Não há dados publicados sobre o assunto ainda, portanto nosso estudo pioneiro pode

ser de grande interesse a respeito de possíveis padrões e marcadores moleculares para a

doença, já que o diagnóstico ainda é feito de forma clínica. Poderemos esclarecer detalhes

fisiológicos e celulares que podem estar relacionados com os dados encontrados em

camundongos.

A comparação de plaquetas humanas ainda está em andamento. Como prévia, temos

na figura 4.36 o gel bidimensional de plaquetas de voluntários sem a Síndrome de Marfan,

enquanto que na figura 4.37 temos um gel do proteoma de plaquetas de um paciente com a

Síndrome.

Em nossas primeiras análises, o programa Melanie identificou 102 spots semelhantes

entre os dois grupos, e porcentagem de semelhança de 54,83%, bem abaixo do padrão

estabelecido para géis semelhantes (figura 4.38).

88

pI 4,0_____________________________________________________________7,0


voluntários sem a Síndrome de Marfan.

kD

250

150

100

75

50

37

25

20

15

89

pI 4,0______________________________________________________________7,0


pacientes com a Síndrome de Marfan.

kD

250

150

100

75

50

37

25

20

15

10

90

F Figura 4.38 Prévia da análise proteômica comparativa de plaquetas humanas. Voluntários

sem a Síndrome de Marfan à esquerda, pacientes com a Síndrome à direita.

Pretendemos dar continuidade aos estudos de plaquetas humanas nesse contexto,

assim como obter mais voluntários para confecção do maior número de géis possíveis, e

tentar encontrar semelhanças entre os pacientes com a Síndrome que possa se enquadrar

como um marcador para a doença e compará-los com o grupo controle (sem a síndrome).

Mesmo assim, nossas primeiras análises já revelam uma grande concentração de

proteínas presentes apenas no grupo controle (sem a síndrome) em pontos vermelho à

esquerda da figura 4.38. Mais géis e mais análises ainda são necessários.

91

5. Conclusão

A técnica de eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida foi padronizada e

reprodutível usando as amostras do extrato proteico de plaquetas e de aorta de

camundongos selvagens e deficientes em fibrilina-1, tratados e não tratados com Losartan.

O Losartan não interfere no proteoma de plaquetas, nem restabelece o perfil proteico

selvagem.

Encontramos diferenças significativas no proteoma do grupo controle e do deficiente

em FBN-1, como por exemplo: Endoplasmina, Fator de von Willebrand, Fator de

Coagulação X, Calpaína I, α-sinucleína, Proteossoma e Vinculina, esta última mais

expressa em camundongos deficientes em FBN-1. Todas de alguma forma poderiam ser

relacionadas com o maior tempo de formação de trombo.

Encontramos diferenças no perfil proteico de Aorta dos mesmo grupos, como por

exemplo a Proteína do choque térmico, anexina, miosina, miosina regulatória, dentre

outras.

Embora ainda em andamento, foram encontradas diferenças no proteoma de Pacientes

com Síndrome de Marfan em comparação com voluntários sem a síndrome.

92

6. Perspectivas

O estudo inédito do proteoma de plaquetas em camundongos modelo para a Síndrome de

Marfan revelou interessantes alvos moleculares, possivelmente envolvidos no maior tempo de

formação de trombo. Entretanto, embora sejam de fundamental importância, somente as

informações parciais sobre a função das proteínas não nos contextualizam em uma visão fisiológica

dinâmica dos processos celulares. Assim, o desenvolvimento de novos trabalhos que envolvam

análises mais abrangentes deve ser realizado. Assim como a validação dessas proteínas por

Immunoblotting, como o caso para a proteína Vinculina, em andamento.

Estudos mais detalhados correlacionando a função das proteínas encontradas assim

como suas interações são necessários para melhor esclarecimento sobre os sintomas

presentes em camundongos FBN-1.

Estudos do proteoma de aorta de camundongos deficientes em FBN-1 ainda estão em

andamento e pretendemos acrescentar a essas análises o tratamento com o Losartan. Essas

análises podem ser de grande importância para o entendimento dos sintomas apresentados

até o presente momento pelo nosso grupo.

As comparações de plaquetas humanas de pacientes Síndrome de Marfan ainda estão

em andamento e podem ser de grande importância para o esclarecimento dos sintomas

encontrados. Pretendemos estabelecer algum marcador ou padrão molecular que auxilie no

diagnóstico da doença, já que ainda é feito basicamente de forma clínica.

93

7. Referências

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Referências eletrônicas consultadas:

(1) (http://www.proteopedia.org/ wiki/index.php/Endoplasmin).

(2) http://www.nlm.nih.gov/mesh/

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8. Anexo I

avaliação da função da fibrilina-1 na trombogênese...

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