AVALIAÇÃO DA VIABILIDADE DE CÉLULAS DE GLIOMA DA LINHAGEM

T98G TRATADAS COM AS FRAÇÕES n-BUTANOL, CLOROFÓRMICA E

ACETATO DE ETILA DO EXTRATO HIDROALCOÓLICO DE Ocimum basilicum

IN VITRO.

AVALUATION OF THE VIABILITY OF T98G GLIOME CELLS TREATED WITH FRANCTIONS OF n-BUTANOL, CHLOROFORM AND ETHYL ACETATE FROM HYDROALCOHOLIC’S EXTRACT OF Ocimum basilicum IN VITRO.

Autores:

GUILHERME DA SILVA ALVES1, LUCIANA NOWACKI 2, WESLEY

MAURÍCIO DE SOUZA3, DANIELA FLORÊNCIO MALUF4 e PAULO

ROBERTO WORFEL 5.

1 Acadêmico do Curso Superior de Tecnologia em Bioprocessos e Biotecnologia da Universidade Tuiuti do

Paraná (Curitiba, PR).

2 Bióloga, Professora Mestre da Universidade Tuiuti do Paraná (Curitiba, PR).

3 Farmacêutico Bioquímico, Professor Doutor da Universidade Tuiuti do Paraná (Curitiba, PR).

4 Farmacêutica Bioquímica, Professora Mestre da Universidade Tuiuti do Paraná (Curitiba, PR).

5 Educador Físico, Professor Mestre da Universidade Tuiuti do Paraná (Curitiba, PR).

Endereço eletrônico para correspondência: Paulo Roberto Worfel, p.worfel@hotmail.com

Endereço: Rua Sydnei A. Rangel dos Santos, 238 – Santo Inácio – Curitiba - Paraná

CEP 82.010-330. Telefone: (55) 41- 9145-6781

RESUMO

O man jer i cão (Ocimum bas i l i cum) é uma p lan ta mu i to u t i l i zada na cu l iná r i a e é mui to u t i l i zada na medic ina t rad ic iona l i ran iana . O es tudo qu ímico des te gênero , t ão r i co em f l avo r i zantes , reve lou a p resença de vá r i as substânc ias químicas de impor tânc ia comerc ial . Um t ipo de cé lu la amp lamente u t i l i zada para es tudos de p ropr i edades dos f lavonó ides são as cé lu las de g l i oma. Neste exper imen to fo ram aval iados os e fe i tos ant i -p ro l i f e ra t i vos das f rações Ace tato de e t i la , n -butano l e C lo ro fó rm ica do ex t ra to h id roa l cóo l i co de Ocimum bas i l i cum em cé lu las de g l ioma , nas concen t rações de 3 µ g/ml , 5 µ g/ml , 7 µ g/m l , 10 µ g/ml , 15 µ g/m l , 20 µ g/m l , 30 µ g/m l , 40 µ g/ml , 50 µ g/ml , 60 µ g/m l , 70 µg/m l e 100 µ g/m l . Após um per íodo de 48 horas de t ra tamento , o número de cé lu las v i áve i s fo i dete rminado u t i l i zando-se o método de co lo ração do c r i s ta l v io l e ta . Houve redução s ign i f i cat i va no número de cé lu las v iáve i s para os t ra tamentos com as f rações Aceta to e C lo ro fó rmica , sendo os resu l t ados cons ide rados sa t i s fa tó r ios para a l i nhagem ce lu la r u t i l i zada no presente es tudo . A f ração n -bu tano l não apresentou redução es ta t i s t i camente s ign i f i ca t i va para a o número de cé lu las v i áve is . Sugere -se que mais es tudos se jam rea l i zados com as f rações Aceta to e Clo ro fórmica, não sendo necessár io o uso de demas iadas concent rações , uma vez que os resu l t ados ap resentados não sugerem uma re lação dose-dependente.

Pa lavras -chave: Med ic ina t rad i c iona l ; F i to te rap ia ; Flavonó ides.

ABSTRACT

Bas i l (Ocimum bas i l i cum) i s a p lant w ide l y used i n cu l ina r y and i t ’ s w ide ly used in I ran ian t rad i t i onal med ic ine . The chemica l s tudy o f t h is genre , so r i ch in f l avo r , revea led the presence o f var i ous chemica l s subs tances w i th comerc ia l impor tance . A ce l l t ype wide l y used to s tudy the f l avono ids p rope r t i es a re t he g l i oma ce l l s . In th is exper imen t we eva luated the ant i p ro l i f era t i ve e f fec t s o f f rac t ions ace tate , N-bu tano l and ch lo ro fo rm o f the hyd roa l coho l i c ex t rac t o f Oc imum bas i l i cum in g l i oma ce l l s , a t concent rat i ons o f 3 µg/ml , 5 µg/ml , 7 µg/ml , 10 µg/ml , 15 µg/ml , 20 µg/ml , 30 µg/ml , 40 µg/ml , 50 µg/ml , 60 µg/ml , 70 µg / ml and 100 µg/ml . A f te r 48 hours o f t reatment , the number o f v iab le ce l l s was de term ined us ing the method o f t he c rys ta l v i o l e t sta in ing. There were s ign i f i can t resu l ts fo r the t reatmen ts wi t h aceta te and ch loro fo rm f rac t ions , and the resu l t s were sa t i s fac tor y fo r the ce l l l i ne used i n t h is s tudy. N-bu tano l f rac t i on showed no s ta t i s t i ca l l y si gn i f i can t reduct i on fo r t he an t i -p ro l i f e ra t i ve act i v i t y. I t i s sugges ted tha t more s tud ies be conducted w i th the ace tate and ch lo ro fo rm f rac t ions, no t requ i r i ng the use o f too many concen t ra t ions , s i nce the i r resu l ts do not sugges t a dose -dependent .

Keywords: T rad i t iona l medic ine; Ph i to therapy; Flavono ids .

1

INTRODUÇÃO

O uso de p lan tas med ic ina is na te rapêu t i ca é mu i to ant i go , e es tá i n t imamen te re lac ionado com a próp r i a evo lução do homem. Para u t i l i za rem as p lan tas como medicamentos , os homens ant i gos va l i am-se de suas p róp r i as exper iênc ias empí r i cas de ace r to e e rro e da observação do uso de p lantas pe los an ima is (OLIVEIRA, 2004) . Den tre os d i versos compos tos encont rados em p lantas , ex is tem os que são d i re tamente essencia is pa ra a f i s io l ogia das mesmas, e os metabó l i t os secundár ios que são ass im denominados por não es ta rem l i gados d i re tamente nos p rocessos f i s io lógi cos norma is , sendo encon t rados em determ inados grupos de p lantas , e podem se r de f i n i dos como compos tos qu ímicos , de es t ru tu ra comp lex a, b io logi camente a t i vos , e encon t rados em ba ixas concent rações , empregados pe las p lantas na de fesa con t ra agen tes bió t i cos e ab ió t i cos agresso res (NETO & CAETANO, 2005) .

Em busca destes compos tos a t i vos pa ra uso em de terminadas doenças, des taca -se o gênero Oc imum, cu jas espéc ies são l a rgamente usadas na medic ina t rad i c ional i ran iana . O estudo qu ím ico des te gênero , t ão r i co em f l avo r izantes , reve lou a presença de vár i as substânc ias qu ímicas de impo r tânc ia comerc ia l (VENÂNCIO, 2006) .

Os f l avonó ides j á demons t ra ram d ive rsas at i v i dades em vá r ias a l te rações ce lu la res , inc lus ive de vá r ios t i pos de câncer . Um t ipo de cé lu la amp lamente u t i l i zada para es tudos de p ropr i edades dos f lavonó ides são as cé lu las de g l ioma. Segundo SILVA et a l (2009 ) , c i tando CHRISTIASEN, LOPEZ & PHILLIPS (2004) , os g l iomas são tumores p r imár ios fo rmados a pa r t i r de tec ido de sus ten tação do cérebro e f requen temente são l oca l i zados nos hemis fé r ios cerebra i s , mas i gua lmente podem te r in í c io no t ronco encefá l i co .

Se gundo OL IVEIRA (2004) , c i tando SOLER (2000 ) , as pesqu isas c ien t í f i cas envo l vendo es tudo de p lantas in i c ia ram na tenta t iva de comprova r a iden t idade botân i ca, compos i ção qu ímica e ação fa rmaco lóg i ca das d rogas vege ta is , agrupando aque las de e fe i t o semelhante . Segundo a o rgan i zação mundia l de saúde, 85% das pessoas do mundo u t i l i zam p lan tas medic ina is pa ra t ra ta r da saúde, 80% das pessoas dos países em desenvo lv imento dependem da medic ina t rad i c i onal e /ou comp lementar para suas necess idades bás i cas de saúde, e que ce rca de 85% da medic ina t rad i c iona l envo l ve o uso de ex t ra tos de p lantas .

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O ob je t i vo des te t raba lho fo i ava l ia r v i ab i l i dade de cé lu las de g l i oma t ra tadas com as f rações n -Butano l , C lo ro fó rmica e Acetato de Et i l a do ex t ra to h id roa l cóo l i co de Ocimum bas i l i cum.

MATERIAL E MÉTODOS

O mater i a l bo tân i co adqu i r ido fo i seco em es tu fa a 40ºC e t r i tu rado a pó , sendo p rev iamente ex t ra ído o ó leo essenc ia l po r h id rodest i l ação em apare lho de C levenger . Em segu ida a ma ter i a l fo i deixado em maceração po r 48 ho ras em so lução h id roa l cóo l i ca . O ex t ra to ob t ido fo i f i l t rado e en tão concen t rado em ro taevaporador (40ºC) a té a secu ra. Após a maceração a d roga fo i esgo tada com uma nova maceração com um so l vente a l tamente po lar (me tano l ) e concent rado em ro taevaporado r (40ºC) a té a secura . As f rações fo ram separadas por a f i n idade de po lar idade em t rês d i fe rentes so lven tes : C lo ro fó rmio , n -Bu tano l e Aceta to de et i l a . As f rações foram l io f i l i zadas no l aborató r i o de B io logia Ce lu la r da Un ive rs idade Federa l do Pa raná .

Nes te expe r imen to fo ram u t i l i zadas cé lu las de g l i oma da l i nhagem T98G. As cé lu las fo ram cu l t i vadas em p lacas de 96 poços , u t i l i zando -se o me io de cu l t u ra DMEM a l t a g lucose com ad i ção de 10% (v /v ) de so ro fe ta l bov ino . Após o per íodo de 24 ho ras para ade rênc ia das cé lu las ao fundo do poço , o meio de cu l t u ra fo i remov ido , e fo ram ad i c ionados aos poços o me io de cu l tu ra e ex t ra to de Oc imum bas i l i cum nas concen t rações de 3 µ g/m l , 5 µ g/ml , 7 µ g/ml , 10 µ g/m l , 15 µ g/m l , 20 µ g/ml , 30 µ g/m l , 40 µ g/m l , 50 µ g/m l , 60 µ g/ml , 70 µ g/m l e 100 µ g/ml .

Após o pe r íodo de i ncubação de 48 horas, as p lacas fo ram re t i radas da es tu fa e rea l i zou -se a ava l i ação da v iab i l i dade ce lu la r u t i l i zando -se o método do c r i s ta l v io le ta (N -hex amet i lpa rarosan i l i na) , con fo rme propos to po r G ILLIES et a l . ( 1986) . O método cons is te na remoção das cé lu las não v iáve i s , po is as cé lu las v i áve i s encon t ram-se ade r idas ao fundo do poço . Após a remoção das cé lu las não v iáve is , as cé lu las ader idas ao fundo do poço foram f i xadas com o uso de metano l po r 10 minutos em temperatu ra amb ien te . Fo ram ad i c ionados nos poços 50 µ L da so lução co rante c r i s ta l v i l e ta (N -hex amet i lpa rarosan i l i na) p reparado a 0 ,2% em etano l 2%. Após 3 m inutos de os poços fo ram exaus t i vamen te l avados com Tampão Fos fa to -Sa l ino (PBS) e o co rante d isso l v ido com 200 µ L de so lução de c i t ra to de sód io (0 ,05mol /L em e tano l 50%) duran te 10 minu tos , no p róp r i o poço da p laca . A absorbânc ia fo i dete rm inada em le i to r de mic rop lacas da B IOT EK® EL800 u t i l i zando o compr imen to de onda 550 nm.

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Os resu l t ados ob t idos fo ram es tat i s t i camen te anal i sados u t i l i zando-se o método ANOVA, segu ido do tes te de Tukey (p<0 ,5) u t i l i zando o p rograma GraphPad Pr ism.

RESULTADOS

O t ra tamento com a f ração ace tato de e t i l a ap resen tou d im inu i ção s ign i f i ca t i va quan to ao número de cé lu las v i áve is nas concen t rações de 3µ g/mL (~54 ,86%), 5µ g/mL (~47 ,7%) , 7µ g/mL ( ~45 ,49%), 10µ g/mL (~49 ,74%), 15µ g/mL (~41 ,74%), 20µ g/mL (~42 ,59%) e 30µ g/mL (~42 ,59%) (grá f i co 1 ) . Es ta d im inu i ção pode es ta r re lac ionada com a apop tose , um fenômeno na tu ra l de e l iminação das cé lu las ano rmais , como as cé lu las con tendo mutações ( tumores) , e danos i r reparáve is ao DNA. Nas concen t rações ac ima de 40µ g/mL fo i ve r i f i cado um aparente aumento no número de cé lu las v i áve is .

G r á f i co 1 – a v a l i a ç ão d o e f e i t o d a f r a ç ã o A c e t a t o d e e t i l a d o e x t r a t o h i d r o a l c ó o l i c o d e O c i m u m b a s i l i c u m s o b r e a p r o l i f e r a ç ão d e c é l u l a s d e g l i o m a . A f r a ç ão a p r es e n t o u r e s u l t a d o es t a t i s t i c am e n t e s i g n i f i c a t i vo p a r a a s con c e n t r a ç õ e s e n t r e 3 µ g / m L e 3 0 µ g / m L u t i l i z an d o -s e o m é t o d o d e c o l o r aç ã o p r o p o s to p o r G i l l i e s e t a l ( 1 9 8 6 ) . O s r e s u l t a d o s o b t i d o s p o r e s p e c t r o f o t o m e t r i a e m 5 5 0 n m f o r a m s u b m e t i d o s à a n á l i s e e s t a t í s t i c a A N O V A , s e g u i d o d o t e s t e d e T u k e y . O e xpe r i m e n t o f o i r e a l i z ad o u m a ve z e m s e x t u p l i c a t a d e p o ç o s . ( * * p < 0 , 1 e * * * p < 0 , 0 1 ) .

4

Para o t ra tamento com a f ração n -butano l aparen temen te não houve ram reduções es ta t i s t i camen te s ign i f i ca t i vas no número de cé lu las v i áve i s , sendo que nas concent rações 20 µ g/mL, 30 µg/mL, 40 µ g/mL, 50 µ g/mL, 60 µ g/mL, 70 µ g/mL, 80 µ g/mL e 100µ g/mL h ouve um aparente aumento no número de cé lu las v i áve is , con fo rme demons t rado no grá f i co 2 . Obse rva-se o mesmo padrão de aumento ob t i do na fração ace tato , po rém, com o aumento de absorbânc ia a par t i r da concen t ração de 20 µ g/mL.

G r á f i co 2 . A v a l i a ç ã o d o e f e i t o d a f r a ç ão n - b u t a n o l d o e x t r a t o h i d r o a l c ó o l i co d e O c i m u m b a s i l i cu m s o b r e a p ro l i f e r aç ã o d e c é l u l a s d e g l i o m a . A f r a ç ão n - b u t a n o l n ã o a p r e s en t o u r e d u ç ão n o n ú m e r o d e cé l u l as v i á v e i s u t il i z a n d o -s e o m é t o d o d e c o l o r a ç ã o p r o p o s t o p o r G i l l i e s e t A l ( 1 9 8 6 ) . O s r es u l t ad o s o bt i d o s p o r e s p e c t r o f o t o m e t r i a e m 5 5 0 n m f o r am s u b m e t i d o s à a n á l i s e es t a t í s t i c a A N O V A , s e g u i d o d o t e s t e d e T u ke y. O e x p e r i me n t o f o i r e a l i z a d o u m a s ó v e z , e m s e x t u p l i c at a d e p o ç o s . ( * p < 0 , 5 , * *p < 0 , 1 e * * * p < 0 , 0 1 )

Para o t ra tamento com a f ração c loro fórm ica houve uma redução es ta t is t i camente s ign i f i cat i va para as concen t rações 10 µ g/mL (~35 ,8%) , 15 µ g/mL (~59 ,19%), 20 µ g/mL (~56 ,56%) , 30 µ g/mL ( ~63 ,25%), 40 µ g/mL (~60 ,86%), 50 µ g/mL ( ~57 ,76%) , 60 µ g/mL (59 ,19%), 70 µ g/mL (~41 ,29%) e 100 µ g/mL (~37 ,23%) , po rém, não houve di fe rença s ign i t i va en t re e las , demonst rando ass im não have r re lação dose-dependente . Grá f .3 .

5

G r á f i co 3 . A v a l i aç ã o d o e f e i t o d a f r a ç ão c l o r o f ó r m ic a d o e x t r a t o h i d r o a l c ó o l i c o d e O c i m u m b a s i l i c u m s o b r e a p r o l i f e r aç ã o d e c é l u l a s d e g l i o m a . E s t u d o e m f u n çã o d a c o n c en t r a ç ã o . A f r a ç ão c l o r o f ó r m i c a a p r e s en t o u r e d uçã o s i g n i f i ca t i v a p a r a o n ú m e r o d e c é l u l a s v i á v e i s n a s co n c e n t r a ç õ e s a p a r t i r d e 1 0 µ g / m L e 1 0 0 µ g / m L , u t i l i z a n d o -s e o m é t o d o d e co l o r a ç ão p r o p o s t o p o r G i l l i e s e t a l ( 1 9 8 6 ) . O s r e s u l t a d o s o b t i d o s p o r e s p e c t ro f o t o m e t r i a em 5 5 0 n m fo r a m s u b me t i d o s à a n á li s e es t a t í s t i c a A N O V A , s e g u i d o d o t e s t e d e T u k e y. O e x p e r i m e n t o f o i r e a l i z a d o u m a v e z , co m s e x t u p l i a c a t a d e p o ç o s . ( * * * p < 0 , 0 1 )

DISCUSSÃO

D ive rsos compos tos são encon t rados no ex t ra to de Ocimum bas i l i cum L . e den t re os compos tos ma jo r i t á r ios podemos c i t a r: α -p ineno , β -p ineno , t rans -sab ineno , 1 ,8 c i neo l , óx ido l ina lo l , l i na lo l , cân fo ra , l -borneo l , 4 -t e rp ineo l , es t rago l , ace tato de bo rn i l a , α - copaeno, β -e lemeno , α -be rgamoteno, α -humu leno, cad ineno, ge rmacreno , γ -e lemeno, δ -gua ieno , γ -cad ineno , espa tu leno l , v i r id i f l o ro l , δ -cad ino l , me t i l chav i co l , c inamato de met i l a , f l avonó ides , sapon inas, es te ró ides l i v res , agl i conas es teró ides e t r i t erpenó ides , depsídeos e deps idonas (MAZUTTI e t a l. , 2006 ; MACHADO e t a l. , 2011 ; SOUSA, 2010) . Dent re os compos tos fenó l i cos p resentes no Ocimum ba l i cum L . pode -se c i t a r compos tos como o ác ido rosmar ín i co , ác ido l i tospé rmico B , ác ido vaní l i co , ác ido p -cumár i co , ác ido h id rox ibenzó i co , ác ido s i r íngi co , ác ido fe rú l i co , ác ido p ro toca tecu i co , ác ido ca fe ico e ác ido gen t ís t i co ( JAVANMARDI et a l. , 2002) . A lguns f l avonó ides são par t i cu la rmente benéf i cos , ag indo como an t i ox idan tes e dando p ro teção con t ra doenças card iovascu la res , certas fo rmas de cânce r ,

6

e acred i t a -se , degeneração dev ido à i dade dos componen tes ce lu la res (DE WICK, 2002 ) .

SARTORI (2005) , c i t ando NIERO (2000 ) , são conhecidos cerca de 4 m i l f l avonó ides na tura is e em ge ra l são encon t rados nas f rações ma is po la res , como ace tato de et i l a (ag l i conas ) e butanól i ca ( f lavonó ides g l i cos i l ados) . A lguns compos tos apo lares , como a luteo l ina , são ex t ra ídos com c lo ro fó rm io ou d i c lo rometano

ROCHA et a l. (2005) , es tudando o e fe i to do t ra tamen to com i so f l avona em tumor só l ido de Ehr l i ch , cons ta tou que as i so f l avonas são capazes de in te r fe r i r no c i c l o de d iv i são ce lu la r , e a capac idade i n ib i tó r i a do c resc imento tumora l po r sua p ropr iedade ant im i tót i ca . O peso e as d imensões tumora is não se a l t e ra ram, po rém, os t ipos ce lu la res fo ram encon t rados em p roporções d i fe ren tes , ou se ja , houve maio r número de cé lu las em mi tose encon t radas no grupo cont ro le do que no grupo t ra tado , fa to que se deve, p rovave lmente , ao b loqueio da progressão do c i c lo ce lu la r e , poss i ve lmen te , assoc iado à a t i vação do gene p21w a f l o qua l , j un tamente com a ina t i vação do gene bc l -2 , induz à apop tose . ZHOU et a l. ( 1998) u t i l i zando i so f l avonas de so ja i nduz iu uma queb ra do c i c lo ce lu la r na fase G2-M em todas nas l i nhagens ce lu la res de câncer de bex iga humanas u t i l i zadas ( I I I -1376 , UM-UC-3, RT-4J82 e TCCSIP) ava l iados po r c i tomet r i a de f l uxo . A lém d isso , a lgumas l i nhas de cânce r de bex iga apresen tam f ragmentação de DNA, cons i s ten te com a apop tose . A p resença de ag l i conas ( Iso f lavonas) na f ração Ace tato de et il a , é uma das possíve is responsáve is pe lo e fe i t o c i t o tóx ico desta , f ren te as cé lu las de g l ioma u t i l i zadas nes te es tudo.

Uma das poss íve i s causas do aumento da absorbânc ia no tes te com a f ração ace tato de et i l a (nas concen t rações ac ima de 40µ g/mL) é o fa to de que a f ração aceta to t em sua cor levemen te esverdeada ( f ig .1 ) , t endo ass im o seu compr imento de onda na fa ixa de l e i t u ra des te expe r imento (550nm) (gra f .4 e f ig .2 ) , sendo que a f ração p resen te , i n teragindo com a membrana p lasmát i ca, pode ter s i do e lu ída jun tamen te com o co rante C r i s ta l V io le ta , e , somando-se as absorbânc ias , ap resen tado va lo res ac ima dos rea i s . É suge r i do que se ja u t i l i zado ou t ro método de de term inação de v iab i l i dade ce lu la r para con f i rmação destes dados , como por exemplo o MTT (3 - (4 ,5 -d imet i l t i azo l -2 i l ) -2 ,5 -d i fen i l b rometo de te t razo l ina ) .

7

F i gu r a 1 . F r a çõ es n -b u t an o l , C l o r o f ó r m i c a e A c e t a t o, r e s p e c t i v a m en t e , n a d i l u i çã o d e 1 0 0 µ g / m L , u t i l i z a n d o - s e c o m o s o l v en t e s o l u ç ã o s al i n a co m 5 % d e e t a n o l .

F o n t e : A u t o r , 2 0 1 2 .

Ab

sorb

ân

cia

Comprimento de onda em nanometros (nm)

0

0,002

0,004

0,006

0,008

0,01

0,012

0,014

0,016

0,018

0,02

400 450 500 550 600 650 700

G r á f i co 4 . V a r r e d u r a d a a b s o r b â n c i a d a f r aç ã o a c e t at o n a c o n c e n t r a ç ã o d e 1 0 0 µ g / m L . N o t a - s e a d i m i n u i ç ão d a ab s o r ç ã o c o n f o r m e o c o m p r i men t o d e o n d a s e ap r o x i m a d o c o m p r i m en t o d e o n d a d e 6 0 0 n m . O c o m p r i m e n t o d e o n d a d a c o r v e rd e l o c a l i za - s e n a f a i xa e n t r e 5 1 0 e 5 7 0 n m . F i g . 2 .

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F i gu r a 2 . Es q u e m a d e c o r e s d a l u z v i s í v e l e s e u s r es p e c t i vo s co m p r i m e n t o s d e o n d a . F o n t e : e n c i c l o p é d i a B r i t â n i c a , 2 0 0 6 .

Es tudos rea l i zados por DAS et a l. , ( 2009) sugerem que os f l avonó ides ap igen ina e ( - ) -ep iga loca tequ ina i nduzem a apoptose em cé lu las de g l i ob las toma de l inhagem T98G and U87MG por um mecan ismo em que é ex ig ido o aumento dos n í ve i s in t race lu la res de ROS (Espéc ies rea t i vas de Ox igên io ) . Resu l t ados pos i t i vos fo ram ob t idos para a mor te po r apoptose com a a t i vação das caspase-8 nas cé lu las de g l i ob las toma após o t ra tamento com ep iga locatequ ina, e um ensa io co lo r imét r i co mos t rou um aumento s ign i f i ca t i vo de caspases a t i vas nas cé lu las t ra tadas com ep iga locatequ ina e EGCC. Em ou t ro es tudo conduzido po r DAS et a l. , ( 2005) fo ram induz idos à apop tose de cé lu las de g l iob las toma ma l i gno humano (U87MG) com a expos i ção a ap igen ina (APG, um f l avono íde ) , ( - ) -ep iga loca tequ ina (ECG, um po l i f eno l ) , ( - ) -ep iga locatequ ina-3 -ga la to (EGCG, um po l i f eno l ) e gen is te ína (um iso f l avonó ide) . O es tudo dose -resposta ind i caram uma d iminu i ção da v iab i l i dade celu la r com um aumento na dose de APG, EGC, EGCG e GST.

KUSUHARA e t a l (2012 ) , rea l i zou um es tudo no qua l camundongos fo ram mant i dos em uma câmara com o amb iente per fumado com α -p ineno ( f i g .3 ) e out ro grupo fo i man t ido em uma câmara com a tmos fera no rma l , du rante qua t ro semanas, após es te per íodo os an ima is receberam um implan te de cé lu las de me lanoma de l inhagem B16 F10 no f l anco e fo ram devo lv i dos pa ra as respec t i vas câmaras . Os an ima is que pe rmaneceram no amb ien te per fumado com α -p ineno t i ve ram uma redução de 40% no vo lume méd io dos me lanomas em re lação aos an ima is eu permanece ram em a tmos fera no rmal . DE MARTINO e t a l (2011 ) , mencionando um es tudo de GU et a l ( 2010) , demos t ra ram que o l i nano l , uma pequena molécu la

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monoterpena na tu ra l , i n i be o c resc imen to de cé lu las de l eucemia wt p53 , poupando as cé lu las hematopo ié t i cas no rmais .

F i gu r a 3 . M o l éc u l a d e α - p i n e n o . ( f o n t e : S O U Z A e t a l, 20 1 0 )

O β -e lemeno , in ib iu a expressão da p ro te ína VE GF (Vascu la r Endothe l i a l Growth Fac to r ) em cé lu las de me lanoma B16F10 i n v i t ro . É conhec ido que a p ro te ína VEG F desempenha um papel fu l c ra l na angiogenese, t umores e metástases . Seu mecan ismo reve lou que a VEGF pode regu la r a p ro l i f e ração ce lu la r , m igração de célu las , a sobrev i vênc ia ce lu la r , a invasão ce lu la r e ass im, a t ravés do recep to r da p ro te ína VEGF e a a t i vação de uma sér i e de respos tas in t race lu la res. Em um mode lo i n v i vo pa ra o t es te de i n i b i ção da ang ionegese , ob teve -se resu l t ados pos i t i vos pa ra ra tos com me lanoma induz ido pe la cé lu la de l i nhagem B16F10 , a l tamente metastá t i ca , havendo redução s ign i f i ca t i va para o tamanho do tumor em re lação ao grupo con t ro le após 21 d ias de t ra tamento com β -e lemeno (CHEN et a l. , 2010) .

DASGUPTA e t a l. ( 2004) obt i ve resu l tados pos i t i vos para o uso de fo lhas de man je r i cão com po tenc ia l qu im iop ro te t i vo , em v i r tude de sua e f i các ia na indução de enz imas de d rogas de des in tox i cação , ta is como a g lu ta t i ona-S- t rans fe rase (GST) e DT-d ia fo rase (DTD). COUTINHO e t a l , rea l i za ram um estudo para a ava l i a r a i n f luênc ia de po l imor f i smos da GST na suscept i b i l i dade para o desenvo l v imen to de g l i oma p r imár io . As d is t r ibu i ções de genót i pos de f requênc ia de GSTM1, GSTT1, GSTP1 e GSTM3, nos casos e con t ro les , não mos t ra ram d i fe renças es tat i s t i camente s ign i f i ca t i vas , suge r i ndo que os po l imo r f i smos tes tados não in f l uenc iam o r i sco de g l i oma pr imár io . Em ou t ro es tudo, rea l i zado por WRENSCH (2003) u t i l i zando os po l imor f i smos GST T1, GSTM1 e GST PA114V e GSTP105V, não apresen taram e fe i tos g loba i s p r i nc ipais des tas var i an tes de GST com a e t io logia do g l i oma, po rém, segundo o au to r , es tes genes podem ser encon t rados a ser impor tan tes em con jun to com adequadas expos i ções ambienta i s .

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Uma das poss íve is causas pa ra a ausênc ia do e fe i to ant ip ro l i fe rat i vo na f ração N-bu tano l é o fa to de que ba ixas concen t rações de f l avono ides são encon t rados nes ta Fração . Um es tudo rea l i zado po r SOUZA e t a l . (2011) , u t i l i zando raí zes de Ure ra bacc i f e ra, mos t ra ram que a concen t ração de f lanovó ides é quat ro vezes ma io r na f ração c loro fó rm ica , em re lação à f ração ace ta to de e t i l a , e o i t o vezes em ra lação à f ração n -bu tano l .

CONCLUSÃO

Com base nos resu l t ados ob t idos nes te es tudo , é poss íve l conc lu i r que há a t i v idade em re lação ao número de cé lu las v iáve is pa ra as f rações C lo ro fórm ica e Acetato de e t i l a pa ra as cé lu las de g l i oma u t i l i zadas, sem a re lação de dose-dependênc ia. São necessár ios es tudos ma is p ro fundados pa ra a comprovação dos resu l t ados , não havendo a necess idade do uso de tan tas concent rações , e com a u t i l i zação de ou t ro método de de terminação de v iab i l i dade ce lu la r , t a l como o MTT.

REFERÊNCIAS

BROCH, Maria Caroline Jacques. Vias de Sinalização de Celular Ativadas por Receptores Purinérgicos em Astrócitos Normais e Gliomas. Porto Alegre: UFRGS, 2004. 126p. Tese (Doutorado) – Programa de pós-graduação em ciências Biológicas – Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, 2004.

COUTINHO, P.; SANDIM, V.; OLIVEIRA, J.A.; ALVES, G.; HATAGIMA, A. Lack of assosciaton between glutathione s-transferase plymorphisms and primary glioma in a case-control study in Rio de Janeiro. Genetics and Molecular Research. Vol. 9, No.1, 2010. p. 539-544.

CHEN, Wenxing; LU, Yin; WU, Jiaming; GAO, Ming; WANG, Aiyun; XU, Bo. Beta-elemene Inhibits Melanoma Growth and Metástasis via Supressing Endothelial Growth Factor-mediated Angiogenesis. Cancer Chemoterapy Pharmacology. Vol. 67, No.4, 2011. p. 799-808.

DAS, Arabinda; BANIK, Naren L.; RAY, Swapan K. Flavonoids Actived Caspases for Apoptoses in Human Glioblastoma T98G and U87MG Cells but not im Human Normal Astrocytes. Cancer, Vol.116, No.1, Nov, 2009. p. 164-176.

DAS, Arabinda; KARMAKAR, Surajit; STUART, Robert K.; PATEL, Sunil J.;BANIK, Naren L.; RAY, Swapan K. Plant derived Flavonoids Induced Proteolytic Activities of Calpain and Caspase-3 for Apoptosis in Human Malignant Glioblastoma U87MG cells. American Association for Cancer Research, Vol 46, 2005.

11

DASGUPTA, T.; RAO, A. R.; YADAVA, P. K. Chemomodulatory efficacy of Basil leaf on drug metabolizing and antioxidante enzymes, and on carcinogen-induced skin and forestomach papillomagenesis. International Journal of Phytotherapy & Phytopharmacology. Fev, 2004.

DE MARTINO, Laura; D’ARENA, Giovanni; MINERVINI, Maria Marta; DEAGLIO, Silvia; SINISI, Nicola Pio; CASCAVILLA, Nicola, DE FEO, Vincenzo. Active Caspase-3 detection to Evaluate Apoptosis Induced by Verbena officinalis essential oil and citral in chronic limphocytic Leukaemia Cells. Revista Brasileira de Farmacognosia, Vol.21, No. 5, Set/Out, 2011. p. 869-873.

DEWICK, Paul M. Medicinal Natural Product – A biosynthetic Approach. 2ª ed. New York: John Wiley, 2002. 515p.

GAJULA, D.; VERGHESE, M.; BOATENG, J.; SHACKELFORD, L. MENTREDDY.; SIMS, C.; ASIAMAH, D.; WALKER, L. T. Basil (Ocimum basilicum) reduces Azoxymethane Induced Colon Tumors in Fisher 344 Male Rats. Research Journal of Phytochemistry, Vol.4, No.3, 2010. p.136-145.

GILLIES, Robert J. ; DIDIER, N.; DENTON, M. Determination of cell number in monolayer cultures. Analytical Biochemistry, Fort Collins, Colorado University State n.159, p.109-113. 1986.

JAVANMARDI, Jamal; KHALIGHI, A; KASHI A.; BAIS, H. P.; VIVANCO, J. M. Chemical Characterization of Basil (Ocimum basilicum L.) Found in Local Accessions and Used in Traditional Medicines in Iran . Journal of Agricultural and Food Chemistry, Vol. 50, nº21, 2002. p.5878-5883.

KUSUHARA, Masatoshi; URAKAMI, Kenichi; MASUDA, Yoko; ZANGIACOMI, Vincent; ISHII, Hidee; TAI, Sachiko; MARUYMA, Koji; YAMAGUCHI, Ken. Fragrant Environment with α-pinene Decreases Tumor Growth in Mice. Biomedical Research, Vol.33, No. 1, 2012. p. 57-61.

MACHADO, Flávia Maria Vasques Farinazzi; BARBALHO, Sandra Maria; SILVA, Tiago Henrique Pereira; RODRIGUES, Jacqueline dos Santos; GUIGUER, Elen Landgraf; BUENO, Patrícia Concotto dos Santos, SOUZA, Maricelma da Silva Soares; DIAS, Lorena Scalioni Borges; WIRTTIJORGE, Michelle Thaís; PERERA, Deybson Gomes; NAVARRO, Larissa Chavez; SILVEIRA, Eliane Pascoal; ARAÚJO, Adriano Cressoni. Efeitos do uso de Manjericão (Ocimum basilicum L.) no Perfil Bioquímico de Ratos Wistar. Journal of the Health Sciences Institute, Vol. 29, No.3, 2011. p.191-195.

12

MARTINS, Ernani Ronie. Morfologia interna e externa, caracterização isozimática e do óleo essencial de Ocimum selloi Benth. Viçosa: UFV, 1996. 97p. Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, MG. 1996.

MAZUTTI, Marcio; BELEDELLI, Bernardo; MOSSI, Altemir José; CANSIAN, Rogério Luís; DARIVA, Cláudio; OLIVEIRA, Vladimir. Caracterização Química de Extratos de Ocimum basilicum L. Obtidos Através de Extração com CO2 A Altas Pressões. Química Nova, Vol.29, No. 6, 2006. p. 1198-1202.

NETO, Pedro Accioly de Sá Peixoto; CAETANO, Luiz Carlos. Plantas medicinais: do popular ao científico. 1ª ed. Maceió: EDUFAL, 2005. 90p.

OLIVEIRA, Renata Barbosa.; ALVES, Ricardo José. Agentes Antineoplasicos Biorredutiveis: Uma nova alternativa para o tratamento de tumores sólidos. Química Nova, Vol.25, No.6, 2002. p.976-984.

OLIVEIRA, M.R.J.; SIMÕES, M.J.S.; SASSI, CRR. Fitoterapia no Sistema de Saúde Pública (SUS) no Estado de São Paulo, Brasil. Botucatu. Revista Brasileira de Publicações Médicas, V.8, No.2, 2006. p.39-41.

ROCHA, Michelle Corrêa; OLIVEIRA, João Alexandre Valentim; CONSTANTINO, Dulce Helena Jardim. Efeito do Tratamento com Isoflavona no Crescimento de Tumor Sólido de Ehrlich . Bauru, Salusvita, V.24, No.3. 2005. p.393-401.

SILVA, Rochele Ferronato Correa; DERTELMANN, Cibila Vieira; FRISON, Thirzá Baptista; MATTANA, Marcelo. Aspectos cognitivos do gliomas de baixo grau: Estudo de caso. Psico, Porto Alegre, PUCRS, v. 40, n.1, p.88-93, Jan/Mar. 2009.

SOUSA, Manacés Cunha. Estudos Químicos e Avaliação Antioxidante, Bactericida e Larvicida do Óleo Essencial do Ocimum basilicum L .João Pessoa: UFPB, 2010. 138p. Tese (Doutorado) Universidade Federal da Paraíba, João Pessoa, 2010.

SOUZA, Letiele Bruck; GINDRI, Amanda Leitão; PIANA, Mariana; FROHLICH, Janaina Kieling; BELKE, Bianca Vargas; ATHAYDE, Margareth Linde. Quantificação de Flavonóides nas Raízes de Urera baccifera Gaudich (Urticacae). Revista Contexto e Saúde, V.10, No.20, Jan/Jun. 2011. p. 1287-1290.

SOUZA, Amanda; LOPES, Elaine M. Cardoso; SILVA, Michele C.; Cordeiro, Inês; Young, Maria Cláudia M.; SOBRAL, Marcos E. G.; MORENO, Paulo R. H. Composição Química e Atividade Inibidora de Acetilcolinesterase de óleos voláteis de Myrceugenia myrcioides (Cambess.) O. Berg e Eugenia riedeliana O. Berg, Myrtaceae. Revista Brasileira de Farmacognosia, Vol. 20, nº. 2, Abr./Mai. 2010. p. 175-179.

13

VENANCIO, Antonio Medeiros. Toxicidade Aguda e Atividade Antinociceptiva do Óleo Essencial do Ocimum basiicum L. (Manjericão), em Mus musculus (Camundongos). Aracajú: UFS, 2006. 108p. Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de Sergipe, Aracajú, SE. 2006.

WRENSCH, Margaret.; KELSEY, Karl T.; LIU, Mei.; MIIKE, Rei.; MOGHADASSI, Michelle.; ALDAPE, Kenneth.; McMILLAN, Alex.; WIENCKE, John K. Glutathione-S-Transferase and Adult Glioma . Canccer Epidemiol Biomarkers Prevention, Vol.13, Mar/2004. p.461.

ZHOU, Jing-Rong; MUKHERJEE, Purna; GUGGER, Eric T.;TANAKA, Toshihide; BLACKBURN, George L.; CLINTON, steven K. Inhibition of Murine Bladder Tumorigenesis by Soy Isoflavones via Alterations in the Cell Cycle, Apoptosis, and Angiogenesis. Cancer Research, Vol.58, Nov.1998. p. 5231-5238.