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1- Fator Inibidor da Prolactina (PIF)
Esta aula serve como um bom modelo para o estudo do arco reflexo nervoso
que controla a secreção de hormônios essenciais para a lactação. O desenvolvimento
completo da glândula mamária depende da ação de vários hormônios, como:
estrógeno, progesterona, hormônio do crescimento, prolactina, hormônios tireoidianos,
glicocorticóides e insulina. Durante a gestação ocorre aumento dessas glândulas e da
sua capacidade secretora devido a ação dos hormônios citados acima, associados aos
de origem placentária (lactogênio placentário e esteróides) sobre o sistema canavicular,
promovendo o desenvolvimento dos ductos e dos alvéolos. A manutenção da secreção
de leite no período pós-parto depende de um arco-reflexo neuroendócrino, que se inicia
ao nível dos mamilos, por estímulos dos mecanorreceptores aí localizados (sucção).
Por intermédio dos nervos sensitivos e conexões multisinápticas ao nível da medula
espinhal, bulbo e mesencéfalo, os impulsos chegam ao hipotálamo e ativam os
mecanismos responsáveis pela secreção de prolactina e ocitocina. A prolactina é o
principal fator responsável pela produção do leite, enquanto a ocitocina age nas células
mioepiteliais que revestem os alvéolos determinando sua contração que promove a
expulsão do leite (lactopoiese ou descida do leite).
� Objetivos:
O objetivo deste experimento é de verificar alguns fatores que
atuam na liberação do PIF, aumentando-o ou diminuindo-o.
� Materiais e Soluções: Materiais: 4 gaiolas, balança comum, balança analítica, seringas. Soluções: pentobarbital sódico à 50 mg/ml, xilocaína 2%, L-Dopa 15 mg/ml, ocitocina. Animais : 4 ratas com as ninhadas.
Serão utilizadas neste experimento, ratas em fase de lactação com suas
respectivas ninhadas, tendo o mesmo número de filhotes de (06) de aproximadamente
14 dias.
As ninhadas deverão ser separadas das mães por 12-14 horas do início
dos experimentos. Durante este período as mães terão acesso livre à alimentação e à
água.
No tempo zero do experimento a ninhada será pesada e colocada junto à
mãe e após 45 minutos, a ninhada será novamente pesada. As bexigas urinárias dos
filhotes devem ser esvaziadas por compressão do ventre.
Obs. 1: Número limitado de 6 filhotes/ ninhadas visa evitar que em ninhadas maiores
ocorra competição entre os filhotes na disputa pelos mamilos e isso interfira nos
resultados.
Obs. 2: Antes da pesagem da ninhada do tempo zero proceder o esvaziamento da
bexiga urinária dos filhotes por meio de compressão leve com o polegar na bexiga
abdominal baixa. Esse manuseio tem o objetivo de evitar que ocorram variações de
peso dos filhotes em decorrência de eliminação urinária que poderia anular as
variações provocadas pela ingestão do leite.
� Técnica: Os animais serão divididos nos seguintes 4 grupos de 1 mãe e filhotes:
1. Controle - Deixar apenas os seis filhotes. Cuidado em esvaziar as bexigas dos
filhotes. Pesar os filhotes. Colocá-los junto à mãe. Retornar a pesá-los 45 minutos
após.
2. Injeção de L-Dopa – Injetar na rata mãe 7,5 mg de L-Dopa (i.p.) e colocar a
ninhada. Após 45 minutos retirá-los e pesá-los. Após esse período, injeta, via
endovenosa, 60 mµ de ocitocina na mãe, junte novamente os filhotes e tome o peso
final dos mesmos.
3. Pentobarbital sódico – Pesar os filhotes; injetar pentabarbital sódico 5 mg/ 100g
(i.p.) na mãe e quando esta estiver anestesiada, colocar os filhotes. Marcar o tempo
zero e pesá-los 45 minutos após. Passado esse tempo injetar 60 mµ (endovenoso)
de ocitocina na mãe. Juntar os filhotes durante 45 minutos e pesá-los novamente.
4. Efeito da anestesia local – Injetar ao redor de cada mamilo 0,10 ml (subcutânea)
de xilocaína 2%. Pesar os filhotes. Colocá-los junto à mãe. Pesá-los novamente
após 45 minutos. Passado esse tempo, injetar 60 mµ (endovenoso) de ocitocina na
mãe. Juntar os filhotes à mãe durante 45 minutos e pesá-los novamente.
� Resultados:
O efeito de cada condição experimental será avaliado pela variação no peso
dos filhotes (peso final – peso inicial) em correlação direita com a quantidade de leite
ejetado pela rata.
VARIAÇÃO DO PESO DOS FILHOTES (APÓS AMAMENTAÇÃO) DE
RATAS EM LACTAÇÃO SUBMETIDAS A VÁRIAS CONDIÇÕES EXP ERIMENTAIS: Tratamento Grupo de alunos Variação de
peso dos filhotes (g): Pfinal – Pinicial
Média dos resultados
G1 Controle G5
G2 Pentobarbital sódico G6
G2 Pentobarbital sódico + ocitocina G6
G3 Dopamina G7
G3 Dopamina + ocitocina G7
G4 Xilocaína G8
G4 Xilocaína + Ocitocina G8
2-Regulação Homeostática da Glicemia INTRODUÇÃO
A manutenção da concentração plasmática de glicose é de suma
importância para a sobrevivência, visto que a glicose plasmática é o principal substrato
metabólico utilizado pelo sistema nervoso central (exceto no jejum prolongado). Uma
breve hipoglicemia pode ocasionar uma disfunção cerebral, e prolongando-se este
estado pode-se ocasionar morte cerebral. Por isso, é imprescindível a existência de
mecanismos glico-regulatórios incumbidos de prevenir ou corrigir a hipoglicemia.
A regulação da captação, estoque e mobilização dos combustíveis celulares
e substratos sob as variações das condições ambientais e fisiológicas em organismos
superiores envolve fatores hormonais, neurais e de substratos.
Fatores Hormonais
Os principais hormônios envolvidos na manutenção da glicemia plasmática
são: insulina, glucagon, epinefrina, cortisol e hormônio do crescimento. Sendo que os
quatro últimos são chamados de hormônios contra-regulatórios, pois se opõem à
principal ação da insulina, que é reduzir a glicemia plasmática.
A insulina desempenha uma função primordial na regulação da glicose
sangüínea. Esse hormônio é produzido no pâncreas, pelas células β das ilhotas de
Langerhans, e é secretado no sangue como uma resposta direta à hiperglicemia. Sua
concentração no sangue acompanha a da glicose, e sua administração provoca
hipoglicemia imediata. As principais substâncias que determinam a liberação de
insulina são: carboidratos, alguns aminoácidos, ácidos graxos livres, corpos cetônicos,
glucagon, secretina, gastrina... A insulina tem efeito imediato, em tecido adiposo e o
muscular, aumentando a velocidade de absorção de glicose. Essa reação é causada
pelo aumento de transporte de glicose na membrana celular devido ao recrutamento de
transportadores de glicose GLUT4, que estão no interior da célula, para a membrana
plástica. Ao contrário, não há efeito direto da insulina na entrada de glicose nas células
hepáticas. Todavia, indiretamente, a insulina aumenta a captação de glicose pelo
fígado em virtude de sua ação: 1) estimulante sobre enzimas que regulam a glicólise e
a síntese de glicogênio; 2) inibitória sobre algumas enzimas glicogenolíticas e
neoglicogênicas.
O glucagon é o hormônio sintetizado no pâncreas pelas células α das ilhotas
de Langerhans. Sua secreção é estimulada pela hipoglicemia, e quando ele chega ao
fígado (via veia porta), provoca glicogenólise por ativar a fosforilase. A maior parte do
glucagon endógeno é retirada da circulação pelo fígado. O glucagon também aumenta
a gliconeogênese a partir de aminoácidos e do lactato. Tanto a glicogenólise quanto a
gliconeogênese, que ocorrem no fígado, contribuem com os efeitos hiperglicêmicos do
glucagon, cujas ações opõem-se às da insulina.
A epinefrina, hormônio sintetizado pela medula adrenal, estimula a produção
de glicose hepática e limita a utilização de glicose. As ações da epinefrina são diretas e
indiretas, e são mediatas através da sua ligação aos receptores α e β adrenérgicos. O
efeito α adrenérgico inibindo a secreção de insulina, é um dos principais efeitos
hiperglicemiante indiretos da epinefrina. A estimulação β adrenérgica da secreção de
glucagon também ocorre, mas sua contribuição no efeito hiperglicemiante sob
condições fisiológicas parece ser menor. A epinefrina também atua diretamente
aumentando a glicogenólise e gliconeogênese hepática. Como o glucagon, a epinefrina
atua em minutos e produz um aumento transiente na produção de glicose. Já o cortisol
e hormônio do crescimento possuem efeitos mais lentos, requerendo diversas horas
para promover o aumento glicêmico. Por isso, estes hormônios, embora sejam
liberados durante a hipoglicemia, não são importantes para a contra-regulação a curto
prazo.
Os glicocorticóides do córtex adrenal elevam a glicose sangüínea e
produzem uma curva de intolerância à glicose do tipo diabético. Na espécie humana,
esta ação ocorre somente em indivíduos com predisposição genética ao diabetes. A
tolerância à glicose está reduzida em 80% dos pacientes com síndrome de Cushing e
20% desses pacientes têm franco diabetes. Os glicocorticóides são necessários para o
glucagon exercer sua ação gliconeogênica durante o jejum. Os principais efeitos
diabetogênicos são: 1) o aumento do catabolismo protéico, que aumenta a
gliconeogênese no fígado; 2) o aumento da glicogenogênese e da cetogênese
hepáticas; 3) a redução de utilização periférica de glicose, que pode ser devido à
inibição da fosforilação da glicose.
O hormônio de crescimento (GH), secretado pela hipófise anterior, também
ocasiona aumento da glicemia. Esse hormônio mobiliza os ácidos graxos livres do
tecido adiposo favorecendo assim a cetogênese, ele reduz a captação de glicose em
alguns tecidos (ação anti-insulínica), aumenta a liberação de glicose hepática e pode
reduzir a capacidade da insulina ligar-se aos seus receptores. O GH não estimula
diretamente a secreção de insulina, porém, a hiperglicemia por ele produzida estimula
secundariamente o pâncreas e pode eventualmente produzir exaustão das células B.
Há evidências de que o GH reduz o número de receptores insulínicos e de que os
glicocorticóides reduzem suas afinidades à insulina. Contudo, a diminuição na
utilização da glicose produzida por esses hormônios deve-se mais à inibição da
fosforilação da glicose do que de sua entrada nas células.
O efeito hiperglicemiante de infusão combinada de glucagon, epinefrina e
cortisol é substancialmente maior do que a soma dos efeitos de cada hormônio
infundido individualmente. Essas interações sinergísticas são potencialmente
relevantes na contra-regulação da glicose.
Fatores Neurais
Estimulações elétricas dos nervos simpáticos hepáticos diminuem o
conteúdo de glicogênio, aumentando liberação de glicose hepática e causando
hiperglicemia em animais. Essas estimulações no pâncreas inibem a liberação de
insulina e estimulam a liberação de glucagon o que resulta no aumento da glicemia.
A estimulação parassimpática via nervo vago aumenta o conteúdo de
glicogênio hepático e diminui a liberação hepática de glicose, sendo que no pâncreas
promove a liberação de insulina, ocasionando a diminuição da glicemia.
Substratos
A glicose “per si” impulsiona o metabolismo hepático em favor do estoque de
glicogênio. Isto se baseia no conceito da auto-regulação de glicose hepática, isto é a
taxa de produção de glicose hepática é uma função inversa da concentração de glicose
plasmática, independente de fatores hormonais ou neurais. Os ácidos graxos e corpos
cetônicos também interferem no metabolismo de glicose.
� Objetivo
Analisar o papel de hormônios no perfil glicêmico, após ingestão de glicose (75g).
� Materiais e Métodos
� 2 Alunos em jejum (8h)
� 200 g de açúcar
� 1 limão (opcional)
� Álcool 77%
� Almotolia
� Algodão
� Luvas
� Lancetas descartáveis adaptadas a um lancetador - Accu-Chek Softclix
Pro; Roche, USA)
� Fitas (Advantage II -ROCHE-USA) para aferir a glicemia.
Monitor de glicemia (Accu-Chek Advantage II, Roche, USA).
� Teste de tolerância à glicose (GTT)
Os testes serão realizados pela manhã, após jejum de 8 horas. As amostras de
sangue (glicemia capilar) serão colhidas do dedo médio (utilizando-se lancetas
descartáveis adaptadas a um lancetador - Accu-Chek Softclix Pro; Roche, USA), antes
e após 2h da ingestão de glicose (75g). A glicemia será aferida utilizando um monitor
de glicemia (Accu-Chek Advantage II, Roche, USA).
3- Influências da Atividade Ovariana Sobre o Útero � Objetivos: (3 GRUPOS)
1. Familiarizar o aluno com o desenvolvimento de trabalhos científicos que duram
vários dias.
2. Analisar os efeitos da atividade dos ovários sobre o útero e massa corporal.
� Materiais e Soluções:
Materiais: Gaiolas para ratos, ração granulada, frascos para água, mesa cirúrgica,
instrumental cirúrgico, agulha e fios para sutura, luvas, seringa de tuberculina, éter,
algodão, câmara para anestesia, balança analítica e balança comum, fita adesiva.
Soluções: pentobarbital sódico, benzoato de estradiol à 25 µg/ Ml/óleo de milho.
Animal: ratas (180 g).
� Técnica: (DEMONSTRATIVA)
1. Separe as ratas em 4 grupos: 1.0) controle/ scham; 1.1) controle + estrógeno; 2.0)
ovariectomizado (OVX) + óleo vegetal; 2.1) OVX + estrógeno; Coloque duas ratas
em cada gaiola, identificadas com o nome dos grupos experimentais e a data do
início do experimento. Para diferenciar as ratas na gaiola, realize marcações nas
orelhas mediante pequenos cortes em V. Isto deve ser feito após a rata estar
anestesiada.
2. Anestesie, por via intraperitoneal, com pentobarbital sódico i.p.
3. Coloque a rata em decúbito lateral sobre a mesa cirúrgica, localize a última costela e
faça a assepsia. Faça uma incisão de 1-1,5 cm, na pele e subcutâneo entre a última
costela e a coxa.
4. Com uma pinça fazer uma seguida incisão na camada muscular abrindo a cavidade
peritoneal (B). Divulsione o músculo abrindo a pinça (C) e observe neste local massa
de gordura (esbranquiçada).
5. O ovário está localizado nesta massa de gordura. Com auxílio da pinça puxe o
ovário ou a massa de gordura (F). Faça uma ligadura logo abaixo da trompa uterina
(G). Corte entre o ovário e a ligadura.
6. Recoloque o restante da cavidade abdominal e suture o tecido (H,I). Não esqueça
que a cirurgia é bilateral.
7. No grupo 1.0 (controle) e 1.1 (tratado com estrógeno), localize os ovários, porém
sem retirá-los. Suture a musculatura e a seguir a pele em planos separados,
passando mertiolato após o término da sutura.
8. Nos outros 2 grupos realize a OVX
Ovariectomia Sequência Experimental :
1. Durante 4 dias que antecedem o sacrifício (9 dias após as cirurgias), injete
subcutaneamente:
- estrógeno na dose de 20 µg (benzoato de estradiol) por dia em cada rata do grupo
1.1 e 2.1
- óleo vegetal nos animais do grupo 2.0;
- pese todas as ratas
- os grupos de alunos 1 a 4 serão responsáveis pelos animais dos grupos 1.0 e 1.1; e
os alunos dos grupos 5 a 8, pelos grupos de animais 2.0 e 2.1.
2. Após 14 dias, sacrificá-las com éter na câmara para anestesia. Abrir a cavidade
abdominal e expor os cornos uterinos. Amarre as 2 extremidades, no seu extremo
mais anterior e, posteriormente, imediatamente antes de formar os 2 cornos.
Seccione a vagina próxima a esta última ligadura e remova-os da rata. É importante
manter igual procedimento em todas as ratas com respeito à retirada dos cornos
uterinos.
3. Os cornos devem ser pesados com o líquido neles contidos. A seguir esvaziados e
pesados novamente.
4. Faça o gráfico da média da massa corporal dos diversos grupos e apresente as
tabelas das massa médias dos cornos uterinos com e sem líquido e relacioná-las
com a massa corporal. Esta relação deve ser expressa em mg/100 g de massa
corporal.
4-Esfregaço Vaginal e Ciclo Estral em Ratas
Obs.: Esta atividade será demonstrativa.
� Objetivos:
1. Conhecer técnicas de investigação das funções endócrinas.
Ovariectomia
2. Identificar as fases do ciclo estral nas ratas, correlacionando-as com as alterações
hormonais.
� Materiais e Soluções:
Materiais: conta-gotas, microscópio, lâminas para microscópio.
Soluções: pentobarbital sódico à 50 mg/ml, mertiolato, solução de NaCl a 0,9%.
Animais: ratas (180 g).
� Técnica:
1. Obtenção e análise do esfregaço vaginal:
2. Segure firmemente a rata pelo dorso, mantendo-a de ventre para cima. Outro
estudante introduz na vagina a ponta de um conta gotas de ponta fina, tendo uma
gota de solução fisiológica.
3. Libere a solução fisiológica na vagina da rata e aspire novamente a solução, a qual
deverá conter suspensão células do epitélio vaginal
4. Esparrame a suspensão na lâmina de vidro e anote na mesma a identificação da
rata.
5. Examine o esfregaço no microscópio com pequeno aumento e faça o diagnóstico da
fase do ciclo estral de cada rata, anotando as características do campo
miscroscópico.
Coleta de material
Microscopicamente as fases do ciclo estral se caracterizam:
Diestro (DII): poucas e pequenas células epiteliais, predominância de leucócitos
e bastante muco.
Proestro: células epiteliais grandes e nucleadas e ausência de leucócitos.
Estro: presença apenas, de células queratinizadas.
Metaestro (DI): algumas células queratinizadas e outras células epiteliais com
presença de leucócitos.
5-Efeitos da Castração e Terapêutica Substitutiva e m Ratos
� Objetivos: (3 GRUPOS)
1. Familiarizar o estudante com a investigação em Endocrinologia.
2. Observar os efeitos dos hormônios sexuais nos órgãos anexos do aparelho
reprodutor.
3. Observar o papel da terapêutica substitutiva.
� Materiais e Soluções:
Esfregaço Vaginal e Ciclo Estral
Materiais: 3 gaiolas, 3 frascos para água, ração granulada, instrumental cirúrgico,
luvas, mesa cirúrgica para ratos, agulha e fio para sutura, balança comum, balança
analítica, seringa de tuberculina, câmara para anestesia, éter, esparadrapo.
Soluções: pentobarbital sódico à 50 mg/ml, mertiolato, propianato de testosterona à
1 mg/ml.
ANIMAIS: ratos de 150-180 g.
� Técnica:
1. Separe, aleatoriamente, 3 grupos de ratos, denominados: 1.0) controle; 2.0) castrado
e 2.1) castrado e tratado com propianato de testosterona.
2. Coloque cada grupo numa gaiola e identificação devida. Faça também a
identificação de cada rato, mediante um pique na orelha, em V, em posição diferente
para cada rato contido na gaiola. Esta identificação faça-a após o rato estar
anestesiado.
3. Anestesie os ratos com pentobarbital sódico , coloque-os em decúbito dorsal e
realize a castração do grupo b e c.
Animal anestesiado em decúbito dorsal Procedimento da orquidectomia: (DEMOSTRATIVO)
3.1. Faça a assepsia com mertiolato e a seguir uma incisão na bolsa escrotal,
separando o testículo dos tecidos adjacentes por divulsão.
4. Retire o testículo da bolsa escrotal. Faça uma ligadura, envolvendo o cordão
espermático com os vasos sanguíneos. Seccione e remova o testículo (H-I).
Orquidectomia
3.3. Proceda de modo análogo para retirar o testículo do outro lado.
3.4. Faça as suturas, mediante pontos separados e passe novamente mertiolato.
� Sequência Experimental:
1. Mantenha os ratos nas gaiolas com ração e água, pesando-os, diariamente, durante
o decorrer do experimento.
2. No 10º dia após a castração, injete no grupo 2.1 propianato de testosterona por via
subcutânea, na dose de 300 µg por rato. Este tratamento deverá ser diário, num
período mínimo de 4 dias, a partir do décimo dia pós-cirúrgico.
3. Após este período, sacrifique os animais com éter na câmara para anestesia.
4. Retire as vesículas seminais, hipófise e adrenais.
5. Imediatamente após a retirada das estruturas do item anterior, pese-as. Relacione a
massa de cada uma em mg/100 g de massa corporal de rato.
Orquidectomia
UNIDADE IVUNIDADE IVUNIDADE IVUNIDADE IV
SISTEMA DIGESTÓRIO E ESTOMATOGNÁTICOSISTEMA DIGESTÓRIO E ESTOMATOGNÁTICOSISTEMA DIGESTÓRIO E ESTOMATOGNÁTICOSISTEMA DIGESTÓRIO E ESTOMATOGNÁTICO
SECREÇÃO SALIVAR E pH BUCALSECREÇÃO SALIVAR E pH BUCALSECREÇÃO SALIVAR E pH BUCALSECREÇÃO SALIVAR E pH BUCAL
� Objetivos: 1. Mostrar a influência do fluxo salivar sobre o pH da boca. 2. Analisar a relação entre o tipo de alimento a ingestão alimentar e a
secreção salivar. � Materiais e métodos: Materiais: fita de pH, limão, chiclete com açúcar, chiclete sem açúcar, bolacha salgada, bolacha doce, refrigerante comum e refrigerante dietético.
Soluções: fluoreto de sódio a 0,05%. Técnicas Para a Determinação do pH da Boca:
Segurar uma das pontas da fita indicadora de pH com os dedos polegar e indicador; introduzir aproximadamente 1/3 da fita na boca do voluntário, mantendo-a dentro até o completo umedecimento com a saliva, colocando a ponta da fita sob a língua a fim de favorecer o contato com o líquido bucal. Após 10 segundos, retirar a fita e fazer a leitura, comparando a reação de cor ocorrida com a da escala colorimétrica fornecida na caixa de fitas, verificando o valor correspondente de pH. Nesta determinação do pH, permanecer no mínimo 1 hora sem ingerir alimentos, chupar balas, mascar chicletes, fumar ou beber refrigerantes. � Seqüência Experimental: 1. Escrever os nomes dos alunos do grupo e numerar seqüencialmente.
Usando a fita para pH, fazer a determinação do pH da boca de cada aluno do grupo. Anotar os resultados.
2. O aluno número 1 irá mastigar um chiclete com açúcar por um período de 5 minutos e, a seguir, medir o pH da boca. Anotar o resultado.
3. Após a realização do item 2, fazer bocheco com solução de fluoreto de sódio a 0,05% e determinar novamente o pH. Anotar os resultados.
4. O número 1 da relação de nomes deverá repetir os ítens 2 e 3 utilizando chicletes sem açúcar e a solução de flúor, Anotando os dados obtidos.
5. O aluno número 2 irá realizar o experimento, ingerindo três bolachas doces em um período de 1 minuto. Medir o pH da boca. A seguir, fazer bochecho com a solução de flúor e medir novamente o pH. Anotar os resultados.
6. O aluno do grupo número 2 deverá repetir o experimento anterior ingerindo três bolachas salgadas.
7. O aluno número 3 deverá ingerir lentamente, mas de forma contínua, um copo de refrigerante comum e, logo a seguir determinar o pH da boca. Após um intervalo de 10 minutos, medir novamente o pH e repetir o experimento ingerindo refrigerante dietético.
8. Escolher dois alunos do grupo e pedir para colocarem 3 gotas de suco de limão sobre o dorso da língua. Após 1 minuto, determinar o pH bucal. Anotar os resultados.
9. Ilustrar os efeitos das manobras experimentais preparando tabelas com os dados obtidos.
� Estudo Orientado: ♦ Em relação ao tipo de alimento apresentado e ingerido, que influência
teve no ph da boca? ♦ O volume de saliva formado foi influenciado pelo tipo de alimento?
Descreva. ♦ Quais são as glândulas encarregadas de produzir saliva? Classificá-las
de acordo com o tipo de saliva secretado. ♦ Explicar a importância da saliva para a manutenção da fisiologia bucal. ♦ Qual a função dos ácinos e dos ductos na secreção salivar? ♦ Como é feita a regulação da secreção salivar? ♦ Qual o volume diário de secreção salivar? Citar fatores que podem
alterar este volume. ♦ Explicar como o fluxo e a composição da saliva podem influenciar o ph
da boca.