Prof. Murilo Malveira Brandão

Maioria das espécies: pequena parte do

genoma consiste de genes que codificam

proteínas;

O restante do genoma, durante muito tempo,

foi considerado como “DNA lixo”, ou seja,

sem função, e nessa parte incluíam-se os

microssatélites.

Sequências Simples Repetidas (SSRs)

Consistem de 1 a 6 nucleotídeos repetidos

em tandem,

Classificadas pelo motivo repetido

◦ mono, di, tri, tetra, penta e hexanucleotídeos

Pelo tipo de seqüência repetitiva

◦ microssatélites perfeitos, imperfeitos,

interrompidos ou compostos

Possuem um alto polimorfismo

Altas taxas de mutação nestes locos

São flanqueados por sequências únicas

Podem ser amplificados através de PCR

Ótimos marcadores moleculares

Protocolo: Desenvolvimento de Marcadores Microssatélites Nucleares

ESALQ/USP

1. Digestão do DNA

Objetivo: digerir o DNA gênomico para gerar

fragmentos de tamanhos adequados (300 – 1200

pb).

◦ Etapa crítica - o DNA deve ter uma boa qualidade e

estar em uma boa concentração (~500 ng/µL).

◦ Se necessário usar Kit de extração de DNA para eliminar

compostos secundários e proteínas.

Em um eppendorf de 1,5 mL: ◦ Água ultra-pura estéril 74,0 µL ◦ Enzima de restrição RsaI (5’)GT¯AC(3’) (10U/µL – Promega) 5,0 µL ◦ Tampão Restrição (10X) 10,0 µL ◦ BSA Acetilado (10 µg/µL) 1,0 µL ◦ DNA (500 ng/µL) 10,0 µL ◦ Volume da reação 100,0 µL

Procedimento: Misturar, suavemente, por pipetagem. Incubar 4 horas a 37 ºC. Aplicar 10 µL da digestão em gel de agarose 1,5%. Deve-se observar um smear (Figura 1).

* Inativação: Incubar a 65 ºC por 15 minutos

Figura 1. DNA genômico de Ilex paraguayensis (A) e Dicksonia sellowiana (B) digerido com RsaI. M: 200 bp Ladder Promega

2. Ligação de Adaptadores

Objetivo: garantir que todos os fragmentos

gerados tenham uma terminação comum e

conhecida.

◦ Adaptadores para RsaI

◦ Rsa21 5’ CTC TTG CTT ACG CGT GGA CTA 3’

◦ Rsa25 5’ TAG TCC ACG CGT AAG CAA GAG CAC A 3’

Em um eppendorf de 1,5 mL: ◦ Água ultra-pura estéril 26,0 µL

◦ T4 DNA Ligase (1U/µL – Promega) 5,0 µL

◦ Tampão Ligação (10 X ) * 5,0 µL

◦ Rsa21 (10 µM) 2,0 µL

◦ Rsa25 (10 µM) 2,0 µL

◦ DNA digerido (~ 500 ng) 10,0 µL

◦ Volume da reação 50,0 µL * tampão deve estar homogêneo. **Add por último a enzima de

restrição e a Ligase

*** Inativação: Incubar a 70 ºC por 10 minutos

Procedimento: Misturar, suavemente, por pipetagem. Incubar 2 horas a 20 ºC (termociclador).

3. Pré-amplificação

Objetivo: garantir que a ligação dos adaptadores tenha ocorrido.

Em um eppendorf de 1,5 mL: ◦ Água ultra-pura estéril 30,4 µL

◦ Cloreto de magnésio (25 mM – Fermentas) 3,0 µL

◦ Tampão (10 X – Fermentas) 5,0 µL

◦ Rsa21 (10 µM) 2,0 µL

◦ dNTPs (10 mM) 4,0 µL

◦ Taq polimerase (5U/µL – Fermentas) 0,6 µL

◦ Reação de ligação 5,0 µL

◦ Volume da reação 50,0 µL

Procedimentos: programação do termociclador: 95 ºC 4 minutos, seguido de 20 ciclos (94 ºC 30 segundos, 60 ºC 1 minuto, 72 ºC 1 minuto), extensão final 72 ºC por 8 minutos.

Aplicar 10,0 µL da reação de amplificação em gel de agarose a 1,5%. Deve-se observar um smear de 300 a 1200 pb

Figura 2. Amplificação pré-seleção dos fragmentos RsaI de DNA genômico de Ilex paraguayensis (A) e Dicksonia sellowiana (B) utilizando o primer Rsa21. M: 200 bp Ladder Promega.

4. Purificação

Objetivo: preparar o DNA para a etapa de seleção de fragmentos (≈ 40 μL da etapa 3) que contenham microssatélites. Usar o kit de purificação de PCR QIAquick da QIAGEN.

4. Purificação

Procedimento: ver recomendações do fabricante.

Eluir o DNA em 100 µL de água ultra-pura estéril em duas etapas. Adicionar, à coluna, 50 µL de água e centrifugar por 1 minuto; repetir o passo anterior.

5.1 Preparo das beads magnéticas (Streptavidin MagneSphere Paramagnetic Particles - Promega)

Procedimento: 1. ressuspender os 600 µL das beads por

agitação; 2. magnetizar e, com cuidado, aspirar o

sobrenadante; 3. adicionar 300 µL de SSC 0,5 X,

ressuspender, magnetizar, descartar o sobrenadante;

4. repetir três vezes a etapa 3; 5. ressuspender as beads em 100 µL de SSC

0,5 X.

◦ Preparo do DNA purificado

Procedimento: 1. 405 µL de água MilliQ + 95 µL de DNA purificado (etapa 4); 2. Incubar a 95 ºC por 15 minutos; 3. Adicionar 13 µL de SSC 20 X e, em seguida, acrescentar 3 µL de

cada (sonda) oligo biotinilado [(CT)8, (GT)8 e (TTC)8], em concentração de 50 µM

4. Deixar à temperatura ambiente por 20 minutos agitando lentamente a cada 2 minutos. A agitação é muito importante nesta etapa.

5. Misturar os 100 µL de beads pré-lavadas com os 522 µL da mistura de hibridação;

6. Incubar por 10 minutos `a temperatura ambiente, agitando suavemente o tempo todo (apenas rolar os tubos entre os dedos);

7. Magnetizar e aspirar o sobrenadante; 8. Ressuspender em 300 µL de SSC 0,1 X (cuidado em sempre trocar

a ponteira); 9. Repetir as etapas 7 e 8 por mais 2 vezes; 10. Ressuspender em 100 µL de água, magnetizar, e reservar o

sobrenadante em um eppendorf; 11. Ressuspender por mais 1 vez com 150 µL de agua; 12. Juntar as duas partes (250 µL) e conservar `a - 20 ºC.

6. Amplificação dos fragmentos selecionados

Objetivo: Aumentar a quantidade de DNA (fragmentos)

Em um eppendorf de 1,5 mL:

Água ultra-pura estéril 51,4 µL

Cloreto de magnésio (25 mM -Fermentas) 6,0 µL

Tampão (10 X - Fermentas) 10,0 µL

Rsa21 (10 µM) 4,0 µL

dNTP (10 mM) 8,0 µL

Taq polimerase (5U/µL - Fermentas) 0,6 µL

Fragmentos selecionados (250 µL) 20,0 µL

Volume da reação 100,0 µL

Procedimentos: programação do termociclador: 95 ºC 1 minuto, seguido de 25 ciclos (94 ºC 30 segundos, 60 ºC 1 minuto, 72 ºC 2 minuto), extensão final 72 ºC, por 5 minutos. Aplicar 10,0 µL da amplificação em gel de agarose 1,5% (Figura 3). Bandas de baixo peso molecular, entre 300 e 1000 pb, é o que se espera; não deve haver bandas preferenciais.

Figura 3. M: 200 bp Ladder Promega. A: fragmentos RsaI do DNA de Dicksonia sellowiana selecionados por hibridização com sondas para SSRs e amplificados com o primer Rsa21.

7. Duplo enriquecimento

Repetir todos os procedimentos a partir da etapa 4, purificando os 100 µL da etapa 6.

8. Clonagem em um vetor pGEM – T easy (Promega)

Em um eppendorf de 1,5 mL: Água ultra-pura estéril 10,0 µL Tampão da ligase (10 X)** 2,0 µL Plasmídio (50 ng/µL) 1,0 µL Produto de amplificação* 6,0 µL T4 DNA Ligase** 1,0 µL Volume da reação 20,0 µL

Procedimento: incubar `a 4 ºC overnight

(termociclador). Obs.:* adicionar uma maior quantidade (> 6,0

µL) se, no gel (Figura 4), verificar que as bandas ficaram claras. ** o tampão e a ligase foram os mesmos utilizados para ligar os adaptadores.

Figura 4. A: fragmentos RsaI de DNA genômico de Dicksonia sellowiana selecionados por complementaridade com as sondas para SSRs, inseridos em vetor pGEM-T Easy e amplificados por PCR utilizando primers M13 forward e reverse. B: controle; pUC19 amplificado com os mesmos primer.

8. PCR para checar a clonagem Em um eppendorf de 1,5 mL: Água ultra-pura estéril 5,6 µL Cloreto de magnésio (25 mM - Fermentas) 0,6 µL Tampão (10 X - Fermentas) 1,0 µL M13 F (10 µM) 0,3 µL M13 R (10 µM) 0,3 µL dNTP 10 mM 1,0 µL Taq polimerase 5U/µL (Fermentas) 0,2 µL Reação de ligação 1,0 µL Volume da reação 10,0 µL

Procedimentos: Ciclos: 95 ºC 4 minutos, seguido de 20

ciclos (94 ºC 30 segundos, 50 ºC 1 minuto, 72 ºC 1 minuto), extensão final 72 ºC por 8 minutos (Figura 4).

9. Transformação em XL1-Blue

Objetivo: transformar células de E. coli, quimicamente competentes, com o produto de clonagem para proporcionar a amplificação do inserto.

Produto de ligação 8,0 µL

Transfo-buffer 32,0 µL

Aliquota células competentes OmniMAX 2T-1 (Invitrogen) 50,0 µL

Volume da reação 80,0 µL

Procedimentos: 1. ressuspender cuidadosamente os 80 µL da reação e

incubar em gelo por 15 a 30 minutos; 2. Retirar do gelo e deixar por 10 minutos `a

temperatura ambiente; 3. Dar um spin, adicionar 440 µL de LB (contendo

ampicilina) a 37 ºC, e incubar `a 37 ºC por 50 minutos;

4. Centrifugar a 3000 rpm por 30 segundos, descartar 440 µL do sobrenadante e, ressuspender o pellet em 160 µL de LB (contendo ampicilina a 100 mg/ml) a 37 ºC.

5. Preparar uma placa com meio LB (Luria-Bertani) sólido (contendo ampicilina), e aplicar 80 µL do volume total por placa.

6. Deixar overnight (18 a 22 horas) a 37 ºC e em seguida colocar em geladeira. Colônias brancas (Figura 5) contém o inserto (fragmentos com SSRs).

Figura 5. Colônias brancas (transformadas) e azuis produzidas pelo crescimento das células de E. coli transformadas com plasmídio pGEM T-Easy contendo ou não insertos de SSRs de Dicksonia sellowiana. As células foram plaqueadas em LB sólido com X-Gal e IPTG e cultivadas overnight a 37 °C.

10. Inoculação e mini-prep (extração plasmidial) Objetivo: isolar o DNA plasmidial das colônias recombinantes.

1. Colocar 1 mL (ou 500 uL???) de meio LB contendo 100 µg/mL de

ampicilina em cada pocinho da placa alta; 2. Inocular as colônias brancas, uma em cada pocinho, utilizando palitos

autoclavados, selar a placa com adesivo e furar em cima com uma agulha, para aeração durante o crescimento;

3. Incubar `a 37 ºC, em agitador a 300 rpm, durante 22 h; 4. Trocar o adesivo da placa e centrifugar (23 ºC) por 6 minutos a 3000

rpm 5. Descartar o sobrenadante e manter a placa invertida sobre papel

absorvente por 1 minuto; 6. Adicionar a cada pocinho 240 µL de GTE (Glicose-Tris-Edta), selar a

placa com adesivo e ressuspender as células agitando no vortex por 2 minutos;

7. Centrifugar por 6 minutos a 4000 rpm (enquanto isto, colocar 5 µL de RNAse, 10 mg/mL, em cada placa de fundo em U);

8. Descartar o sobrenadante, adicionar a cada pocinho 80 µL de GTE, e selar a placa com adesivo. Agitar no vortex por 5 minutos;

9. Transferir 60 µL de cada suspensão de células para placa de fundo em U contendo RNAse;

10. Adicionar a cada pocinho 60 µL de NaOH 0,2M – SDS 1 %, selar a placa com adesivo e misturar 10 vezes por inversão. Incubar 10 minutos a temperatura ambiente (começar a marcar o tempo quando colocar a solução na primeira fileira);

11. Colocar na centrífuga e dar um spin (até 1000 rpm);

12. Adicionar a cada pocinho 60 µL de KOAc (acetato de potássio) 3M (estocado a 4 ºC), selar a placa com adesivo e misturar 10 vezes por inversão;

13. Remover o adesivo e incubar em estufa a 90 ºC por exatos 30 minutos;

14. Esfriar a placa em gelo por 10 minutos e centrifugar por 4 minutos a 4000 rpm;

15. Fixar com fita adesiva uma placa filtro no topo de uma placa em U e, transferir todo o volume para a placa filtro e centrifugar por 4 minutos a 4000 rpm;

16. Remover a placa filtro e adicionar ao filtrado 90 µL de isopropanol gelado;

17. Selar a placa com adesivo e misturar 20 vezes por inversão. Trocar o adesivo e centrifugar por 45 minutos a 4000 rpm, 20 ºC;

18. Descartar cuidadosamente o sobrenadante e adicionar 180 µL de etanol 70% gelado;

19. Centrifugar por 5 minutos a 4000 rpm, 20 ºC, e descartar o sobrenadante;

20. Inverter a placa sobre papel absorvente e deixar secar por 60 minutos `a temperatura ambiente;

21. Ressuspender em 60 µL de água miliQ. Deixar overnight.

11. Reação de sequenciamento e purificação 11.1 Reação de sequenciamento Água miliQ 1,4 µL

Primer (5 µM) 0,6 µL

DYEnamic mix 4,0 µL

DNA (50 -200 ng/µL) 4,0 µL

Primer (MER) 5’ CAT ACG ATT TAG GTG ACA CTA TAG 3’

Procedimentos: 27 Ciclos: 95 ºC 25

segundos, 50 ºC 15”, 60 ºC 1 minuto), 4 ºC forever.

11.2 Purificação 1. adicionar 1 µL de acetato de amônio 7,5M e 28 µL de

etanol 100% a cada reação de sequenciamento (a concentração final de etanol deve ser de 70%);

2. agitar levemente para homogeneizar;

3. manter por 15 minutos (precipitação) em ambiente escuro;

4. centrifugar `a temperatura ambiente por 25 minutos a 4000 rpm;

5. remover o sobrenadante e adicionar 150 µL de etanol 70% (gelado) para lavar o pellet. Centrifugar nas mesmas condições descritas na etapa 4;

6. remover o sobrenadante e deixar o pellet secar ao ar (ambiente escuro);

7. ressuspender o pellet em 10 µL de loading solution e deixar overnight a 4 ºC

8. vortexar, centrifugar (spin) e sequenciar.

ABI 3500

Extração do DNA e reação PCR

◦ Pares de primers (forward e reverse) - universais de cpDNA

◦ PCR: 35 ciclos – Temperatura de anelamento: 53°C

◦ visualização em gel de agarose 1%

Figura : Fragmentos de cpDNA amplificados de quatro indivíduos de Ceiba pubiflora em gel de agarose 1%, para pares de primers cpDNA (P1 a P8). Marcador de peso molecular M1=100pb e M2=1Kb.

DNA Cloroplastidial (cpDNA)

◦ 1 célula = 10.000 cópias do cpDNA

◦ Região LSC = menos conservada

Estudos taxonômicos

Purificação da Reação com Enzimas de Restrição

Shimp Alkaline Phosphatase (SAP) a 1U/μL e Exonuclease I (EXO) a 20U/μL (mix de restrição)

Ativadas a 37ºC por 30 min. e, em seguida, desnaturadas a 80ºC por 20 min.

Reação de preparo para o sequenciamento ◦ PCR com a presença de somente um dos primer

(forward ou reverse)

◦ bases nucleotídicas marcadas com fluorescência

◦ leitura automatizada do sequenciador (ABI 3500).

Seleção de Primers cpDNA e Número de Haplótipos ◦ padrão de amplificação – observação de única

banda no gel

◦ BioEdit

◦ correção manual das sequências

Alinhamento das sequências: ◦ Mega v.4.0 – método Clustal-W

◦ DNASP 4.1:

◦ determinar o número de haplótipos

◦ frequência na amostra

◦ diversidade nucleotídica (π)

◦ diversidade haplotípica (HD)