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Enzimas: como atuam ?catalisadoresclassificaoespecificidade e mecanismos de aoregulao enzimticainibidores e aplicaesBIO10-329 Biofsica de ProtenasRegente: Clia R. CarliniAteno ! Use o modo apresentao de slides para ativar as animaes

Um pouco de Histria sobre enzimas:

1700:Estudos da digesto de carnes por secrees do estmago.1833:Payen e Persoz: descobriram a converso do amido em acar pela saliva.1850: Louis Pasteur concluiu que leveduras catalisam a converso de acares em lcool.1878:Friedrich Wilhelm Khne cunha o nome "enzima","en" = dentro e "zyme" = levedura.1897:Buchner descobriu que extratos de levadura podiam converter o acar em lcool, e que fermentos eram molculas.1926:J.B.Sumner cristaliza a primeira protena, urease, e demonstra que a atividade enzimtica uma caracterstica de molculas definidas.

Enzimas so protenas que agem como catalizadores biolgicos:enzimaComposto A (substrato)Composto B (produto)Centro ativo ou stio catalticode uma enzima a poro da molcula onde ocorre a atividade catalticaObserve que no h consumo ou modificao permanente da enzimaReao catalisada pela enzima

Teoria da catliseNo equilbrio da reao, as velocidades das reaes se igualam: v1 = v-1

- concentraes de todos os reagentes no se alteram mais - pode se dizer que a reao terminou

Catalisador acelera as velocidades de ambos os lados da reao

- o ponto do equilbrio atingido mais rpido

- o ponto do equilbrio no se altera, ou seja [reagentes] e de [produtos] no final da reao so as mesmas da reao no catalisada

- termodinmica da reao no se altera

Catalisador no consumido na reao pode atuar em [ ] baixasConsidere as reaes:

Um Catalisador diminui a barreira energtica criando percursos alternativos da reao para formao do estado de transio.Energia de ativao ou barreira energtica: quantidade de energia que preciso fornercer aos reagentes para a reao ocorrerEstado de transio ou complexo ativado: forma molecular inter- mediria entre o reagente e o produto, existe somente no alto da barreira energtica. altamente instvel.Teoria da catliseO grfico mostra a variao de energia ao longo de uma reao.

Enzimas so catalisadores biolgicos:Que diferenas existem entre catalisadores inorgnicos, como ons metlicos, e as enzimas ?

enzimas so mais eficientes: podem acelerar reaes at 1014 vezes contra 102 103 vezes dos catalisadores inorgnicos;

enzimas so especficas: catalisam reaes envolvendo s vezes apenas um nico tipo de reagente;

enzimas so estereo-especficas e no produzem sub-produtos reacionais;

enzimas operam em condies amenas de temperatura, presso e pH;

enzimas podem ser altamente reguladas atravs de fatores extrnsecos reao, tanto por ativadores como por inibidores.

Equao geral de uma reao enzimtica

Nmero de turnover ou de renovao: quantas vezes a enzima completa o ciclo da reao em um segundoEnzimas acelaram reaes vrias ordens de grandeza Compare esses nmeros !

EnzimaVelocidade na ausncia de enzima

Reaes/segundoVelocidade da reao catalisada

Reaes/segundoPoder catalticoAnidrase carbnica H2O2 H2O + O2

Triosefosfato isomeraseCarboxipeptidase AAMP nucleosidaseNuclease de estafilococos1.3 X 10 1

4.3 X 10 63.0 X 10 91.0 X 10 111.7 X 10 -131.0 X 106

4.30057860957.7 X 106

1.0 X 1091.9X 10116.0 X 10125.6 X 1014

Por que a catlise por enzimas mais eficiente ?Aumento da concentrao dos reagentes na superfcie da enzima: atrao dos reagentes para interao com a enzima).

Orientao correta dos reagentes (substratos): parte da energia de ativao representa o posicionamento adequado dos reagentes para que haja contacto entre os tomos corretos. O sitio ativo da enzima favorece o posicionamento correto dos reagentes.

Aumento da reatividade dos reagentes: as cadeias laterais (R) dos aminocidos da enzima ou co-fatores e coenzimas podem interagir diretamente com os substratos, dando-lhes carga eltrica ou polarizando-os, tornando-os quimicamente mais reativos, ou ainda cedendo ou transferindo certas funes qumicas.

Induo de deformao fsica no substrato, por contacto com as cadeias laterais (R) dos aminocidos das enzimas, que desestabilizam a molcula do substrato e facilitam o rompimento de laos covalentes

Algumas protenas, enzimas em especial, contm em sua molcula uma poro no proteica, que essencial para atividade biolgica.Distino entre cofator e coenzima depende da fora de ligao com a apoprotena. Ex: o NAD+ pode ser cofator de uma enzima (ligao fraca) e ser coenzima de outra (ligao forte). O mesmo ocorre com as metais.Coenzimas participam do ciclo cataltico das enzimas recebendo ou fornecendo grupos qumicos para a reao

Algumas enzimas formam intermedirios covalentes com seus substratosEnzimas com o mesmo tipo de mecanismo cataltico, ou seja, possuem o mesmo grupo de aminocidos no stio ativo, formam intermedirios covalentes similares

Classificao das Enzimas:

considera tipo de reao e substratos

Nomenclatura oficial das enzimas dada pela Enzyme Comission da International Union for Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB) :

ATPase (Adenosinatrifosfatase): EC 3.6.1.3 - uma hidrolase.........................3 - atua num anidrido......................3.6 - o anidrido contm fosfato..........3.6.1 - esse anidrido ATP..................3.6.1.3Nmeros identificam o tipo de reao e o tipo de substrato alvo

1. xido-redutases ( Reaes de xido-reduo). Transferncia de eltronsSe uma molcula se reduz, h outra que se oxida. 2. Transferases (Transferncia de grupos funcionais) grupos aldedo gupos acila grupos glucosil grupos fosfatos (quinases)3. Hidrolases (Reaes de hidrlise)Transformam polmeros em monmeros. Atuam sobre: Ligaes ster Ligaes glicosdicas Ligaes peptdicasLigaes C-N4. Liases (Adio a ligaes duplas)Entre C e C Entre C e O Entre C e N5. Isomerases (Reaes de isomerizao)6. Ligases (Formao de laos covalentes com gasto de ATP)Entre C e O Entre C e S Entre C e N Entre C e C

Formas rgidasE e S se deformam, para otimizar o encaixeEmil Fisher, na dcada de 1950, props o modelo chave-fechadura para expli-car o reconhecimento (especificidade) do substrato pela enzima. Nesse modelo, o stio ativo da enzima pre-formado e tem a forma complementar molcula do Substrato, de modo que outras molculas no teriam acesso a ela.

No entanto, o modelo chave-fechadura no explica a interao das enzimas com inibidores e anlogos dos substratos.

Na dcada de 1970, Daniel Kosland props o modelo de encaixe induzido, no qual o contacto com a molcula do substrato induz mudanas conformacio-nais na enzima, que otimizam as intera-es com os resduos do stio ativo. Esse o modelo aceito hoje em dia.Enzimas so especficas para o reconhecimento de seus substratos.Modelo Chave-FechaduraModelo Chave-Fechadura

Carboxipeptidase A uma enzima digestiva da classe das metaloproteinases.Em B: A ligao do substrato dipeptdico glicil-L-tirosina (em verde) causa uma profunda mudana conformacional nas vizinhanas do stio ativo da carboxipeptidase A. Clique com o mouse para observar a re-orientao da posio da Tyr248 em relao outra figura. Em A: o stio cataltico dessa enzima formado pelos resduos (em vermelho) de Tyr248 (acima, direita) e de Glu270 (centro), e um tomo de Zn2+, que est acima do Glu270.AB

Mecanismo de ao da quimotripsina, um exemplo tpico de uma serino proteinaseO H+ transferido da His-57 para o substrato. A ligao susceptvel clivada, e parte do substrato fica ligado covalentemente enzimaA H2O transfere H+ para a His-57 e OH para o substrato, formando um segundo estado de transio tetradricoO H+ transferido da His-57 de volta para a Ser-195. A outra poro do substrato liberada da enzima, que retorna ao estado inicial A Ser-195 transfere H+ para His-57 formando um estado de transio tetradrico com o substrato. O Asp-102 estabiliza o prton na His-57 fazendo uma ligao inica

Fatores que afetam a atividade enzimtica:

Condies do meio que afetam estabilidade proticapHtemperatura

Tempo da reao

Concentrao dos reagentesa enzimao substrato co-fatore(s)Vrios so os fatores que afetam o funcionamento das enzimas como catalisadores. Alguns desses fatores so decorrentes da natureza proteica das enzimas, como o efeito do pH e da temperatura. Para se estudar o efeito isolado de um dos fatores acima, necessrio que todos os outros fatores sejam mantidos fixos.

Fatores que controlam a atividade enzimtica:Fatores que afetam a estabilidade proteica das enzimasVariaes de pH: pH timoO pH timo de uma enzima reflete variaes no estado de ionizao de resduos de aminocidos do stio ativo. A enzima est pelo menos parcialmente desnaturada em pHs afastados do pH timo. Quando o substrato uma molcula ionizvel, o pH timo da enzima tambm reflete o seu estado de ionizao .

Fatores que controlam a atividade enzimtica:Fatores que afetam a estabilidade proteica das enzimasVariaes de pH: pH timoVariaes de temperatura: temperatura timaTemperatura timaPouca energia para a reao acontecerAo contrrio da curva em forma de sino no caso da atividade enzimtica versus pH, a enzima s est desnaturada em temperaturas acima da temperatura tima.

Fatores que controlam a atividade enzimtica:Tempo da reao

Concentrao:da enzimado substrato de co-fatore(s)

A [substrato] cai na mesma razo em que a [produto] aumenta em funo do tempo.

A enzima existe sob duas formas: enzima livre E e complexo enzima-substrato ES. No incio da reao, a [E] livre cai e a do complexo [ES] aumenta e atinge um mximo, em que no h mais [E] livre no meio. Nessa situao (indicada no retngulo cinza), diz-se que a enzima est saturada (s existe no complexo ES). A velocidade da reao a mxima.

O grfico abaixo ilustra como as concentraes de E, S e P variam ao longo do tempo da reao.

Na dcada de 1950:

Michaelis e Menten formularam as bases da cintica enzimtica, para explicar como a concentrao do substrato [S] afeta a velocidade da reao v, conforme se observa no grfico abaixo.

A velocidade da reao apresenta trs regies de comportamento diferente, a medida que se aumenta a concentrao do substrato:parte a: v aumenta proporcionalmente com aumentos de S. parte b: v aumenta no proporcionalmente com aumentos de S.parte c: v no aumenta mais, tendendo a um valor mximo (Vmax), sendo independente da [S]

Para se chegar equao da hiprbole quadrada do grfico V x S, o grfico de Michaelis Menten, considera-se que o conjunto de reaes est em equilbrio, ou seja, a [ES] constante e o sistema tem a sua velocidade mxima, Vmax.Igualando-se Vf = Vd e resolvendo para V, chega-se Equao de Michaelis-Menten:Vf formao ES = Vd desdobramento ESQuando [ES] constante, as velocidades de formao (Vf) e de desdobramento (Vd) do complexo ES so iguais:Aplicando a Lei de Ao das Massas para definir Vf e Vd, temos:

A constante de Michaelis-Menten (KM) um parmetro cintico que traz informaes sobre a afinidade que a enzima tem pelo substrato. O KM numricamente igual [substrato] que produz metade da Vmax .Substituindo na equao v por Vmax/2, vemos:

Uma outra forma de se obter os valores de KM e de Vmax atravs do grfico dos duplos recprocos (1/V x 1/S), e da equao de Lineweaver-Burk.

A velocidade da reao somente proporcional [E]quando a enzima est saturada, ou seja, reao de ordem zero (independe) em relao a [S] Eficincia cataltica

Kcat/Km

Parmetro mais adequado para comparaes cinticas - k2 ou kcat (constante cataltica) mede o poder cataltico da enzima

v = k2 Etotal + [P] k2 = Vmax (s-1) [ES] [Etotal]Para calcular kcat considera-se que toda a E existe como ES, e que v=Vmax

Interaes secundrias de proteinases com seus substratosA tabela ilustra como interpretar Kcat, KM e eficincia cataltica (kcat/KM), comparando a ao de enzimas proteolticas sobre diferentes substratos sintticos. O ponto de clivagem dos substratos est indicado pela flecha. Conforme o nmero de resduos de aminocidos aumenta esquerda do ponto de clivagem, a eficincia cataltica (kcat/KM) das enzimas melhora (considerando-se como 1 o valor obtido com o substrato mais curto).

No caso da tripsina, o Km diminue 3X, sem alterar o kcat, ou seja a formao do complexo ES com o substrato maior facilitado, mas no foi afetada a sua transformao em produto.

No caso da elastase, o Km diminue ~300 X e o kcat aumenta ~10x, ou seja todas as etapas da reao so facilitadas com o substrato mais longo.Como resultado, a eficincia cataltica aumentou 3.900 vezes.

Enzima Substratoskcat(seg-1) KM (mM)Razokcat/ KMTripsina (pH 7.5)

Quimotripsina (pH 7.9)

Elastase (pH 8.0)Z-Lys-OMeZ-(Ala)2-Tyr-Lys-OMe

Z-Tyr-Gly-OMeZ-(Ala)2-Ala-OMe

Z-Ala-OMeZ-(Ala)2-Ala-OMe101106

0.610

6.7730.230.08

23 2

153 0.4313

1190

13900

Representao esquemtica do stio de reconhecimento do substrato da QUIMOTRIPSINA. O stio ativo de uma enzima proteoltica em geral uma fenda onde se localizam os resduos de aminocidos (S) dotados de capacidade cataltica. O resduo de aminocido da enzima que efetua a clivagem do substrato designado S1, e sucessivamente esquerda na seqncia primria da enzima, ficam os resduos S2, S3, S4, etc. De maneira anloga, os resduos de aminocidos da enzima direita de S1 so designados com S1, S2, S3, etc. O resduo cataltico S1 da enzima cliva o substrato proteico no resduo P1, determi- nando sua especificidade primria. esquerda e direita de P1 na seqncia do substrato proteico, esto os resduos P2, P3, etc, e P1, P2, etc, respectivamente. A figura acima explica os dados da tabela no slide anterior. O encaixe da enzima com a molcula do substrato melhora quando outros resduos, alm de S1 e P1, interagem. Na tabela, os substratos com resduos P2 a P4 proporcionaram melhores parmetros, mostrando que as interaes que esses realizam com a enzima influenciam sua atividade enzimtica.

A atividade enzimtica pode ser regulada por diferentes mecanismos, que muitas vezes atuam em conjunto na mesma enzima.

Entre estes mecanismos, destacam-se:Como so controladas as enzimas in vivo, alm de alteraes na disponibilidade de S e da prpria E ? Lembrar que em geral no ocorrem variaes bruscas de pH e de temperatura.Inibidores: irreversveis: no proticos e proticos reversveis: competitivo, no competitivo ou misto, incompetitivo

Alosteria:ativadores e inibidorescooperatividade

Modulao covalenteAtivao de zimogniosFosforilao e defosforilao

Inibidores irreversveis:Compostos orgnicos clorados ou fosforados so bons exemplos de inibidores enzimticos irreversveis, pois reagem com o resduo S1 de serino-enzimas, formando um complexo irreversvel. Uma das enzimas altamente sensvel a esses compostos a acetilcolinesterase, responsvel pela metabolizao do neurotransmissor acetilcolina em neurnios centrais e perifricos.

Este o mecanismos de ao dos inseticidas organofosforados, como o malathion e o parathion. Tanto a acetilcolinesterase de insetos como de mamferos so igualmente inibidas por essas drogas. Contribue para a toxicidade desses inseticidas a longa meia vida que esses apresentam no ambiente.Acetilcolinesterase complexada com sarin ou gs dos nervos (dose letal 0,01 mg/kg, oral), um organofosforado altamente txico e voltil, que reage com o resduo de Ser ativo da enzima.dose letal: 3-13 mg/Kg, oralInseticidasorganofosforados

PMSF phenylmethane sulphonyl fluorideNo laboratrio, serino-enzimas podem ser identificadas por serem eficientemente inibidas por compostos organofosforados menos txicos como o diisopropilfluorofosfato (DFP) ou o fluoreto de fenilmetilenosulfonila (PMSF).

Diferentes compostos so utilizados em laboratrio para identificar o mecanismo cataltico de enzimas, baseado em reaes especficas para as cadeias laterais de aminocidos que podem fazer parte do stio ativo dessas.

Serpinas: serine proteinase inhibitorsModo de ao de serpinas:

A serpina e a enzima inicialmente formam um complexo no covalente (EI), complexo de Michaelis. Em seguida, a clivagem da ligao peptdica na ala reativa forma em um intermedirio acil-enzima (EI*), que pode resultar em transposio e insero da ala da serpina na enzima, bloqueando-a permanentemente, ou em certas circunstncias, na liberao da serpina clivada e da enzima livre.Inibidores proteicos de enzimas proteolticas desempenham importantes papis fisiolgicos. Entre esses esto as serpinas, inibidores de serino-proteinases, e as cistatinas, inibidores de cisteno-proteinases. Em ambos os casos, os inibidores funcionam como falsos substratos, sendo reconhecidos e clivados pelas enzimas, que ficam aprisionadas num complexo com o inibidor.

A Superfamlia dasSerpinasserpinas inibitriasserpinas no inibitrias so conhecidas cerca de 500 serpinas (at set.2001)apresentam 1 cadeia com 350-500 aminocidosfilogenticamente formam 16 clsa maioria tem atividade como inibidor de serino proteinasesexistem serpinas no inibitriasa figura ao lado mostra vrios processos fisiolgicos e/ou patolgicos nos quais existe participao de serpinas


Entre estes mecanismos, destacam-se:Como so controladas as enzimas in vivo, alm de alteraes na disponibilidade de S e da prpria E ? Inibidores: irreversveis: no proticos e proticos reversveis: competitivo, no competitivo ou misto, incompetitivo



Inibio competitiva o inibidor anlogo estrutural do substrato e compete com ele pela ligao ao stio ativo com aumento da [substrato], ocorre diminue da inibio caracterizando uma competio entre S e I no h alterao da Vmax h um aumento de Km por um fator a, que permite o clculo da constante de inibio, Ki

Inibio no competitiva ou mista inibidor no anlogo estutural do substrato - no se liga ao stio ativo inibidor se liga E e ao ES aumento da [substrato] no diminue a inibio - no h competio Km aumenta e Vmax diminu

Inibio incompetitiva inibidor anlodo do estado de transio e se liga somente ao complexo ES Km aumenta e Vmax diminu


Entre estes mecanismos, destacam-se:Como so controladas as enzimas in vivo, alm de alteraes na disponibilidade de S e da prpria E ? Agora vamos falar de:Inibidores: irreversveis: no proticos e proticos reversveis: competitivo, no competitivo ou misto, incompetitivo



Ativador alostricoInibidor alostricoEnzimas tipo K: efetores alostricos alteram o KmEnzimas tipo V: efetores alostricos alteram a VmaxEnzimas alostricas possuem uma regio diferente do stio ativo ao se liga um efetor ou modulador alostrico. A mudana conformacional decorrente da ligao do efetor alostrico se propaga pela molcula e afeta o stio ativo, ativando-o ou inibindo-o. Observe nas figuras.Grfico V x S (Michaelis-Menten) uma curva sigmide

A aspartato transcarbamoilase fornece N-carbamoil-aspartato para a rota de sntese de pirimidinas. uma enzima alostrica tipo K, inibida por CTP e ativada por ATP, sendo composta por 6 unidades regulatrias e 6 catalticas.




Modulao covalenteFosforilao e defosforilao Ativao de zimognios

inativaativaFosforilao - DefosforilaoquinasefosfataseAo contrrio da alosteria, em que os efetores ligam-se enzima apenas por ligaes fracas, na modulao covalente a enzima modificada covalentemente por duas outras enzimas: uma quinase fosforila a enzima s custas de ATP, e uma fosfatase remove o grupo fosfato da enzima fosforilada. A modulao covalente energticamente cara, pois necessita duas outras protenas e ATP para regular a atividade de uma enzima. Ao contrrio, na alosteria a enzima controlada pelas concentraes relativas de seus efetores e a afinidade da enzima por estes.

Em resposta ao hormnio adrenalina ou epenifrina, h um aumento da concentrao de glicose circulante, preparando o organismo para luta ou fuga.

Na primeira etapa dessa resposta metablica, a adrenalina ativa por alosteria a enzima de membrana adenilato ciclase, formando AMP cclico.

Numa segunda etapa de alosteria, o AMP cclico ativa a protena quinase A (PKA), ligando-se sua unidade regula- tria e liberando a unidade cataltica ativa.

Na terceira etapa, ocorre modulao covalente em que a PKA fosforila a fosforilase quinase, tornando-a ativa.

Na quarta etapa, tambm por modulao covalente, a fosforilase quinase fosforila a glicognio fosforilase, ativando-a. Por fim, esta hidrolisa diretamente o glicognio liberando glicose-1-fosfato para a via glicoltica.A regulao do metabolismo intermedirio, por exemplo, sntese e degradao de lipdeos e carboidratos envolve etapas de alosteria e modulao covalente

membranaXZEnzima 4EMecanismos de regulao do metabolismo de carboidratos e lipdeosEm vias metablicas reguladas por alosteria, uma enzima inicial da rota controlada por um dos produtos finais da mesma.




Modulao covalenteFosforilao e defosforilao Ativao de zimognios

zimognios: as proteases so sintetizadas numa forma inativa por estar em uma conformao desfavorvel, com bloqueio ou desalinhamento dos resduos do stio cataltico. conformao desfavorvel resulta de pores adicionais da cadeia poli-peptdica, que devem ser retirados para que a protena assuma a forma ativa. podem acontecer duas situaes, combinadas ou no: - zimognio tem uma extenso N-terminal (pro-segmento) que precisa ser retirada. Pro-segmentos podem ter de 2 a 150 resduos a.a. - zimognio tem cadeia polipeptdica nica, que precisa ser clivada (protelise limitada) para formar duas ou mais subunidades. converso do zimognio protease ativa pode resultar da ao proteoltica de outra protease, ou de alterao do pH ou temperatura do meio, ou ainda, da adsoro do zimognio uma superfcie negativa. Esses eventos determinam mudana conformacional e/ou auto-hidrlise pela prpria protease. ativao irreversvel, e porisso, energeticamente cara para o organismo.Ativao de zimognios um caso especfico de modulao covalente exclusivo de alguns tipos de enzimas proteolticas.

A Quimotripsina formada por dois domnios, com 6 folhas antiparalelas (vermelho) cada. O stio ativo contendo a trade cataltica (Ser195, Asp102, His57, as cadeias laterais esto destacadas) localiza-se entre os dois domnios. As pontes S-S aparecem em violeta.Linhas pontilhadas indicam os resduos 14-15 e 147-148 presentes no precursor inativo, quimotripsinogenio. A enzima digestiva quimotripsina sintetizada como quimotripsinognio, com um cadeia nica, impossibilitando a montagem do stio ativo, formado pela His57, Asp102 e Ser195 (em rosa). No intestino, o quimotripsinognio clivado pela tripsina em dois pontos, retirando dois dipeptdeos. A quimotripsina ativa possue trs subunidades, cadeias A, B e C, unidas por 5 pontes S-S.

As asprtico-proteases gstricas, como a pepsina, so sintetizadas como zimogniosEm verde est representado o prosegmento com 43 aminocidos, que bloqueia o acesso ao stio ativo.

Inicialmente, o pepsinognio ativado pela exposio ao HCl, com uma mudana conformacional que permite que algumas molculas hidrolisem o pro-segmento, tornando-as ativas.

Em seguida, a pepsina formada faz a protelise limitada de mais molculas de pepsinognio.

Em rosa est representado as regies da molcula que se reorganizam com a retirada do pro-segmento.

A Coagulao Sanguinea resultado da ativao de uma cascata de zimognios de serino-proteinases.

A cascata pode ser iniciada independentemente atravs do fator XII (via intrnseca) ou do fator VII (via extrnseca). Ambas as rotas convergem para uma via comum, com a ativao do fator Xa. Este, em presena de fator Va, converte protrombina em trombina. O fibrinognio clivado formando fibrina por ao da Trombina.VIA COMUM VIA INTRNSECA Xa X VIIIa IXa IX XIa XIIa Superfcie - Va PKHMWKSuperfcie -Va V XII XI

Para mais informaes, visite as pginas abaixo:http://www.brenda.uni-koeln.de/

http://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/CSA/

http://merops.sanger.ac.uk/cgi-bin/merops.cgi?id=index;action=clanid

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