Profª. Drª. Priscila MelloElaborado por: Profa. Dra. Marta Bastos

Seqüência alvo

✓ Reação que permite a amplificação

de um fragmento específico de DNA,

aumentando a possibilidade de

visualização.

✓ “XEROX MOLECULAR”

✓ 1952 - Watson & Crick: Modelo da molécula de DNA

✓ 1971 - Gobind Khorana:

replicação de um pedaço de

DNA 2 primers.

✓ Maquinaria de

Replicação.

✓ Separação da dupla fita de DNA

- Helicase X Aumento da temperatura

✓ 1985 - Kary B. Mullis- Amplificação

de sequências de DNA.

Limitações:

-Síntese de primers

- Purificação de DNA polimerase

✓ Limitações:

- Síntese de primers

- Purificação de DNA polimerase

✓ 1976 - Thomas D. Brock

- DNA polimerase termoestável de

Thermus aquaticus .

✓ Desnaturação

✓ Anelamento

✓ Elongação

✓Termociclador

✓ amostra de DNA (template- molde)

- DNA genômico

- cDNA

✓ primers (iniciadores)

✓ dNTPs

✓ DNA polimerase

✓ MgCl2

✓ Solução Tampão e água destilada

✓ primers (iniciadores)

✓ dNTPs

✓ DNA polimerase

✓ MgCl2

✓ Solução Tampão e água destilada

DNA

Esta reação permite a amplificação de qualquer

sequência de DNA coletada de amostras de materiais

biológicos como sangue, urina, outros fluidos corporais,

cabelo e fragmentos teciduais. Amostras de

microorganismos, células vegetais ou animais mesmo

que com milhares de anos, também podem ser

detectadas pela PCR.

* Aplicável em organismos mortos. Uma vez que a amplificaçãoocorre in vitro, e depende apenas da amostra genética coletada,não do complexo enzimático do organismo.

VANTAGENS

* Facilidade de contaminação: Devido a sua alta sensibilidade,os fragmentos de amostras anteriormente trabalhadas(amplicons na forma de aerossóis) podem vir a seremamplificados no processo.

Para reduzir o risco de contaminações são fundamentais osseguintes cuidados:

DESVANTAGENS

• A separação física em dois laboratórios “pré-PCR” e “pós-PCR”,de modo que cada um tenha o máximo de independênciapossível

• Descarte de ponteiras e tubos utilizados.

• Controle do fluxo de pessoas, também de visitantes externos,

mas principalmente do pessoal que pode transitar de umlaboratório para o outro. O maior risco de contaminação éatravés dos amplicons (fragmentos de DNA) produzidos nolaboratório pós “PCR” e transportados pelos experimentadoresate o laboratório de “pre-PCR”.

DESVANTAGENS

✓ Composta por ciclos

✓Desnaturação das cadeias

✓Anelamento dos Primers ou iniciadores

✓ Polimerização das novas cadeias complementares pela

ação da enzima Taq DNA polimerase.

✓ Temperatura de 94 a 96ºC (3 a 5 minutos )

✓ Temperatura de 94 a 96ºC (30 segundos)

✓Temperatura varia de acordo com os primers

✓Tempo

✓ Temperatura de 72ºC, tempo varia de acordo com tamanho

do amplicon

Desnaturação

Anelamento

ExtensãoFinal do ciclo

✓ Nº de ciclos variável: 25 a 30

1 ciclo = 2 Amplicons

2 ciclos = 4 Amplicons

3 ciclos = 8 Amplicons

4 ciclos = 16 Amplicons

5 ciclos = 32 Amplicons

6 ciclos = 64 Amplicons

7 ciclos = 128 Amplicons

No. No. Amplicons

Ciclos Copias do DNA alvo

1 2

2 4

3 8

4 16

5 32

6 64

20 1.048.576

30 1.073.741.824

✓ Eletroforese em gel de agarose

✓ Real time PCR ou PCR em tempo real

ou PCR quantitativo

Intensa padronização

Contaminação

Não automatizado

Necessidade de pós-processamento do produto

da PCR

Resultados não são expressos em números

✓ Real time PCR- PCR quantitativo

Diagnósticos de doenças infecciosas:

O diagnóstico de doenças infecciosas temcomo principio a detecção do patógêno ou desua ação..

Atualmente, o PCR é utilizado em laboratórios de

investigação médica e biológica objetivando diferentes

tarefas, como a identificação de doenças hereditárias, a

construção de árvores filogenéticas, a clonagem de genes,

teste de paternidade, detecção de organismos causadores

de infecções, concepção de organismos transgênicos, entre

outras.

✓ Diagnósticos moleculares

Identificação de doenças hereditárias

Testes de paternidade

✓Teste de paternidade

✓ Teste de paternidade

-Baseado em seqüências repetitivas encontradas no DNA

-Microssatélites (SNP- single nucleotide polimorphism): classe

de DNA repetitivo de poucas bases

- STR ou VNTRs : regiões com número variável de repetições

✓ Microsatélites (SNPs)

✓ Marcador molecular de

doença

✓ Teste de paternidade

(STRs ou VNTRs)

✓Teste de paternidade

✓Teste de paternidade

PM M F P1 P2

✓ Identificação de indivíduos

DNA controle

Acusado VítimaAmostra

✓ Análise Forense

Teste de paternidade

✓ Análise

Forense

✓ Análise da expressão de genes (RT-PCR)

- Extração de RNAm

- Preparo do cDNA

- gene de referência (gene constitutivo)

✓ RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA – DNA

polimórfico randomicamente amplificado)- DNA

fingerprinting

– PCR utilizando-se iniciadores aleatórios em baixa

estringência (especificidade no produto de DNA a ser

amplificado)

– Não é necessário um conhecimento prévio do genoma

– Uniformidade no padrão de bandas para espécies

relacionadas

400bp

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75bp

✓ RAPD