protocolos engenharia genética

DepartamentodeBiologia

BIOTECNOLOGIA ENGENHARIAGENTICAU

Manualprticoe Protocolosexperimentais 20102011 CarlosSinogas

www.ensino.uevora.pt/biotec

U

PROCEDIMENTOSDESEGURANA.................................................................................................................................................................3 Vesturioecomportamentos........................................................................................................................................................................3 Riscosfsicos........................................................................................................................................................................................................4 Riscosqumicos..................................................................................................................................................................................................4 Riscosbiolgicos................................................................................................................................................................................................5 Planeamento........................................................................................................................................................................................................5 Procedimentosgerais......................................................................................................................................................................................5 . REGISTOSERELATRIOS...................................................................................................................................................................................6 PreparaodoTrabalhoInventivo(Poster)................................................................................................................................................7 TcnicasLaboratoriaisBsicasemMicrobiologia....................................................................................................................................8 Meiosdecultura.................................................................................................................................................................................................8 Esterilizao.........................................................................................................................................................................................................8 TubosdeculturaePlacasdePetri..............................................................................................................................................................9 Instrumentosparatransfernciadeculturas........................................................................................................................................9 Cmarasdecultura........................................................................................................................................................................................10 . Frigorfico...........................................................................................................................................................................................................10 MtodosdeEsterilizao..................................................................................................................................................................................11 Esterilizaopelocalor.................................................................................................................................................................................11 Esterilizaoporgases.................................................................................................................................................................................12 Radiaes...........................................................................................................................................................................................................12 . Filtraoestril................................................................................................................................................................................................13 Desinfectanteseantispticos...................................................................................................................................................................13 PROTOCOLOSEXPERIMENTAIS....................................................................................................................................................................14 PIPETAGENS,DILUIESESOLUES......................................................................................................................................................15 CULTURADEBACTRIAS(E.coli).................................................................................................................................................................20 PREPARAODEDNAPLASMDICO(LiseAlcalina)............................................................................................................................21 MINIPREPARAODEDNAPLASMDICO(MiniPrep).........................................................................................................................23 DIGESTOCOMENZIMASDERESTRIO...............................................................................................................................................24 . ANLISEDEDNASEMGELDEAGAROSE.................................................................................................................................................25 PREPARAODEBACTRIASCOMPETENTES.......................................................................................................................................26 TRANSFORMAO..............................................................................................................................................................................................27 . Anlisedeprotenarecombinante................................................................................................................................................................28 ELECTROFORESEDEPROTENAS(PAGE)................................................................................................................................................29 PreparaodasAmostras............................................................................................................................................................................30 Preparaodogel...........................................................................................................................................................................................30 UElectroforese..................................................................................................................................................................................................30 Electroforese.....................................................................................................................................................................................................31 Coloraodasprotenas...............................................................................................................................................................................31 ANEXOSPlasmdios..........................................................................................................................................................................................32 pCS11...................................................................................................................................................................................................................32 UpCS62................................................................................................................................................................................................................32 pCS62...................................................................................................................................................................................................................33 pCS71...................................................................................................................................................................................................................34 pCS84...................................................................................................................................................................................................................35 pSK+......................................................................................................................................................................................................................36 ANEXOSEnzimas..............................................................................................................................................................................................37 BamHI.................................................................................................................................................................................................................37 EcoRI...................................................................................................................................................................................................................37 SalI........................................................................................................................................................................................................................37 UANEXOSTabelaPeridica..........................................................................................................................................................................38 TrabalhoAutnomopararelatriofinal....................................................................................................................................................39

NDICE

Biotecnologia/EngenhariaGentica2010/11

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PROCEDIMENTOSDESEGURANA(AdaptadodeBiotechnologyExplorations,ASMPress) EnsinareaprendernolaboratriodeBiotecnologiaenvolvesempreumcertonvelderiscoparaooperadore companheiros.Novosequipamentos,reagentesemateriaisbiolgicossoparteintegrantedostrabalhos experimentaisqueenvolvemcidosnucleicoseprotenas.Osestudantesestoaaprendernovastcnicas,usando reagentesemateriaisbiolgicosenovosequipamentosqueapresentamalgumrisconocontextodasuautilizao laboratorial.Nosendopossvelfazeraexperimentaosemusarosequipamentos,osreagenteseomaterial biolgico,esperasedosestudantesqueadoptemasatitudesadequadasparaminimizaodosriscosassociados. Alertapermanente,umconceitoimportadodospilotosdeavio,criaoenquadramentoparaamanutenoda seguranaapropriadafaceaosriscosinerentes.Talcomoopilotodeveestaralertaparaasuaenvolvente,com constantevigilnciaparaasuaseguranaeadosoutros,assimosestudantesdebiotecnologiadevemfazerno laboratrio.Opilototemsempredesaberondeest,paraondevaiecomolchegar.Traduzidoparaoambiente laboratorial,osestudantesdevemestarconcentradosnastarefasquedesenvolvem,compreenderoequipamento, osreagenteseosmateriaisbiolgicosqueusam,devendoseguirospassosadequadosconduodaexperincia. Aomesmotempocadaestudantedeveconheceroqueosseuscolegasfazemeosprotocolosqueseguem. Nesteenquadramentosoquatroasprincipaisquestesdeseguranaquesecolocam: Vesturioecomportamentos Riscosfsicos Riscosqumicos RiscosBiolgicos

VESTURIO E COMPORTAMENTOS Reduziraomnimoospertencespessoaiseoutrosmateriaisnabancadadetrabalho.Casacos,sacoseoutros pertencesdeveroserdepositadosnobengaleiroentradadolaboratrio. Usodebataobrigatrio(Sempre),paraevitarsujaroucontaminararoupa. Cabelo,quandocomprido,devidamenteapanhadoparaevitarasuaignionachamaouacontaminao qumicaoubiolgica. Sapatosfechadossorecomendados,poisosabertosnoprotegemdeeventuaisrespingosquepossamcair. ProtecodosolhosepelenuaaquandodautilizaodeUV Luvasdescartveissoexigveisquandosemanipulamcertosreagentesoumicrorganismos. desaconselhadoousodejias,emespecialanisepulseirasqueimpedemoadequadousodasluvas. Comer,beber,mascarpastilhaselsticas,aplicarcosmticosproibidonolaboratrio,paraqueeventuais contaminaesnosejamdirigidasparazonasnoprotegidas.Roerasunhas,lpis,canetasededosnaboca igualmenteproibido,pelasmesmasrazes. Osestudantesdevemconhecerecompreenderbemotrabalhoafazer.Umaboaprogramaomeiocaminho paraumaboaexecuo.Odocentedeverserquestionadosemprequesurjamdvidassobreos procedimentosaseguir. Asmosdevemsersemprelavadasantesdeiniciarotrabalhoedepoisdeconcludaaexperimentao,para quecontaminantesnosejamintroduzidosnemtransportadosparaforadolaboratrio. Asbancadasdetrabalhodevemsersemprelimpasesanitarizadascomlcoolantesdoinciodotrabalhoe depoisdesteconcludo.Noseconheceoqueoutrosestudantespossamterdeixadonolaboratrio,nemse pretendedeixarcontaminaesparaquemvieraseguir.


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RISCOS FSICOSFogo Identificaralocalizaodochuveiro,dosextintoresedosbaldesdeareia. Identificaralocalizaodosquadroselctricosedatorneirageraldogs. Aquecerprodutosaaltastemperaturaspodeprovocarqueimaduras. Assoluesaquecidasnomicroondas,emespecialasagaroses,podemficarsobreaquecidaseentrarem ebulioexplosivaapsagitao,provocandoqueimadurasgraves.

Bicosdegselamparinas Conhecercomosedeveacenderobicodegs. Nuncaabandonarumbicooulamparinaacesa.Evitarmovimentlosquandoacesos. Flamejarosinstrumentoseostuboscomcuidadoparaevitarformaodeaerossis. Nousarmaterialfacilmenteinflamvelnasproximidadesdachama(atenoaolcool).

Autoclave Evitarexposioaosvaporesdaautoclaveaquandodasuaabertura.Podemprovocarqueimaduras. Usarluvasisolantespararemovermateriaisdaautoclave

Vidrospartidosematerialcortante Osvidrospartidosdeveroserremovidoscomauxliodepinaouluvas,nuncacomasmosdesprotegidas. Nocolocarvidrospartidosnolixocomum. Seapropriadorecolherparadescontaminao. Usarlminascortantescomauxliodepinasouluvas.

Equipamentoelctricoedeelectroforese Verificaroscaboselctricosdosequipamentosenuncausarcabosdefeituosos. Evitarousodematerialelctricoprximodegua. Desligaroequipamento(botoOFF)antesdeoligarcorrente.Nuncaligaroudesligarumaparelhode electroforesesemantescortaracorrente(botoOFF). Nuncaabrirumatinadeelectroforesesemantesdesligaracorrenteelctrica.

TransiluminadordeUV AousarotransiluminadordeUV,nuncaoligueantesdebaixaratampaprotectora. Desliguealuzantesdelevantaratampaeremoverogel.

RISCOS QUMICOS Prestaratenosnotasdosprotocolossobreosriscosassociadosaalgunsreagenteseseguirasinstrues dodocente. Nuncapipetarboca.Usarpipetadoresmecnicos. Osrestosdeprodutosqumicosnodevemserrejeitadosparaoesgoto. Localizarochuveiroeosistemadelavagemdeolhos.


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Aroupaatingidaporreagentesqumicosdeverserdeimediatoremovidaeapeleemcontactoser abundantementelavada. Noremoverprodutosqumicosdolaboratrio.

Algunsreagentesqumicosausarnasexperinciastmassociadosriscosparticulares.Ousodereagentesem soluoouprmisturadosreduzonveldeexposioeotempodasuautilizao.Aquantidademanipulada tambmimportante.Algunsreagentescomriscosespecficosautilizarnassesseslaboratoriais: AcrilamidaebisacrilamidaMutagnico,carcinognicoeneurotxicoqunadoinaladoouingerido.Usar apenassoluespreviamentepreparadasecomluvas. PersulfatodeamnioOxidantepotente.Manterafastadodemateriaiscombustveisedefontesdecalor. Clorofrmio DTT(Ditiotreitol)Provocairritaonosolhos,pele,membranasdasmucosasetratorespiratrio. EtanolInflamvel. Brometodeetdio(solues)Mutagnico.Usarluvas. SDS(laurilsulfatodesdio)Irritantedosolhosedapele. cidosebasesconcentradosCorrosivos.Provocamqueimadurasaocontacto.

RISCOS BIOLGICOS Desinfectarareadetrabalhoantesedepoisdemanipularmicrorganismos. Usarlixviadiluda(10%dehipocloritodesdio)paradescontaminarreaseinstrumentoseventualmente contaminados. Evitarasmosnabocaounosolhos. Flamejarcuidadosamenteinstrumentosetubosparaevitaraformaodeaerossis. Noremovermicrorganismosdolaboratrio. TratartodasasamostrasdeDNA,plasmdiosebactriascomomaterialcontaminado. Rejeitarasculturaseoutromaterialcontaminadonotabuleiroparaautoclavar. Nojuntarmaterialnocontaminadonotabuleiroparaautoclavar. Norejeitarnolixocomumoquequerquesejaquetenhacontactadobactrias.

Sebemqueosmicrorganismosausarnaexperimentao(E.coli)nocoloquemriscosbiolgicosparticulares devetersesempreemmentequesocriadascondiesdecrescimentodosmesmos.Orisconaturalmente aumentacomaquantidadedebactriaseoutrosmicrorganismos,eventualmentepatognicos,podemcontaminar asculturaseseramplificados.

PLANEAMENTONoiniciarqualquerexperinciasemoconvenienteplaneamento.Oconhecimentoecompreensoprviosdos procedimentosexperimentais,grelhasadequadaspararegistodosresultadoseaefectivadisponibilidadedetodos osrecursosmateriaisnecessriosconstituemelementosimportantesparaosucessodasexperincias.Otempo "perdido"numplaneamentoiniciallargamentecompensadopelonveldaaprendizagemconseguidoepela prevenodanecessidadederepetiodeexperinciaseventualmentebloqueadas.

PROCEDIMENTOS GERAISTodososprocedimentosdeveroserefectuadostendoemmenteaminimizaodosriscosassociados manipulao,numaperspectivadeprotecodoprpriooperadoredeterceiros.Maisimportantequeum conjuntoderegrasaobedecerautilizaodobomsensodooperadornostrabalhosarealizar.U

muitoimportanteusaracabeaantesdasmos.


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REGISTOSERELATRIOSconvenienteusarumblocooucadernopararegistodetodasasocorrnciasedosresultadosdaexperimentao. Sugereseousodecadernodelaboratrio,deprefernciacomfolhasnoamovveis,paraquenosejam eliminadasnotasouregistosconsideradosirrelevantesnaaltura,comosucedecomfrequnciaquandosepassam osapontamentos"alimpo",masdegrandeutilidadeparaconsultafuturanaelaboraodorelatriofinalouparaa eventualrepetiodaexperincia.Origorepormenordosregistosefectuadosduranteaexecuodotrabalho experimentalfacilitaroaaprendizagemeainterpretaodosresultadosobtidos,emespecialquandoestesso inesperados. Umqualquerrelatriodeumaexperincialaboratorialdeverdocumentardeformatocompletaquantopossvel oprocedimentoexecutadoeosresultadosobtidos.Paraalmdissodeversertambmobjectivodorelatorredigir umdocumentocompreensvelparaoleitoresusceptveldeapoiaraeventualrepetiodamesmaexperinciaem idnticascondies.Paraaelaboraodosrelatriossugeremse,comoorientao,asseguintesseces: Ttulo Resumo Objectivo Introduo Palavraschave Materialereagentes Protocoloexperimental Identificadordocontedodorelatrio Pequenotextodequeconstemosobjectivosalmejadoseasconclusesobtidas Razodeserdotrabalhorealizado Dadosconhecidosquejustificamarealizaodaexperinciarelatada Termosdirectamenterelacionadoscomotrabalho Listagemexaustivadoequipamento,reagenteseoutromaterialusado Marchageraldosprocedimentosaplicados.Deveroserrelatadosos procedimentosconcretosexecutados,comrefernciaaeventuaisdesvios relativamenteaoprocedimentorecomendado/descrito Registodasobservaesefectuadasedosdadosrecolhidos Comentriocrticoaosresultadosobtidos Descriodocumprimentoouincumprimentodoobjectivo,decorrentedos resultadosobtidos Comentrioglobalidadedaexperincia,comrecomendaesparaasua repetioououtrasconsideradasadequadas Refernciasconsultadasouutilizadasparaarealizaodotrabalho

Resultados Discusso Concluso Notacrtica Bibliografia

Dependentedotipodotrabalhoexecutado,daformadorelatrioedasensibilidadedorelator,algumasdas secesdescritaspoderoserfundidas,como"Resultadosediscusso"ou"Discussoeconcluses",por exemplo


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PreparaodoTrabalhoInventivo(Poster)Umacomunicaoemposter,emprincpio,aapresentaodeumtrabalhointermdioemcursosdeexecuo. Comasuaapresentaopretendese,emgeral,comunicarumamensagemaosvisitanteseesperasedestesuma interacoquepermitamelhorarotrabalhoemcurso. Amensagemapassardeverserimediata(primeiravista),defcilleituraederpidaapreensodistnciade, pelomenos,ummetro.Tantoquantopossveldeverserminimizadootextoaincluirevalorizadososesquemase grficos. ParaalmdaIDENTIFICAOdo(s)autor(es)edaInstituioondeotrabalhofoirealizado,umposterdever incluirumaprimeiraseco,quesedesignausualmenteporINTRODUO,emquecolocadooproblemaa abordarpelotrabalhoquesecomunicafaceaostateoftheartactualequeconduzdirectamenteaosOBJECTIVOS almejados.DeverdepoisexistirumaoutrasecoemquesedescrevaaMETODOLOGIAutilizada(ouautilizarno casodepropostasdetrabalhofuturo)aantecederosRESULTADOSobtidos(ouesperados)quedeverodepoisser contextualizadosnumaDISCUSSOdequeresultaaCONCLUSO.PorfimdeverserindicadaaBIBLIOGRAFIAem queoautorsebaseouparaarealizaodotrabalho.


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TcnicasLaboratoriaisBsicasemMicrobiologiaAodesenvolvimentodostrabalhosemBiotecnologiafundamentalrecorrerstcnicasprpriasdaMicrobiologia paraamanipulao,crescimentoemanutenodebactriaseoutroshospedeirosdeDNAsrecombinantes. Osmicrorganismossoubquos.Podemencontrarsenosolo,noar,nagua,nacomida,nosesgotosenas superfciescorporais,entreoutroslocais.Ouseja,existemportodooladonossavolta,onossoambienteest repletodemicrorganismos.Paraestudarqualquertipodemicrorganismonecessriosepararestaspopulaes mistas,deformaamanipularnolaboratrioaschamadasculturaspuras,culturasdeumanicaestirpe.Apesardo fornecimentodeestirpesbacterianaspurasparaarealizaodostrabalhos,asculturaspodemviraser contaminadas. Paraisolareestudarosmicrorganismosemculturapura,oexperimentadornecessitadealgunsequipamentos laboratoriaisbsicosedaaplicaodetcnicasespecficasusandomateriaisparticulares.Nasprticasque aplicaremosnodecursodestadisciplina,tersederecorrerstcnicasbasedemicrobiologia/bacteriologiacom utilizaodosequipamentosemateriaisespecficosqueseindicam: Equipamento Autoclaveedispositivosdefiltraoestril Ansaseagulhas.Pipetasemicropipetas Banhosdeguaeestufas Frigorfico Fluxolaminar(conveniente) guadestiladadequalidade Meiosdecultura(bactrias) Lquido Semislido Slido Tubosparacultura PlacasdePetri

Materiais

MEIOS DE CULTURAAsobrevivnciaeosuportedevidadosmicrorganismosdependemdofornecimentoadequadodenutrientese convenientescondiesparaoseucrescimento.Quantoaosnutrientes,grandepartedosmicrorganismosapenas necessitamdesubstnciasolveisdebaixopesomolecular,usualmenteoriginadaspeladegradaoenzimticade outrosnutrientesmaiscomplexos.Umasoluocontendoestesnutrientesdesignadacomomeiodecultura.Em geral,osmeiosdeculturasolquidos,semislidosouslidos.Ummeiolquidosemagentesolidificante designadoporcaldonutritivo.Umcaldonutritivosuplementadocomumagentesolidificante,usualmenteoagar, originaummeioslidoousemislido.Oagarumextractodealgasmarinhas,umcarbohidratocomplexoque contemmaioritariamentegalactoseepossuimuitopoucovalornutritivo.Oagarmuitoadequadocomoagente solidificanteporqueseliquefazacercade100Cesolidificaa40C.Devidoaestaspropriedades,os microrganismos,emespecialospatognicos,podemsercultivadosatemperaturasdaordemdos37Csemreceios deliquefacodomeiosolidificado.Ummeiodeculturabemsolidificadoexigeumaconcentraodeagarda ordemdos1,5a1,8%.Umaconcentraoinferiora1%resultanummeiosemislido. Paraalmdasnecessidadesnutritivas,vriosoutrosfactoresambientaisprecisamdesercontroladosparao sucessodaculturadosmicrorganismos,comosejamopH,atemperatura,oambientegasosoouapresso osmtica.

ESTERILIZAOAesterilizaoumdospontoschaveparaosucessodotrabalhoemmicrobiologia.Paratrabalharemcondies deesterilidadefundamentalousodematerialestrileaaplicaodetcnicasadequadas.Aesterilizao processopeloqualsoeliminadastodasasformasdevidadequalquermeiooumaterial.Asprincipaistcnicas paraaesterilizaoderotinaemlaboratriosoasseguintes:


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Calor

Filtrao Produtosqumicos

Calorseco(arquente) 160Ca180Cdurante1/2horaa3horas Materialdevidroemvazio Calorhmido(vapor) Circulaodevapora100C.Esterilizaointermitente(soluestermolbeis) Autoclave.Vaporsobpresso,temperaturasacimados100C(meiosdecultura, soluestermoestveis) Membranasfiltrantescomporosde0,05ma0.8m Remoodemicrorganismosdesoluestermolbeisporfiltrao xidodeetileno Materialdeplstico Betapropiolactona Tecidosvivos,materiaisbiolgicos

TUBOS DE CULTURA E PLACAS DE PETRITubosdeensaioemvidroeplacasdePetriemvidroeplsticoconstituemosprincipaissuportesparao desenvolvimentodasculturasdemicrorganismos.Ummeionutritivoadequadonaformadecaldonutritivooude agarusadoemtubosdeensaio,enquantonasplacasdePetriapenasseusameioslido.Umambienteestril preservadonostubosdeculturaporvriostiposdetampas.Historicamenteorolhodealgodohidrfobo, desenvolvidoporSchroederevonDuschnosculodezanove.Hojeemdia,amaiorpartedoslaboratriosusam tampasemformademanga,emmetalouplsticoresistenteaocalor.Avantagemdestastampasresidenofactode noexigiremtantotrabalhonasuapreparaoeseremmaisfacilmenteremovidasereintroduzidasnostubos duranteamanipulao. AsplacasdePetridisponibilizamumamaiorsuperfcieparaculturaecrescimentodosmicrorganismos.So compostasporumabasecircularinferior,ondecolocadoomeioeporumatampadomesmoformatoe ligeiramentemaiorqueseencaixanabase.ExistemplacasdePetridevriasdimensesparadiferentesexigncias laboratoriais.Narotinasousadasplacasdecercade10cmdedimetro.Omeionutritivoestril,contendoagar, numvolumede15a20mlvertidonasplacasquandoaindaquenteapsfusodoagaredeixadoarrefecera temperaturainferiora40C.Depoisdeinoculadascomosmicrorganismosasplacassoincubadasemposio invertidaparaevitarqueasgotasdecondensao,formadasnatampaduranteoarrefecimentodoagar,tombem sobreasuperfciedoagar.

INSTRUMENTOS PARA TRANSFERNCIA DE CULTURASExisteanecessidadedetransferirosmicrorganismosdeummeiodeculturaparaoutros,desdeculturasde armazenamentoamanutenoparaculturasdeanlise.oprocessodesubculturaquetemdenecessariamente serefectuadocomtcnicaestrilparaevitarpotenciaiscontaminaesdassubculturas. Asansaseagulhas,usualmentefabricadascommetaisinertescomoaplatinaeinseridasemcabosprpriosparaa manipulao,soinstrumentosmuitodurveisdefcilutilizao.Sofacilmenteesterilizveisnomomentodasua utilizaoporincineraochama,numaposioquaseverticalatometalficaraorubro.Importardepois deixararrefecerentre10a20segundos,foradachama,masnasuaproximidade,ondeacargademicrorganismos ambientaisviveisinferior.Depoisdearrefecidos,paranoinactivarosmicrorganismosatransferir,podemser usadaspara"picar"umaculturaslidaoulquidaeinocularoutromeio.Umavezesterilizada,aansadeverserde imediatoutilizadaantesdeserdenovocolocadanabancada. Aspipetassooutrosdosinstrumentosdetransfernciadeculturasdeusomuitogeneralizado.Socalibradase permitematransfernciadequantidadesdeculturaslquidaspreestabelecidas.Sodevidroouplstico,comuma extremidadeafiladaeoutraparaaaspiraoeexpulsodolquidoquecontenham.Podemseresterilizadaspor calorsecoouhmido,conformeotipodematerialdequesoconstitudas.Apesardetradicionalmenteserem instrumentospara"pipetarboca"proibidousarabocaparaaspirarmicrorganismos.Existemauxiliares mecnicosdisponveisparaoefeito,comoperasdeborrachaoucorposdeseringaqueseadaptamnaextremidade largadapipeta. AspipetasPasteur,tubosdevidronograduadoscomumadasextremidadesafiladassotambmdeusomuito frequenteemtrabalhosdemicrobiologia,tambmpelasuafacilidadedeesterilizaoextempornea.


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CMARAS DE CULTURADascondiesparacrescimentodosmicrorganismos,umadasmaisrelevantesasuatemperaturaptimade crescimento.Asestufassousadasparaamanutenodatemperaturaptimadosmicrorganismosem crescimentoduranteoperododecultura.Socmarasemqueatemperaturaambienteinteriorcontroladapor termstato,paraqueamesmasejamantidadentrodelimitesapropriadosparaocrescimentocelular.Usamem geralumsistemadecirculaodearaquecidoe,paraevitaradesidrataodosmeiosemincubao,devero contertambmumafontedevapordegua(umrecipientecomguanoseuinterior,quandonovenham preparadasparaoefeitodeorigem). Osbanhosdegua(banhomaria)comguaatemperaturacontroladaportermstatoconstituemoutrodos instrumentosfrequentementeempreguesparaacriaodascondiesdetemperaturaptimadecrescimentodos microrganismos.Ontimocontactodaguaatemperaturacontroladacomorecipienteondecrescemos microrganismosapresentaavantagemdepermitirumamaisrpidaeeficaztransfernciadocalor.Almdisso,os banhoscomagitaofacilitamtambmoarejamentodasculturas,degrandeimportnciaparaocrescimentodos microrganismosaerbios.Adesvantagemdobanhodeguaresidenofactodespoderserusadoparaasculturas emmeiolquido,aocontrriodasestufasdear,queservemtantoparaculturasemmeiolquidocomoemmeio slido.

FRIGORFICOOfrigorficooutradaspeasfundamentaisemlaboratriodemicrobiologia.Oambientedebaixatemperatura quedisponibilizadamaiorrelevnciaparaamanutenoearmazenamentodasculturascelularesemfasede nocrescimentoentreosperodosdesubculturaeparaaconservaodosmeiosesterilizadoseoutrosreagentes. Tambmassoluesecompostostermolbeistmperodosdeconservaomaisalargadosquandoarmazenados abaixastemperaturas.


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MtodosdeEsterilizaoEsterilizaoumprocessoqueeliminatodososorganismosvivosqueseencontremsuperfcieounointerior deummaterial,podendoseralcanadopelaexposiodomaterialaagentesletaisfsicosouqumicosou,nocaso doslquidos,pelaseparaomecnicadosorganismosatravsdefiltraes.Existemmuitasformasdeesterilizar materiaisemeios,easuaescolhadependedanaturezadosmateriaisaseremesterilizadosbemcomoda disponibilidadedemeiosdetrabalho. Anoodeesterilidade(estril=infecundo)encontrasefrequentementeassociadaaduasoutras:adeassepsia (ausnciadesepsis=putrefaco)eadedesinfeco(livrardainfeco).Estessignificadosliteraiscorrespondem, defacto,snoestcnicasdestasterminologias.Emmicrobiologiareferimonosaesterilizaoquandose pretendeimpedirapropagaodemicrorganismos;aassepsiaquandosepretendetrabalharemambiente desprovidodemicrorganismoseadesinfecoquandoseaplicamtcnicasdestinadasaeliminarmicrorganismos potencialmentepatognicosparaooperador. Destasnoes,aaprofundarnoexercciodaexperimentaoquesedesenvolvernadisciplina,importa consideraremparticularastcnicasqueseutilizamemmicrobiologiaparaaeliminaodemicrorganismos viveis:aesterilizao.

ESTERILIZAO PELO CALORA.CalorHmidoOaparelhomaisusadoparaesterilizarmateriaisemeiosdeculturaaautoclave.Asautoclavestrabalham semelhanadepanelasdepressodomsticas.Asautoclavesdelaboratriooperamnormalmentesobuma pressode1,02Baraumatemperaturade121C.Aautoclaveesterilizaamaioriadosmateriaisem1530 minutos,sendoavariaodotempodeesterilizaodevidarelaosuperfcie/volumedosmateriaisaserem esterilizados.

Aspectosdaesterilizaoporvaporpresso TemperaturaOsendoesporosdasbactriassoasformasdevidamaisresistentesaocalor,easuadestruiopodeser conseguidaseforaplicadovaporsobrepresso.Umatemperaturade121Cofereceumaboamargemde seguranaseformantidaduranteumespaodetempoapropriado.

HumidadeAcoagulaodoprotoplasmabacterianoemtemperaturasmoderadasrequerhumidadeehmedidaqueesta removidaatemperaturanecessriaparahavercoagulaoaumentarapidamente.Seovaporforsobreaquecido ficarmais"seco"oqueocasionaumaumentodatemperaturaedotempodeexposioparaaesterilizao,que nasituaoextremadeesterilizaoemcalorsecoserde170Cduranteumahora.Emconcluso,vapor excessivamentequenteperdealgumadasuaeficciacomoagenteletalparaalmdepoderserlesivoparaos materiaisaseremtratados.

PressoApresso,nosvaloresusadosnaautoclave,porsisnoexercequalquerefeitonaesterilizao,sendotilpara elevaratemperaturadovaporacimados100C.

TempoOtemponecessrioparaqueovaportenhaaoportunidadedepenetrareaquecerosmateriaisaserem esterilizados.Mesmoquandoastemperaturasdeesterilizaosoatingidas,osagentesviraisoumicrobianosno sotodosmortosdeumavez.Avelocidadedemorteumaconstanteaumadadatemperaturaeporcadaunidade detempodeexposioaoagenteletal,umaproporoqueconstanteparaumadadapopulao.Normalmente demora11a12minutosa121C(calorhmido)paramatarosendoesporosdasbactriastermoflicas,osagentes maisresistentesnasmanipulaesdodiaadia.


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PurgaOarrelativamentefrionacmaradeesterilizaomuitomaispesadoqueovaportemperaturade esterilizao.Senoforpermitidaasadadoarcriaseumaestratificaonaautoclavequeconduzaumafaltade uniformizaodastemperaturasdesenvolvidas.Umavezqueoareovaporsolentosamisturaremse,as diferenasdetemperaturaentrecamadaspodesermuitogrande,porissoanecessidadedesesubstituirtodooar porvapor(purga).

NaturezadocarregamentoGeralmente,osmateriaismaisvolumososrequeremummaiortempodeesterilizao,sendoprefervelesterilizar pequenosvolumesdecadavez,porexemploprefervelesterilizar5balesdelitrodecadavezdoqueesterilizar apenasumbalocomcincolitros.Osfrascosdevemsertapadoscomalgodooupapel.Sefornecessriousar tampasroscadas,devemirpoucoapertadasparaaautoclavedemodoapermitiremasadadeareentradade vapor,evitandoseassimorebentamentodefrascosnaautoclave.

B.CalorsecoOcalorsecousadoparaesterilizarmaterialdevidro,outrosmateriaisslidostermoestveisealguns componentesdemeiosoualimentosqueficariamimprpriosseexpostosaovapor.Tratasetambmdeumdos mtodosdeesterilizaomaisusadosedemuitofcilaplicao.Oequipamentoindispensvelapenasuma estufadealtatemperatura(160200C).Paraalmdeterdesertidaemcontaaresistnciatrmicadosmateriais aesterilizarporestatcnica,aoutraprecauoaconsiderarprendesecomaminimizaodapossibilidadede contaminaressesmateriaisdepoisdaesterilizao.

ESTERILIZAO POR GASESOrecenteincrementodousodematerialdeplsticodeutilizaonicacomoseringas,caixasdePetri,tubosde cultura,filtros,etc.,levouaodesenvolvimentodeumanovaformadeesterilizaoqueusagasestxicosparaa eliminaodosmicrorganismosdemateriaistermosensveis.Aaplicaodestatcnicarequerautilizaode equipamentosprpriosqueforcemacirculaodogstxicoatravsdetodasassuperfciesdosmateriais,oquea tornadedifcilutilizaoemlaboratriosdetiponoindustrial. Oxidodeetilenoogsusadocommaiorfrequncianestetipodeesterilizaes.Estegs,aocontrriode muitosprodutosqumicostxicos,poucocorrosivoenoalteraosmateriaisaseremesterilizados,sendo facilmenteremovidoporarejamento.Assuasdesvantagensincluemanecessidadedelongosperodosde exposioparaseobteraesterilizao(vriashoras),areactividadecomcomponentesdosmeiosecertostiposde plsticoseanecessidadedeequipamentosprpriosedisponibilidadedogs,comosereferiu.

RADIAESAlgunsprocessoscomerciaisusamasradiaesparaaesterilizaoafriodecertosmateriaiscomoprodutos farmacuticos,porexemplo.Airradiaoousoderadiaesionizantesdealtaenergiaqueincluemraiosgama produzidosapartirdecobalto60oucsio139ederaioscatdicosproduzidosemgeradoreseaceleradoresde electres. Airradiaocomluzultravioletanoumaformamuitosatisfatriadeesterilizaodadaasuafracacapacidade depenetraonosmateriaiseprodutosaesterilizar.,contudo,deutilizaofrequentenadiminuiodonvelde contaminaodeespaosconfinados,comosalasestreisoupequenosambientes,sendoparticularmenteteis tambmparaareduodainfecciosidadeviraldevidosalteraesinduzidasnomaterialgenticodaspartculas viraisexpostas.


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FILTRAO ESTRILOprincipalmtodoparaaesterilizaodelquidosquecontenhamcomponentestermosensveistaiscomo vitaminas,protenassricaseantibiticos,porexemplo,afiltrao.Tradicionalmenteosmicrobiologistas esterilizavamestesprodutosrecorrendoafiltrosfeitosapartirdeterradediatomceasefibrasdeasbesto, previamenteesterilizadosemautoclave.Presentementeestesfiltrosforamsubstitudosporfiltrosdeacetatode celuloseoupolicarbonatosnosquaisostiposdeporosdesenvolvidospermitemfiltraescomelevadosgrausde preciso.Existemactualmentedisponveisnomercadofiltrosesterilizantesdevriosporosecapacidades filtrantes.Osmaisfrequentese,porisso,maisacessveissofiltrosdeporosde0,45mou0,2mdedimetro, queretmosmicrorganismospresentesnassolues. Paraesterilizarumasoluoporfiltrao,nohmaisquepassaressasoluoatravsdeumdestesfiltrospela aplicaodeumapressopositivanolquidoafiltrar(filtrosdeseringa,porexemplo)ounararefacodoarno contentorquerecebeofiltrado.Emqualquerdoscasosestatcnicarequerarecolhadofiltradoemcondiesde assepsiaparaimpediracontaminaodolquidoesterilizado. Salvorarasexcepes,afiltraoestrilnoretmaspartculasvirais.Nopodendoserconsideradocomo mtodode"esterilizaodevrus".Afiltraoestrilmesmoumatcnicafrequentementeusadaemvirologia paraapurificaodesuspensesviraispelaeliminaodebactriaspotencialmentecontaminantes.

DESINFECTANTES E ANTI-SPTICOSMltiplosreagentesqumicossodiariamenteutilizadosparacontrolodadisseminaodemicrorganismos.Os produtosusadosna"limpeza"deutensliosdiversos,frequentementedemasiadotxicosparaserusados directamentenoHomem,sochamadosdedesinfectantes.Osprodutosqueaplicamosnapele,comomesmo objectivodeeliminareventuaismicrorganismos,soantispticos. Particularmenteeficazemuitotilnolaboratrio,paraeliminaodevrusemicrorganismosasoluode hipocloritodesdio(lixvia)comquesetratamosmateriaisdelaboratrioapsexposioaagentesinfecciosos.


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PROTOCOLOSEXPERIMENTAIS (NBDeumamaneirageralosprotocolosconstantesdestemanualforamadaptadosduraodeumasesso prticadeduashoras,noconstituindo,nasuageneralidade,asmelhoresopestcnicasparaosobjectivos pretendidos).


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PIPETAGENS,DILUIESESOLUESIntroduoOrigornasdiluiesaefectuarcomalgunsmateriaisbiolgicosereagentes,nocontextodevriosdostrabalhos experimentaisqueaquiseincluem,crticoefundamentalparaosucessoeparaafiabilidadedosresultados. Porqueseobservacomfrequnciaalgumainabilidadedosestudantesparaamanipulaoadequadadas micropipetaseparaumraciocniooperacionaltantodasdiluiesexpressascomopotnciasde10comonaforma deprepararsoluestituladas,introduzseestetrabalhopreliminar.

Materialereagentes Soluoconcentradadeazuldemetileno Sorofisiolgico(salino) guadestilada Micropipetasdiversas Microtuboseppendorf Espectrofotmetro

Procedimentoindividual Pipetagem1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Marcarquatromicrotuboseppendorf(de1a4) Paratubo2pipetar5Ldeguadestilada,portrsvezes(total15L) Paratubo2pipetar90Ldeguadestilada,portrsvezes(total270L) Paratubo3pipetar160Ldeguadestilada,portrsvezes(total480L) Pesarindividualmentecadaumdosquatrotubos. Registaraspesagens Avaliarosresultados

Procedimento(porgrupo) Diluiesdecimais1. 2. Marque6tubosdeensaio(de1a6) Apartirdasoluoconcentradadeazuldemetilenoproceda,sseguintesdiluiessequenciais: Tubo Solvente(ml) Corante(ml) Soluoprecedente(ml) Diluio(10 x )P P

1 0 5,0 0

2 4,5 0,5 0

3 4,5 0 0,5

4 4,5 0 0,5

5 4,5 0 0,5

6 4,5 0 0,5

3. 4. 5. Completaropreenchimentodatabelaacimacomasdiluiesemcadatubo. Registeasintensidadesdecorobservveisnosdiferentestubos Determineaabsorvnciadassoluesa600660nm(lerdamaisdiludaparaamaisconcentrada).


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Diluiesdetrsemtrs1. 2. Marque6tubosdeensaio(de1a6) Apartirdasoluoconcentradadeazuldemetilenoproceda,sseguintesdiluiessequenciais: Tubo Solvente(ml) Corante(ml) Soluoprecedente(ml) Diluio(10 x )P P

1 0 5,0 0

2 5 2,5 0

3 5 0 2,5

4 5 0 2,5

5 5 0 2,5

6 5 0 2,5

3. 4. 5. Completaropreenchimentodatabelaacimacomasdiluiesemcadatubo. Registeasintensidadesdecorobservveisnosdiferentestubos Determineaabsorvnciadassoluesdostuboscomnmeropara600660nm

TPC Diluionica1. Apartirdasoluoconcentradadeazuldemetilenocomoprocederiaparaapreparaode5mlde cadaumadasseguintessolues: i. Diluiode5x10 2 P P

ii. Diluiode5x10 2 P P

PreparaodesoluesPretendendoseobter100mldecadaumadassoluesqueselistam,indiqueasquantidadesdeprodutosa misturarparaasuapreparaonolaboratrio: 1. NaOH0,1N 2. 3. 4. 5. 6. 7. U

SO 4 H 2 0,1NB B B B

NaCl0,1M NaCl100mM Glicerol10%(frmulaC 3 H 8 O 3 )B B B B B B

Glucose10%(frmulaC 6 H 12 O 6 ) Etanol70%(frmulaC 2 H 6 O 2 )B B B B B B B B B B B B


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RegistodeobservaeseResultadosPIPETAGENSEDILUIES Operador: Tubo Pipetagens 1 2 3 4 Tubo 1 2 3 4 5 6 Tubo Diluiesdetrsemtrs 1 2 3 4 5 6 Amostra DO 600nm /mlB B

Data: ____/____/____

Volume total 0 270L 480L

Peso

Diferena

Observaes

Amostra

DO 600nm /mlB B

Concentrao calculada

Observaes

Diluiesdecimais

Concentrao calculada

Observaes


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Grfico

Notas:


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SOLUES Operador: Diluio 5X10 2P P

Data: ____/____/____

Componentes

Peso/volume

Diluio 5X10 2P P

NaOH0,1N (100ml) SO 4 H 2 0,1NB B B B

(100ml) NaCl0,1M (100ml) NaCl100mM (100ml) Glicerol10% (100ml) Glucose10% (100ml) Etanol70% (100ml) Notas:


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CULTURADEBACTRIAS(E.COLI)

MaterialeReagentesBactriarecombinante LB10X: o Bactotriptona 100g o Extractodelevedura 50g o NaCl 100g o H2Odestiladaat 1000ml pH7,5. Autoclavar.Conservarestrila4C. Diluirextemporneaeesterilmentea1:10comguaestril. Ampicilina1000X o 50mg/mlemgua. Esterilizarporfiltrao,conservara20C

ProtocoloExperimental1. 2. 3. Preparar50mldemeioLB1X,contendoampicilina(50g/ml). Inocularcombactriacontendooplasmdioapreparar. Incubar37Cduranteumanoitesobagitao.


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PREPARAODEDNAPLASMDICO (LISEALCALINA)(NBlongadurao)

MaterialeReagentesBactriarecombinante LB1Xcomampicilina. Lisozima(p) Isopropanol 5MNaCl Etanolpuroe70% TEpH8,0 o 10mMTrisHClpH8,0 o 1mMEDTA) Pronase20mg/mlemgua o autodigeridadurante2horasa37C.Conservara20C PronaseMix: o Pronase 50l o 10%SDS 86l o H2O 860l RNAseA10mg/mlem: o 10mMTrisHClpH7,5 o 15mMNaCl o incubadapor15minutosa100Cearrefecimentolento.Conservara20C RNAsemix: o RNAseA 40l o TEpH8,0 10ml SoluoI: o 25mMTrisHClpH8,0 o 50mMGlucose o 10mMEDTA SoluoII: o 0,2NNaOH o 1%SDS SoluoIII: o 5MKOAc 60ml o Ac.acticoglacial 11,5ml o H2Odestilada 28,5ml pH4,8 Fenol:clorofrmio: o Fenoldestilado 50ml o Clorofrmio 50ml o Alcoolisoamlico 1ml o 8hidroxiquinolena 0,1g o TEpH8,0 15ml (usarapenasafaseorgnica,decoramarela,noagitar)


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ProtocoloExperimental1. Usar50mldeculturasaturadadebactriarecombinante. a. Centrifugar4.000XGdurante15minutosa4C. b. Lavarosedimentodebactriascom5mldeLB. c. Decantareescorrercompletamenteosobrenadante. Ressuspenderbemosedimentocom2mldeSoluoI. Adicionar10mgdelisozima.Misturar. a. Repousar10minutostemperaturaambiente. Adicionar4mldeSoluoII. a. Misturarporinverso. b. Repousar10minutosnogelo. Adicionar3mldeSoluoIII. a. Misturar. b. Repousar10minutosnogelo. Centrifugar7.000XGdurante30minutosa4C. a. Filtrarosobrenadanteporgazehidrfila. Adicionar0,6volumesdeisopropanol. a. Repousar10minutostemperaturaambiente. b. Centrifugar7.000XGdurante30minutos. c. Decantar. Lavaroprecipitadocometanola70%. Lavaroprecipitadocometanola96%. a. Secaroprecipitado. Dissolvercom500ldeRNAsemix. a. Incubara37Cdurante60minutos. Adicionar100ldePronasemix. a. Incubara37Cdurante30minutos. Extrair2vezescomfenol:clorofrmio(igualvolume). a. Tomarafaseaquosa,seminterfase. Adicionar0,04v.de5MNaCl(24*l)e2v.deetanolpuro(1,2ml). a. Precipitarduranteumanoitea20C. RecuperarDNAplasmdicoporcentrifugao(7.000XGdurante30minutos). a. Dissolvercom50ldeTEpH8,0. AvaliaraconcentraodeumaalquotaporleituradaDOa260nm a. (50g/ml=1UDO)

2. 3. 4. 5. 6. 7.

8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15.


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MINIPREPARAODEDNAPLASMDICO (MINIPREP)MaterialeReagentes(mesmosdaPreparaodeDNAPlasmdico)

ProtocoloExperimentalInocular5mldeLBcomcadacolniaaanalisar. a. Incubara37Cduranteumanoitecomagitao. 2. Pipetar1,5a2mldesuspensoparamicrotubo. a. Centrifugar1minutonamicrocentrfuga. b. Decantareescorrercompletamenteosobrenadante. 3. Ressuspenderosedimentocom100ldeSoluoI;Misturar. 4. Adicionar200ldeSoluoII;Misturarporinverso. 5. Adicionar150ldeSoluoIII;Misturar. 6. AgitarfortementemoparapartirDNAcromosomal. 7. Centrifugar5minutosnamicrocentrfuga. 8. Pipetar400ldesobrenadantelmpido(seminterfacenemprecipitadosobrenadante). 9. Adicionar250ldeisopropanol. a. Repousar10minutostemperaturaambiente. b. Centrifugar20minutosnamicrocentrfuga. c. Decantar. 10. Lavaroprecipitadocometanolpuro. a. Centrifugar5minutosnamicrocentrfuga. b. Decantar,escorreresecar. 11. Dissolvercom50ldeRNAsemix. a. Incubara37Cdurante30minutos. 12. Usar10lparadigestocomenzimaderestrio. 1.


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DIGESTOCOMENZIMASDERESTRIO

MaterialeReagentesSoluodeDNAaanalisar Enzimasderestrio: o BamHI(10U/l) o EcoRI(20U/l) o SalI(20U/l) Fenol:clorofrmio Tampodeenzima10X(dofabricante)ou TUS10X(TampoUniversalStratagene) o 1MKOAc o 250mMTris/Acetato,pH7,6 o 100mMMgOAc o 5mMMercaptoetanol o 100g/mlBSA

ProtocoloExperimental1. Emmicrotubo,adicionarsequencialmente: a. H 2 Oestril 19,25l(ouq.b.p.25lfinal) b. SoluodeDNA 1l(1g) c. TUS10X 3,75l(1,5Xfinal) d. Soluodeenzima 1l(10Unidades) Misturarnovortex. Centrifugarbrevementeparalevartudoparaofundodotubo. Incubara37Cdurante1hora. Desproteinizarpelofenol:clorofrmio: a. Adicionar25ldefenol:clorofrmio. b. Misturarbem. c. Centrifugar1minutonamicrocentrfuga. d. Pipetarfaseaquosaparanovotubo. Tomar10lparaanliseemgel.B B

2. 3. 4. 5.

6.


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ANLISEDEDNASEMGELDEAGAROSE

MaterialeReagentesSoluodeDNAaanalisar DNAmarcador: o lambdaXBstEII TBE10X o 890mMTris o 890mMcidobrico o 20mMEDTA pH8,0 AgarosemdiaoubaixaEEO(SigmaTipoIIouV) Brometodeetdio10mg/ml DyeDNAs(IndicadordeMigrao): o 25%Ficoll400 o 0,25%OrangeG

ProtocoloExperimental1. Preparaodogel a. Prepararomoldeparaogel. b. Fundiraagarose(0,7%)em95%volumefinaldegua. c. Arrefeceracercade50C. d. Adicionar5%deTBE10X(0,5Xfinal). e. Adicionar0,005%Brometodeetdio(0,5g/mlfinal). f. Misturareverternomolde. g. Colocaropenteedeixarsolidificar. Colocarogelnoaparelho,apenassubmersoemTBE0,5X. AplicarasamostrasdeDNA,contendo10a20%deDyeDNAs. AplicarumaamostradeDNAmarcador(0,5a1g) Procederseparaoelectrofortica(75V),atconvenientemigrao. VisualizarnotransiluminadorsobluzUV(300a320nm). a. Observarogel Registarasbandas(desenhar) Fotografarogelcomfiltrovermelhodegelatina.

2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.


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PREPARAODEBACTRIASCOMPETENTES

MaterialeReagentes E.ColiXL1B LB10X Tetraciclina1000X: o 12,5mg/mlem50%etanol.Conservara20C. 100mMCaCl 2 (filtraoestril) Glicerol50%(v/v)(filtraoestril)B B

ProtocoloExperimental1. 2. Inocular10mldeLB1X(Tetraciclinaopcional)comcolniadeE.coliXL1B. a. Incubara37Csobforteagitao,duranteumanoite. Usar4mldaculturaparainocular50mldeLBpraquecidoa37C. a. Incubara37Csobforteagitaoat0,2UDOa600nm(cercade2X10 7 bactrias/ml)(2a4 horasantesdaaula). b. Arrefecer15minutosembanhodegelo. c. Centrifugar3.000XGdurante10minutosa4C. d. Decantar. Ressuspenderosedimentodebactriasem20mlde100mMCaCl 2 . a. Repousar15minutosnogelo. b. Centrifugar3.000XGdurante10minutosa4C. c. Decantar. Ressuspenderosedimentodebactriascom5mlde100mMCaCl 2 . Adicionar20%deglicerola50%(10%final) a. Repousardurante30minutosa4C Repartiralquotasde50la500lpormicrotubos a. Conservarcongeladoa80C Testaraeficciadetransformaocom50ldebactriascompetentesP P B B B B

3.

4. 5. 6. 7.


26

TRANSFORMAO

MaterialeReagentesBactriascompetentes SoluodeDNAsplasmdico(pDNA) LB10X Ampicilina1000X PlacasdeAgar/LB/Amp: BactoAgar 7.5g LB10X 50ml H 2 Oat 500ml Autoclavar,Deixararrefecera50C.Adicionar500ldeAmpicilina1000X. Repartirdeimediatopelasplacasdepetri.B B

ProtocoloExperimental1. 2. 3. Pipetarparaummicrotubo5ldesoluodepDNA. Pipetarparaoutromicrotubo5ldesoluodepDNAdiludaa1:100. Adicionar50ldebactriascompetentesacadatubo. a. Homogeneizarnovortex. b. Repousar10minutosnogelo. c. Incubara37Cdurante5minutos. Adicionar1mldemeioLBpraquecido(semantibitico). a. Incubara37Cdurante1hora. b. Centrifugar1minutonamicrocentrfuga. c. Decantar. Ressuspenderasbactriasem200ldemeioLB. EspalharsobreplacadeAgar/LB/Ampatsecar. a. Incubara37Cemestufaduranteumanoite. Picarcolnias.

4.

5. 6. 7.


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ANLISEDEPROTENARECOMBINANTENB.Apartirdecolniadebactriatransformada,queexprimaumaprotenarecombinante,extraireanalisarem geldeelectroforeseosperfisproteicosdabactriainduzidaenoinduzida.

MaterialeReagentesBactriarecombinante(pCS938.15) LB/Amp IPTG100mM

Protocoloexperimental1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. RessuscitarculturadebactriarecombinanteemmeiodeculturaLB/Amp/Agar(slido) Expandirumacolniaem10mLdemeioLB/Amp(lquido) Incubaro/n37Csobagitao Adicionar4mLdeLB/AMPpraquecidoa2tubosesterilizados Inocular1mLdeculturabacterianaemcadatubo Adicionaraumdostubos(INDUZIDO)50LdeIPTG100mM Incubarasduasculturasa37Cdurante30minutos,sobagitao Tomar,decadacultura,para2microtubos,1mldesuspenso(4tubos) Centrifugar2minutos Decantarerejeitarsobrenadantes a. Congelar20Cumtubodebactriainduzidaeoutrodebactrianoinduzida 11. Resuspenderossedimentosdosoutrostuboscom1,5mLdesalino a. AvaliareregistaraDOa550nm


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ELECTROFORESEDEPROTENAS(PAGE)

MaterialeReagentesExtractosdebactriarecombinante(pCS938.15)comexpressoinduzidaenoinduzida Acrilamidaa50%(esterilizadaporfiltrao) Bisacrilamidaa1,25% Tris1,5MpH8.8 Tris1,5MpH6.8 SDS10% TEMED10% Persulfatodeamnio10%(extemporneo) TampoLaemmli10X: Tris250mM Glicina1,92M SDS1% pH8.3 Tampodeelctrodos: T.Laemmli1X Tampodeamostra(2X): Tris125mMpH6.8 SDS4% Glicerol20% BME10% Azuldebromofenol0,2% Soluodecolorao: AzuldeCoomassie0,2% Metanol50% cidoacticoglacial10% Soluodediferenciao Metanol10% cidoacticoglacial10%


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ProtocoloExperimental

PREPARAO DAS AMOSTRAS1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Ressuspender,descongelando,cadasedimentodebactriasrecombinantesinduzidasenoinduzidas com100ldetampodeamostra Aqueceremguaferventedurante3minutos Centrifugar10.000GX3min Tomarosobrenadanteparanovotubo Arrefeceremgelo Conservarcongeladoa20C,senecessrio Tomarparagel0,15UDOa550nm(calculadocombasenaDOdaculturaanteriormentedeterminada)

PREPARAO DO GEL1. 2. Montaromoldeparaogel(dentrodeplstico) Preparargeldeseparao(emErlenmeyer): a. Acrilamida40% 7,5mL b. Bisacrilamida1,25% 3,0mL c. Tris1,5MpH8.8 7,5mL d. SDS10% 300L e. H2O 11,4mL f. TEMED10% 150l g. Persulfatodeamnioa10% 150l 3. Homogeneizarsemintroduzirmuitoar 4. Verternomolde 5. Adicionarpequenovolumedeguanasuperfciedogel(semmisturar) 6. Deixarpolimerizar(20a30min) 7. Preparargeldestacking(emErlenmeyer): a. Acrilamida40% 900L b. Bisacrilamida1,25% 500l c. Tris1,5MpH6.8 1,8mL d. SDS10% 75l e. H2O 5,1ml f. TEMED10% 75l g. Persulfatodeamnioa10% 75l 8. Removeraguasobrenadantedogeldeseparao 9. Colocaropente 10. Verterogeldestacking 11. Deixarpolimerizar(10a20minutos) U


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ELECTROFORESE1. 2. 3. 4. 5. 6. Montarogelnatinadeelectroforese Encherascmarasdoselctrodoscomotampodeelectroforese Aplicar50ldeamostraporpoodogel(0,15UDOa550nm) Registaralocalizaodecadaamostra Ligaracorrenteelctrica(70volts)ataoindicadordemigraoseposicionarnofimdogel(5horas) Desmontarosistemarecuperandoogel

COLORAO DAS PROTENAS1. 2. 3. 4. 5. 6. Mergulharogelemabundantesoluodecolorao a. Corardurante30minutoscomagitao Passarogelparasoluodediferenciao. Mergulharemabundantesoluodediferenciao a. Diferenciarcomagitaoatcontrasteconveniente(mudarsoluoquandonecessrio) Observaremtransiluminadordovisvel Registarosresultados(desenharasbandas). Fotografar


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ANEXOSPLASMDIOSPCS11

U


32

PCS62


33

PCS71


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PCS84


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PSK+


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ANEXOSENZIMASBAMH IOrigem:BacillusamyloliquefaciensH ReacoEnzimtica: 150mMNaCl 10mMTrisHCl 10mMMgCl2 1mMdithiothreitol 100g/mlBSA. pH7.9 Incubaoa37C. Inactivaopelocalor:No

5...G^GATCC...3 3...CCTAG^G...5

ECO RIOrigem:E.coliRY13 ReacoEnzimtica: 50mMNaCl 100mMTrisHCl 10mMMgCl2 0.025%TritonX100 pH7.5 Incubaoa37C Inactivaopelocalor:65CX20minutos

5...G^AATTC...3 3...CTTAA^G...5

SAL IOrigem:StreptomycesalbusG ReacoEnzimtica: 150mMNaCl 10mMTrisHCl 10mMMgCl2 1mMdithiothreitol 100g/mlBSA pH7.9 Incubaoa37C. Inactivaopelocalor:65CX20minutos

5...G^TCGAC...3 3...CAGCT^G...5


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U

ANEXOSTABELAPERIDICA


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TRABALHOAUTNOMOPARARELATRIOFINAL CadagruporeceberumDNAplasmdiconoidentificado,emquantidadevestigial

Problema:Identificaroplasmdio. Relataraestratgiaadoptada,osprocedimentosutilizadoseosresultadosobtidos

Estratgiasugerida1. 2. 3. 4. 5. 6. U

Prepararbactriascompetentes TransformarcomoDNAdesconhecido PrepararDNAplasmdicoemquantidadeadequada Digerircomasenzimasderestrio Analisarfragmentosemgel Compararcomosperfisobtidoscomosdosplasmdiosincludosnestemanual,paraidentificao.

NOTAS/Registoderesultados

E:\Documents\UEVORA\Disciplinas\EngGenet\201011\Manual.docx

CarlosSinogas


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