Biologia 12º ano

Fundamentos de Engenharia Genética

Dogma Central da Biologia Molecular

O que é Engenharia Genética?

• É a modificação de seres vivos pela manipulação directa do DNA, através da inserção ou delecção de fragmentos específicos. A sua aplicação inclui a produção de vacinas, proteínas por microorganismos, alimentos, transplantes, terapia génica, animais transgénicos.

• Também conhecida como Tecnologia do DNA Recombinante

• Inclui o isolamento, cópia e multiplicação de genes, recombinação de genes, ou DNA de diferentes espécies, e transferência de genes de uma espécie para outra, contornando o processo reprodutivo

Exemplos de aplicações

Na produção de insulina humana através do uso modificado

de bactérias e na produção de novos tipos de ratos como o

OncoMouse (rato cancro) para pesquisa, através de

manipulação genética. Uma vez que uma proteína é

codificada por um segmento específico de ADN chamado

gene, versões futuras podem ser modificadas mudando o

ADN de um gene. Uma maneira de fazê-lo é isolando o

pedaço de ADN contendo o gene, cortando-o com precisão, e

reintroduzindo o gene em um segmento de ADN diferente.

A insulina facilita a entrada da

glicose nas células (onde ela será

utilizada para a produção de

energia) e o armazenamento no

fígado, na forma de glicogênio.

Retira o excesso de glicose do

sangue. Isso ocorre, logo após as

refeições, quando a taxa de

açúcar sobe no sangue. A falta

ou a baixa produção de insulina

provoca diabetes, doença

caracterizada pelo excesso de

glicose no sangue

(hiperglicemia).

História da engenharia genética

1930 - Dois pesquisadores norte-americanos demonstraram a regulação pelos

genes da produção de proteínas e enzimas e a consequente intervenção nas

reacções dos organismos dos animais. A partir destas pesquisas, teve

início o progresso de descoberta da estrutura genética humana.

1944 – Na pesquisa da cadeia molecular do ácido desoxirribonucleico (DNA),

ou (RNA), descobriu-se que este é o componente cromossômico que

transmite informações genéticas.

1953 – Conseguiu-se mapear boa parte da estrutura da molécula do DNA.

1961 – Foi descoberto que o principal responsável pela síntese

proteica é o DNA e passou então a ser o elemento central

das pesquisas de engenharia genética.

1972 – Ligaram-se duas cadeias de DNA. Uma era de

origem animal, a outra bacteriana. Esta foi a primeira

experiência bem sucedida onde foram ligadas duas

cadeias genéticas diferentes, e que é considerada por muitos

autores o início da criação sintética de produtos de

engenharia genética.

1978 - O suíço Werner Arber e os norte

americanos Daniel Nathans e Hamilton O.

Smith foram laureados com o Prêmio Nobel de

medicina ou fisiologia por terem isolado as enzimas

de restrição que são substâncias capazes de quebrar o

DNA controladamente em pontos precisos. Juntamente

com a Ligase que consegue unir fragmentos de

ADN, as enzimas de restrição formaram a base

inicial da tecnologia do DNA recombinante.

Era da manipulação genética

Iniciou-se, então, a era da manipulação de mensagens

genéticas, expressas em fragmentos de sequências que

compõem o código genético e os nucleotídeos.

A partir deste momento a engenharia genética passou a

modificar as moléculas de DNA, utilizando enzimas

específicas. As ligases, enzimas que agem para unir a cadeia

fragmentada, começaram a ser descobertas e sintetizadas

para manipulação genética.

• Para obter um pedaço de DNA, é preciso “cortar” o fragmento da molécula e, em seguida, colar suas extremidades. Para cortar os pedaços de DNA, são utilizadas as enzimas de restrição e, para se ligar os fragmentos de DNA, são utilizadas as enzimas de ligação ou ligase.

Enzimas de Restrição

• São endonucleases que clivam o DNA em sequências específicas chamadas locais de restrição.

• Quebram a ligação fosfodiéster.

• Os locais de restrição são, geralmente, sequências palindrómicas (mesma sequência de nucleótidos, mas de polaridade inversa).

Enzymes for DNA manipulation – restriction enzymes

Enzimas de Restrição

Classes of Restriction Enzymes

Type Icleavage occurs 400-7000 bpfrom recognition site

Type IIcleavage occurs adjacent orwithin recognition site

Type IIIcleavage occurs 25-27 bpfrom recognition site

• Endonucleases específicas isoladas de procariontes.

• Protegem a bactéria do ataque de vírus (fagos).

• Protegem seu próprio DNA metilando-o no local de restrição.

• Enzimas do tipo II são as mais utilizadas em Biologia Molecular.

EcoRI metilase

Os VectoresSão moléculas de DNA que irão

propagar o DNA clonado.  Características desejadas:

•Habilidade de se duplicar na célula hospedeira;

• Marca genética para selecionar a célula contendo o vector (resistência a drogas ou marcas auxotróficas);

•Locais de clonagem únicos.

Clonagem de Genes

Clonagem de um gene ou de qualquer fragmento de ADN ocorre da seguinte forma:

a) O gene é ligado a um vector, formando um DNA recombinante.

b) Esta molécula é introduzida numa célula hospedeira (bactéria) onde permanece num

estado epissomal (não integrado no genoma do hospedeiro).

c) Vector tem a capacidade de se replicar autonomamente.

d) À medida que a célula hospedeira se vai dividindo, o vector recombinante também se

divide e é transmitido às células-filhas, formando-se um clone de células iguais.

Clonagem em E. coli utilizando plasmídeo vector

Objectivos da clonagem

• Plasmídios

• Bacteriófagos (fagos)

• Cosmídios

• Cromossomos artificiais de levedura (YAC)

• Vectores especiais para plantas, células de insetos e mamíferos

Tipos de vectores

Plasmídios• Moléculas de DNA fita dupla circulares e de replicação autónoma (ORI);

• Têm marcas de selecção para resistência a antibióticos.

Caixa de Petri com colónias bacterianas brancas - significa a presença de DNA recombinante no plasmídio.

Bacteriófagos• Infectam células de E. coli e o DNA duplica-se na célula hospedeira.• Ex: Fago

  O Ciclo de vida de um bacteriófago

Clonagem no Fago λ

Utilização da tecnologia do DNA recombinante

Substância obtida pela tecnologia do rDNA Aplicação

Hormona do crescimento Disfunção hipofisária

Factor de crescimento da pele Processos de cicatrização da pele

Interferão Cancro

Factores de coagulação VII, VIII e IX Hemofilia

Vacina para a hepatite Hepatite B

Teste da SIDA Despiste da SIDA

Superóxidodismutase Evita a extensão de danos após enfarte do miocárdio.

Eritropoetina Anemia

Biblioteca de Genes

- O processo de multiplicação dos organismos que contêm o rDNA permite não só a produção da substância codificada, mas também a clonagem desse gene. - Os investigadores, conservam, cópias desses genes, conseguidas através da produção de DNA complementar (cDNA), constituindo bibliotecas genómicas ou bibliotecas de genes.

Transcriptase reversa – na produção de cDNA (DNA complementar)

- Produz uma molécula de DNA a partir de uma molécula de mRNA- Isolada dos retrovírus-Aplicação: Produção de cDNA

- A comparação entre o cDNA (que não contém intrões) com o DNA original permite localizar as regiões codificantes (exões) e as não codificantes (intrões) de um determinado gene e facilita a produção de seres eucariontes em bactérias.