Biologia 12º ano
Fundamentos de Engenharia Genética
Dogma Central da Biologia Molecular
O que é Engenharia Genética?
• É a modificação de seres vivos pela manipulação directa do DNA, através da inserção ou delecção de fragmentos específicos. A sua aplicação inclui a produção de vacinas, proteínas por microorganismos, alimentos, transplantes, terapia génica, animais transgénicos.
• Também conhecida como Tecnologia do DNA Recombinante
• Inclui o isolamento, cópia e multiplicação de genes, recombinação de genes, ou DNA de diferentes espécies, e transferência de genes de uma espécie para outra, contornando o processo reprodutivo
Exemplos de aplicações
Na produção de insulina humana através do uso modificado
de bactérias e na produção de novos tipos de ratos como o
OncoMouse (rato cancro) para pesquisa, através de
manipulação genética. Uma vez que uma proteína é
codificada por um segmento específico de ADN chamado
gene, versões futuras podem ser modificadas mudando o
ADN de um gene. Uma maneira de fazê-lo é isolando o
pedaço de ADN contendo o gene, cortando-o com precisão, e
reintroduzindo o gene em um segmento de ADN diferente.
A insulina facilita a entrada da
glicose nas células (onde ela será
utilizada para a produção de
energia) e o armazenamento no
fígado, na forma de glicogênio.
Retira o excesso de glicose do
sangue. Isso ocorre, logo após as
refeições, quando a taxa de
açúcar sobe no sangue. A falta
ou a baixa produção de insulina
provoca diabetes, doença
caracterizada pelo excesso de
glicose no sangue
(hiperglicemia).
História da engenharia genética
1930 - Dois pesquisadores norte-americanos demonstraram a regulação pelos
genes da produção de proteínas e enzimas e a consequente intervenção nas
reacções dos organismos dos animais. A partir destas pesquisas, teve
início o progresso de descoberta da estrutura genética humana.
1944 – Na pesquisa da cadeia molecular do ácido desoxirribonucleico (DNA),
ou (RNA), descobriu-se que este é o componente cromossômico que
transmite informações genéticas.
1953 – Conseguiu-se mapear boa parte da estrutura da molécula do DNA.
1961 – Foi descoberto que o principal responsável pela síntese
proteica é o DNA e passou então a ser o elemento central
das pesquisas de engenharia genética.
1972 – Ligaram-se duas cadeias de DNA. Uma era de
origem animal, a outra bacteriana. Esta foi a primeira
experiência bem sucedida onde foram ligadas duas
cadeias genéticas diferentes, e que é considerada por muitos
autores o início da criação sintética de produtos de
engenharia genética.
1978 - O suíço Werner Arber e os norte
americanos Daniel Nathans e Hamilton O.
Smith foram laureados com o Prêmio Nobel de
medicina ou fisiologia por terem isolado as enzimas
de restrição que são substâncias capazes de quebrar o
DNA controladamente em pontos precisos. Juntamente
com a Ligase que consegue unir fragmentos de
ADN, as enzimas de restrição formaram a base
inicial da tecnologia do DNA recombinante.
Era da manipulação genética
Iniciou-se, então, a era da manipulação de mensagens
genéticas, expressas em fragmentos de sequências que
compõem o código genético e os nucleotídeos.
A partir deste momento a engenharia genética passou a
modificar as moléculas de DNA, utilizando enzimas
específicas. As ligases, enzimas que agem para unir a cadeia
fragmentada, começaram a ser descobertas e sintetizadas
para manipulação genética.
• Para obter um pedaço de DNA, é preciso “cortar” o fragmento da molécula e, em seguida, colar suas extremidades. Para cortar os pedaços de DNA, são utilizadas as enzimas de restrição e, para se ligar os fragmentos de DNA, são utilizadas as enzimas de ligação ou ligase.
Enzimas de Restrição
• São endonucleases que clivam o DNA em sequências específicas chamadas locais de restrição.
• Quebram a ligação fosfodiéster.
• Os locais de restrição são, geralmente, sequências palindrómicas (mesma sequência de nucleótidos, mas de polaridade inversa).
Enzymes for DNA manipulation – restriction enzymes
Enzimas de Restrição
Classes of Restriction Enzymes
Type Icleavage occurs 400-7000 bpfrom recognition site
Type IIcleavage occurs adjacent orwithin recognition site
Type IIIcleavage occurs 25-27 bpfrom recognition site
• Endonucleases específicas isoladas de procariontes.
• Protegem a bactéria do ataque de vírus (fagos).
• Protegem seu próprio DNA metilando-o no local de restrição.
• Enzimas do tipo II são as mais utilizadas em Biologia Molecular.
EcoRI metilase
Os VectoresSão moléculas de DNA que irão
propagar o DNA clonado. Características desejadas:
•Habilidade de se duplicar na célula hospedeira;
• Marca genética para selecionar a célula contendo o vector (resistência a drogas ou marcas auxotróficas);
•Locais de clonagem únicos.
Clonagem de Genes
Clonagem de um gene ou de qualquer fragmento de ADN ocorre da seguinte forma:
a) O gene é ligado a um vector, formando um DNA recombinante.
b) Esta molécula é introduzida numa célula hospedeira (bactéria) onde permanece num
estado epissomal (não integrado no genoma do hospedeiro).
c) Vector tem a capacidade de se replicar autonomamente.
d) À medida que a célula hospedeira se vai dividindo, o vector recombinante também se
divide e é transmitido às células-filhas, formando-se um clone de células iguais.
Clonagem em E. coli utilizando plasmídeo vector
Objectivos da clonagem
• Plasmídios
• Bacteriófagos (fagos)
• Cosmídios
• Cromossomos artificiais de levedura (YAC)
• Vectores especiais para plantas, células de insetos e mamíferos
Tipos de vectores
Plasmídios• Moléculas de DNA fita dupla circulares e de replicação autónoma (ORI);
• Têm marcas de selecção para resistência a antibióticos.
Caixa de Petri com colónias bacterianas brancas - significa a presença de DNA recombinante no plasmídio.
Bacteriófagos• Infectam células de E. coli e o DNA duplica-se na célula hospedeira.• Ex: Fago
O Ciclo de vida de um bacteriófago
Clonagem no Fago λ
Utilização da tecnologia do DNA recombinante
Substância obtida pela tecnologia do rDNA Aplicação
Hormona do crescimento Disfunção hipofisária
Factor de crescimento da pele Processos de cicatrização da pele
Interferão Cancro
Factores de coagulação VII, VIII e IX Hemofilia
Vacina para a hepatite Hepatite B
Teste da SIDA Despiste da SIDA
Superóxidodismutase Evita a extensão de danos após enfarte do miocárdio.
Eritropoetina Anemia
Biblioteca de Genes
- O processo de multiplicação dos organismos que contêm o rDNA permite não só a produção da substância codificada, mas também a clonagem desse gene. - Os investigadores, conservam, cópias desses genes, conseguidas através da produção de DNA complementar (cDNA), constituindo bibliotecas genómicas ou bibliotecas de genes.
Transcriptase reversa – na produção de cDNA (DNA complementar)
- Produz uma molécula de DNA a partir de uma molécula de mRNA- Isolada dos retrovírus-Aplicação: Produção de cDNA
- A comparação entre o cDNA (que não contém intrões) com o DNA original permite localizar as regiões codificantes (exões) e as não codificantes (intrões) de um determinado gene e facilita a produção de seres eucariontes em bactérias.