engenharia genética
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Engenharia genética - potencialidades.TRANSCRIPT
Engenharia GenéticaIsabel Lopes
A molécula de DNA
• Intocável (1950-1975)
• A partir de década de 70, foi possível abri-la,
extrair genes, transplantá-los, multiplicá-los
• Conhecer doenças humanas
• Transformar organismos…
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Como encontrar um gene?
Como isolá-lo?
• Uso de enzimas de restrição
– Cortam a molécula de DNA em zonas
específicas, sempre que as encontram.
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Presentes em bactérias, que as usam
como mecanismo de defesa contra os
vírus que as atacam (bacteriófagos).
Enzimas de restrição
• Endonucleases de restrição
– Enzimas presentes nas bactérias que
cortam a cadeia de DNA em zonas
específicas – zonas de restrição
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Fragmentam o DNA em fragmentos mais pequenos que
contêm na extremidade a sequência reconhecida.
Enzima de restrição Eco RI
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Por exemplo a enzima Eco RI reconhece a sequência:
5´GAATTC3´
Enzima de restrição Eco RI
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Por exemplo a enzima
Eco RI reconhece a
sequência:
5´GAATTC3´
fará o corte entre o
nucleótido de guanina
e o nucleótido de
adenina em cada
cadeia.
Extremidades coesivas
Ligases do DNA
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Permitem catalizar
as reacções em que
as extremidades
livres são ligadas a
novas sequências de
DNA (novo gene) por
complementaridade
de bases.
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Cada fragmento de DNA, que foi separado do resto
da molécula, contém um ou mais genes.
Cada gene permite a síntese de uma proteína,
por isso ao estudarmos o gene estamos a estudar a
proteína que ele codifica.
Isolando fragmentos de DNA (genes) podem
transferir-se para outro organismo.
Como fazer a transferência?
Técnica do DNA recombinante
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É necessário usar um vector, uma entidade que possa
transferir o gene do organismo (de onde foi retirado) para
o organismo que o vai receber
Vectores mais importantes:
plasmídio* de bactérias
Técnica do DNA recombinante
“Vector”
Os plasmídio é uma molécula de DNA circular não ligada ao
cromossoma, e que se encontra no hialoplasma das bactérias. Multiplica-se a
cada divisão celular, passando uma cópia para cada célula “filha”.
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A mesma enzima corta o
DNA dador, de forma a
isolar o gene que se
pretende inserir no
plasmídeo.
Técnica do DNA recombinante
“Corte e isolamento do gene”
A enzima de
restrição corta o
DNA do
plasmídeo num
ponto específico.
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Técnica do DNA recombinante
“Introdução no plasmídeo”
O gene a inserir é colocado em contacto com o
plasmídeo, juntamente com ligases do DNA (enzimas).
O gene passa
a fazer parte
do plasmídeo,
que possui
agora um DNA
recombinante
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Técnica do DNA recombinante
“Propagação”
O plasmídeo recombinante em contacto com bactérias
introduz-se em algumas delas.
As bactérias portadoras do plasmídeo sintetizam
agora a proteína desejada.
Como saber quais as
bactérias portadoras
do DNA recombinante?
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Técnica do DNA recombinante
“Selecção”
Os plasmídeos usados possuem genes que lhes
conferem resistência a determinados antibióticos.
Num meio com determinado
antibiótico, sobreviverão
apenas as bactérias
resistentes, e portanto
portadoras do gene
pretendido (com DNA
recombinante).
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Técnica do DNA recombinante
“Aplicações”
Estudos de mecanismos de replicação e
expressão de genes
Determinação da sequência de um gene
(e proteína codificada)
Aumento no rendimento de plantas
Obtenção de organismos geneticamente
modificados capazes de produzir
substâncias úteis (ex.: insulina humana)
…
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Técnica do DNA complementar
Para obtenção de insulina humana:
Antes: Uso de insulina obtida a partir do pâncreas de
vacas ou de porcos (provocava por vezes rejeição)
Solução?
Uso do RNAm existente nas
células do pâncreas humano
Recurso a uma enzima existente
nos vírus: transcriptase reversa
(catalisa a formação de DNA a partir
de RNA)
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Formação de cDNA
A molécula de
RNAm, serve de
molde à sintese de
uma molécula de
DNA(já sem intrões e por isso
funcional)
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Formação de cDNA
O gene isolado que
codifica a síntese de
insulina pode agora
ser inserido numa
bactéria e iniciar-se a
produção industrial
de insulina
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Reacções de polimerização em cadeia (PCR)
Quando é necessária uma quantidade de DNA
superior à disponível, como obtê-la?
Casos que envolvem as ciências forenses
Na década de 80, passou a utilizar-se a
técnica do PCR para fazer milhares de
cópias de um único segmento de DNA.
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PCR
Técnica é usada em tubos de ensaio contendo o DNA e
mais alguns compostos necessários, como primers
(DNAs iniciadores) e a enzima DNA polimerase
(enzima que faz a replicação do DNA).
Os primers são fitas de DNA, com mais ou
menos 20 bases (A, T, C, G) complementares,
isto é se ligam por complementaridade ao início
da sequência de DNA que se quer multiplicar.
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PCR
Quando uma molécula de DNA vai ser multiplicada
deve-se separar a dupla fita, formando assim duas
fitas diferentes mas complementares entre si. Cada
fita servirá de molde para a duplicação, por isso,
precisamos de dois tipos de primers diferentes
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PCR
Obtêm-se uma amostra mínima de DNA de uma célula
humana.
A amostra de DNA, a enzima que faz a replicação (DNA
polimerase), os nucleótidos de DNA e os primers
complementares a sequência de DNA são colocados em um
tubo de ensaio.
Coloca-se o tubo de ensaio numa máquina de PCR (maquina
que aumenta e diminui a temperatura de acordo com um
programa). Os passos seguintes, de aquecimento e
arrefecimento, acontecem dentro da máquina controlados pelo
programa.Adaptado de http://www.sobiologia.com.br/conteudos/Biotecnologia/recombinante.php
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PCR
Aquece-se o tubo a 94ºC para desnaturar (separar a dupla
cadeia) o DNA.
Cada cadeia simples do DNA desnaturado serve de molde
para a síntese de novas cadeias complementares. Para isso
submete-se a 54ºC onde os primers servem de iniciadores para
a enzima polimerase.
Aquece-se novamente o tubo a 72ºC (temperatura ideal de
funcionamento da DNA polimerase) para a duplicação da cadeia
- ligação dos nucleotídos livres por complementaridade à cadeia
de DNA ,formando assim uma nova cadeia dupla.
Repete-se até obtenção da quantidade necessária.
Adaptado de http://www.sobiologia.com.br/conteudos/Biotecnologia/recombinante.php
Vamos investigar…
O caso do “chupa-chupa lambido”, e terás de o
resolver. Terás a mais avançada tecnologia forense ao
teu lado: Os perfis de ADN.
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Experimenta este cenário interactivo, do Web site NOVA: "Trail The Killer's", que
te guia pelo processo de criação de perfis de ADN de diversos suspeitos de crimes
e pelas provas deixadas na cena do crime. Depois vais comparar os perfis que
obtiveste e esperançosamente, encontrar o criminoso… (clica no ?)
Vamos investigar…
Este excerto de vídeo do web site NOVA: "Trail The
Killer's" segue uma equipa de peritos que investigam a
evidência forense de 1954 referente ao assassinato de
Marilyn Sheppard, um dos crimes mais famosos e não
resolvidos na história dos E.U.A.
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