associaÇÃo das biotÉcnicas: aspiraÇÃo folicular guiada por ... · tua alma: mãe, pai... ......

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA“JÚLIO MESQUITA”

FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIASCÂMPUS DE JABOTICABAL

ASSOCIAÇÃO DAS BIOTÉCNICAS: ASPIRAÇÃOFOLICULAR GUIADA POR ULTRA-SONOGRAFIA E

SUPEROVULAÇÃO NA PRODUÇÃO IN VITRO E IN VIVODE EMBRIÕES BOVINOS

Andréa Renesto

Médica Veterinária

JABOTICABAL – SÃO PAULO – BRASIL

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Agosto de 2004UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

“JÚLIO MESQUITA”FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS

CÂMPUS DE JABOTICABAL

ASSOCIAÇÃO DAS BIOTÉCNICAS: ASPIRAÇÃOFOLICULAR GUIADA POR ULTRA-SONOGRAFIA E

SUPEROVULAÇÃO NA PRODUÇÃO IN VITRO E IN VIVODE EMBRIÕES BOVINOS

Andréa Renesto

Orientador: Profa. Dra. Lia de Alencar Coelho

Dissertação de Mestradoapresentada à Faculdade deCiências Agrárias e Veterinárias– Unesp, campus de Jaboticabal,como parte das exigências paraa obtenção do título de Mestreem Medicina Veterinária(Reprodução Animal).

JABOTICABAL – SÃO PAULO – BRASIL

Agosto de 2004



iii

DADOS CURRICULARES DO AUTOR

ANDRÉA RENESTO – Nascida aos 10 dias de março de 1977 em Pereira

Barreto – SP. Graduou-se em Medicina Veterinária na Universidade do Oeste

Paulista – UNOESTE – no período de Janeiro de 1995 a Dezembro de 1999. No

período de Fevereiro de 2000 a Agosto de 2001 cursou a Especialização Lato

Sensu em Reprodução Animal, na Universidade do Oeste Paulista – UNOESTE.

Em fevereiro de 2001 ingressou na Especialização Lato Sensu em Julgamento

das Raças Zebuínas, da Faculdade de Agronomia e Zootecnia de Uberaba –

FAZU, obtendo o título de Especialista em Julgamento das Raças Zebuínas em

Dezembro de 2001. Graduou-se como Jurada efetiva das Raças Zebuínas através

do Colégio Técnico de Jurados das Raças Zebuínas da Associação Brasileira dos

Criadores de Zebu, no período de Junho de 1999 a Outubro de 2001. Ingressou

no Programa de Mestrado em Medicina Veterinária, Área de Concentração

Reprodução Animal, pela faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – UNESP

- Jaboticabal-SP, em março de 2002.



iv

Agradeço a Deus por essa existência, pela coragem,

vontade e principalmente pela força

nos momentos mais difíceis...

Dedico este trabalho aos meus pais!

É mais uma prova do sinônimo de amor e carinho que

vocês me proporcionaram durante toda minha existência.

.... Vocês que abriram mão de muitos sonhos em função

dos meus... Não há palavras que expressem minha

gratidão e meu amor!!!

“ Se um dia já homem feito e realizado, sentires que aterra cedeu a teus pés, e que tuas obras morreram, quenão há ninguém a tua volta para te estender a mão,esquece a tua maturidade, passa pela tua mocidade,volta a tua infância e balbucia, entre lágrimas eesperanças, as últimas palavras que sempre estarão natua alma: Mãe, Pai...



v

Rui Barbosa

Aos meus irmãos, que tanto amo, Silvana e Éden:

Obrigada pelo apoio incessante e por acreditarem emmim, mesmo nas horas em que eu cheguei a duvidar!!

“ À medida que o nosso amor progride, mais nos convencemosde que Deus existe e de que a alma é imortal”.

(Dostoievski)

Ao meu querido amigo Irineu Gonçalves Filho;

“ A imortalidade de que se reveste a natureza humanafaz o homem sempre presente.

Presente pela cultura que transmitiu.Presente pela amizade que conquistou.

Presente pelo exemplo que legou.Sempre presente porque o homem é educador.”

(Dostoievski)



vi

Ofereço:

A Profa Dra. Lia de Alencar Coelho

Ao Prof. Dr. Joaquim Mansano Garcia

A Profa Dra. Caliê Castilho

Obrigada ... pela orientação,valiosos ensinamentos,

pela confiança e inestimável apoio,pela amizade e convivência enriquecedora...

À vocês, minha eterna admiração!!Em especial a minha querida amiga Caliê... não tenho

palavras de agradecimento, admiração e respeito...

“ É muito melhor ousar fazer coisas grandiosas,triunfar gloriosamente, mesmo que com alguns fracassos nomeio do caminho, do que se igualar aquela pobres almas que

não aproveitam nem sofrem muito,pois vivem na penumbra cinza de quem não sabe o que é a

vitória nem a derrota”(Theodore Roosevelt)



vii

“ ...E encontrei liberdade e segurança

em minha loucura:

a liberdade da solidão e

a segurança de não ser compreendido,

pois aqueles que nos compreendem

nos escravizam de algum modo...”

(Gibran Khalil Gibran)



viii

AGRADECIMENTOS

A realização deste trabalho só foi possível graças à colaboração direta e indireta

de muitas pessoas. Manifesto minha eterna gratidão a todas elas!!

À Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciência Agrárias e Veterinárias

de Jaboticabal, e ao departamento de Medicina Veterinária Preventiva e

Reprodução Animal – DRA pelas instalações, condições de trabalho e

oportunidade oferecida.

À Universidade do Oeste Paulista pelo incentivo a pesquisa, por ceder os animais

da segunda fase do trabalho e colocar a disposição às instalações da Fazenda

Experimental, em nome da amiga Profa Dra. Caliê Castilho, que me guiou no

caminho da pesquisa. Não tenho palavras de agradecimento... é só sentimento!!!

À Gilmar Garcia que gentilmente forneceu os animais e toda instalação da

Agropecuária J Garcia para os experimentos da primeira fase do trabalho.

“ A arte suprema do mestre consiste em despertar alegria, provocando curiosidade

pelo conhecimento criativo. A única finalidade da educação deve consistir em

preparar indivíduos que pensem e ajam como pessoas – independentes e livres”.

(Albert Einstein)

À todos os funcionários que me acompanharam no campo, ajudando

intensamente na realização desse trabalho. Fica aqui minha gratidão, vocês foram

fundamentais para o projeto...e, foram... incansáveis!!

Aos meus companheiros de trabalho e amigos, Dr. Irineu Gonçalves Filho, Dr.

Valdecir Marin Júnior e Dr. Marcelo Moura, inicialmente pela amizade e por



ix

acreditarem em mim e posteriormente pela confiança, compreensão e força...

Vocês fizeram parte da realização desse sonho e com vocês aprendo mais a cada

dia os principais valores da vida: ética, companheirismo, conhecimento, respeito,

seriedade e amizade! “... Amigos que se tornaram parceiros, parceiros que se

tornaram amigos. Sementes plantadas e regadas com respeito, admiração e muita

amizade!! “

Ao meu querido e doce JV. Obrigada pela sinceridade, pelos olhos cheio de

carinho pela beleza e grandeza dos seus sentimentos. Você foi fundamental em

um momento da minha vida em que cheguei a achar que as pessoas eram só

maldade e que a vida era repleta de injustiças e incompreensão.

“ Parece que tudo já foi dito entre nós. Agora só vale a pena dizer da saudade que

você deixou...” (Carlos Drummond de Andrade)

A todos meus familiares que mesmo distantes sempre me apoiaram e torceram

por mim em mais essa etapa da minha vida.

A todos os professores e funcionários do Departamento de Reprodução Animal

pela amizade, convívio harmonioso e colaboração. Em especial a Bel e a Roberta

pela paciência e atenção.

Ao Médico Veterinário e amigo José Otávio Folino pelo auxílio na colheita de

embriões, pela ajuda em um dos momentos mais difíceis e tão engrandecedor que

passei na minha vida e principalmente pela amizade! A você e sua esposa Milene,

nunca esquecerei o carinho, a amizade, o apoio, o incentivo, as palavras de fé, de

esperança... pela mão amiga estendida, pelo estímulo e conforto...

Ao Médico Veterinário Fábio Mustafá pelo auxílio no desenvolvimento dos

trabalhos na Fazenda Experimental. Obrigado companheiro!!



x

Aos funcionários da Avanti Consultoria Pecuária, Carol, Regina e Jú! A realização

desse trabalho contou diretamente com a colaboração de vocês... por me

apoiarem e principalmente pela compreensão da minha inconstância de humor. E,

também aos funcionários da Nelore, Adriana e Maurílio! Obrigada pela força!!

Aos pós-graduandos de Jaboticabal, em especial a Déia e Gabriel que foram

extremamente prestativos quando precisei de ajuda. Companheirismo é uma

qualidade de poucos... Obrigado companheiro!!! Ao Max, Cris, Vi, Letícia, Éricles...

A minha amiga irmã Ka (Karina Ueda Stringuetta). Você, mesmo distante, sentia

quando eu precisava de uma palavra amiga e de um conforto e mesmo quando eu

não queria falar você sempre tinha uma palavra de carinho. Obrigada por você

nunca desistir de mim!!!

A minha amiga irmã Lê (Alessandra Reis).... sempre presente em todos os

momentos em que precisei, sempre pronta para ouvir! Obrigada pelos sábios

conselhos e por me fazer ver, por muitas vezes, a força que existe em mim e que

Deus nos dá a todo instante. Obrigada pela amizade e pelos momentos de alegria

fraterna que sempre marcaram nossa convivência... Você que une a ação ao

sentimento e ao pensamento! Muito obrigada!!!

À minha amiga querida, Janete (Fernanda Prata Cunha)... Muito obrigada pela

força e por se preocupar tanto comigo. Você tem sido uma grande amiga...

sabemos que podemos contar uma com a outra!!! “Toghethersss... foreverssss....”

À minha eterna amiga Maria de Lamare... nem tenho palavras para agradecer toda

força que já me deu. Obrigada pelo querer bem e pela confiança! Saiba que você

é companheira ímpar... parceira cem por cento!

Àos meus amigos: Lu Kahale, Flor (Fabiana), Verinha, Baraldi, Talita Medeiros, Li,

Gabi, Dani Bolota, Dipilik (Bárbara), Dani Tenca, Lala, Dudu, Fer Rezek, Tiago,



xi

Kel, Gui, SI, Déia Basso, Bidu, Elaine, Ricardo Porção, Mary, Dedé, Thá, Morcega

(Kelma), Paulinha, Flá, Ana Laura, D.Lenita, Mav... enfim a todos MUIIITTOOO

OBRIGADA PELO APOIO E PRINCIPALMENTE PELA AMIZADE!!

SUMÁRIO

I. INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 15

II. REVISÃO DA LITERATURA..................................................................................... 17

III. MATERIAL E MÉTODOS......................................................................................... 25

Local do Experimento.............................................................................................. 25

Animais ..................................................................................................................... 25

Tratamentos.............................................................................................................. 25

Aspiração Folicular.................................................................................................. 28

Lavagem e seleção dos oócitos ............................................................................. 28

Transporte de oócitos ............................................................................................. 29

Maturação in vitro (MIV) .......................................................................................... 29

Fecundação in vitro (FIV) ........................................................................................ 29

Cultivo in vitro (CIV)................................................................................................. 30

Colheita de embriões............................................................................................... 30

Manipulação e Avaliação Morfológica dos Embriões TE ..................................... 30

Análise Estatística ................................................................................................... 30

IV. RESULTADOS......................................................................................................... 32

V. DISCUSSÃO ............................................................................................................. 38

VI. CONCLUSÃO .......................................................................................................... 41

VII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................................... 42



xii

ASSOCIAÇÃO DAS BIOTÉCNICAS: ASPIRAÇÃO FOLICULAR GUIADA POR

ULTRA-SONOGRAFIA E SUPEROVULAÇÃO NA PRODUÇÃO IN VITRO E IN

VIVO DE EMBRIÕES BOVINOS

RESUMO – Visando otimizar o uso alternado das biotecnologias TE e OPU-

FIV o presente trabalho teve como objetivo avaliar em vacas da raça Nelore o

efeito do início da superovulação ovariana (SOV) 48 a 60 horas após a aspiração

folicular em fase aleatória do ciclo estral (OPU 1) e avaliar a produção in vitro de

embriões oriundos de oócitos aspirados (OPU 2) em diferentes momentos da

primeira onda folicular induzida após a SOV. As fêmeas (n=23) foram submetidas

a OPU 1, em fase aleatória do ciclo estral, seguida pela inserção de implante de

progestágeno (Crestar®). Em torno de 48 a 60 horas após a aspiração iniciou-se a

SOV, utilizando-se FSH (Folltropin®) 180 mg por vaca dividida em 8 doses,

durante 4 dias consecutivos. Durante 6a e 7a aplicações de FSH foi administrada

500 µg de PGF2α (Preloban®) e o Crestar foi retirado durante a administração da

sétima dose de FSH. Após 12 horas do término da SOV, as fêmeas receberam

25mg de LH exógeno (Lutropin-V®) para causar ovulação e realizar a IA com

tempo fixo. Foram realizadas 2 inseminações com intervalo de 12 horas, sendo

que a 1ª inseminação ocorreu 12 horas após a administração de LH. Sete dias

após a 1ª IA as fêmeas foram coletadas. No dia da colheita dos embriões as

fêmeas foram divididas em 6 tratamentos, T(0-144) (n=4), T(48-120) (n=5), T(48-

96) (n=4), T(72-96) (n=3), T(96-72) (n=4), T(96-48) (n=3) que variaram de acordo

com o momento da administração de PGF2α em relação a colheita de embriões e

aspiração na primeira onda após a SOV. A aplicação de PGF2α foi realizada no

dia da colheita (dia 0), 48, 72 ou 96 horas após a colheita e a aspiração 144, 96,

72 ou 48 horas após a PGF2α. Não houve diferença significativa na % de oócitos

aspirados e embriões produzidos com a alternância das biotecnologias OPU e TE.

No entanto, foi observada diferença significativa (p>0,05) no número de oócitos

recuperados entre os tratamentos, sendo que a recuperação no T(96-48) foi

significativamente menor quando comparada ao T(48-96) e T(72-96),



xiii

demonstrando que o momento da aspiração muito próxima da PGF2α (48 horas

após) prejudicou a recuperação de oócitos. Concluí-se que a superovulação não

afeta a recuperação de oócitos e a produção in vitro de blasctocistos quando a

OPU é realizada a partir de 48 horas após a PGF2α na onda subseqüente a

superovulação podendo ser utilizada para o incremento na produção de embriões

de vacas da raça Nelore.

Palavras chaves: aspiração folicular, competência oocitária, dinâmica folicular,

nelore, superovulação



xiv

ASSOCIATION OF THE BIOTECHNIQUES: ULTRASOUND-GUIDED

TRANSVAGINAL FOLLICULAR ASPIRATION AND SUPEROVULATION IN

PRODUCTION IN VITRO AND IN VIVO OF BOVINE EMBRYOS

SUMMARY - Aiming at to optimize the alternating use of the biotechnologies

multiple ovulation and embryo transfer (MOET) and Ovum Pick Up and in vitro

fertilization (OPU-FIV) the present work had as objective to evaluate in Nelore

donors breed the effect of the beginning of the superovulation (SOV) at 48-60

hours after the follicular aspiration in randomly phase of the estrous cycle (OPU 1)

and to evaluate the in vitro embryo development of recovered oocytes (OPU 2) at

different moments of the first folicular wave after the SOV. The females (n=23)

were submitted to a OPU 1, in randomly phase of the estrous cycle, followed for

the insertion of progesterone (Crestar®). Around 48 - 60 hours after the aspiration

the superovulaction was induced with FSH (Folltropin®) 180 mg/ cow divided in 8

doses, during 4 consecutive days. Luteolytis was induced with two doses of PGF2á

(Preloban®, 500 µg), during the sixth and seventh infections of FSH and Crestar

was removed during the administration of the seventh dose of FSH. 12 hours after

the end of the SOV, the females received 25mg of LH (Lutropin-V®) to cause

ovulation. Two Artificial inseminations with fixed time were done with interval of 12

hours and the first occurred 12 hours after the LH administration. Seven days after

1ªIA the embryo were collected and all cows divided in 6 treatments, T(0-144)

(n=4), T(48-120) (n=5), T(48-96) (n=4), T(72-96) (n=3), T(96-72) (n=4), T(96-48)

(n=3) that accordance with the injection of PGF2 á , embryo recovery and

aspiration in the first wave after the SOV. The PGF2 á application was carried in

the embryo recovery (day 0), 48, 72 or 96 hours after and aspiration 144, 96, 72 or

48 hours after the PGF2 á. There was no significant difference in % of oocytes

recovery and embryos development with the alternation of the biotechnologies

OPU and SOV. However, significant difference (p>0,05) in the number of oocytes

recovery between the treatments was observed. The recovery in T(96-48) was

significantly lesser when compared with T(48-96) and T(72-96), demonstrating that



xv

the moment of the aspiration very next to the PGF2á (48 hours after) harmed the

oocytes recovery. The results of the present study concluded that the

superovulation not affect the oocytes recovery and the embryo development when

the OPU is carried 48 hours after the injection of PGF2á in the subsequent wave

after the superovulation and may to be used for the increment of embryos yield of

Nelore donors.

key words: superovulation, follicular aspiration, oocyte competence, follicular

dynamic, Nelore breed.



xvi

I. INTRODUÇÃO

No atual contexto de evolução da produtividade na pecuária nacional,

associado às evoluções científicas e tecnológicas, várias biotecnologias ligadas a

reprodução animal vem sendo desenvolvidas e aprimoradas com o intuito de

aumentar a eficiência reprodutiva, maximizando a produção de animais

geneticamente superiores, visando o aproveitamento deste material genético para

obtenção do maior número de descendentes, em um curto período de tempo.

Seguindo a evolução das principais biotecnologias adotadas e trabalhadas

no Brasil, é importante ressaltar, inicialmente, o papel da Inseminação Artificial

(IA), sendo a primeira biotecnologia adotada nos sistemas de produção brasileiros

que visa a multiplicação genética de touros de alto valor. Com a introdução de

esquemas de ovulações múltiplas, recuperação e transferência de embriões, mais

conhecida como Multiple Ovulation and Embryo Transfer (MOET), junto com a

criopreservação de embriões na década de 80, a bovinocultura passou a ter em

mãos ferramentas para aumentar o número de gestações provenientes de fêmeas

de alto mérito genético (RODRIGUES, 2001). A produção embrionária através da

TE é uma biotécnica mundialmente difundida e vem apresentando um crescimento

acentuado onde mais de 500.000 embriões são colhidos e transferidos ou

congelados anualmente (THIBIER, 2000).

A Fertilização In Vitro (FIV), por sua vez, é considerada a terceira geração

de biotecnologia aplicada ao Melhoramento Genético, após a IA e a TE. No início

da década de 90, com a introdução da aspiração folicular guiada por ultra-

sonografia (Ovum Pick-up) seguida pela produção in vitro de embriões (OPU-PIV),

a expectativa no incremento da produtividade das fêmeas aumentou.

Na bovinocultura brasileira, essas tecnologias também vêm sendo

amplamente utilizadas e adaptadas ao nosso sistema de produção e, ao longo da

sua evolução, tem revelado bons índices reprodutivos, confirmando ser um

processo economicamente viável, bastante divulgado e empregado na pecuária

moderna.



xvii

No entanto, segundo BO et al., (2000) alguns inconvenientes podem ser

observados nos programas de superovulação como a necessidade de iniciar o

tratamento hormonal em momento determinado do ciclo estral e pouca

consistência na produção de embriões viáveis pelas doadoras, sobretudo quando

se considera que 20% a 30% das doadoras não produzem nenhum embrião

transferível. A variabilidade na produção de embrião pode ser influenciada por

fatores relacionados com o tratamento superovulatório ou em maior grau por

fatores individuais associados às características da dinâmica folicular ovariana

(BO et al., 1995; BO et al., 2000) ou condição ovariana no momento da

superovulação (MONNIAUX et al., 1983; DIAZ, 2001).Sem contar que repetidos

tratamentos superovulatórios em novilhas e vacas afetam a fertilidade podendo

causar cistos e dificuldade para estabelecimento de prenhez posterior (GALLI et

al., 2003).

A FIV pode contribuir como uma alternativa para a superovulação e maior

produção de embriões por unidade de tempo quando comparada a TE. No

entanto, mesmo com os progressos obtidos nos processos de maturação in vitro

(MIV), fecundação in vitro (FIV) e cultivo in vitro (CIV) para o desenvolvimento

embrionário, esta técnica ainda apresenta algumas desvantagens que precisam

ser melhoradas e solucionadas. As taxas de blastocistos bovinos oriundos de

oócitos maturados e fertilizados in vitro têm permanecido relativamente estáticas

na última década, onde somente em torno de um terço (LONERGAN, et al., 1994;

THOMPSON; DUGANIZICH, 1996; DAYAN, et al., 2000) dos oócitos selecionados

morfologicamente antes de serem submetidos a MIV resultam em embriões

viáveis.

Tendo em vista que as biotecnologias MOET e OPU-PIV são de extrema

importância para aumentar a velocidade de ganho genético do rebanho nacional, o

presente trabalho visando a otimização pelo uso alternado destas biotecnologias

testou:

- o efeito do início da superovulação (SOV) 48 a 60 horas após a aspiração

folicular em fase aleatória do ciclo estral – aspiração referência (OPU 1);



xviii

- a produção in vitro de embriões oriundos de oócitos aspirados (OPU 2)

em diferentes momentos da primeira onda folicular após a SOV.

II. REVISÃO DA LITERATURA

O ciclo estral (CE) bovino é compreendido pelos eventos reprodutivos que

se apresentam entre dois períodos de receptividade sexual (cio). As fêmeas da

espécie bovina ao atingirem a puberdade exibem comportamento estral em média

a cada 21 dias, variando de 17 a 24 dias tanto em raças européias (ROBINSON;

SHELTON, 1991; WRIGHT; MALMO, 1992; BO; ADAMS; MAPLETOFT; 2000)

quanto zebuínas (GALINA; ARTUR, 1990; PINHEIRO, et al., 1998; FIGUEIREDO,

et al., 1997; GAMBINI, et al., 1999) até que a prenhez se estabeleça.

Durante o ciclo estral ocorrem importantes alterações no córtex ovariano

que incluem crescimento e atresia de vários folículos antrais até o aparecimento

do folículo ovulatório, bem como a formação e lise do corpo lúteo (CASTILHO,

1999). O crescimento folicular na espécie bovina exibe padrão contínuo de

crescimento e atresia dos folículos ovarianos (MATTON, et al., 1981; WOOLUMS;

PETTER, 1994) que se inicia na vida fetal, passa pela puberdade (EVANS, et al.,

1997) e continua na vida reprodutiva até a seniIidade (HAFEZ, 1993). Muitos

estudos com ultra-sonografias seriadas foram realizados e demonstraram que

durante o ciclo estral de novilhas ou vacas zebuínas e européias ocorrem duas

(PIERSON; SIROIS; SAVIO, 1988; GINTHER; KNOPF, 1989; FIGUEIREDO, et al.,

1997) ou três (SAVIO, et al., 1988; GAMBINI, et al., 1998; BARROS, et al., 1993;

FIGUEIREDO, et al., 1997; CASTILHO, et al., 2000) ondas de crescimento

folicular.

Este processo contínuo de crescimento e regressão dos folículos, que leva

ao crescimento do folículo pré-ovulatório, é conhecido como dinâmica folicular,

enquanto que o padrão de crescimento e atresia de um grupo de folículos

ovarianos é denominado onda de crescimento folicular (LUCY, et al., 1992). Cada

onda folicular é composta por 3 fases: recrutamento ou emergência, seleção e

dominância (SIROIS, 1990).



xix

A emergência da primeira onda folicular é observada em torno de um dia e

meio após a ovulação (ADAMS, et al., 1992; GINTHER, et al., 1997) quando um

conjunto de folículos antrais dependentes de FSH começa a se desenvolver. Foi

observado um aumento na concentração plasmática de FSH que antecede 1 a 2

dias a emergência de cada onda folicular (ADAMS, et al., 1992; GIBONS;

GINTHER, 1999). Em torno de 3 a 4 dias após a emergência da onda o FSH reduz

para níveis basais e o futuro folículo dominante é selecionado, continua seu

crescimento, enquanto o restante dos folículos detém seu crescimento ou

regridem e são chamados de subordinados (BODENSTEINER, et al. 1996;

GINTHER, et al., 1997; GINTHER, et al., 2000).

A fase de seleção do folículo dominante durante a primeira onda folicular foiobservada por GINTHER et al. (1996), como a divergência na taxa de crescimento entre ofuturo folículo dominante (FD) e o maior folículo subordinado (FS) 2,8 dias após aemergência da onda quando o futuro folículo dominante apresentou 8,5 mm de diâmetro e omaior subordinado 7,2 mm. CASTILHO; RENESTO; GARCIA (2003), estudando aseleção folicular em novilhas da raça Nelore observaram que em média 84 horas após aovulação o maior folículo subordinado medindo 5,5 mm cessa seu crescimento, enquanto ofuturo dominante com 7,5 mm continua a se desenvolver. Nas novilhas da raça Nelore, 24horas antes da divergência no crescimento folicular foi observada a menor concentraçãoplasmática de FSH.

Existe uma relação funcional entre a concentração de estradiol e FSH em novilhas.O aumento ou decréscimo na concentração de estradiol no início da divergência resulta emdecréscimo ou aumento, respectivamente, na concentração de FSH (KULICK, et al., 1999;GINTHER, et al., 2000b).

Provavelmente o responsável pela queda do FSH antes da seleção é a produção deestradiol e inibina, sobretudo pelas células da granulosa do folículo dominante, que atuaminibindo a liberação de FSH pela hipófise anterior (FINDLAY; CLARKE, 1987). Asconcentrações de FSH são mantidas em níveis basais até o folículo dominante da primeiraonda perder sua dominância, resultando em aumento nos níveis de FSH e subseqüenteemergência da segunda onda folicular (BODENSTEINER, et. al., 1996).

Alguns trabalhos têm demonstrado que qualquer folículo saudável ou emcrescimento é capaz de se tornar dominante. O aumento da concentração sérica de FSH,decorrente da destruição do folículo dominante após a divergência, resulta na dominânciado maior folículo subordinado (KO, et al., 1991, GINTHER, et al., 2000). Da mesmaforma, um folículo aleatoriamente escolhido dentre um grupo de folículos de 5 mm, noinício da onda folicular, pode ser direcionado para a dominância após a aspiração de todosos outros da onda (GIBBONS; GINTHER, 1997).

Tratamentos com FSH no início do desenvolvimento folicular estimulam muitosfolículos a obterem diâmetro de dominância (ADAMS, et al., 1994), sendo à base dosprotocolos de superovulação com FSH para colheita de embriões.



xx

A superovulação é uma eficiente técnica para se obter várias progênies de

fêmeas geneticamente superiores e pode ser realizada mediante aplicação

seriada de FSH no início da 2a onda folicular, ou seja, entre os dias 9 a 12 do ciclo

estral (GOULDING, et al., 1990). A resposta ovariana a superovulação depende

do número de folículos presentes no ovário sensíveis a gonadotrofina e do estágio

da onda folicular no momento em que a aplicação de FSH é iniciada

(DRIANCOUT, 2001). No entanto, um dos principais inconvenientes observados

nos programas de superovulação é a necessidade de iniciar o tratamento

hormonal em momento determinado do ciclo estral (BO, et al., 2000).

Outro inconveniente da SOV é a baixa consistência na produção de

embriões viáveis pelas doadoras, um terço das doadoras tratadas não respondem

a SOV, por outro lado um terço produz em média 3 embriões e somente o terço

restante resulta em grande número de embriões transferidos (GALLI, et al., 2003).

Esta variação na resposta, têm-se transformado em fator limitante para o uso em

larga escala da tecnologia (ARMSTRONG, 1993; MAPLETOFT; PIERSON, 1993,

BO, et al., 1995). Dentre os fatores que podem ser responsabilizados por tais

variações, podemos citar a influencia do tipo, o grau de pureza, a dose e o

esquema de administração do hormônio (BECKER; PINHEIRO, 1986;

MAPLETOFT; PIERSON, 1994), estado nutricional da doadora (YAAKUB, et al.,

1999; SIDDIQUI, et al., 2002), histórico reprodutivo, idade, estação do ano, efeito

de repetidas superovulações (MAPLETOFT; PIERSON, 1994), raça, Bos indicus

quando comparada a raças européias (BARROS; NOGUEIRA, 2001), além da

condição folicular no início do tratamento superovulatório (MONNIAUX, et al.,

1983; GRASSO, et al., 1989; PIERSON; GINTHER, 1988; BUNGARTZ;

NIEMMAN, 1994, BO, et al., 1995) que pode estar diretamente relacionada a fase

ideal para se iniciar a estimulação hormonal exógena.

A estimulação hormonal com FSH pode ser iniciada antes da emergência

da onda folicular ou no dia da emergência (GOULDING, et al., 1990; NASSER, et

al., 1993; ADAMS; ROBERTS, et al., 1994; BO, et al., 1995; STOCK, et al., 1996),

ou seja, antes dos folículos subordinados iniciarem seu processo de atresia (BO,

et al., 1995).



xxi

Segundo PIERSON et al. (1988), GRASSO et al. (1989), GUIBAULT et al.

(1991) e ADAMS et al. (1993), o início de tratamentos com gonadotrofinas na

presença de um folículo dominante ou após a seleção do folículo dominante

resulta em uma redução da resposta superovulatória.

BERGFELT et al. (1994) e MERTON et al. (2002), iniciaram a

superovulação 48 e 38 a 46 horas, respectivamente, após a aspiração e obtiveram

melhores resultados.

Em vista dessas informações, uma alternativa para se obter uma melhor

resposta superovulatória é controlar a dinâmica folicular (BO, et al., 2000), ou a

emergência da nova onda folicular em programas de transferência de embriões. A

sincronização da emergência da onda folicular tem como objetivo remover o efeito

supressivo do folículo dominante e iniciar uma nova onda (BO, et al.,1995; 2000),

situação que ocorre normalmente em animais entre os dias 8º e 12° após a

detecção do estro.

Existem diferentes métodos pelos quais se pode controlar a dinâmica

folicular em bovinos. Estudos demonstraram que a eliminação do folículo

dominante, por métodos físicos ou hormonais, resultam em aumento de FSH e

desta forma emergência de uma nova onda folicular num período de tempo

conhecido (ADAMS, et al., 1992; BO; GHINTHER, et al., 1996; MIHM, et al.,

1997). A possibilidade de utilização de estradiol (BO, et al., 1993,1994;

CARRIERE, et al., 1995) ou estradiol associado a progestágenos (BO, et al., 1991;

1996) para sincronizar a onda folicular, vem sendo muito utilizado em protocolos

de superovulação em bovinos (BO, et al., 1995b, 1996; BROADBENT, et al., 1995;

ANDRADE, et al., 2002a,b,c; OLIVEIRA, et al., 2002). Quando a progesterona é

usada associada ao estrógeno, a emergência da nova onda folicular ocorre ao

redor de 4 ou 5 dias após o tratamento ( BO, et al., 1995, 1996; CACCIA; BO,

1998; MAPLETOFT, et al., 1999). BO et al. (2000), demonstraram que o início do

tratamento com gonadotrofinas 4 dias após o tratamento com progesterona e

estradiol resulta em resposta superovulatória semelhante a iniciada na emergência

da segunda onda folicular ou entre os dias 8º e 12º do ciclo estral.



xxii

O mesmo foi observado em vacas da raça Nelore, onde trabalhos utilizando

métodos hormonais para sincronizar a onda folicular para início da SOV

demonstraram que não há comprometimento da morfologia do embrião ou taxa de

gestação, quando comparado ao protocolo padrão e elimina a necessidade de

observar o cio, permitindo a superovulação de grande número de doadoras em

curto período de tempo (AZEVEDO; COELHO,1991; ANDRADE; OLIVEIRA, et al.,

2002; ANDRADE, et al., 2003).

Além dos métodos hormonais empregados para promover a sincronização

da emergência da onda folicular em vacas, o método físico através da aspiração

folicular guiada por ultra-sonografia transvaginal vem sendo utilizado com

sucesso.

BERGFELT et al. (1994), realizaram aspiração folicular de todos os folículos

maiores ou iguais a 5 mm de diâmetro, em estágio aleatório do ciclo estral, e

constataram aumento no nível sérico de FSH em 24 horas e emergência da nova

onda folicular em torno de 48 horas após a aspiração folicular. O mesmo foi

constatado por trabalhos com aspiração somente do folículo dominante, tanto em

novilhas Bos taurus (AMARIDIS, et al., 1999; ADAMS, et al., 1994; BERGFELT,

1994) quanto Bos indicus (BURATINE, et al., 2000).

SHAW et al. (1999) e MERTON (2003), estudando procedimentos de

superovulação com aspiração prévia do folículo dominante observaram aumento

no índice de embriões viáveis de 3,9 a 5,9. GRADELA et al. (2000), avaliando em

vacas Nelore a resposta da SOV iniciada na presença ou ausência do FD e após a

aspiração do FD observaram que a resposta superovulatória das doadoras não

diferiu entre os grupos, mas a taxa de viabilidade embrionária foi maior nos grupos

sem FD (69,4%) e FD aspirado (68,99%) quando comparados ao grupo com FD

presente (48,54%).

No início da década de 90, com a introdução da Ovum Pick-up, seguida

pela produção in vitro de embriões (OPU-PIV), a expectativa no incremento da

produtividade das fêmeas aumentou. A aplicação da OPU-FIV é de grande

importância para a multiplicação rápida de animais, e exibe algumas vantagens

quando comparada com a MOET. NIBART et al. (1995), demonstraram que se



xxiii

pode obter até 18 gestações em três meses utilizando aspiração folicular,

enquanto com a TE clássica, no mesmo período, seria possível obter apenas 5

gestações. Desta forma pela OPU-FIV é possível produzir 2 a 3 vezes mais

embriões por unidade de tempo quando comparado à TE convencional. Outras

vantagens da OPU-PIV são a obtenção de oócitos em qualquer fase do ciclo estral

sem tratamento gonadotrófico (MERTON, et al., 2003), possibilitando realizar

repetida recuperação de oócitos de animais vivos sem trauma aparente do trato

reprodutivo, permitindo, desta forma, a produção de embriões oriundos de vacas

senis (BROGLIATTI; ADAMS, 1996), com patologias reprodutivas adquiridas

(LOONEY, et al., 1994; HASLER, et al., 1995; RODRIGUES; GARCIA, 2000),

prenhes, durante o primeiro trimestre de gestação (BUNGARTZ, et al., 1995;

MEINTJES, et al., 1995) ou em novilhas pré-púberes (ARMSTRONG, et al.;

ADAMS, 1994; BROGLIATTI, 1996). Outra vantagem particular da FIV em relação

a outras biotecnologias é a maximização do uso do sêmen, permitindo maior

produção de embriões com doses de alto valor comercial e inclusive sêmen

sexado (FABER, et al., 2003).

Entretanto, as taxas de blastocistos bovinos oriundos de oócitos maturados

e fertilizados in vitro têm permanecido relativamente estáticas na última década,

somente em torno de um terço (LONERGAN, et al., 1994, THOMPSON;

DUGANIZICH, 1995), 15 a 20% (HENDRIKSEN, et al., 2000) ou 35% (DAYAN,

2001) dos oócitos selecionados morfologicamente antes de serem submetidos a

MIV resultam em embriões viáveis. Segundo PEIXER et al. (1995), além dos

baixos índices de blastocistos, a produção in vitro de embriões ainda apresenta

algumas limitações: qualidade biológica dos embriões, dificuldades na

criopreservação dos embriões e dos oócitos, menor viabilidade dos oócitos obtidos

de bezerras em relação aos de vacas e novilhas, e o custo, que é superior ao

embrião produzido pela transferência de embriões (TE).

Buscando obter maior número de embriões em curto espaço de tempo, os

protocolos têm geralmente consistido de uma ou duas aspirações semanais

usando animais superovulados ou não (LOONEY, et al., 1994; BOLS;

BUNGARTZ, et al., 1995; HASLER, et al., 1995; STUBBINGS, 1995). Embora a



xxiv

aspiração realizada 2 vezes por semana aumente o número de folículos, oócitos

recuperados e embriões produzidos (GIBBONS, et al., 1994), a alta freqüência e o

curto intervalo entre as aspirações afeta negativamente o número de oócitos

(HASLER, et al., 1995; BOUSQUET, et al., 1999) a longo prazo.

Têm sido reportadas taxas de recuperação de oócitos em torno de 2 a 3 por

doadora, por sessão de aspiração (PIETERSE, et al., 1988), 4,7 (BOUSQUET, et

al., 1999), 9,7 (DAYAN, et al., 2000) e acima de 11 oócitos (BORDIGNON, et al.,

1997) .

Existe também uma ampla variação na produção de oócitos e embriões,

KRUIP et al. (1994), relataram variação entre as doadoras de 9 a 26% e HASLER

et al. (1995), variação entre 4% a 33%. DAYAN et al. (2000a), observaram

variação entre 14 e 54% na produção de embriões em 20 doadoras submetidas a

OPU-FIV.

Essa variação pode estar diretamente relacionada ao fato de que o oócito

para ser fertilizado in vivo é obtido através da ovulação de um folículo saudável,

durante uma fase específica do ciclo estral e os oócitos aspirados para a produção

in vitro são obtidos de folículos em diferentes estágios do desenvolvimento

(LONERGAN, et al., 1994; HENDRIKSEN, et al., 2000), em fases distintas do ciclo

estral (MACHATKOVÁ, et al., 1996), portanto expostos a diferentes concentrações

de FSH, podendo levar a uma diminuição na competência oocitária

(MACHATKOVA, et al., 2004).

Vários estudos têm demonstrado que a fase do ciclo estral e inclusive do

desenvolvimento folicular influenciam a competência oocitária, uma vez que o

diâmetro do folículo afeta diretamente o oócito (MACHATKOVA, et al., 2004). Em

alguns estudos, oócitos provenientes de folículos maiores se desenvolvem melhor

in vitro, onde se observou aumento na produção de embriões de oócitos aspirados

de folículos médios e grandes quando comparado a folículos pequenos (PAVLOK,

et al., 1992; LOONERGAN, et al., 1994; ARLOTTO, et al., 1996; HAGEMANN, et

al., 1999b). Provavelmente devido a fase de dominância do ciclo estral onde o

folículo dominante afeta negativamente a competência oocitária dos folículos

subordinados induzindo avanço no estádio de atresia (HENDRIKSEN, et al.,



xxv

2000). No entanto, CAROLAN et al. (1996), SENEDA et al. (2001), não

observaram influência do diâmetro folicular sobre a competência do oócito,

analisando oócitos aspirados de folículos pequenos e grandes.

MACHATKOVA et al. (1996), comparando a aspiração em diferentes

estádios do ciclo estral, demonstraram que oócitos colhidos nos dias 14 a 16 do

ciclo apresentavam melhores índices de competência para o desenvolvimento até

balstocisto quando comparados aos aspirados nos dias 7, 8 e 9. Em outro estudo,

oócitos colhidos de folículos subordinados nos dias 2, 3 e principalmente no dia 7

da onda, demonstram menor competência que aqueles recuperados no dia 5

(VASSENA, 2003). HAGEMAN (1999), MACHATKOVA et al. (2000), concluem

que o desenvolvimento até balstocisto é significativamente maior em oócitos

colhidos durante a fase de crescimento folicular comparado à fase de dominância

independente do diâmetro do folículo, porém a competência oocitária tendeu a

aumentar em oócitos oriundos de folículos maiores.

CASTILHO; GARCIA (2003), estudando a fase da 1ª onda e o diâmetro

folicular sobre a competência oocitária em Nelore observaram que não houve

efeito do diâmetro folicular sobre a produção de balstocistos, mas houve interação

do diâmetro com a fase folicular e concluíram que a competência é melhor nos

folículos pequenos no início da onda e melhora nos folículos maiores com o

avanço da onda. O mesmo foi observado por MACHATKOVA et al. (2004) em Bos

taurus.



xxvi

III. MATERIAL E MÉTODOS

Local do Experimento

Os experimentos para colheita de material (oócitos e embriões) foram

desenvolvidos na Agropecuária J. Garcia localizada no município de Regente Feijó

– SP e Fazenda Experimental da Unoeste localizada no município de Presidente

Bernardes – SP. Posteriormente os oócitos foram enviados ao Laboratório de

Biotecnologia do Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Reprodução

Animal da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinária (FCAV) da Universidade

Estadual Paulista (UNESP), Câmpus de Jaboticabal – SP, para produção in vitro

(PIV) dos embriões.

Animais

Foram utilizadas 23 fêmeas adultas da raça Nelore (Bos taurus indicus), com idadeentre quatro a nove anos, pesando em média 500 Kg. As fêmeas, em perfeitas condiçõessanitárias e reprodutivas foram mantidas em pasto de Brachiaria decumbens, com acesso aágua e sal mineral Ad libitum.

Tratamentos

As fêmeas foram submetidas a uma aspiração folicular – aspiração folicularreferência (OPU 1) em fase aleatória do ciclo estral, seguida pela inserção de implante deliberação lenta de progestágeno (Crestar® Intervet International B.V-Boxmeer-Holanda).Em torno de 48 a 60 horas após a aspiração iniciou-se o tratamento de supererovulaçãoovariana (SOV) utilizando-se FSH (Folltropin® Vetrepharm Inc. Ontário, Canadá) na dosetotal de 180 mg por vaca, com duração de quatro dias consecutivos, em oito aplicações(quadro 1). Durante a sexta e sétima aplicação de FSH foi administrada por via IM 500 µgde PGF2α (Preloban® Intervet International B.V-Boxmeer-Holanda) e o implante deprogestágeno foi retirado durante a administração da sétima dose de FSH.

Quadro 1. Esquema de superovulação com FSH:



xxvii

Horário Dia 1(FSH)

Dia 2(FSH)

Dia 3

(FSH/ PGF2α)

Dias4

(FSH/ PGF2α)

7:00 h 40mg 20mg 20mg 10mg + 500 µg19:00 h 40mg 20mg 20mg + 500 µg 10mg

Aproximadamente 12 horas após o término da SOV, as fêmeas receberam 25mg deLH exógeno (Lutropin-V® Vetrepharm, Beleville, Ontário, Canadá) para causar ovulação erealizar a IA com tempo fixo. Foram realizadas 2 inseminações com intervalo de 12 horas,sendo que a 1ª inseminação ocorreu 12 horas após a administração de LH, utilizando sêmencongelado da raça nelore em palhetas de 0,5 mL, descongelado de acordo com o critérioindicado pelas centrais (36°C por 30’).

No dia da colheita dos embriões as fêmeas foram divididas em seis tratamentos quevariaram de acordo com o momento da aplicação de PGF2α após a colheita de embrião(Dia 0) e a aspiração folicular (OPU2) realizada após a SOV (figura 1). Os tratamentosrealizados foram:

T (0-144) – aplicação de PGF2á imediatamente após a colheita de embriões easpiração 144 horas após a administração de PGF2á;

T (48-120) – aplicação de PGF2á 48 horas após a colheita de embriões e aspiração120 horas após a administração de PGF2á;




T (96-48) – aplicação de PGF2á 96 horas após a colheita de embriões e aspiração48 horas após a administração de PGF2á

A PGF2α foi administrada em diferentes momentos para avaliar se haveria efeito dafase da primeira onda folicular na segunda aspiração folicular (OPU 2) e avaliar se estasegunda aspiração seria afetada pela prévia superovulação.

Tratamento – T(0-144) (n=4)

144 horasDia 0 OPU 2PGF2á


48 horas 120 horas



xxviii

Dia 0 PGF2á OPU 2


48 horas 96 horasDia 0 PGF2á OPU 2







Figura 1. Representação esquemática dos tratamentos realizados após a colheita deembriões em 23 fêmeas nelore.D 0 – dia da colheita dos embriões/ n – número de animais

Aspiração Folicular

O procedimento de aspiração folicular foi realizado utilizando-se equipamento deultra-som Aloka SSD-500 com transdutor microconvexo de 5 mHz (UST 974-5) conectadoa guia de biópsia adaptado por Chuck Bolland, com agulhas 18 G, (Cook VBOAS 1855) elinha de aspiração (Cook VBOA 18L) em tubos de centrífuga de 50 mL. A pressão devácuo foi obtida com uma bomba Cook V-MAR 5000, ajustada entre 72 e 78 mmHg.

Para evitar movimentos peristálticos e desconforto ao animal foi feita anestesiaepidural com 5 mL de Lidocaína a 2% (Pearson®) e em seguida o transdutor foi inseridoaté o fundo vaginal e, com o auxílio da manipulação transretal, os ovários foramposicionados para obtenção de uma boa visualização na tela do ultra-som. Os folículos aserem aspirados foram posicionados no percurso da linha de punção indicada na tela do



xxix

ultra-som e quando a agulha se aproximou do folículo a ser aspirado, o pedal da bomba devácuo foi pressionado e o folículo aspirado (NIBART et al., 1995), o mesmo procedimentofoi repetido em todos os folículos visíveis de cada ovário. A lavagem da agulha e o meio derecebimento dos oócitos foi composto de DPBS (Dulbeco Modificado - Nutricell) acrescidode 5,0 UI/mL de heparina sódica (Liquemine ) e 50 mg/mL de Gentamicina (Gentocin ).

Lavagem, seleção dos oócitos

O material aspirado foi transferido para o filtro de colheita de embriões

(EmCom®) e lavado com a mesma solução utilizada na aspiração. O sedimento

restante no filtro foi observado em placas de Petri e efetuado a busca e contagem

dos oócitos e posterior classificação da qualidade. Os oócitos foram classificados

de acordo com sua morfologia (número de camadas de células do cumullus e

aspecto do citoplasma) em graus I, II e III (GI, GII e GIII), oócitos sem cumullus

(s/c), expandidos (exp), degenerados (deg) e atrésicos (atr), segundo LONERGAN

(1992). Os oócitos considerados viáveis foram classificados como GI, GII e GIII,

lavados em solução TCM 199 Hepes (Gibco) suplementado com 10% SFB

(Gibco), 50 µg de gentamicina, 2,2 µg de piruvato e transportados em criotubos

(Corning®) contendo meio de maturação em banho Maria a 35°C.

Transporte dos oócitos

Os oócitos foram transportados em meio de maturação composto por meio

TCM 199 Bicarbonato, suplementado com 10% SFB, 50UI de hCG/mL, 0,5 µg/mL

de FSH, 1µg/mL de estradiol, 2,2µg/mL de piruvato, 70 µg/mL de amicacina em

atmosfera de 5% de CO2 e 5% de O2. O tempo médio de transporte variou de 6 a

8 horas, não ultrapassando 8 horas do início da aspiração na primeira vaca até a

chegada dos oócitos ao laboratório.

Maturação in vitro (MIV)

Chegando no laboratório os oócitos foram lavados três vezes em meio de lavagemTCM-199 Hepes, suplementado com 10% de SFB e 70 µg de amicacina. Em seguida,foram transferidos para placas de Petri, em microgotas de 100 µL de meio de maturação,



xxx

que consistiu de meio TCM 199 Bicarbonato, suplementado com 10% SFB, 50UI dehCG/mL, 0,5 µg/mL de FSH, 1µg/mL de estradiol, 2,2µg/mL de piruvato, 70 µg/mL deamicacina. Os oócitos permaneceram incubados por 24 horas a 38,5°C em atmosfera de 5%de CO2 em ar.

Fecundação in vitro (FIV)

Os oócitos maturados foram lavados três vezes em meio de fecundação

TALP-FIV e transferidos para microgotas de 100µL de meio de fecundação Tyrode

modificado (TALP) suplementado com 10 µg/mL de heparina e 160 µL da solução

PHE. O sêmen congelado foi separado em Gradiente de Percoll 90 e 45%,

submetido a uma força de centrifugação de 900g durante 30 minutos. O sedimento

foi recuperado e avaliado quanto ao volume, concentração e motilidade

espermática. A concentração final foi ajustada para 25 x 106 espermatozóides

vivos por mL, de modo que, ao adicionar 4µL do sêmen em cada microgota de

100µL de meio TALP-FIV-Gotas, obteve-se a concentração final de 100x103

espermatozóides vivos por gota. Posteriormente, foram incubados em temperatura

de 39°C por 18 a 20 horas, com atmosfera de 5% de CO2 em ar, para a

fecundação.

Cultivo in vitro (CIV)

Após o tempo de fecundação, os zigotos foram lavados por três vezes em meio SOFe as estruturas transferidas para microgotas com 100 µL de meio de cultivo, recobertas poróleo mineral, permanecendo nestas por um período de 6 a 8 dias até os zigotos atingirem osestádios de mórula (Mo) e blastocisto (Bl). O meio de cultivo foi renovado em cadamicrogota no terceiro e quinto dia (feeding) e no 6º e 7º dia foi observado odesenvolvimento embrionário.

Colheita de embriões

Sete dias após a primeira IA, os embriões foram colhidos pelo método não cirúrgicocomo descrito por NEWCOMB et al. (1978), utilizando-se Solução Salina FosfatadaTamponada (DPBS – Dulbecco Modificado-Cutilab), contendo 1% de Soro Fetal Bovino



xxxi

(SFB), ou seja, 10 mL de SFB em 1 litro de DPBS, ambos a 37°C e recuperados em filtropróprio (EmCom ).

Manipulação e Avaliação Morfológica dos Embriões TE

Os embriões foram rastreados e transferidos para Placa de Petri contendo DPBSenriquecido com 10% de SFB. Posteriormente foi avaliado o estádio de desenvolvimentodo embrião (mórula, blastocisto, blastocisto em expansão e balstocisto eclodido)(LINDNER & WRIGHT-JR, 1983). Quanto ao formato e integridade da zona pelúcida e amorfologia foram classificados em normais, degenerados, não fertilizados e sem zonapelúcida (BOLAND et al., 1978).

Análise Estatística

Os dados referentes à aspiração folicular realizada após a superovulação

(OPU 2) foram avaliados pelo teste do Qui-Quadrado. Para verificar se houve

diferença com relação aos resultados da OPU 2 quando comparamos com os

resultados da OPU 1 (referência), utilizou-se um delineamento inteiramente

casualizado

utilizando o procedimento GLM (General Linear Model) no software

Statystical Analysis System (SAS), seguido pelo teste de Duncan para estabelecer

a comparação entre médias. Neste caso, as variáveis analisadas (percentual de

oócitos viáveis e a taxa de blastocistos) foram obtidas a partir das diferenças com

relação aos resultados da OPU 2 quando comparados com os resultados da OPU

1 (referência).



xxxii

IV. RESULTADOS

A aspiração folicular referência (OPU 1), em 23 vacas da raça Nelore, foi

realizada em 6 sessões de aspiração resultando na recuperação de 299 oócitos

(média de 13 por animal), dos quais 223 (74,5%), uma média de 9,6 por animal,

foram submetidos a maturação e fecundação in vitro produzindo 44 blastocistos

(19,7%), uma média de 1,9 por animal. Embora a OPU 1 tenha sido realizada em

fase aleatória do CE os dados foram agrupados por tratamento, pois a aspiração

referência (OPU 1) e OPU 2 foi realizada nos mesmos animais para avaliar a

resposta destes mesmos indivéduos aspirados em fase aleatória e posteriormente

em tempo determinado. Portanto quando os animais foram agrupados por

tratamentos, o percentual de oócitos viáveis variou de 61,5 a 88,9%, sendo em

média 74,5%, enquanto o desenvolvimento dos oócitos maturados até blastocisto

variou de 1,9 a 54,2%, sendo em média 19,7% (Tabela 1).

Tabela 1. Número de animais aspirados, total de oócitos recuperados, número e

percentual de oócitos viáveis e número e percentual de blastocistos obtidos em

fase aleatória do ciclo estral na aspiração referência (OPU 1) de 23 vacas da raça

nelore agrupadas em 6 sessões de acordo com o tratamento da OPU 2.

Número de oócitos BlastocistosSessõesOPU

no deanimais

Total Viáveis (%) no %

1ª T (0 – 144) 4 38 29 (76,3) 9 31,02ª T (48 – 120) 5 61 53 (86,9) 1 1,93ª T (48 – 96) 4 52 32 (61,5) 6 18,84ª T (72 – 96) 3 34 23 (67,6) 4 17,45ª T (97 – 72) 4 87 62 (71,3) 11 17,76ª T (96 – 48) 3 27 24 (88,9) 13 54,2

Total 23 299 223 (74,5) 44 19,7%Resultados da produção in vitro das sessões de aspiração folicular realizadas em fase aleatória do ciclo estral na aspiraçãoreferência (OPU 1), agrupadas conforme os tratamentos da OPU 2: T (0-144), T (48-120), T (48-96), T (72-96), T (96-72), T(96-48).



xxxiii

Após a aspiração folicular referência (OPU 1) as mesmas fêmeas foram

superovuladas para colheita in vivo de embriões e aspiradas novamente (OPU 2)

em diferentes momentos da 1º onda folicular após a superovulação (Tabela 2). Do

total de 252 oócitos recuperados (média de 10,9 por animal), 73,8% ou 186 (média

de 8,1 por animal) foram classificados morfologicamente como viáveis e

submetidos à maturação e fecundação in vitro, resultando em 17,2% ou 32

blastocistos (média de 1,4 por animal).

O número de oócitos recuperados e produção de blastocistos (total e

percentual) foram afetados (P<0,05) pelo momento da aplicação de PGF2α e a

segunda aspiração folicular (OPU 2) e podem ser observados na tabela 2.

Tabela 2. Número de animais, total de oócitos aspirados, número e percentual de

oócitos viáveis e número e percentual de blastocistos obtidos de vacas da raça

nelore aspiradas em diferentes momentos da 1ª onda folicular após a

superovulação (OPU 2) nos tratamentos T (0-144), T (48-120), T (48-96), T (72-

96), T (96-72) e T (96-48).

Número de oócitos BlastocistosTratamento no deanimais

Total Viáveis (%) no %

T (0 – 144) 4 41 29 (70,7) b 14 48,3 aT (48 – 120) 5 58 52 (89,7) a 6 11,5 bT (48 – 96) 4 61 41 (67,2) bc 6 14,6 bT (72 – 96) 3 21 17 (81,0) ab 2 11,8 bT (96 – 72) 3 56 42 (75,0) ab 3 7,1 bT (96 – 48) 4 15 05 (33,3) c 1 20,0 ab

Total 23 252 186 (73,8%) 32 17,2%Letras diferentes diferem entre si dentro da coluna (p<0,05). Tratamentos:

T (0-144) – PGF2á imediatamente após a colheita de embriões, aspiração 144 horas após a injeção de PGF2á

T (48-120) – PGF2á 48 horas após a colheita de embriões e aspiração 120 horas após a injeção de PGF2á




T (96-48) - PGF2á 96 horas após a colheita de embriões e aspiração 48 horas após a injeção de PGF2á



xxxiv

O percentual de oócitos viáveis foi menor (P<0,05) no T (96-48) (33,3%),

quando a PGF2α foi aplicada 96 horas depois da colheita de embriões e 48 horas

após foi realizada a OPU 2, comparando aos demais tratamentos. No tratamento

T (48-120), a PGF2á foi administrada 48 horas após a colheita de embriões e 120

horas após foi realizada a OPU 2 e obteve-se o maior percentual de oócitos

viáveis entre os tratamentos (89,7%), diferindo dos tratamentos T (0-144), T (48-

96) e T (96-48) que obtiveram 70,7%, 67,2% e 33,3%, respectivamente. Os

tratamentos T (72-96) e T (96-72) não diferiram entre si (P<0,05) do tratamento T

(48-120) quanto ao número de oócitos viáveis.

Com relação à taxa de embriões produzidos in vitro, o melhor tratamento

observado foi o T (0-144) com 48,3% de blastocisto, que diferiu dos tratamentos T

(48-120), T (48-96), T (72-96) e T (96-72) e não diferiu (P<0,05) do T (96-48).

(Tabela 2)

Uma vez que os animais foram submetidos a duas aspirações foliculares

com um tratamento superovulatório intermediário foi estabelecida uma

comparação da produção in vitro entre a OPU 1 (referência) e OPU 2 como

demonstra a tabela 3, onde observa-se que a produção de embriões no T (96-48)

foi significativamente menor (p<0,05) quando comparada aos demais tratamentos,

os quais não deferiram entre si (p>0,05).



xxxv

Tabela 3. Comparação entre médias dos resultados de número de oócitos viáveis

e taxa de blastocisto obtidos na OPU 2 e comparadas aos resultados

da OPU 1 (referência) em 23 vacas da raça nelore aspiradas em fase

aleatória do ciclo estral ou agrupadas em diferentes tratamentos.

Diferenças entre OPU 1 e OPU 2*

Tratamentos Oócitos viáveis

Diferença (%)

BlastocistosNS

Diferença (%)

T (0-144) -6,08 a 17,42

T (48-120) 8,34 a 0,66

T (48-96) -4,93 a 12,13

T (72-96) 8,77 a 6,3

T (96-72) -11,98 a -10,63

T (96-48) -61,1 b -34,97Letras diferentes na mesma coluna diferem entre si pelo teste de Duncan (p<0,05).

NS –não significativo (p>0,05). * diferenças entre os resultados (percentual de oócitos viáveis e a taxa de

blastocistos) da OPU 2 comparada a OPU 1 (referência) para estabelecer a comparação entre médias.

O gráfico 1 demonstra o percentual de oócitos viáveis e balstocistos obtidos

na aspiração referência (OPU 1) e na aspiração folicular realizada em diferentes

momentos da primeira onda folicular após a superovulação.



xxxvi

OPU1 e OPU2 - % oócitos e Bl

76,3

86,9

61,567,6

88,9

71,370,7

89,7

67,2

81

33,3

75

31

1,9

18,8 17,4

54,2

17,7

48,3

11,5 14,6 11,8

20

7,1

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 - 144 48 - 120 48 - 96 72 - 96 96 - 48 96 - 72

Tratamentos

%oó

cito

svi

ávie

s/%

Bl

% oócitos viáveis - OPU 1 % oócitos viáveis - OPU 2 % Bl viáveis - OPU 1 % Bl viáveis - OPU 2

Gráfico1. Resultado da % média de oócitos viáveis recuperados e taxa de

blastocistos obtidos de oócitos aspirados em fase aleatória do ciclo

estral na aspiração referência (OPU 1) e em diferentes momentos

da primeira onda folicular após o tratamento superovulatório (OPU

2), realizado em 23 fêmeas da raça nelore, agrupadas nos

tratamentos T(0-144), T (48-120), T(48-96), T(72-96), T(96-72) e T

(96-48), de acordo com o tempo de administração de PGF2á após

a colheita de embriões e o momento da segunda aspiração após a

SOV (OPU 2).

A produção in vivo de embriões (TE) nas 23 vacas da raça Nelore resultou

em 72 embriões (3,1 por animal), dos quais 73,6% ou 53 (2,3 por animal) foram



xxxvii

classificados morfologicamente como viáveis e 26,3% ou 19 (3,1 por animal) foram

classificados como não viáveis (Tabela 4).

Tabela 4. Número de animais, número e média total de embriões recuperados,

número de embriões não viáveis, número, média e percentual de

embriões viáveis produzidos in vivo.

Produção de embriões in vivoSessões n Total e

médiaNão

viáveisViáveise média

% Viáveis

1ª T (0 – 144) 4 17 (4,2) 1 16 (4,0) 94,12ª T ( 48 – 120) 5 7 (1,4) 6 1 (0,2) 14,33ª T (48 – 96) 4 12 (3,0) 1 11 (2,7) 91,74ª T (72 – 96) 3 1 (0,3) 1 0 (0,0) 0,05ª T 96 – 72) 4 19 (4,7) 7 12 (3,0) 63,26ª T (96 – 48) 3 16 (5,3) 3 13 (4,3) 81,3

Total 23 72 (3,1) 19 (26,3%) 53 (2,3) 73,6%Produção in vivo de embriões realizada após a aspiração referência (OPU 1) e que precedeu a OPU 2.

V. DISCUSSÃO

No presente estudo com vacas da raça nelore a aspiração referência (OPU

1) realizada em fase aleatória do CE resultou em uma média 9,6 oócitos viáveis e

na OPU 2 a média, independente do tratamento, foi de 8,1 oócitos. Quando os



xxxviii

animais foram agrupados por tratamentos o percentual de oócitos viáveis variou

de 33,3% no T (96-48) a 89,7% no T (48-120).

Essas médias obtidas são semelhantes as taxas de recuperação de oócitos

observadas por CASTILHO, (2003), SENEDA, et al., (2001) e DAYAN et al.,

(2000), 9,0, 9,2 e 9,7, respectivamente.

Com relação à taxa de blastocistos, na OPU 2, embora não houve diferença

significativa, os tratamentos que resultaram em maior taxa de desenvolvimento

embrionária foram o T (0 – 144) com 48,3% e T (48-120) com 11,5 % dos oócitos

maturados e fecundados atingindo o estágio de blastocisto. O desenvolvimento

embrionário em todos os tratamentos da OPU 2 variou de 7,1% a 48,3% e na OPU

1, excluindo o valor de 1,9%, variou de 17,4% a 54,2% e ampla variação também

foi observada por KRUIP et al. (1994), 9 a 26% e HASLER et al. (1995), 4% a 33%

e DAYAN et al. (2000a), 14 e 54%.

Na produção in vivo de embriões, iniciada 48 a 60 horas após a OPU em

fase aleatória do CE, obtivemos uma média de 2,3 embriões por animal, que não

diferiu da média nacional nas doadoras zebuínas observada por BECKER et al. e

RODRIGUES et al., (1988), ALVIM et al., 2000; ANDRADE et al., 2000; FONSECA

et al., 2000; NOGUEIRA et al., 2000; PENNA et al., 2000; PINTO et al., 2000) que

variou de 2,4 a 9,9 embriões. GRADELA et al. (2000), também não observaram

aumento de estruturas quando realizaram a SOV na ausência do FD, embora

houve melhora na viabilidade embrionária.

Quando analisamos por tratamentos obtivemos as melhores médias de

embriões produzidos in vivo nos tratamentos T (0-144) e T (96-48), 4,0 e 4,3, as

taxas intermediárias nos tratamentos T (48-96) e T (96-72), 2,7 e 3,0 e ausência

de produção nos tratamentos T (48-120) e T (72-96) que de acordo com GALLI

(2003) confirmam a baixa consistência na produção in vivo de embriões, sendo

que um terço das doadoras tratadas não respondem a SOV, um terço produz em

média 3 embriões e somente o terço restante resulta em grande número de

embriões transferidos.

Quando comparamos os tratamentos realizados na OPU 2, observou-se

que a recuperação no T(96-48), 5 oócitos (33,3%), foi significativamente menor



xxxix

que os demais tratamentos, demonstrando que o momento da aspiração folicular

muito próxima a administração de PGF2α apenas 48 horas prejudicou a

recuperação dos oócitos. È importante ressaltar que a resposta a superovulação

desses animais foi boa e a presença de muitos CLs nos ovários pode ter

dificultado a recuperação dos oócitos na OPU 2, reforçando o fato que a aspiração

realizada muito próxima a administração de PGF2α pode prejudicar a posterior

recuperação de oócitos. Por outro lado podemos observar que nos tratamentos

em que a aspiração folicular foi realizada a partir de 96 horas da aplicação de

PGF2á as taxas de oócitos não variaram, demonstrando que a recuperação e a

produção in vitro após a SOV é possível sem prejudicar os índices de produção.

Além da possibilidade da diminuição da recuperação dos oócitos em função

da presença de vários CLs nos ovários , outro fator que pode ter afetado

diretamente essa recuperação é a ausência da emergência da onda folicular até

48 horas após a colheita de embriões. Segundo ADAMS et. al (1992), FORTUNE

et al. (1993), GIBONS, GINTHER (1999), em torno de 24 a 36 horas após a

ovulação ocorre o crescimento de um grupo de folículos que é caracterizado como

a emergência da onda folicular no CE normal. No entanto, não existe na literatura

trabalhos que demonstrem o tempo de emergência da onda folicular após

superovulação, mas no presente trabalho podemos afirmar que até 48 horas após

a PGF2á não houve emergência da onda folicular e esta provavelmente ocorre

mais tarde em animais superovulados, pois acima de 72 horas observamos

aumento no percentual de oócitos recuperados e acima de 96 horas não houve

comprometimento da taxa de oócitos recuperados e produção de blastocistos.

É importante ressaltar que assim como no T (0-144) obteve-se a maior taxa

de blastocistos produzidos in vitro, também observou-se maior taxa de blastocistos

produzidos in vivo, demonstrando que a SOV além de não ter prejudicado a

recuperação na OPU 2, ainda gerou bom índice na produção de embriões in vivo.

Os resultados de recuperação de oócitos e taxa de balstocistos das

aspirações não variaram significativamente entre a OPU 1 e OPU 2, concluindo

que é possível realizar a alternância das biotecnologias sem prejudicar os índices



xl

de produção, desde que a OPU ocorra após a lise dos CLs presentes nos ovários

após a superestimulação.

VI. CONCLUSÃO

- a aspiração folicular realizada muito próxima à colheita de embriões

diminui significativamente a recuperação de oócitos;

- a superovulação realizada a partir de 96 horas após a aplicação de

PGF2α em animais previamente superovulados para colheita de embriões in vivo

não afeta a recuperação de oócitos e a produção in vitro de blasctocistos;

- é possível realizar a alternância das biotecnologias sem prejudicar

significativamente os índices de produção.



xli

VII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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