Universidade Estadual do CearáFaculdade de VeterináriaPrograma de Pós-Graduação em Ciências VeterináriasBiotécnicas Aplicadas à Reprodução de Fêmeas Caprinas e Ovinas

Transgênese e Clonagem

Vicente José de F. Freitas

Laboratório de Fisiologia e Controle da Reprodução

www.uece.br/lfcr

Plano de Aula

• Apresentar conceitos.

• Discutir a transgênese e clonagem em pequenos ruminantes:• Princípios.

• Métodos.

• Apresentar novas técnicas.

• Considerações finais.

➢ Animais ou plantas

• Adição, troca ou inativação de um determinado gene.

• Maioria das vezes: OGMs são organismos transgênicos.

➢ Transgênese animal

➢ Possibilidades sem precedentes

➢ Limitações éticas e legais

• Legalização junto aos orgãos competentes

• Brasil CTNBio

• CQB (Certificado de Qualidade em Biossegurança)

Transgênese

Aplicações da transgênese

Salmão (Salmo salar) transgênico para GH:Precoce para abateAqua Bounty Technologies

➢Peixes transgênicos com fins comerciais

GloFish com fluorescência vermelha: PET nos EUA

Aplicações da transgênese

Camundongo transgênico para estudo de hipertrofia cardíaca (Dr. João Bosco Pesquero - UNIFESP).

➢Camundongos transgênicos como modelo de estudo defunções gênicas e doenças humanas

Aplicações da transgênese

➢Suínos transgênicos para produção de órgãos“humanizados” para uso em xenotransplantes.

Aplicações da transgênese

➢Caprinos transgênicos para produção de proteínasrecombinantes no leite.

Lizosima humana (Dr. James Murray - EUA).

Proteína da teia de aranha(Nexia Biotechnologies - Canadá)(Universidade de Wyoming - EUA).

Aplicações da transgênese

• 1º medicamento aprovado para uso humano a partir do leite deanimais transgênicos.

• Prevenção de eventos trombo-embólicos em cirurgias e no peripartode pacientes com deficiência hereditária de anti-trombina.

Anti-trombina III humana GTC Biotechnologies➔ rEVO

Por que a produção em animais?

Houdebine, 2008

Aspectos Bactéria Levedura Cél. de inseto + baculovirus

Cél. CHO

Plantas transgênicas

Animais transgênicos

Nível de Produção

++(+) ++(+) + + ++ ++++

Custo de Produção

+++++ +++++ ++ ++ +++++ ++++

Scaling up +++++ +++++ ++ + +++++ ++++

Processamento pós-traducional

+ ++ +++ ++++ +++ ++++

Glicosilação + ++ +++ ++++ ++ ++++

Propriedade Intelectual

++++ +++ +++ ++ +++ +++

Produtos no mercado

++++ +++ +++ +++++ + +++

Por que a produção em animais?

Houdebine, 2008

Fucose

Galactose

Ác. Siálico

Glic-Nac

Manose

Xilose

Bactérias

Insetos

PlantasMamíferos

Proteína

Qual espécie escolher?

• 1 L de leite/lactação

• 5 a 8 lactações/ano

• 1ª lactação: 6 meses

• 8.000 L de leite/lactação

• 1 lactação/ano

• 1ª lactação: 2,5 anos

• 800 L de leite/lactação

• 1 lactação/ano

• 1ª lactação: 1 ano

Transgênese na espécie caprina

➢Principais características:

• Boa aptidão leiteira

• Gestação: 5 meses

• prolificidade (cabritos/parto)

• custo de manutenção

• eficiência na microinjeção de DNA (x bovinos)

Métodos para obtenção

• Métodos clássicos:

• Microinjeção pró-nuclear

• Produção de zigotos (in vivo ou in vitro)

• Transferência nuclear de células somáticas (TNCS)

• Métodos alternativos:

• Vetores lentivirais

• Transferência de genes mediada por espermatozoides

• Sistema CRISPR-Cas9 (Repetições Palindrômicas Curtas

Agrupadas e Regularmente Interespaçadas)

Microinjeção pró-nuclear

Microinjeção daconstrução de DNA

Purificação

Fundadores

Leite

Rebanhotransgênico

Medicamento

Transferência para receptoras

Doadora de embrião pró-nuclear

Microinjeção de embriões prónucleares colhidos de cabras Canindé (a) ou Saanen (b).

Doadora de embrião pró-nuclear

Efeito da raça da doadora sobre a qualidade da microinjeção.

Doadora de embrião pró-nuclear

Diagnóstico de prenhez, sobrevivência embrionária e parto em receptoras deembriões colhidos de cabras Canindé e Saanen.

Estudos nos fundadores e geração F1

Estudos nos fundadores e geração F1

Dia -20 Dia 0

Dinâmica do hG-CSF no leite de cabra transgênica durante a lactação induzida.

Mean 690 μg/ml

Estudos nos fundadores e geração F1

Teste de formação de colônia de granulócitos. Controle negativo (leite de cabra nãotransgênica), o leite de cabra transgênica (contendo 50, 100 e 200 ng/ml de hG-CSF) e ocontrole positivo (hG-CSF recombinante; Filgrastim, 50 ng ml).

Estudos nos fundadores e geração F1

Prenhezes Descendentes Descendentes por sexo (%)a

Taxa de transgênicos(%)b

Total

M F M F

10M 7 11 6 (54,5) 5 (45,5) 3 (50,0) 3 (50,0) 6 (54,4)

12F 5 8 4 (50,0) 4 (50,0) 2 (66,7) 1 (33,3) 3 (37,5)

Total 12 19 10 (52,6) 9 (47,4) 5 (55,6) 4 (44,4) 9 (47,4)

Transmissão do transgene à descendencia das duas linhagens de caprinos transgênicos.

Transferência Nuclear de Células Somáticas

• Mesmo procedimento para obtenção da ovelha Dolly• Wilmut et al. (1997)

• Eficiência de 7,7%• Keefer et al. (2002)

Transferência Nuclear de Células Somáticas

Antitrombina(Baguisi et al. 1999)

Glucoceribrosidase(Bertolini et al. 2016)

α-lactalbumina (Feng et al. 2015)

Sistema CRISP/Cas9

• Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats• Repetições Palindromicas Curtas Agrupadas e Regularmente

Interespaçadas

• Mecanismo de defesa do sistema imune bacteriano contrafagos e plasmídeos invasores• Ishino et al. (1987)

• Como funciona em transgênese?• Técnica que possibilita cortar, através da nuclease Cas9, uma sequencia

de DNA específica, reconhecida por complementariedade com um RNAservindo de guia.

• Os mecanismos celulares de reparação do DNA permitem chegar àinativação de um gene alvo, a inserção de uma sequencia genética ou amodificação de uma sequencia existente.

Sistema CRISP/Cas9

Sistema CRISP/Cas9

Peptídeos de Penetração Celular (PPCs)

• Moléculas com capacidade de internalizar moléculasbiologicamente ativas em células eucarióticas• (Rádis-Baptista e Kerkis, 2011)

• Crotamina• Miotoxina isolada do veneno da cascavel (Crotalus durissus terrificus) da

América do Sul

Dr. Gandhi-Rádis BaptistaUniversidade Federal do Ceará

Peptídeos de Penetração Celular (PPCs)

• Crotamina:• Liga-se eletrostaticamente ao DNA, formando um complexo peptídeo-DNA e

realizando a entrega no interior das células

• Nascimento et al., 2007

Considerações

• A produção de proteínas recombinantes no leite depequenos ruminantes transgênicos está aos poucostornando-se uma realidade industrial.

• A dificuldade técnica e o custo da transgênese emanimais domésticos são as principais causas de sualentidão de aplicação prática.

• É necessário o desenvolvimento de métodos maiseficientes para melhorar o sucesso da técnica. Noentanto, o sistema CRISPR-Cas9 está facilitando esteprocesso.