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MARCELO JOÃO AMADEI TÍTULO: EXPRESSÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DE GALECTINA-3 EM LESÕES FOLICULARES BENIGNAS E MALIGNAS DA TIRÓIDE Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina, para obtenção do Título de Mestre em Ciências da Saúde. São Paulo 2006

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MARCELO JOÃO AMADEI

TÍTULO: EXPRESSÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DE GALECTINA-3 EM

LESÕES FOLICULARES BENIGNAS E MALIGNAS DA TIRÓIDE

Tese apresentada à Universidade

Federal de São Paulo – Escola

Paulista de Medicina, para

obtenção do Título de Mestre em

Ciências da Saúde.

São Paulo

2006

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MARCELO JOÃO AMADEI

TÍTULO: EXPRESSÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DE GALECTINA-3 EM

LESÕES FOLICULARES BENIGNAS E MALIGNAS DA TIRÓIDE

Tese apresentada à Universidade

Federal de São Paulo – Escola

Paulista de Medicina, para

obtenção do Título de Mestre em

Ciências da Saúde.

Orientador: Reinaldo P Furlanetto

Co-orientador: João Roberto Maciel Martins

São Paulo

2006

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO

ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE MEDICINA

DISCIPLINA DE ENDOCRINOLOGIA

Chefe do Departamento: Emilia Inoue Sato

Coordenador do Curso de Pós-Graduação: Sérgio Atala Dib

iii

FICHA CATALOGRÁFICA

Amadei, Marcelo J

Expressão imuno-histoquímica de galectina-3 em lesões foliculares

benignas e malignas da tiróide

p. 51

Tese de Mestrado – Disciplina de Endocrinologia – Universidade Federal de

São Paulo, Escola Paulista de Medicina

Orientador: Reinaldo Perrone Furlanetto

Descritores: tiróide, neoplasia folicular, imuno-histoquímica, galectina-3

MARCELO JOÃO AMADEI

TÍTULO: EXPRESSÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DE GALECTINA-3 EM

LESÕES FOLICULARES BENIGNAS E MALIGNAS DA TIRÓIDE

BANCA EXAMINADORA

Profa. Dra. Maria Aparecida da Silva Pinhal

Profa. Dra. Edna Teruko Kimura

Profa. Dra. Rosalinda Yossie Asato de Camargo

Suplente:

Profa. Dra. Rosana Delcelo

iv

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO............................................................................................1

2. OBJETIVO..................................................................................................9

3. MANUSCRITO..........................................................................................10

4. CONSIDERAÇÕES FINAIS......................................................................38

5. BIBLIOGRAFIA.........................................................................................44

v

1. INTRODUÇÃO

Os nódulos de tiróide (NT) são extremamente comuns. A prevalência de

nódulos tiroidianos palpáveis nos estudos populacionais de Framingham,

Massachusetts e Whickham, Inglaterra foi 4,2% e 3,2%, respectivamente (1,2).

Esta prevalência é ainda maior ao se utilizarem métodos de imagem como ultra-

sonografia de alta resolução (3). Em um estudo populacional em Hyvinka,

Finlândia, usando transdutor com freqüência de 7,5 MHz, foram detectados

nódulos em 27% das mulheres e 15% dos homens (4).

O espectro clínico varia de nódulos incidentais, assintomáticos, pequenos e

solitários, nos quais a exclusão de neoplasia maligna é a principal preocupação,

àqueles grandes nódulos, parcialmente intra-torácicos que levam a sintomas

compressivos, necessitando de cirurgia independente da etiologia (5).

Em adultos, 80% dos nódulos são benignos (lesões colóides, cistos

degenerativos, adenomas foliculares, tiroidite). Em contraste, embora raros (0,22-

1,8%), nódulos de tiróide em pacientes menores de 21 anos têm uma alta

incidência de malignidade (33% crianças x 5% adultos) (6). Outros aspectos

clínicos, além da faixa etária, devem ser considerados para a possibilidade de

câncer em um nódulo de tiróide: sexo (a proporção de nódulos malignos em

homens é o dobro daquela em mulheres), presença de linfadenopatia regional,

lesão de rápido crescimento, história prévia de irradiação em cabeça e pescoço,

aparecimento de rouquidão, disfagia progressiva ou dispnéia, nódulo fixo, duro,

irregular à palpação e história familiar de câncer de tiróide ou de neoplasia

endócrina múltipla tipo 2 (7).

2

Os métodos disponíveis para avaliação dos nódulos de tiróide incluem a

citologia do material obtido por punção aspirativa com agulha fina (PAAF),

cintilografia e ultra-sonografia. A PAAF inicial é mais útil no diagnóstico e custo-

efetiva que as outras formas de investigação (8).

A PAAF oferece resultados diagnósticos úteis em cerca de 80% dos casos

(9), podendo ser maior ainda dependendo da experiência do puncionador e do

citopatologista, número de aspirações, características dos nódulos, critérios

diagnósticos utilizados e se associada com ultra-sonografia (10). A incidência de

resultados falso-negativos diminui com a experiência clínica e é estimada em torno

de 1% (11).

De maneira geral, a sensibilidade da PAAF varia de 68-98% (média 83%) e

a especificidade, de 72-100% (média 92%). A acurácia diagnóstica, contudo,

depende de como se classificam as lesões ditas foliculares ou suspeitas (12).

Há quatro possíveis resultados com PAAF: (1) maligno, (2) benigno, (3)

suspeito ou indeterminado e, (4) inadequado. A PAAF pode identificar com

confiança nódulos colóides, tiroidite, carcinomas papilífero, medular, anaplásico,

linfoma e, até mesmo, lesões metastáticas. A principal limitação técnica é a

diferenciação citopatológica de uma lesão folicular (13). Cerca de 15% das PAAF

mostram-se suspeitas ou indeterminadas, também referidas como lesões ou

neoplasias foliculares. De 20-25% destas lesões se confirmam malignas após a

cirurgia (14,15). Assim, pelo risco potencial de neoplasia maligna em NT com

PAAF suspeita, há indicação para tratamento cirúrgico em todos os casos (desde

que não seja nódulo autônomo, pois, neste caso a PAAF pode também ser

3

suspeita e a possibilidade de malignidade é muito menor que em nódulos não-

funcionantes).

Os diagnósticos mais freqüentes de neoplasias foliculares submetidas à

cirurgia são, em ordem decrescente de ocorrência: nódulos hiperplásicos,

adenoma folicular, tiroidite linfocítica, carcinoma papilífero variante folicular, bócio

colóide, carcinoma folicular e carcinoma folicular variante oncocítica. A distinção

entre adenoma e carcinoma folicular necessita de critérios histológicos para

confirmar ou excluir a invasão capsular tiroidiana e/ou vascular, impossibilitando

seu correto diagnóstico através da PAAF (16,17,18).

O diagnóstico de CPVF pode ser difícil no aspirado de material celular de

nódulos tiroidianos. A escassez de algumas características citológicas do

carcinoma papilífero, como corpos psamomatosos e inclusões intranucleares

tornam o diagnóstico citológico bastante difícil. Além disso, o aspirado pode

mostrar algumas características mais sugestivas de nódulo hiperplásico ou

adenoma folicular, a depender da presença e aspecto do colóide (19,20).

Vários estudos tentaram identificar critérios preditivos de malignidade em

pacientes com diagnóstico de neoplasia folicular à citologia. Sexo, tamanho do

nódulo e características da glândula à palpação foram os principais fatores

relacionados com risco de malignidade (18). Contudo, nem critérios clínicos,

cintilográficos ou ultra-sonográficos se mostram suficientemente sensíveis ou

específicos para distinguir confiavelmente se a neoplasia folicular identificada à

PAAF é benigna ou maligna.

As lesões foliculares de tiróide podem variar de alterações vistas nos

folículos difusamente, como ocorre no hipertiroidismo, até aquelas que formam um

4

ou mais nódulos. Adenoma folicular, carcinoma folicular e a variante folicular do

carcinoma papilífero normalmente ocorrem como nódulos solitários encapsulados

(21).

Adenomas se apresentam como nódulos solitários sem qualquer evidência

de invasão capsular ou vascular. Múltiplos nódulos encapsulados são

normalmente denominados como hiperplasia nodular. Os adenomas foliculares

são classificados de acordo com seu padrão de crescimento como macrofolicular,

simples, microfolicular, fetal, embrionário e trabecular. O tumor hialinizante-

trabecular é uma entidade distinta que alguns autores, baseados em estudos de

caracterização imunohistoquímica, acreditam tratar-se de uma forma de carcinoma

papilífero encapsulado (22).

O carcinoma folicular representa cerca de 5% dos casos de carcinoma de

tiróide em áreas suficientes em iodo. Tradicionalmente, dois tipos principais de

carcinoma folicular são reconhecidos: minimamente invasivo e grosseiramente

invasivo. O segundo tipo é um tumor diagnosticado clínica e cirurgicamente como

câncer. Tais lesões invadem grosseiramente vasos cervicais ou através da

cápsula da tiróide. São freqüentemente hipercelulares, normalmente

microfoliculares, e/ou focalmente sólidos. Alguns desses tumores podem ser

classificados, de acordo com sua morfologia, como “carcinoma insular” (22).

O carcinoma folicular minimamente invasivo lembra um adenoma folicular; a

lesão é bem definida e freqüentemente encapsulada. O diagnóstico patológico de

carcinoma folicular minimamente invasivo é feito quando há invasão capsular e/ou

vascular. A invasão capsular é normalmente vista como uma lingüeta de células

tumorais penetrando, num padrão semelhante a um gancho ou em cogumelo, a

5

cápsula tumoral. Pode ser limitado à cápsula ou atravessá-la, alcançando o

parênquima tiroidiano circunjacente (22).

O carcinoma papilífero é a neoplasia maligna mais comum de tiróide e seu

diagnóstico patológico é baseado na demonstração de características

citohistológicas típicas. Critérios “maiores”: cromatina frouxa, aumento do núcleo,

invaginações intranucleares e inclusões citoplasmáticas. Critérios “menores”:

colóide eosinofílico espesso, esclerose, nucléolo excêntrico e irregularidades na

membrana nuclear. Há muitas variantes histológicas descritas, baseadas na

morfologia celular (variante células altas), no padrão de crescimento (variante

folicular) e no estroma tumoral (variante esclerosante difuso) (22).

O CPVF é a segunda variante mais comum de carcinoma papilífero, após a

forma clássica, e até 15% destes tumores podem mostrar invasão capsular e

vascular. Contudo, desde sua descrição em 1960 por Lindsay, tem havido muita

controvérsia no diagnóstico do CPVF. As razões para tais divergências incluem os

seguintes: (1) uma grande proporção de CPVF surge em um “fundo” de bócio

nodular e lembram adenoma ou nódulos adenomatosos (que não apresentam

invasão capsular ou vascular); (2) alguns tumores mostram uma distribuição

multifocal ao invés de difusa das características nucleares do carcinoma papilífero

ou, às vezes, sequer as apresentam (22). Esta controvérsia no diagnóstico

histológico é complicada com estudos mostrando uma grande variabilidade entre

observadores no diagnóstico de CPVF, mesmo entre patologistas experientes

(23).

Avanços recentes em diagnóstico molecular como imunohistoquímica,

reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) quantitativo e ensaios

6

de atividade enzimática tornaram possível analisar tais nódulos com o objetivo de

identificar marcadores que possam distinguir lesões benignas e malignas de

tiróide (24).

As características ideais de um marcador molecular que seja útil para o

diagnóstico de NT e carcinoma de tiróide são: (1) distinguir confiavelmente

neoplasias benignas e malignas de tiróide, especialmente em nódulos suspeitos à

citologia; (2) deve ser confirmado por diferentes investigadores; (3) capaz de ser

mensurado a partir de material obtido por PAAF, através de imunocitoquímica,

ensaio funcional ou RT-PCR; (4) possuir significância prognóstica em pacientes

diagnosticados com carcinoma de tiróide, bem como acrescentar informações

sobre a patogênese e opções de tratamento destes pacientes (25).

Há mais de 50 marcadores moleculares analisados em pacientes com NT.

Novos marcadores potenciais aparecem na literatura com freqüência crescente,

embora não sejam usados na prática diária. Dentre os marcadores moleculares

com maior potencial está a galectina-3 (GAL-3) (25,26).

A GAL-3 faz parte de uma família de lectinas ligadoras de β-galactosídeo

com seqüências de aminoácidos relacionadas, às vezes referidas como lectinas

tipo S. As lectinas são proteínas que se ligam a estruturas específicas de

carboidratos e podem, assim, reconhecer glicoconjugados específicos entre uma

vasta amostra expressa em tecidos animais (27).

A expressão de lectinas solúveis é modulada durante a carcinogênese.

Alterações relacionadas à transformação maligna ocorrem na expressão de

lectinas celulares endógenas e a quantidade de lectinas celulares e de superfície

7

celular aumentam consideravelmente durante a progressão para um fenótipo

metastático.

As galectinas são proteínas com pelo menos um domínio de

reconhecimento de carboidratos que apresentam (1) homologia significante na

seqüência de aminoácidos e (2) afinidade demonstrada para β-galactosídeos (28).

Há, até o momento, 14 galectinas descritas em mamíferos e muitas destas foram

encontradas em outras espécies. As galectinas são todas pequenas proteínas

solúveis com peso molecular dos monômeros variando entre 14-36 KDa. Elas são

sintetizadas no citoplasma e freqüentemente permanecem neste compartimento,

embora possam ser secretadas para o meio extra-celular ou translocadas para o

núcleo (29).

As galectinas desempenham papel em diversos processos biológicos:

desenvolvimento, diferenciação e morfogênese, imunidade e apoptose. Além

destes, vários processos celulares como comunicação, adesão, transporte e

modulação parecem ser auxiliados pelo reconhecimento específico de

glicoconjugados (30).

A GAL-3 é expressa em vários tecidos epiteliais (cólon, mama, fígado, pele,

cérebro, ovários, estômago, rins e endotélio), monócitos, macrófagos, basófilos e

mastócitos, além de fibroblastos, condrócitos e osteoblastos. Em alguns tecidos, a

expressão de GAL-3 é regulada durante o processo de diferenciação. Também em

vários tecidos tumorais foi identificada expressão alterada de GAL-3: linfoma

anaplásico de grandes células, carcinoma de mama, cólon, melanoma e

carcinoma de tiróide, entre outros. Esta lectina tem vários ligantes conhecidos

8

celulares e extra-celulares, entre os quais membros da família laminina,

fibronectina fetal, mucina, IgE e Bcl-2 (31).

Vários estudos têm relacionado a expressão de GAL-3 com carcinoma de

tiróide. Contudo, resultados controversos em tipos histológicos de padrão folicular

(adenoma e carcinoma folicular e CPVF) foram obtidos.

9

2. OBJETIVO

Tendo em vista os resultados divergentes obtidos com o marcador

galectina-3 em diferentes centros, o objetivo deste estudo foi:

Avaliar, através de imunohistoquímica, a acurácia do marcador galectina-3

na capacidade de distinção entre carcinoma folicular, adenoma folicular,

carcinoma papilífero variante folicular e nódulo hiperplásico de tiróide.

10

Galectin-3 immunohistochemistry for follicular patterned thyroid lesions

Authors: Marcelo J Amadei1, Rosana Delcelo2, Ana PR Paiotti3, Ângela FL

Waitzberg2, Thais Heinke2, João RM Martins1, Reinaldo P Furlanetto1

1 Division of Endocrinology and Metabolism, Department of Medicine

2 Laboratory of Immunohistochemistry, Department of Pathology

3 Department of Pathology

Federal University of São Paulo

Address to correspondence: RUA BOTUCATU, 740 -2° ANDAR

VILA CLEMENTINO - CEP: 04023-900 - SÃO PAULO - BRASIL

TEL: 55 11 55719826/55764229 - FAX: 55 11 55748432

E-MAIL: [email protected]

11

ABSTRACT

Follicular thyroid lesions represent a challenge for both cytological and histological

diagnosis. The more frequent follicular neoplasms are hyperplastic nodules (HN),

follicular adenoma (FA), follicular carcinoma (FC) and follicular variant of papillary

carcinoma (FVPC). The accuracy of galectin-3 immunohistochemistry in

distinguishing benign from malignant thyroid follicular patterned lesions will be

presented. One hundred and thirty six cases selected from the Pathology

Department were reviewed according to the World Health Organization

classification for thyroid neoplasms, including 28 cases of FVPC, 20 FC, 46 FA,

and 42 HN. Immunohistochemical method was streptavidin-biotin-peroxidase

complex with monoclonal antibody to galectin-3. Galectin-3 was negative for most

benign lesions (93.1%). Positivity for FC was 20%, and for FVPC it was 89%.

Overall capacity to distinguish benign from malignant follicular patterned lesions

was: sensitivity=0.60; specificity=0.93; negative predictive value=0.82; positive

predictive value=0.82; accuracy=0.81; odds ratio=21.71. In conclusion, galectin-3

is a good marker for follicular variant of papillary carcinoma and also has good

predictive values for follicular lesions. It could be a helpful marker in cytological

analysis and in borderline histological lesions thus minimizing unnecessary

surgery.

KEYWORDS: IMMUNOHISTOCHEMISTRY; GALECTIN-3; FOLLICULAR

NEOPLASM, THYROID

12

INTRODUCTION

Thyroid nodules (TN) are very common. Prevalence of palpable TN in

populational surveys are 3.2-4.2% (1,2). Using thyroid ultrasonography this

prevalence increases to 27% in women and 15% in men (3).

Initial fine needle aspiration biopsy (FNAB) is the most useful method to

evaluate TN. Its sensitivity and specificity is around 68-98% and 72-100%,

respectively (4).

However, an important technical limitation of FNAB is cytological distinction

between benign and malignant follicular lesions. Such distinction is only possible

during histological examination (5). The finding of thyroid capsular or vascular

invasion confirms diagnosis of carcinoma. Approximately 15% of FNAB are

suspicious or unable to be diagnostic. Of these, 20-25% are confirmed malignant

by histological examination (6). Because of potential risk of malignancy, all TN with

suspicious FNAB need surgical removal (7).

The more frequent histological diagnosis of suspicious FNAB are

hyperplastic nodule, follicular adenoma, Hashimoto’s thyroiditis, follicular variant of

papillary cancer, colloid goiter, follicular carcinoma, and oncocytic variant of

follicular carcinoma (8,9).

Recent advances in molecular studies involving immunohistochemistry,

reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and enzyme activity

assays allowed evaluation of TN with suspicious FNAB. The main goal is to identify

molecular markers able to distinguish between benign and malignant thyroid

follicular lesions (10,11).

13

There are over 50 molecular markers analysed in the current literature. New

markers are becoming more and more frequent. However, its clinical use is still

very uncommon (12). Among these molecular markers, galectin-3 (GAL-3) has

emerged with greatest potential.

GAL-3 belongs to a family of β-galactoside-binding animal lectins. Lectins

are proteins able to bind specific structures of carbohydrates and can recognize

particular glycoconjugates expressed in animals (13).

GAL-3 is normally present in various epithelial tissues like colon, breast,

liver, skin, brain, stomach, kidneys and also in inflammatory cells like monocytes,

macrophages, mast cells and fibroblasts. In several tumoral types, GAL-3

presented an altered expression as found in anaplastic lymphoma, breast cancer,

melanoma, colon carcinoma and thyroid cancer (14).

Several papers showed increased expression of GAL-3 in thyroid

carcinoma, especially in the papillary type. However, controversial results were

obtained when evaluation of lesions commonly diagnosed as suspicious in FNAB

were included.

In face of different results found with galectin-3 at several centers, the

objective of this study was: to evaluate, using immunohistochemistry, accuracy of

GAL-3 to distinguish between benign (hyperplastic nodule and follicular adenoma)

and malignant (follicular variant of papillary carcinoma and follicular carcinoma)

thyroid lesions.

14

MATERIAL AND METHODS

1) SURGICAL SPECIMENS

Paraffin-embeded thyroid samples obtained from Pathology Department

Archive from May 1997 to April 2003 were retrieved. Cases with initial diagnosis of

follicular adenoma (FA), follicular carcinoma (FC), follicular variant of papillary

carcinoma (FVPC) and hyperplastic nodule (HN) were selected. Samples were

taken from Hospitals associated to Federal University of São Paulo. The present

study had previous approval of Local Ethical Committee.

Paraffin blocks unavailable or without conditions for new cut sections were

excluded. Selected cases had initial diagnosis reviewed in hematoxilin-eosin

stained slides according to the World Health Organization classification for thyroid

neoplasms: 46 FA (17 follicular adenomas, 07 microfollicular adenomas, 01 fetal

adenoma, 01 hyalinizing trabecular tumor, 02 trabecular/solid adenomas and 18

oncocytic variant follicular adenomas); 20 FC (06 highly invasive, 06 insular

carcinomas, 04 minimally invasive and 04 oncocytic variant), 42 HN and 28 FVPC,

totalizing 136 cases (15).

2) IMMUNOHISTOCHEMICAL METHOD

Surgical samples of thyroidectomy formalin-fixed and paraffin-embeded

were cut into 3µm sections in slides previously treated with 3-

aminopropyltrietoxisilane, deparaffinized with xylene and rehydrated in ethanol.

Heat-induced antigen retrieval was performed in microwave in a citrate buffer (pH

6.0) for 30 minutes. Endogenous peroxidase activity was inhibited by immersing

the sections in 3% hydrogen peroxidase for 20 minutes at room temperature. After

washes with phosphate-buffered saline (PBS), slides were incubated with

15

monoclonal antibody against galectin-3 (9C4 clone, IgG1 subclass, Novocastra

Laboratories Ltd, New Castle, UK), with a 1:150 dilution for 18 hours at 4oC. Once

again washed with PBS, sections were then incubated with the biotinylated

secondary antibody for 15 minutes at room temperature, followed by reaction with

streptavidin-biotin based immunoperoxidase detection system (LSAB+ System,

DAKO Corp, Carpinteria, CA, USA) for another 15 minutes. Finally, to visualize the

reaction we used a 3,3’-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) and a 1%

hydrogen peroxidase solution. Slides were dehydrated with increasing alcohol

concentrations and counterstained with Harris hematoxilin.

Positive control of GAL-3 was classic variant of papillary carcinoma and

internal negative control was normal thyroid.

3) IMMUNOHISTOCHEMICAL EVALUATION

Two independent pathologists without access to initial and reviewed

diagnoses evaluated sections in optical microscopy. Semiquantitative criteria were:

• Negative (benign lesion) – no reactivity or a few neoplastic cells with

nuclear reactivity or <10% tumoral cells with cytoplasmatic positivity

• Positive (malignant lesion) – ≥ 10% neoplastic cells with reactivity in

cytoplasma or both in cytoplasma and nucleus.

Cases with discordant results were reviewed by both pathologists for final

decision.

4) STATISTICAL ANALYSIS

Histomorphological diagnosis was the gold standard. Sensitivity, specificity,

negative and positive predictive values, accuracy and odds ratio were assessed.

Sensitivity was defined on the basis of thyroid cancer detection using GAL-3

16

immunohistochemistry [true positive/(true positive + false negative)]. Specificity

was defined on the basis of benign thyroid neoplasms detection [true negative/(true

negative + false positive)]. Positive and negative predictive values were

respectively computed as [true positive/(true positive + false positive)] and [true

negative/(true negative + false negative)]. Diagnostic accuracy represents a

combination of sensitivity and specificity [(true positive + true negative)/(true

positive + false positive + true negative + false negative)]. Odds ratio was

calculated by the ratio of (true positive/false negative)/ (false positive/true negative)

(16).

17

RESULTS

Tables 1 and 2 show features of cases of follicular carcinoma and FVPC.

GAL-3 expression in neoplastic cells occurred mostly in cytoplasma (Figure

1). Nuclear reactivity was seen both in a few tumoral cells as in fibroblasts,

endothelium and histiocytes. In these non-tumoral cells, expression was present in

areas of thyroiditis (Figure 2).

In benign lesions, GAL-3 was negative in 93.1% (Figure 3). For FVPC, it

was positive in 89% of cases. However, positivity of FC was low (20%). Results of

reactivity for each histological type are presented in Table 3.

Of three positive cases of HN, two had controversial results between

pathologists, showing weak and focal expression, but fulfilling criteria of positivity.

In three positive cases of FA there was no controversy.

There were three negative cases of FVPC and controversy occurred in two

of these. Four cases of FC were positive: 02 poorly differentiated lesions, one

minimally invasive and one oncocytic variant. It was not possible to establish

association between histological subtype of FC and GAL-3 expression.

The presence of thyroiditis did not influence any result. It was present in

nine cases of FVPC (two negative cases for GAL-3) and other nine cases of FA.

Overall capacity to distinguish benign (FA and HN) from malignant (FC and

FVPC) lesions was: sensitivity 60%, specificity 93%, negative predictive value

82%, positive predictive value 82%, accuracy 81% and odds ratio 21.71.

Excluding cases of FC, sensitivity, specificity, positive and negative

predictive value and accuracy would be, respectively: 89%, 93%, 80%, 96% and

91%. Odds ratio would be 119.

18

DISCUSSION

Recent evidence confirms crucial importance of cancer cell interaction to

carbohydrate during tumoral progression. Lectins are carbohydrate-binding

proteins, excluding enzymes and antibodies (17).

Increased GAL-3 expression in cancer cells was initially found in breast

tumours. Thereafter, colon cancer, gastric tumours, liver cancer, hematological and

central nervous system malignancies were found to present altered GAL-3

expression (17). Specifically in thyroid cancer, since initial study of Xu et al, a

growing interest in the use of this lectin as a marker to distinguish follicular thyroid

lesions has emerged (18).

GAL-3 is implicated in many different biological functions of tumoral cells: (1)

cell-to-cell interaction; (2) adhesion, migration and invasion; (3) tumor growth and

metastasis; (4) proliferation and cell cycle regulation; (5) apoptosis and (6)

angiogenesis (19). In thyroid tumours, Yoshii et al analysed effects of anti-sense

GAL-3 complementary DNA transfection in papillary carcinoma cell lines in vitro.

Authors concluded that overexpression of GAL-3 is important for the maintenance

of transformed phenotype, probably due to the anti-apoptotic activity of the lectin

(20).

Another issue to be considered for GAL-3 is its localization in tumoral cell.

Normal thyroid cells do not express GAL-3 by immunohistochemistry (21). After

synthesis in cytoplasma GAL-3 usually reside in this compartment. However, it can

be secreted or translocated to the nucleus. In malignant neoplasms of thyroid,

GAL-3 expression is much more important in cytoplasma than in nucleus. For

colon cancer, an association between GAL-3 localization in tumoral cell and status

19

of cell differentiation was found. In thyroid malignancies, however, there is no

correlation of histological aggressiveness or dedifferentiation status with GAL-3

localization (22).

Capacity to distinguish follicular benign and malignant thyroid lesions using

GAL-3 immunohistochemistry is very controversial (Table 4). Therefore, diverging

results among different studies demand an analysis of some methodological

aspects: (1) utilization of distinct criteria for positivity in immunohistochemistry; (2)

use of different histological definitions for follicular lesions; (3) different origin of

monoclonal antibodies against GAL-3; (4) use of immunohistochemical detection

systems biotin-based or biotin-free.

Only one study compared monoclonal antibodies from different sources.

Authors evaluated follicular carcinoma cases and there was no interference in the

lectin expression (35). It is necessary to emphasize that this was not the objective

of the study. It was done with the purpose of make a comparison with other papers

which used different monoclonal antibodies.

Another relevant methodological issue is the detection system used for most

authors, including the present one. All of these detection methods are biotin based.

Oxyphilic cells in thyroid gland are rich in endogenous biotin. GAL-3

immunohistochemistry can present false-positive results in oxiphilic cells when

biotin based detection methods are used, especially when heat-induced antigen-

retrieval is necessary (39). Centers that regularly obtain best results with GAL-3

immunohistochemistry to distinguish follicular lesions use biotin-free detection

systems (40).

20

A few positive cases of GAL-3 immunohistochemistry in follicular adenomas

are present in all papers published. This find gave rise to a hypothesis that these

cases could represent, in fact, malignant lesions but evidence of vascular or

capsular invasion was still not identified (40). Despite that molecular mechanisms

of tumorigenesis are not completely understood, findings that benign lesions

express foci of clonal expansion suggest an evolutional process of goiters and

adenomas to carcinoma (41). Thus, positive cases of adenoma could indeed

represent malignant lesions in a stage where histological invasion is not found by

optical microscopy.

There is also a supposition that expression in adenomatous cells could be

influenced by cytokine secretion from lymphocytes in areas of thyroiditis (40).

However, none of three positive cases of follicular adenoma presented foci of

thyroiditis. We had 15 cases associated with areas of lymphocytic thyroiditis

among our 48 selected cases of carcinoma. There was no interference of presence

of thyroiditis in GAL-3 immunohistochemistry evaluation.

Martins et al, using a quantitative RT-PCR method, found GAL-3 expression

in 80% of multinodular goiter samples and in 60% of follicular adenomas (29).

Other reports, have also described GAL-3 expression in benign lesions and even in

normal thyroid tissue (42,43). It is known that GAL-3 is normally present in

endothelial cells and it can be increased in histiocytes and other inflammatory cells.

So, it is possible that a contamination of tissue sample could occur with non-

tumoral cells that express GAL-3 and a positive result would be obtained by RT-

PCR. By immunohistochemistry, we can identify tumoral cells and to consider, or

not, expression in different areas. Our cases presented GAL-3 reactivity in non-

21

tumoral cells only in thyroiditis areas (Figure 2) or histiocytes in an isolated pattern.

A recent study, by Feilchenfeldt et al, compared GAL-3 expression by the

quantitative RT-PCR and immunohistochemistry methods. They found a significant

increase in galectin-3 (at protein level and, to a lesser extent, at mRNA level) in

papillary carcinomas (44).

Follicular variant of papillary carcinoma is the second most common variant

after classic papillary carcinoma. Over 15% of these tumours can present capsular

or vascular invasion (45). However, diagnosis of this variant is not easy to perform.

There is a great variability of different diagnoses of this histological type even when

experienced endocrine pathologists analyse the samples (46). Features of this

tumour that make its diagnosis difficult are: (1) multifocal, rather than diffuse,

distribution of nuclear characteristics of papillary carcinoma and (2) the most

common occurrence of this tumour is the encapsulated form; a solitary lesion that

shows no invasive feature (45). Our results confirm that galectin-3

immunohistochemistry is a very good method to identify this variant of papillary

carcinoma. It could be used as a complement to histological evaluation of

suspicious thyroid nodules.

Considering only oncocytic variant of follicular adenoma and carcinoma,

Nascimento et al found increased expression of GAL-3 in carcinomas (59 x 7.1%)

(26). Volante et al, evaluating a large series of oncocytic cell tumours of the

thyroid, found a sensitivity for GAL-3 of 95.1% and specificity of 88% (47). In the

present study, we had one positive case among 14 oncocytic adenomas and

another among 04 oncocytic variant of follicular carcinomas.

22

A growing number of reports have been published evaluating GAL-3 utility in

FNAB. Bartolazzi et al, in a multicentric study, described values of sensitivity,

specificity and accuracy of 100%, 98% and 99%, respectively, in the capacity to

distinguish between benign and malignant thyroid lesions on fresh cytological

material from preoperative FNAB (25). However, in a recent report, Maruta et al

evaluated galectin-3 immunostaining of cytological material obtained from thyroid

follicular lesions on FNAB. Authors were unable to reproduce those results,

founding lower values of sensitivity (89%) and specificity (75%) to distinguish

between follicular adenoma and carcinoma (48).

Finally, recent studies have used panels of molecular markers, including

GAL-3, trying to improve accuracy. Some of these markers are thyroid peroxidase,

CITED-1, CK19, HBME-1, CD26, heparanase and many others (35, 37, 38, 49-51).

Association of different markers seems to be a promising area for evaluation of

suspicious thyroid lesions.

We concluded that galectin-3 is a good marker for follicular variant of

papillary carcinoma. It presents good positive and negative predictive values and

can be useful in histological evaluation of thyroid nodules with borderline features

of papillary carcinoma. It should not be used to distinguish follicular thyroid

adenoma and carcinoma.

23

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30

Table 1. Distribution by gender, age and TNM stage in the cases of follicular

variant of papillary carcinoma (FVPC)

Gender Age(y) TNM Gender Age(y) TNM

F+ 45 T1N0Mx F+ 41 T4aN1Mx

F 29 T1N0Mx M 36 T1N0M0

F 40 T3N0Mx F*+ 41 T1N0Mx

F 35 T1N0Mx F 33 T4aN1M0

M+ 40 T3N0M0 F+ 63 T3N0Mx

F+ 63 T3N0Mx F 16 T2NoMx

F 62 TxNxMx F*+ 58 T1N0Mx

F 62 T1NxMx F 52 T1N0Mx

F 67 T4aN0M1 F 69 T4aN0M1

F 34 T3N0Mx F 27 T1N0M0

F 12 T4aN1Mx F 74 T4bN0Mx

F* 57 T2N0M0 F NA T3N0Mx

F 24 T3N1M1 F NA T3N0Mx

F+ 57 T4aN0Mx F 55 T3N0M0

F+ 35 T1N0M0 F 27 T1N1M0

+ Cases with presence of areas of thyroiditis; *NEGATIVE cases for GAL-3; NA –

data not available

31

Table 2. Distribution by gender, age and TNM stage in the cases of follicular

carcinoma (FC)

Gender Age(y) TNM Gender Age(y) TNM

F 69 T4aN0M1 F 66 T2NoMx

F+ 17 T3N0M0 M* 75 T3N0M1

F+ 61 T2N0M0 F 47 T2N0M0

F+ 62 T2N0M0 F 75 T2N0Mx

F+ 39 T3N0M0 F+ 36 T2N0Mx

M 75 T2N0M0 F NA T3N0Mx

F* 60 T1N0M0 F+ 24 T2N0Mx

F 23 T1N0Mx F 69 T4bN0Mx

M 62 T4bN0Mx F* 86 T3N0Mx

M* 66 T2N0M0 F 39 T3N0M0

+ Cases with presence of areas of thyroiditis; + POSITIVE cases of GAL-3;

NA – data not available

32

Table 3. Positive results of GAL-3 according to histological subtype of benign and

malignant lesions of thyroid

Histological diagnosis Number of cases with ≥ 10% of

positive tumoral cells/Total cases

Benign

- Follicular adenoma 02/28

- Oncocytic variant adenoma 01/18

- Hyperplastic nodule 03/42

Malignant

- Follicular carcinoma 01/06

- Minimally invasive FC 01/04

- Poorly differentiated FC 01/06

- Oncocytic variant of FC 01/04

- Follicular variant of papillary CA 25/28

FC – follicular carcinoma; CA - carcinoma

33

Table 4. Previous studies with GAL-3 for follicular variant of papillary carcinoma

(FVPC), follicular carcinoma (FC), follicular adenoma (FA) and hyperplastic nodule

(HN) (positive results/total of samples evaluated)

First author, year FVPC FC FA HN Antibody origin

Xu, 1995 (18) - 7/7 0/10 - Boehringer-Mannheim

Fernandez, 1997 (23) 2/2 4/8 0/8 0/3 --

Gasbarri, 1999 (24) - 14/14 1/37 0/11 Boehringer-Mannheim

Bartolazi, 2001 (25) - 54/57 4/54 0/50 Novocastra

Nascimento, 2001 (26) - 11/14 1/9 - Research Diagnostics

Coli, 2002 (27) - 3/5 17/27 7/25 Ylem

Beesley,2002 (28) 3/4 12/12 2/18 - Novocastra

Martins, 2002 (29) - 18/20 14/31 - Affinity Bioreagents

Gaffney, 2003 (30) - 14/21 03/14 - Novocastra

Kovacs, 2003 (31) - 7/10 4/19 0/25 Novocastra

Jarubiak-Wielganowicz, 2003 (32) - 36/42 8/42 - Dako

Oeistreider-Kedem, 2004 (33) 15/18 7/11 2/19 - Affinity Bioreagents

Mehrotra, 2004 (34) - 14/19 18/19 - Novocastra

Weber, 2004 (35) - 4/9 4/13 - Research Diagnostics

De-Leon-Mazariegos, 2004 (36) - 5/21 4/44 - Novocastra

Prasad, 2005 (37) 13/13 04/06 2/21 - Novocastra

de Matos, 2005 (38) 13/25 8/38 2/18 1/12 Novocastra

34

FIGURE LEGENDS

Figure 1. Positive immunostaining for galectin-3 in a follicular variant of papillary

carcinoma showing cytoplasmatic expression, 10x optical microscopy.

Figure 2. Immunostaining for galectin-3 in a germinative center of thyroiditis area,

10x optical microscopy.

Figure 3. Negative immunostaining for galectin-3 in a follicular adenoma, 4x optical

microscopy

35

FIGURES

Figure 1

36

Figure 2.

37

Figure 3.

38

4. CONSIDERAÇÕES FINAIS

Evidências crescentes confirmam a importância crucial de interações

entre células cancerosas e resíduos de carboidratos durante a progressão

tumoral. As lectinas são definidas como proteínas ligadoras de carboidrato,

excluindo enzimas e anticorpos. As lectinas podem ser: (1) lectinas tipo C

(incluindo as selectinas); (2) lectinas tipo P; (3) pentraxinas e (4) galectinas (28).

A GAL-3 consiste de três domínios: (1) domínio N-terminal compreendendo

cerca de 20 aminoácidos; (2) domínio composto de 10 repetições de aminoácidos

com resíduo aromático conservado (domínio R), e (3) domínio de reconhecimento

de carboidrato na porção C-terminal composto de aproximadamente 140

aminoácidos. A expressão de GAL-3 ocorre em diferentes células e tecidos

normalmente, ou mesmo durante fases evolutivas. Assim, por exemplo, há

expressão em fibroblastos, macrófagos, basófilos, mastócitos, condrócitos e

osteoblastos, células endoteliais, além do cérebro, ovários, estômago, fígado,

cólon e pele (29).

A expressão aumentada de GAL-3 em células cancerígenas foi inicialmente

identificada em tumores de mama (32). Em seguida, foi descrita em

adenocarcinoma de cólon, tumores gástricos e carcinoma hepatocelular. Em

carcinoma de tiróide, desde o estudo de Xu et al, tem-se aprofundado no uso

desta lectina para distinção de lesões foliculares de tiróide (33).

A GAL-3 tem sido implicada em várias funções biológicas em células

tumorais: (1) interação célula-célula; (2) adesão, migração e invasão; (3)

crescimento tumoral e metástase; (4) proliferação e regulação de ciclo celular; (5)

apoptose; (6) angiogênese (29). Especificamente em tumores de tiróide, Yoshii et

39

al avaliaram os efeitos da transfecção de DNA complementar anti-sense de GAL-3

em carcinoma papilífero, que apresenta expressão elevada deste marcador.

Determinaram que a presença de GAL-3 era importante para manutenção do

fenótipo maligno transformado (34).

Na tentativa de associar o marcador com a agressividade tumoral, poucos

estudos correlacionaram a expressão de GAL-3 com a evolução dos pacientes.

Kawachi et al. encontraram expressão aumentada de GAL-3 nos tumores

primários com metástase, quando comparados com aqueles sem metástase.

Contudo, a expressão de GAL-3 nos linfonodos era menor que no tumor primário.

Sugerem que na continuidade da progressão tumoral, em estágios tardios, a

expressão diminuída de GAL-3 possa facilitar a liberação de células cancerosas

da lesão primária para invasão e metástase (35).

Outro aspecto também a ser considerado para GAL-3 é a sua localização

na célula tumoral. No tecido tiroidiano normal, a GAL-3 não é expressa (36).

Depois de sintetizada no citoplasma, freqüentemente permanece neste

compartimento, embora possa ser secretada ou translocada para o núcleo. Em

neoplasias malignas de tiróide, a expressão citoplasmática de GAL-3 ocorre de

maneira muito mais importante que a nuclear. Em adenocarcinoma de cólon foi

encontrada associação entre a localização de GAL-3 e o grau de diferenciação

celular. Contudo, nos tumores de tiróide, benignos ou malignos, há expressão

predominantemente citoplasmática, sem relação com agressividade

histopatológica ou estado de dediferenciação (37).

Quanto aos resultados tão divergentes entre os diferentes estudos para

distinção de lesões foliculares, alguns aspectos metodológicos merecem

40

consideração: (1) uso de diferentes critérios de positividade/malignidade entre os

estudos; (2) uso de critérios histológicos distintos para definição de lesões

foliculares; (3) obtenção de anticorpos monoclonais de diferentes fontes; (4)

utilização de sistemas de detecção imunohistoquímicos com e sem biotina.

Apenas um estudo comparou anticorpos monoclonais para GAL-3 de

diferentes empresas. Foram estudados casos de carcinoma folicular e não foi

encontrada diferença na expressão da lectina (38). Os autores descrevem apenas

a ocorrência de maior coloração de fundo com anticorpo da empresa Novocastra.

Vale ressaltar que este não era o objetivo do estudo e que foi feito na tentativa de

atenuar este efeito ao comparar seus resultados com os de outros centros.

Outro fator interferente pode ser o sistema de detecção utilizado pela

grande maioria dos autores, inclusive no presente estudo. São métodos de

detecção baseados em biotina. Na glândula tiróide, as células oxifílicas são ricas

em biotina endógena e a imunohistoquímica para GAL-3 pode promover

resultados falso-positivos em lesões celulares oxifílicas quando baseada em

métodos de detecção com biotina, especialmente quando é necessária a

recuperação antigênica induzida por calor (39,40). Os centros que obtêm os

melhores resultados com GAL-3 na diferenciação de lesões foliculares utilizam

sistemas de detecção sem biotina.

Martins et al, utilizando a técnica de RT-PCR quantitativa, mostraram

positividade de GAL-3 em 80% das amostras de bócio multinodular e em 60% das

amostras de adenoma folicular (41). Outros estudos também descreveram

expressão de GAL-3 em lesões foliculares benignas, em tiróide normal e doença

de Graves (42,43,44). Sabe-se que há expressão de GAL-3 no endotélio, e que

41

pode estar aumentada em histiócitos e outras células inflamatórias. Assim, é

possível que ocorra uma contaminação da amostra tecidual com células não

tumorais que expressam GAL-3 e, através da RT-PCR, seriam selecionados como

casos positivos para GAL-3. Na imuno-histoquímica, é possível identificar as

células tumorais e considerar, ou não, a expressão de áreas distintas. Nos casos

avaliados, houve expressão de GAL-3 em células não-tumorais apenas em áreas

de tiroidite ou em histiócitos, de maneira isolada. Estudo recente comparou a

expressão de GAL-3 através das técnicas de RT-PCR e imuno-histoquímica. Os

autores descrevem que a expressão em nível protéico foi pouco maior do que a

molecular, através da quantificação de mRNA, nos casos de carcinoma papilífero

(45).

Outro aspecto de interesse quanto à positividade para GAL-3 em alguns

casos de adenoma folicular é a especulação que possam representar lesões

malignas, mas ainda sem identificação de invasão capsular ou vascular. Embora

os mecanismos moleculares da tumorigênese não estejam completamente

elucidados, a observação de que lesões benignas como bócio multinodular

apresentam focos de expansão clonal, sugerem um estágio nas várias etapas da

possível evolução de bócios e adenomas para carcinoma (46). Assim, os

adenomas positivos para GAL-3 poderiam se tratar de lesões malignas em uma

etapa sem invasão histologicamente identificável.

Há, ainda, a hipótese de que a marcação nas células adenomatosas seja

influenciada por secreção de citocinas por linfócitos em áreas de tiroidite (47).

Contudo, em nenhum dos nossos três casos positivos de AF havia presença de

42

tiroidite. Não houve interferência da presença de tiroidite nas avaliações de

expressão de GAL-3, tanto nos casos benignos quanto nos malignos.

O diagnóstico da variante folicular do carcinoma papilífero não é fácil, como

demonstrada pela grande variabilidade entre observadores, mesmo entre

patologistas endócrinos experientes (48). As características deste tumor que mais

dificultam seu diagnóstico são: (1) um padrão de distribuição multifocal ao invés de

difuso das características nucleares de carcinoma papilífero, e (2) a forma mais

comumente encontrada é a encapsulada que é uma lesão solitária com ausência

de qualquer característica invasiva (22). A GAL-3 mostrou ser um ótimo marcador

para esta variante de carcinoma papilífero, podendo ser utilizada na

caracterização de nódulos suspeitos à histologia.

Considerando apenas a variante oxifílica de adenoma e carcinoma folicular,

Nascimento et al mostraram expressão maior de GAL-3 em carcinomas (59 x

7,1%) (49). Volante et al relatam em uma grande série de lesões oxifilicas valores

de sensibilidade de 94% e especificidade de 87% (50). Contudo, no presente

estudo, encontramos apenas um caso positivo entre 14 adenomas oxifílicos e

outro, dos 04 carcinomas foliculares variante oxifílica.

Alguns estudos têm sido publicados utilizando GAL-3 associada à PAAF,

por imuno-citoquímica, em nódulos de tiróide. Em estudo multicêntrico e

prospectivo, Bartolazzi et al descrevem valores de sensibilidade, especificidade e

acurácia de 100%, 98% e 99%, respectivamente, na distinção de lesões benignas

e malignas da tiróide de material citológico de PAAF (51). Porém, estudo recente,

não conseguiu reproduzir tais resultados, alcançando valores de sensibilidade de

89%, especificidade de 75% , VPP, 74% e VPN, 89%, avaliando PAAF de lesões

43

foliculares com diagnósticos histopatológicos de adenoma e carcinoma folicular

(52).

Finalmente, estudos mais recentes têm utilizado painéis de marcadores,

incluindo GAL-3, para tentar melhorar a sensibilidade e especificidade. Incluem-se

os marcadores CITED-1, CK19, HBME-1, CD26, heparanase, entre outros (53-58).

A associação de diferentes marcadores parece ser a área mais promissora para

avaliação de lesões suspeitas.

Concluímos que a galectina-3 é um bom marcador para CPFV e apresenta

elevados valores preditivos negativo e positivo. Pode ser útil, assim, na avaliação

de nódulos de tiróide que apresentem características citohistológicas típicas de

carcinoma papilífero, mas de maneira dispersa ou escassa. Não deve ser utilizada

para distinção de adenoma e carcinoma folicular da tiróide.

44

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