Disciplina Proteômica

07/05/2015

Visão Geral

• Proteômica– Método novo de identificação e quantificação absoluta

“global” de proteínas– Validação do método

• Comparação com AQUA

• Variação da composição proteica em relação às condições ambientais

• Avaliação do custo proteico e de processos biológicos• Visão global do metabolismo • Heterogeneidade em Operons (mecanismos pós-

traducionais?)

Introdução

• A disponibilidade de dados de quantificação absoluta de proteínas são de grande importância na compreensão da biologia de sistemas por dois grandes motivos:

1. Participação nos sistemas biológicos

2. As concentrações proteicas determinam a taxa de adaptação de processos celulares

Introdução

• “Padrão Ouro” para quantificação absoluta:– Western Blot

• No entanto, para se obter o maior número possível de proteínas de uma maneira absoluta...

Espectrometria de massas

Introdução

• Metodologia de quantificação absoluta (AQUA)– Nessa metodologia são utilizados peptídeos sintéticos

marcados.

– Determinada pela adição (concentração conhecida) de peptídeos sintéticos marcados na amostra que permitem calcular a quantidade de peptídeos não marcados (endógenos) com base no espectro dos respectivos peptídeos marcados

Metodologia AQUA

Metodologia AQUA

• Limitações– A disponibilidade e os custos ($$$) para

encomendar os peptídeos sintéticos é um fator limitante.

– Inviável para abordagens de quantificação e identificação globais/larga escala

Contexto

• Necessidade de desenvolvimento de novas abordagens de quantificação absoluta que permitam expandir a quantificação (“escala global”) e que sejam label free (menor custo)

Objetivo Proteômico

• Quantificar de modo absoluto o maior número possível de proteínas expressas no citoplamas de Bacillus subtilis com o método LC/MSᴱ

Objetivo Científico

• Validar um novo método independente de dados LC/MSᴱ, na quantificação de proteínas de B. subtilis em diferentes condições de cultivo.

Métodos de identificação de peptídeos

• Dependente de Aquisição de Dados (DDA)– Seleção dos íons que serão fragmentados a partir

dos peptídeos mais intensos

• Independente de Aquisição de Dados (DIA)– Não há seleção dos peptídeos. O critério de

fragmentação não é com base na intensidade dos peptídeos, mas sim numa faixa de massa onde tudo que estiver dentro da faixa estipulada será fragmentado e identificado

AQUA

Método DDA (AQUA)

Método DIA (LC/MSᴱ)

Métodos de identificação de peptídeos

• Alternativo ao AQUA:– MSᴱ-Hi3• Estratégia Hi3: Após a identificação dos peptídeos

utilizando o método DIA, é feita a comparação das intensidades médias de sinal dos três peptídeos mais intensos de uma proteína com uma proteína padrão digerido internamente

DIA

MSᴱ-Hi3 AQUA

Fonte da amostra

• Bacillus subtilis cepa BSB 168 T +

•10 g/L Caseinhydrolysate •3,9 g/L Acido L-glutâmico•1,3 g /L de L-alanina•1,5 g/L de L-asparagina •1,4 g/L de KH2PO4•1,4 g/L de NH4Cl•0,1 g/L Na2SO4,•0,1 g/L de NH4NO3•0,1 g/ L de MgSO4•0,02 g/L CaCl2•0.075 g/L de MnSO4,•FeCl3 0,001 g/L

•2 g/L de (NH4) 2SO4•1,4 g/L de K2HPO4•0,6 g/L de KH2PO4,•0,1 g/L Na3citrate•0,2 g/L de MgSO4•0,001 g/L de MnSO4•5 g/L de glucose•0,001 g/L de FeCl 3

Condição S Condição CH

MetodologiaCultura de B.

subtilis

Meio CHMeio S

Coluna de C18

Tripsina

Cultura de B. subtilis

Meio CHMeio S

Coluna de C18

Tripsina

Peptideos marcados

Metodologia

LC/SRM

Hi3

AQUA

LC/MSᴱ

6 proteínas

4 proteínas

4000 QTRAP

TSQ VANTAGE

Synapt G2

DDA

DIA

Metodologia

• Tempo total da corrida– 4000 QTRAP: 1620 min -> 27 hrs– TSQ VANTAGE: 1440 min -> 24 hrs– Synapt G2: 4770 min -> 79,5 hrs

• Tempo parcial de uso da máquina– Synapt G2: 5058 min -> 84,3 hrs

• Método de ánalise – 4000 QTRAP:MultiQuant 1.2– TSQ VANTAGE: Pinpoint 1.0– Synapt G2: MassLynx V4.1

Resultados

• 3 replicatas técnicas para cada 3 replicatas biológicas• Proteínas identificadas em pelo menos 3 replicatas• FDR: 0,8 para condição S 0,4 para condição CH• Identificação de 1079 proteínas

23% 67% 10%

Condição S Condição CH•88% Citoplasma•8% Membrana•4% Extracelular

• A quantificação do número de moléculas por célula chegou a 4 ordens de magnitude;– Proteínas com 18 m/c até 150.000 m/c

• Abordagem Hi3 para quantificação• Comparação das intensidades de sinal de três

péptidos trípticos mais intensos com uma proteína padrão interno (ADH1)

• Comparação com Western Blot

• Comparação com AQUA

• Quantificação absoluta mais confiável• CV abaixo de 10%• Adição de peptídeos marcados dificulta quantificação em larga

escala• Etapa de pré-fracionamento• Teste Wilcoxon-Rank-Sum

Limitação do método

• 259 genes essenciais -> número de cópias elevado

• 192 quantificados absolutamente• Proteínas essenciais não quantificadas podem

ser divididos em dois subgrupos.– Proteínas de baixo peso molecular– Proteínas de membrana

• Menor probabilidade de gerar peptídeos por digestão tríptica, que se encaixam na janela analítica do espectrômetro de massa

Impactos fisiológicos

• Condição S– Glicose como fonte de carbono– Condição glicolítica– Síntese de aminoácidos

• Condição CH– Aminoácidos como fonte de carbono– Condição Gliconeogênica– Degradação de aminoácidos– Volume celular 1,94X maior do que em S

• Condição S– 35 proteínas com

abundancia maior do que 10.000 m/c

– Metabolismo do carbono

– Síntese de aminoácidos– Maquinaria de tradução– Chaperonas

• Condição CH– 51 proteínas com

abundancia maior do que 10.000 m/c

– Degradação de aminoácidos

– Gliconeogênese

127 proteínas expressas diferencialmente

Regulação pós

traducional

Cobertura das vias metabólicas

• Fator de transcrição AHRC– Reprime a

expressão de genes que codificam para a síntese de arginina

– Induz a degradação de arginina.

• Promotor ativado por ROCR – expressão de proteinas da via da degração da arginina

Síntese diminui 50xDegradação aumenta

20x

• A quantificação absoluta permitiu analisar os níveis proteicos heterogêneos de proteínas cujos genes são codificados por um mesmo operon.

• Análise da quantidade de proteínas relacionadas a operons conhecidos e que sabidamente estão envolvidos no metabolismo e em vias de sínteses de cofatores.

• Operons com no mínimo 3 proteínas identificadas

“Operon Heterogeneity”

Condição S Nº m/c

Condição CH

• Como explicar que proteínas cujos genes estão num mesmo operon pode apresentar níveis de expressão (número de moléculas por célula) tão diferentes?

Mas...

Regulação Pós-Transcricional

Cálculo de Custo de Proteína

• As células têm de investir um conjunto disponível de recursos limitados em processos biológicos

• O custo de proteína em um processo biológico é definido como a massa total de proteínas investida no processo

• O custo individual de uma proteína corresponde à quantidade de proteína multiplicado pela respectiva massa individual, em Daltons.

• Visão global sobre a distribuição de massa nas principais funções biológicas.

Conclusões

• Identificação de 1079 proteínas • ~40% de cobertura de sequência (utilizando os 3 peptídeos) • ~40% de cobertura do proteoma citosólico predito

• Comparando MSᴱ-Hi3 X AQUA – Reprodutibilidade: MSᴱ-Hi3 < AQUA– Coeficiente de variação: MSᴱ-Hi3 > AQUA– Capacidade de identificação e quantificação: MSᴱ-Hi3 > AQUA

Conclusões

• O método aplicado MSᴱ-Hi3 para a quantificação absoluta de proteínas contribuiu para a análise de biologia de sistemas por:– Aprimorar o conhecimento de modelos dinâmicos com

base na concentração de proteínas– Permite a detecção de novos mecanismos de regulação

(Pós-Transcricionais)– Capaz de inferir o custo real de proteínas em diferentes

processos (inclusive de vias metabólicas)– Tornar possível avaliar a distribuição dos recursos

celulares

Conclusão

• O artigo traz um novo método (MSᴱ-Hi3)– DIA– Validado• MSᴱ-Hi3 > AQUA

• Pode ser aplicado para abordagens de investigações globais e de biologia de sistemas.

Figuras • http://

www.sigmaaldrich.com/life-science/proteomics/mass-spectrometry/protein-aqua/protein-aqua-strategy.html

• http://www.the-scientist.com/?articles.view/articleNo/40051/title/Moving-Target/

• http://www.nature.com/nmeth/journal/v10/n1/abs/nmeth.2309.html