proteÔmica comparativa de linhagens celulares … · análise proteômica de linhagens celulares...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
LABORATÓRIO DE BIOLOGIA MOLECULAR E GENÔMICA
PPRROOTTEEÔÔMMIICCAA CCOOMMPPAARRAATTIIVVAA DDEE LLIINNHHAAGGEENNSS CCEELLUULLAARREESS
HHUUMMAANNAASS EEXXPPOOSSTTAASS AA EESSTTRREESSSSEE OOXXIIDDAATTIIVVOO IINNDDUUZZIIDDOO PPOORR
RRIIBBOOFFLLAAVVIINNAA FFOOTTOOSSSSEENNSSIIBBIILLIIZZAADDAA
Ana Rafaela de Souza Timoteo
Natal/RN
Setembro/2011
Ana Rafaela de Souza Timoteo
PPRROOTTEEÔÔMMIICCAA CCOOMMPPAARRAATTIIVVAA DDEE LLIINNHHAAGGEENNSS CCEELLUULLAARREESS
HHUUMMAANNAASS EEXXPPOOSSTTAASS AA EESSTTRREESSSSEE OOXXIIDDAATTIIVVOO IINNDDUUZZIIDDOO PPOORR
RRIIBBOOFFLLAAVVIINNAA FFOOTTOOSSSSEENNSSIIBBIILLIIZZAADDAA
Dissertação entregue a Coordenação do Programa
de Pós-Graduação em Ciências Biológicas da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte,
como Requisito Parcial à obtenção do título de
Mestre em Ciências Biológicas
Orientadora: Adriana Ferreira Uchôa
Co-orientadora: Lucymara Fassarella Agnez-Lima
Natal/RN
Setembro/2011
2
AGRADECIMENTOS
- A Deus, primeiramente, que ilumina, diariamente, meus passos e meu caminho,
permitindo-me concretizar os meus sonhos e que, com certeza, continuará sempre
me guiando nas etapas que hão de vir.
- Aos meus pais, exemplos de dedicação, doação, honestidade, disciplina, entre
tantas outras coisas, e, principalmente, de amor, e por tudo o que sou e que tenho
hoje. Vocês são meu exemplo maior, que espero, um dia, alcançar.
- Aos meus irmãos, Aninha e Tuno, que são essenciais para minha vida, por todo o
amor, cumplicidade e compreensão compartilhados entre nós;
- Às minhas grandes amigas, Amanda (Mandinha) e Angélica (a Gêka), por tudo que
a gente viveu (e viverá) em todos estes anos de amizade. Pessoas que pretendo ter
pra sempre ao meu lado;
- Às minhas orientadoras, profª. Lucymara Fassarella e profª. Adriana Uchôa, pela
paciência e compreensão, e, principalmente, por todos os ensinamentos
compartilhados;
- A Tirzah e profª Daniella, componentes da banca de qualificação, pelas críticas e
sugestões;
- A Anilina, Iza, Julliane, não só companheiras de base de pesquisa, mas também
amigas, que compartilham e vivenciam comigo, o “Estresse oxidativo”, por toda a
ajuda e apoio dispensados, não só na “bancada”.
- A Ralfo, Del, Fabão, Jana, Rita, Fabí, Danizinha, pela amizade e carinho, vocês
são pessoas fundamentais para mim e para o bom astral do laboratório;
3
- Aos demais membros do LBMG/LAMA, pelos momentos de cooperação e
confraternização, que me fazem ter orgulho de pertencer a esta grande família.
- Ao CNPq, pelo apoio financeiro dado ao projeto.
4
RESUMO
Espécies reativas de oxigênio (EROs) são geradas, continuamente, podendoser provenientes do metabolismo celular ou induzidas por fatores exógenos, alémdisso, apresentam a capacidade de danificar moléculas, como DNA e proteínas.BER é considerada a principal via de reparo de danos oxidativos ao DNA,entretanto, diversos estudos tem demonstrado a importância da participação deproteínas de outras vias na correção destas lesões. A deficiência de algumasenzimas da via NER, como CSB e XPC, que atuam na etapa de reconhecimento dalesão nas duas subvias deste sistema, influencia na eficácia do reparo de danosoxidativos. Entretanto, os mecanismos através dos quais, células deficientes nestasenzimas respondem ao estresse oxidativo e suas conseqüências ainda necessitamser mais bem esclarecidos. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi realizar umaanálise proteômica de linhagens celulares proficiente e deficiente em NER, expostasao estresse oxidativo, de modo a identificar proteínas envolvidas, diretamente ounão, na resposta ao estresse oxidativo e reparo de DNA. Para isto, três linhagens defibroblastos humanos, MRC5-SV, CS1AN (deficiente em CSB) e XP4PA (deficienteem XPC), foram tratadas com riboflavina fotosenssibilizada e, em seguida, foirealizada a identificação das proteínas diferencialmente expressas através doseqüenciamento de peptídeos por espectrometria de massas. A partir dosresultados, observou-se que a linhagem MRC5-SV apresenta aumento deexpressão na maioria das proteínas envolvidas com a defesa celular, sendo umaresposta esperada para uma linhagem celular normal submetida a estresse. Alinhagem CS1AN demonstrou uma resposta desarticulada, não sendo possívelestabelecer muitas interações entre as proteínas identificadas, podendo ser umaexplicação para sua sensibilidade a tratamentos com riboflavina e outros agentesoxidantes e aumento da morte celular provavelmente por indução das vias pró-apoptóticas. Já linhagem XP4PA apresentou maior expressão de proteínasbloqueadoras da apoptose, assim como, houve a inibição ou redução da expressãode outras envolvidas com a ativação deste processo, sugerindo a ativação de umcircuito anti-apoptótico nesta linhagem, o que pode ajudar a explicar a altasusceptibilidade de indivíduos XPC a desenvolvimento de cânceres. Estesresultados também contribuirão para o esclarecimento dos mecanismos de atuaçãode NER em danos oxidativos e para a compreensão de vias importantes nacorrelação do estresse oxidativo, reparo e formação de tumores malígnos.
Palavras-chave: XPC, CSB, NER, apoptose.
IV
5
ABSTRACT
Reactive oxygen species (ROS) are continuously generated and can bederived from cellular metabolism or induced by exogenous factors, in addition, havethe capacity to damage molecules like DNA and proteins. BER is considered themain route of DNA damage oxidative repair, however, several studies havedemonstrated the importance of the proteins participation of other ways to correctthese injuries. NER enzymes deficiency, such as CSB and XPC, acting in thedamage recognition step in the two subways this system influences the effectivenessof oxidative damage repair. However, the mechanisms by which cells deficient inthese enzymes respond to oxidative stress and its consequences still need to bebetter understood. Thus, the aim of this study was to perform a proteomic analysis ofcell lines proficient and deficient in NER, exposed to oxidative stress, in order toidentify proteins involved, directly or not, in response to oxidative stress and DNArepair. For this, three strains of human fibroblasts, MRC5-SV, CS1AN (CSB-deficient) and XP4PA (XPC-deficient) were treated with photosensitized riboflavinand then carried out the differentially expressed proteins identification by massspectrometry. From the results, it was observed in MRC5-SV increase expression inmost of the proteins involved in cellular defense, an expected response to a normalcell line subjected to stress. CS1AN showed a response disjointed, it is not possibleto establish many interactions between the proteins identified, may be oneexplanation for their sensitivity to treatment with riboflavin and other oxidants andincreased cell death probably by induction of pro-apoptotic pathways. AlreadyXP4PA showed higher expression of apoptosis-blocking proteins, as there wasinhibition or reduced expression of others involved with the activation of this process,suggesting the activation of an anti-apoptotic mechanism in this lineage, which mayhelp explain the high susceptibility to develop cancers in XPC individuals. Theseresults also contribute to elucidate action mechanisms of NER in oxidative damageand the understanding of important routes in the oxidative stress correlation, repairand malignant tumors formation.
Keywords: XPC,CSB, NER, apoptosis.
V
6
ÍNDICE
RESUMO...........................................................................................................
ABSTRACT.......................................................................................................
LISTA DE ILUSTRAÇÕES................................................................................
LISTA DE TABELAS.........................................................................................
IV
V
VIII
X
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS............................................................ XI
1. INTRODUÇÃO.............................................................................................. 13
1.1. EROs e Estresse oxidativo................................................................ 13
1.2. Danos oxidativos e reparo de DNA................................................... 15
1.2.1. BER: Reparo por Excisão de Bases......................................... 17
1.2.2. NER: Reparo por Excisão de Nucleotídeos............................. 19
1.3 – Fotossensibilizador: Riboflavina...................................................... 24
2. JUSTIFICATIVA............................................................................................ 27
3. OBJETIVOS.................................................................................................. 29
3.1. Objetivo geral ................................................................................... 29
3.2. Objetivos específicos ........................................................................ 29
4. MATERIAIS E MÉTODOS .......................................................................... 30
4.1. Linhagens celulares humanas........................................................... 30
4.2. Tratamento com riboflavina............................................................... 30
4.3. Extração, quantificação e precipitação das proteínas totais............. 31
4.4. Análise da expressão diferencial de proteínas.................................. 31
4.4.1. SDS-PAGE...............................................................................
4.4.2. Eletroforese bidimensional.......................................................
4.4.3. Visualização dos géis...............................................................
4.4.4. Análise dos géis.......................................................................
31
32
33
33
4.5. Identificação de proteínas diferencialmente expressas..................... 34
4.5.1. Extração e digestão das proteínas dos géis bidimensionais.... 34
4.5.2. Digestão dos peptídeos extraídos............................................
4.5.3. Sequenciamento dos peptídeos por análise espectrométrica..
34
35
VI
7
4.6. Redes de interações.......................................................................... 35
5. RESULTADOS ............................................................................................. 36
5.1. Análise da expressão diferencial de proteínas .................................
5.2. Proteínas identificadas por espectrometria de massas.....................
5.3. Interatomas........................................................................................
36
40
46
6. DISCUSSÃO .............................................................................................. 51
7. CONCLUSÃO ............................................................................................. 61
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................. 62
VII
8
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1: Formação das lesões 8oxoG e FapyG, a partir da oxidação da guanina
C8-OH.
Figura 2: Representação esquemática das seis principais vias de reparo de DNA e
alguns dos seus principais substratos correspondentes
Figura 3: Reparo por excisão de bases (BER). Destacando-se a principais enzimas
envolvidas nas diferentes etapas do reparo, e as diferentes proteínas envolvidas nas
duas subvias: single nucleotide (SN-BER) ou short-patch (SP-BER) e long-patch
(LP-BER).
Figura 4: Reparo por excisão de nucleotídeos em mamíferos.
Figura 5: Molécula da Riboflavina, destacando-se a cadeia Ribitil e os anéis de
Isoaloxazina.
Figura 6: Produção de espécies reativas de oxigênio a partir de
fotossensibilizadores, através da fotoativação ou mecanismo enzimático.
Figura 7: Géis bidimensionais das proteínas solúveis totais extraídas da linhagem
MRC5 submetidas a tratamento com ribofavina fotossensibilizada.
Figura 8: Géis bidimensionais das proteínas solúveis totais extraídas da linhagem
CS1AN submetidas a tratamento com ribofavina fotossensibilizada.
Figura 9: Géis bidimensionais das proteínas solúveis totais extraídas da linhagem
XP4PA submetidas a tratamento com ribofavina fotossensibilizada.
Figura 10: Diagramas contendo o número de proteínas identificadas em cada
linhagem tratada e de acordo com as condições de tratamento.
VIII
9
Figura 11: Proteínas envolvidas com a regulação da apoptose nas três linhagens
tratadas com riboflavina.
Figura 12: Interatomas gerados pelo programa STITCH 2.0 com as proteínas
identificadas por espectrometria de massas nas três linhagens submetidas ao
tratamento sem fotossensibilização da riboflavina.
Figura 13: Interatomas gerados pelo programa STITCH 2.0 com as proteínas
identificadas por espectrometria de massas nas três linhagens submetidas ao
tratamento com fotossensibilização da riboflavina.
Figura 14: Modelo esquemático da indução de apoptose pela oxidação da cofilina.
Figura 15: Esquema sugerindo a atuação das proteínas envolvidas com o processo
de apoptose.
IX
10
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Número de pontos protéicos extraídos de cada linhagem celular.
Tabela 2: Proteínas identificadas por espectrometria de massas nas três linhagens
tratadas com riboflavina.
Tabela 3: Proteínas identificadas pelo STITCH 2.0 que estabelecem interação com
as proteínas identificadas por espectrometria de massas e estão ligadas a estresse
oxidativo e reparo de DNA.
X
11
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
°C = graus Celsius;
µg = micrograma;
µM = micromolar;1O2: Oxigênio singlete;
8-oxoG: 7,8-diidro-8-oxo-guanina;
A: adenina;
ACN: Acetonitrila;
BER (Base Excision Repair): Reparo por Excisão de Bases;
C: citosina;
CS (Cockayne Sindrome): Síndrome de Cockayne
D-MEM: Dulbecco's Modified Eagle's Medium
DR (Direct Reversal): Reparo por Reversão Direta;
EROs: Espécies Reativas de Oxigênio
FAD: flavina adenina dinucleotídeo;
FapyAde: 4,6-diamino-5-formamidopirimidina;
FapyGua: 2,6-diamino-4-hidroxi-5-formamidopirimidina;
Fe: Ferro;
FMN: flavina mononucleotídeo;
Fpg: formamida pirimidina glicosilase;
G: guanina;
GG-NER (Genome Global-NER): Reparo Genômico Global;
GO: guanina oxidada;
H2O2: Peróxido de hidrogênio;
HO2●: Radical hidroperoxila;
HR (Homologous Recombination): Reparo por Recombinação Homóloga;
IEF: focalização isoelétrica;
kDa: kilodaltons;
LP-BER (long-patch-BER): Via longa do BER;
M = molar
Me-FapyGua: 2,6-diamino-4-hidroxi-5N-metilformamidopirimidina;
MEM ALPHA: Minimum Essential Medium α
mL: mililitro;XI
12
mM = milimolar;
MM: massa molecular;
MMR (Mismatch Repair): Reparo de bases mal-pareadas;
NER (Nucleotide Excision Repair): Reparo por Excisão de Nucleotídeos;
NHEJ (Non-homologous end-joining): Reparo por Junção Não-Homóloga;
O2●-: Radical superóxido;
OH●: Radical hidroxila;
PBSA: solução salina tamponada em fosfato;
pI: ponto isoelétrico;
SBF: soro fetal bovino;
SN-BER (single nucleotide-BER): Nucleotídeo único ou via curta do BER;
SP-BER (short-patch-BER): Via curta do BER;
T: timina;
TC-NER (Transcription coupled-NER): Reparo Acoplado à Transcrição;
TFA: ácido trifluoracético
U: uracila;
UV = Ultra-violeta;
Vhr: Volts/hora;
XP: Xeroderma Pigmentoso
XII
13
1. INTRODUÇÃO
1.1. EROs e Estresse Oxidativo
O oxigênio é um dos elementos mais abundantes da atmosfera terrestre e
participa de diversos processos metabólicos na maioria dos organismos, sendo a
conversão e mobilização de energia o principal deles para os seres aeróbicos.
Vários destes processos, podem levar a redução parcial do oxigênio originando
subprodutos de reações denominados de Espécies Reativas de Oxigênio (EROs),
como os radicais hidroxila (OH●) e superóxido (O2●-) (HALLIWELL e GUTTERIDGE,
1990). A maioria das EROs produzidas endogenamente são derivadas do
metabolismo aeróbico (WARNER, 1994; MICHIELS et al., 1994). Estima-se que 1-
5% do oxigênio consumido pelas células seja capaz de formar EROs (CHANCE et
al., 1979), entretanto, nem sempre ocorrem como uma conseqüência do
metabolismo mitocondrial. Podem ser geradas também pela atividade do citocromo
P450, dos peroxissomos, assim como, pela ação das oxidases da membrana celular
em resposta a fatores de crescimento e citocinas (BARZILAI e YAMAMOTO, 2004).
E, além disto, a sua produção pode ser influenciada tanto por estes fatores
endógenos, quanto por fatores exógenos, como radiações (UV e ionizantes) e
substâncias químicas.
Estas moléculas podem ser radicalares, como os radicais superóxido e
hidroxila, ou não radicalares, como o oxigênio singlete (1O2) e o peróxido de
hidrogênio (H2O2). Em condições fisiológicas normais atuam em importantes rotas,
como vias de sinalização, resposta imune, entre outras. Porém, em excesso, podem
ocasionar danos às células, uma vez que são capazes de agir sobre os lipídios,
proteínas e ácidos nucléicos (HALLIWELL E GUTTERIDGE, 2007). Frente a esta
pressão seletiva, os organismos aeróbios desenvolveram ao longo do processo
evolutivo mecanismos de defesa para neutralizar os efeitos danosos mediados pela
EROs. Estes podem ser divididos em três tipos ou etapas de atuação: 1) prevenção
da formação de EROS, 2) eliminação das EROs e 3) reparo das moléculas
modificadas por EROs. A primeira linha de defesa inclui a diminuição da reatividade
do O2 com outras moléculas; por meio do transporte do O2 de forma ligada; através
da quelação de metais durante seu transporte e armazenamento para que não reaja
14
com o peróxido de hidrogênio e ocorra a Reação de Fenton; por intermédio da
manutenção da formação de EROs nas mitocôndrias e outras organelas, como
peroxissomos, entre outros (SIES, 1993).
A eliminação das EROs pode ocorrer por meio da atuação de múltiplos
agentes, incluindo as enzimas antioxidantes, superóxido dismutase, catalase,
glutationa redutase, tiorredoxina redutase, entre outras (FINKEL E HOLBROOK,
2000) e por mecanismos antioxidantes não enzimáticos com a participação da
vitamina C, vitamina E, tocoferol, carotenóides e compostos fenólicos obtidos
através das ingestão de alimentos de origem animal e vegetal (STIPANUK, 2000)
O desbalanço entre a quantidade das espécies reativas e das substâncias
antioxidantes, alterando o estado redox da célula, acarreta no processo denominado
de estresse oxidativo, que, normalmente, ocasiona modificações deletérias a célula
(COOKE et al., 2003) devido ao grande número de danos gerados e moléculas
atingidas. Ao chegar neste ponto, em que as defesas primárias e secundárias não
foram suficientes e que ocorreu o dano, as moléculas podem ser reparadas pelo
mecanismo de defesa terciário. Este último é constituído pelos sistemas de reparo
de DNA que são de grande importância para a manutenção da estabilidade
genômica, ou destinadas para a degradação, como no caso de diversas proteínas.
Dentre tantas espécies, o radical hidroxila se destaca pela sua facilidade de
ser gerado, através da quebra da molécula de água ou até mesmo por meio de
reações de outras EROs, como reações de Fenton com peróxido de hidrogênio, e
também pela sua alta reatividade, sendo o radical de oxigênio conhecido mais
reativo, com um alto potencial de redução, o que possibilita a oxidação não seletiva
de uma grande variedade de compostos orgânicos (NOGUEIRA et al., 2007). O
superóxido e o oxigênio singlete também são duas formas bastante reativas de
oxigênio molecular, podendo ser produzidos em vários processos biológicos e na
fotossensibilização de algumas substâncias, como a riboflavina e o azul de metileno.
Estas espécies podem oxidar diretamente e indiretamente as moléculas, neste
último, por meio da geração de outras espécies reativas, como no caso do radical
hidroxila proveniente de reações ocorridas com o superóxido. Além disso, sabe-se
que o superóxido pode diminuir a atividade de algumas enzimas antioxidantes, como
a catalase, e sua produção no interior de membranas hidrofóbicas pode ser muito
danosa, uma vez que o superóxido é altamente reativo em solventes orgânicos
(HALLIWELL e GUTTERIDGE, 2007). O 1O2 por sua vez, reage, preferencialmente,
15
com resíduos de guanina livres ou guanina integrada ao DNA, devido ao fato da
mesma ser a base mais susceptível a danos oxidativos, em conseqüência de seu
baixo potencial redox, (STEENKEN e JOVANOVIC, 1997)
Como citado anteriormente, os danos ocasionados pelas EROs podem
abranger diversas moléculas. No caso dos lipídios, sabe-se que ácidos graxos
poliinsaturados e seus ésteres são um grande alvo para espécies reativas de
oxigênio e nitrogênio e sua oxidação nas membranas celulares tem sido abordada
como uma importante rota no estresse oxidativo in vivo (NOGUCHI et al., 2000). A
peroxidação de lipídios de membrana pode levar à morte celular tanto pela lise da
célula, quanto pela liberação do citocromo c da mitocôndria que é um sinalizador
para apoptose (NOMURA et al., 2000).
Em relação às proteínas, a ocorrência de danos pode prejudicar a função de
receptores, anticorpos, enzimas, transdução de sinais e o transporte de proteínas,
além de levar a danos secundários em outras moléculas. Por exemplo, a presença
de danos em enzimas envolvidas nas vias de reparo, aumenta os níveis de dano
oxidativo e a freqüência de mutação, enquanto nas DNA polimerases, pode diminuir
sua fidelidade na replicação do DNA (HALLIWELL e GUTTERIDGE, 2007).
No caso da ação das espécies reativas em bases nitrogenadas, observam-se
danos tanto ao DNA genômico, quanto ao DNA mitocondrial, e o acúmulo dessas
lesões está associado com apoptose e mutagênese, podendo levar ao
envelhecimento precoce, câncer e algumas doenças neurológicas, como o
Alzheimer (SASTRE e PALLARDO et al., 2003; KLAUNIG e KAMENDULIS, 2004;
NEELEY et al., 2006). Entretanto, o que tem se observado é que o efeito deletério
do estresse oxidativo está relacionado a diversos fatores podendo ser alterado,
consideravelmente, de um ser vivo para outro, de acordo com a idade, o estado
fisiológico e a dieta (NIESS et al., 1999). Podendo, também, variar entre tipos
celulares e, até mesmo, entre células de um mesmo tecido, uma vez que, a
capacidade antioxidante destas pode ser bastante diversificada (BERRA e MENCK,
2006).
1.2. Danos oxidativos e Reparo de DNA
O genoma de todos os seres vivos está constantemente sujeito a danos,
sendo o DNA alvo de diversos agentes lesivos de natureza física ou química. Danos
16
no DNA são inevitáveis e gerados a partir de fontes endógenas e exógenas,
originando diversos tipos de lesões que podem variar desde pequenos adutos na
molécula a quebras de dupla-fita. Estima-se que cerca de 104 lesões são induzidas
no genoma de células de mamíferos diariamente, como por exemplo, a deaminação
de cerca de 200 citosinas e a oxidação de 180 guaninas (HALLIWELL e
GUTTERIDGE, 2007).
Os principais danos oxidativos ao DNA são a 8-oxodG (7,8-diidro-8-oxo-
deoxyguanina) e FapyG (2,6-diamino-4-hidroxi-5-formamidopirimidina), sendo o
primeiro altamente oxidável e considerado mais mutagênico do que citotóxico,
porém, podendo dar origem a outras lesões mais tóxicas, como imidazolona, e
oxazolona (NEELEY e ESSIGMAN, 2006). Já a FapyG, assim como, a FapyA (4,6-
diamino-5-formamidopirimidina), caracterizadas pela abertura de um dos anéis
aromáticos das purinas, são consideradas altamente letais, pois se este dano não
for reparado, pode bloquear a atuação de polimerases, inibindo a síntese de DNA ou
RNA e também, acredita-se que FapyG seja tão mutagênica quanto a 8-oxoG,
principalmente, em células de mamíferos (DIZDAROGLU et al, 2008) (Figura 1).
Figura 1: Formação das lesões 8oxodG e FapyG, a partir do aduto radicalar da guanina C8-OH (Adaptada de DIZDAROGLU et al., 2008).
17
O reparo dos danos de DNA é de extrema importância, na literatura são
descritos seis principais sistemas de reparo: Reparo por Reversão Direta (DR –
Direct Reversal), Reparo por Excisão de Bases (BER – Base Excision Repair),
Reparo de bases mal-pareadas (MMR – Mismatch Repair), Reparo por Excisão de
Nucleotídeos (NER – Nucleotide Excision Repair), Reparo por Recombinação
Homóloga (HR – Homologous Recombination) e, por fim, Reparo por Junção Não-
Homóloga (NHEJ – Non-homologous end-joining) (Figura 2) (KLUNGLAND et al.,
2007).
1.2.1. BER – Reparo por excisão de bases
Dentre todos os sistemas de reparo já descritos, o BER é o principal
responsável por reparar a maioria dos danos oxidados ao DNA, sendo uma via
altamente conservada e constituindo-se, resumidamente, dos seguintes passos: 1 -
reconhecimento e excisão da base inapropriada, retirando-se a base oxidada
através da quebra da ligação N-glicosídica pelas glicosilases, gerando um sítio
abásico (ou sítio AP – apurínico ou apirimidínico); 2 - retirada do sítio abásico,
através da atuação de AP-endonucleases; 3 - limpeza de resíduos terminais; 4 -
reposicionamento do nucleotídeo excisado, por meio de DNA-polimerases; 5 -
Figura 2: Esquema com as seis principais vias de reparo de DNA e alguns dos seus principaissubstratos correspondentes (Adaptada de KLUNGLAND, 2007).
18
fechamento da ligação com a atuação da DNA ligase (HEDGE et al., 2008; BOHR et
al., 2007).
A especificidade do BER é determinada pelas glicosilases que iniciam o
reparo, cada DNA-glicosilase é específica para determinadas lesões. O
recrutamento de diferentes enzimas que atuam no BER depende do tipo do dano,
bem como, do padrão de expressão das enzimas (LARSEN et al., 2007). Esta via
pode ser subdividida em: single nucleotide (SN-BER) ou short-patch (SP-BER) e
long-patch (LP-BER) (Figura 3), sendo a principal diferença entre os dois a
quantidade de nucleotídeos que são repostos pelas DNA-polimerases, determinada
pelas enzimas envolvidas no processo (HEDGE et al., 2008 JEPPESEN et al.,2011).
Figura 3: Reparo por excisão de bases (BER). Destacando-se a principais enzimasenvolvidas nas diferentes etapas do reparo, e as diferentes proteínas envolvidas nas duassubvias: single nucleotide (SN-BER) ou short-patch (SP-BER) e long-patch (LP-BER)(Adaptada de JEPPENSEN et al., 2011).
19
O reparo das lesões oxidadas, geralmente é iniciado pelas DNA-glicosilases,
que reconhecem a base oxidada ou um pareamento errôneo com a base oxidada,
as quais podem ser exemplificadas pela Fpg e OGG1, entre outras. Seguindo a
ação das glicosilases, o sítio abásico gerado pela retirada da base é removido pela
atuação das endonucleases, como, por exemplo, a APE-1, gerando uma
extremidades 3´OH livre para ação de uma DNA-polimerase (, ou em eucariotos)
e ligase, as quais finalizam o reparo (SUNG e DEMPLE, 2006).
Além do sistema de reparo BER, a participação do NER, já constatada em
diversos estudos, também é um importante alvo de pesquisas atualmente.
1.2.2. NER – Reparo por Excisão de Nucleotídeos
O reparo por excisão de nucleotídeos (NER) é uma via altamente conservada,
sendo considerada um dos mecanismos de reparo mais versáteis por atuar em
diversas lesões. As lesões reconhecidas por esta via apresentam características
comuns que é a capacidade de causar tanto a distorção da dupla hélice como a
modificação química do DNA (HESS et al., 1997). Os dímeros de pirimidina
ciclobutano (CPD) e os fotoprodutos-6,4 (6,4-PP) são exemplos de lesões reparadas
pelo NER, sendo os danos mais significativos causados por UV (NIEDERNHOFER
et al., 2004). Além disso, adutos de DNA, como os gerados por ligações covalentes
entre as bases de DNA e hidrocarbonetos, também são alvos de reparo desta via
(BENHAMOU e SARASIN, 2000).
No processo de caracterização do NER foram identificados seis fatores de
reparo, XPA, RPA, XPC, TFIIH, XPG e XPF-ERCC1, necessários e suficientes para
remover os danos do DNA. XPA, RPA e XPC atuam na primeira etapa de
localização dos sítios de danos e de recrutamento do fator de reparo e de
transcrição TFIIH, o qual é constituído por seis polipeptídeos, dentre os quais as
helicases XPB e XPD são responsáveis por desnaturar o DNA no local do dano, e
as subunidades XPG e XPF-ERCC1 realizam duas incisões nas extremidades 3' e
5', respectivamente. O fator de replicação C (RFC), PCNA e DNA polimerases δ e ε
preenchem a lacuna, e na etapa final, a DNA ligase I completa o reparo.
O NER pode ser classificado em dois tipos: reparo global do genoma (GG-
NER), que realiza o reparo no genoma completo, e o reparo acoplado àtranscrição (TC-NER), responsável pelo reparo de lesões em áreas
20
transcricionalmente ativas do DNA. Estas duas vias seguem, basicamente, os
mesmos passos, sendo fundamentalmente idênticas, excetuando-se os mecanismos
de reconhecimento do dano (Figura 4).
No GG-NER, existe um complexo protéico composto por XPC, HR23B, ou
HR23A, que são ortólogas de Rad23, e CEN2 que são responsáveis pela detecção
do dano. XPC se liga ao DNA danificado e a poli-ubiquitinação desta proteína
aumenta a afinidade pelo dano, estando Rad23 relacionada com esta modificação
pós-traducional. CEN2, por sua vez, apesar de nem sempre ser requerido, atua na
estabilização deste complexo de reconhecimento (ARAKI et al., 2001). No TC-NER,
o recrutamento das proteínas destinadas ao reconhecimento do dano, é induzido
pela parada da maquinaria de transcrição, não havendo participação de XPC. Para
que as proteínas do NER tenham acesso ao dano no DNA, o complexo da RNA
polimerase II deve ser removido e isto ocorre, principalmente, por meio da ação das
proteínas CSA e CSB, assim como outros fatores específicos do TC-NER. Os
passos subseqüentes do GG- e TC-NER seguem uma via comum (Figura 4)
(JEPPESEN, 2011).
Apesar de o NER ser reconhecido como o sistema de reparo de grandes
grupamentos (bulky adducts), diversos estudos tem mostrado a sua atuação em
outros tipos de lesões, como bases oxidadas, as quais são, em sua grande maioria,
reparadas pelo BER (AAMANN et al., 2010; BRANUM et al., 2001; HUANG et al.,
1994). Devido a esta característica, o NER assume um papel de backup para a via
BER na remoção desses danos. Como tem sido visto, o NER é capaz de remover
diversas lesões induzidas por EROs, como timina glicol, ciclodeoxiadenosina e 8-
oxoG (KURAOKA ET AL., 2000; REARDON ET AL., 1997). A participação de
proteínas do NER na remoção de 8-oxodG (D’ERRICO ET AL., 2006; SLUPPHAUG
ET AL., 2003; TUO ET AL., 2003), a principal lesão oxidada mutagênica, sugere o
NER como uma via alternativa no reparo desse tipo de lesão durante o estresse
oxidativo.
A importância deste sistema é constatada pela existência de algumas
doenças relacionadas com o funcionamento deficitário do mesmo, como Xeroderma
Pigmentoso (XP) e Síndrome de Cockayne (CS), tendo sido obtidos avanços
consideráveis sobre o processo do NER humano através do estudo das mesmas.
Indivíduos afetados com qualquer uma destas desordens autossômicas recessivas
mostram hipersensibilidade severa à UV.
21
Xeroderma pigmentoso é uma doença autossômica recessiva hereditária
caracterizada por uma marcada fotossensibilidade, hiperpigmentação e um aumento
de mais de 1000 vezes do risco de desenvolvimento de câncer de pele, sendo uma
característica adicional desta doença, em cerca de 30% dos portadores, a presença
de anormalidades neurológicas. Os indivíduos XP podem apresentar deficiência em
Figura 4: As duas subvias de reparo por excisão de nucleotídeos de mamíferos.No GG-NER, os danos de distorção da hélice do DNA são reconhecidos pelo complexo XPC-HR23B-CEN2 em qualquer lugar do genoma. No TC-NER, o reconhecimento ocorre pelaestagnação da RNA pol II em lesões de DNA na fita transcrita de genes ativos, facilitada porCSB, CSA e XAB2. (Adaptada de JEPPENSEN et al., 2011).
22
um dos sete grupos de complementação XP, XPA-XPG, correspondendo a
mutações em uma destas proteínas (KRAEMER et al., 1987; KRAEMER et al.,
2007), além de ter sido observado um oitavo grupo, onde os portadores apresentam
mutação na polimerase η (MASUTANI et al., 1999). Os produtos de gene XP são
conhecidos por executar várias funções durante o reconhecimento de danos e
incisão do DNA (LINDAHL e WOOD, 1999). Foi constatado que indivíduos com
deficiência em XPC não apresentam neurodegeneração, enquanto que indivíduos
portando mutações em XPA ou XPB apresentam neurodegeneração severa. Isto é
associado ao fato de TC-NER ser a via mais ativa deste tipo de reparo em
neurônios, sendo, portanto, a mais importante para a proteção deste tipo celular
(YAMAMOTO et al., 2007).
Por outro lado, a Síndrome de Cockayne, tem como principal característica a
neurodegeneração e não confere um aumento no risco de seus portadores
desenvolverem câncer. Outros sintomas desta doença incluem nanismo caquético,
retardo do crescimento e desenvolvimento depois do nascimento, além de
fotossensibilidade e catarata (LICHT et al., 2003). Os produtos do gene CS estão
envolvidos no reconhecimento da lesão na via TC-NER (FRIEDBERG, 1996). Sabe-
se que 62% dos casos de CS são ocasionados por mutações no gene CSB
(LAUGUEL et al., 2010), enquanto que, a maior parte dos indivíduos com deficiência
em CSA apresenta também mutações associadas em XP-B, XP-D ou XP-G.
(OSENBROCH et al., 2009).
Uma das hipóteses sugeridas para explicar as diferenças entre indivíduos XP
e CS seria o comportamento diferencial de suas células ao reparar danos oxidados
no DNA, os quais ainda são, relativamente, pouco estudados nesses casos
(HOEIJMAKERS, 2001). Recentemente, algumas evidências da participação de
NER no reparo de lesões oxidadas em DNA de humanos e roedores começaram a
ser obtidas. Por meio de análises de imunohistoquímica, utilizando-se amostras de
tecido cerebral de pacientes com XP-A e CS já falecidos, revelou-se o acúmulo de
danos oxidativos no DNA e distúrbios na expressão de superóxido dismutase em
pacientes XP-A, mas não em CS, sugerindo que estes eventos estariam
relacionados à neurodegeneração associada à doença XP. Como já descrito, a
freqüência mais elevada e os exemplos mais severos de anormalidades
neurológicas são observados entre indivíduos com mutações nos genes CSB, sendo
encontradas algumas evidências do acúmulo de danos oxidados no DNA e de
23
disfunção mitocondrial nestes (JEPPENSEN et al., 2011). No que diz respeito a
atuação de CSB, foi constatada a deficiência na excisão de 8-oxodG no DNA de
células deficientes em CSB, devido a redução de expressão de OGG1 (DIANOV et
al., 1999). Sendo, após alguns anos, demonstrada a atividade de CSB, na remoção
de 8-oxodG do genoma de células, independente do reparo mediado por OGG1
(OSTEROD et al, 2002).
Além de ter sido demonstrado que a proteína XPC está envolvida no reparo
da 8-oxodG e 8-oxodA e que XPC atua como um co-fator para a clivagem da 8-
oxodG pela OGG1 (D’ERRICO et al., 2006), o que leva ao acúmulo de danos
oxidados nestas células, alguns estudos demonstraram uma maior resistência e,
simultaneamente, decréscimo de apoptose, em células deficientes em XPC
expostas a cisplatina (WANG et al., 2004) e Iludina S (antibiótico) (DE WARD et al.,
2008). E, em estudo recente realizado em nosso laboratório, uma linhagem
deficiente em XPC apresentou viabilidade semelhante à linhagem proficiente em
NER (MRC5) após serem submetidas a estresse oxidativo induzido pela
fotossensibilização da riboflavina, enquanto que, as linhagens deficientes em XPA
(XP12RO) e em CSB (CS1AN) se mostraram mais sensíveis ao tratamento (MELO,
2010 em preparação). Desta forma, estas características podem estar associadas à
tumorigênese apresentada por este tipo de células.
Embora tenha sido demonstrado que o NER seja capaz de promover a
excisão de 8-oxodG, timina glicol, e talvez outras lesões de base de DNA geradas
por estresse oxidativo de forma tão eficiente como os dímeros de timina ciclobutano
(REARDON et al., 1997), a 8-oxodG e outras lesões oxidativas são reparadas de
forma muito eficiente pela via de reparo de bases (BER) por meio da atuação da
OGG1 e outras glicosilases (FROMME e VERDINE, 2004). Assim, o mecanismo de
atuação de NER ainda não foi descrito e necessita ser melhor esclarecido, apesar
das evidências da participação de proteínas de NER no reparo dos danos oxidados
do DNA em associação com proteínas da via BER. Bem como, pouco se sabe a
cerca de que vias estão envolvidas na resistência das linhagens deficientes em XPC
quando expostas a diferentes tipos de estresse, especialmente, o oxidativo.
24
1.3. Fotossensibilizador: Riboflavina
Em pesquisas envolvendo estresse oxidativo e caracterização de moléculas
atuantes neste processo têm sido utilizadas diversas substâncias para indução de
estresse oxidativo como, por exemplo, a riboflavina (7,8-dimetil-10-ribitil-
isoaloxazina), azul de metileno, entre outros, denominados de fotossensibilizadores.
Estes são compostos que ao serem excitados pela luz, produzem espécies reativas
que causam danos em biomoléculas e são responsáveis pela citotoxicidade em
terapias fotodinâmicas (GABRIELLI et al., 2007).
A riboflavina, que é comumente denominada vitamina B2, é hidrossolúvel e
apresenta coloração amarela e fluorescente, sendo sua molécula constituída por
uma cadeia ribitil e um sistema de anéis de isoaloxazina (Figura 5) (SOUZA et al.,
2005; ANICETO et al., 2000).
Plantas, fungos e diversas bactérias são capazes de sintetizar a riboflavina,
através de uma série de reações que utiliza o trifosfato de guanosina (GTP) como
molécula precursora, terminando em uma reação de dismutação catalisada por uma
enzima denominada riboflavina sintase. Os animais, por sua vez, incluindo o ser
humano, são incapazes de sintetizá-la, tendo que adquirí-la, principalmente, a partir
da ingestão de alimentos ricos nesta molécula (COLIBUS e MATTEVI, 2006). Com o
desenvolvimento de processos biotecnológicos, sua produção industrial foi
Figura 5: Molécula da Riboflavina, destacando-se a cadeia Ribitil e os anéis de Isoaloxazina(Fonte: SOUZA et al., 2005).
25
possibilitada, recorrendo a microorganismos capazes da sua biossíntese, incluindo
fungos filamentosos como Ashbya gossypii, Candida famata e Candida flaveri, assim
como as bactérias Corynebacterium ammoniagenes e Bacillus subtilis (STAHMANN
et al., 2000).
Esta vitamina apresenta papéis muito importantes por participar de diferentes
aspectos do metabolismo celular, como precursora de coenzimas constituintes da
cadeia transportadora de elétrons (FMN e FAD), assim como, originando moléculas
que estão ligadas a diversas enzimas que atuam em reações de reparo de DNA,
dentre outros papéis. Além disso, destaca-se o caráter duplo desta molécula, que
pode tanto contribuir quanto inibir o estresse oxidativo através da sua habilidade de
produzir superóxido e, ao mesmo tempo, estar envolvida na redução de
hidroperóxidos. (SOUZA et al., 2005; MASSEY, 2000).
A geração de espécies reativas, pela fotossensibilização da riboflavina, ocorre
por meio da absorção de luz pela molécula, alcançando seu estado triplete excitado,
podendo agir, diretamente, sobre um substrato levando à fotoxidação deste e à
conseqüente formação de radicais intermediários (mecanismo tipo I), além de
espécies reativas de oxigênio, tais como ânion superóxido, radical hidroxil e
peróxido de hidrogênio ou interagir com o oxigênio molecular gerando oxigênio
singlete (chamado de mecanismo tipo II) (HIRAKU et al., 2007; SOUZA et al., 2005)
(Figura 6). Outro aspecto importante na atuação desta molécula é a sua capacidade
de gerar efeitos citotóxicos mesmo quando não exposta à irradiação, através de um
mecanismo enzimático mediado por peroxidases (SOUZA et al., 2005).
A ação fotodinâmica de qualquer fotossensibilizador, incluindo a riboflavina,
em sistemas biológicos é um quebra-cabeças, podendo ser afetado por diferentes
variáveis, incluindo o mecanismo fotoquímico, a localização do fotossensibilizador,
os alvos biológicos de reatividade e a rede de sinalização celular, além disso, essas
variáveis podem afetar as propriedades das outras (TARDIVO et al., 2005).
26
Figura 6: Produção de espécies reativas de oxigênio a partir de fotossensibilizadores, atravésda fotoativação ou mecanismo enzimático, destacando-se os tipos. (Adaptada de SOUZA et al,2005). FS= Fotossensibilizador; 3FS*= Fotossensibilizador no estado triplete; S= Substrato; FS-
▪= Radical ânion do fotossensibilizador; FSox= Fotossensibilizador oxidado; FSred=Fotossensibilizador reduzido.
27
2. Justificativa
As células respondem ao estresse por meio da ativação de diversos
mecanismos, o que pode ser observado através de alterações na expressão de
diferentes proteínas com as mais variadas funções. O modo como estas proteínas
estão atuando, em que vias metabólicas, e os tipos de interações estabelecidos
entre elas podem ser melhor investigados através de estudos aplicando-se a
proteômica que, com um leque variado de técnicas, permite desde a identificação de
um grande número de proteínas, simultaneamente, até a detecção de modificações
estruturais sofridas pelas mesmas. Em uma abordagem investigativa inicial, o
estudo comparativo de proteomas de diferentes linhagens celulares poderá
estabelecer quais proteínas estão sofrendo alteração de expressão, permitindo-se a
elaboração de um perfil de proteínas envolvidas na resposta ao estresse oxidativo
gerado pelo tratamento com riboflavina fotossensibilizada.
Em relação à resposta ao estresse oxidativo e ao reparo de danos ao DNA
gerados por este tipo de estresse em células deficientes em NER, os mecanismos
de atuação das principais proteínas ainda não estão bem esclarecidos. Muito do
conhecimento quanto às funções de proteínas NER é proveniente de estudos com
ultravioleta. Porém os danos induzidos por este agente não justificam fenótipos
como neurodegeneração e tumores internos observados em pacientes CS e XP, o
que coloca os danos induzidos por EROs como principais responsáveis por esses
fenótipos. Por outro lado, o papel mutagênico de lesões como a 8-oxodG está bem
documentado na literatura, porém seu papel no bloqueio da replicação ou
transcrição, e conseqüentemente na indução de apoptose, ainda é alvo de
controvérsia. Em adição, pouco é conhecido quanto ao papel biológico de outras
lesões oxidadas como FapyG e guaninas hiperoxidadas. Embora a parada do ciclo
celular em G2, níveis reduzidos de apoptose, aumento de mutações e câncer em
células deficientes em XPC, assim como, a ausência de tumores e
neurodegeneração devido à alta taxa de apoptose em pacientes CS, estejam
reportados na literatura, as lesões e mecanismos relacionados a esses eventos são
pouco compreendidos. Desta forma, a caracterização e obtenção de um perfil
protéico das linhagens celulares deficientes em XPC ou CSB, em comparação a
MRC5, auxiliará a esclarecer diferentes respostas apresentadas por estas linhagens
28
celulares. Além disto, o entendimento das relações existentes entre várias moléculas
e vias atuantes, envolvidas diretamente ou indiretamente na defesa contra o
estresse oxidativo e no reparo de DNA, em resposta a este tipo de estresse.
Também, possibilitará a escolha de alvos para um estudo detalhado de
determinadas vias que promovem o desenvolvimento das doenças relacionadas
com a ausência de CSB, XPC, e de outras doenças relacionadas à
neurodegeneração, e ao desenvolvimento de tumores.
29
3. Objetivos
3.1. Objetivo Geral:
Realizar uma análise comparativa da expressão de proteínas totais solúveis
envolvidas na resposta ao estresse oxidativo e no reparo de DNA entre linhagens
celulares humanas proficiente e deficientes em NER, expostas a riboflavina
fotossensibilizada.
3.2. Objetivos específicos:
3.2.1. Obter os perfis das proteínas solúveis das linhagens celulares humanas
tratadas com riboflavina;
3.2.2. Identificar proteínas expressas diferencialmente em resposta ao
estresse oxidativo;
3.2.3. Predizer interações entre as proteínas identificadas;
3.2.4. Correlacionar as funções das proteínas com os mecanismos de
resposta ao estresse.
30
4. Materiais e métodos
4.1. Linhagens celulares humanas
Para a obtenção do perfil protéico das células eucarióticas, foram
utilizadas três linhagens de células humanas, sendo uma proficiente, a MRC5-SV
(fibroblasto de pulmão de feto humano – células normais transformadas por SV-40)
e duas deficientes no sistema de reparo NER (Reparo por Excisão de Nucleotídeos),
sendo estas CS1AN (deficiente no TC-NER – fibroblastos provenientes da pele de
indivíduos CS com o gene CSB mutado, transformados por SV-40) e XP4PA
(deficiente no GG-NER – fibroblastos provenientes da pele de indivíduos XP com o
gene XPC mutado, transformados por SV-40).
As células foram cultivadas em meio Dulbecco's Modified Eagle's Medium
(DMEM – GIBCO) suplementado com bicarbonato de sódio (NaHCO3), 10% de soro
bovino fetal (SBF) (GIBCO) e 1% de antibióticos (100 µg/mL Estreptomicina e 100U
Penicilina) em garrafas de poliestireno (Sarstedt) até atingirem a confluência. As
células foram mantidas em incubadora Elite II (REVCO) a 37ºC e 5% de CO2.
As mesmas foram subcultivadas até a terceira passagem (três subcultivos)
para, em seguida, serem submetidas ao tratamento com riboflavina com o intuito de
induzir estresse oxidativo. Cada subcultivo procedeu-se da seguinte maneira: o meio
de cultura foi removido dos frascos, as células foram lavadas com D-PBSA (solução
salina tamponada em fosfato: NaCl - 0,14 M, KCl - 0,002 M, Na2HPO4 – 0,006 M,
KH2PO4 – 0,001 M) aquecido, em seguida, desagregadas dos frascos, utilizando-se
tripsina-EDTA 5% (1X) (GIBCO) e, por fim, foi adicionado o meio D-MEM.
4.2. Tratamento com riboflavina
As células destinadas ao tratamento com riboflavina foram mantidas em
cultivo sob as mesmas condições descritas no item anterior em garrafas de
poliestireno até atingirem a confluência. A concentração de 200 µM de riboflavina
utilizada nos tratamentos foi escolhida a partir dos resultados de viabilidade celular
obtidos pelo nosso grupo de pesquisa em trabalho anterior, utilizando-se o método
de exclusão com azul de Trypan. Nesta concentração, as três linhagens se
31
apresentaram viáveis, observando-se redução de viabilidade somente em CS1AN
com cerca de 70% de células viáveis. A cultura de células confluente foi submetida a
uma incubação, pré-tratamento com riboflavina, sendo a concentração de de
riboflavina, adicionada ao meio de cultura Minimum Essential Medium α (MEM
ALPHA - GIBCO) e mantidas por um período de 30 minutos na incubadora a 37ºC e
5% de CO2. Em seguida, a cultura foi exposta à luz por 30 minutos sob incidência de
33,3 J/cm2 de potência luminosa, os controles negativos e as células submetidas a
riboflavina sem irradiação foram mantidos no escuro, e os ensaios foram realizados
em temperatura ambiente.
4.3. Extração, quantificação e precipitação das proteínas totais
Após a realização dos tratamentos, para indução de estresse oxidativo, as
linhagens celulares humanas, foram submetidas à extração de proteínas solúveis
totais, utilizando-se solução de Lise (Uréia – 7 M; Tiouréia – 0,5 M; DTT – Ditiotreitol
– 50 mM; 0,05% CHAPS). Em seguida, as proteínas das amostras foram
quantificadas através do Método de Bradford (BRADFORD, 1976) com o Reagente
de Bradford concentrado da BioAgency e leitura em espectrofotômetro de
microplacas (QuantTM – BIOTEK), a 595 nm.
As amostras foram concentradas, aplicando-se o protocolo de precipitação
com acetona, desta forma, foram adicionados três volumes de acetona 100%
gelada, em seguida, a amostra foi mantida no freezer a -20ºC por um período de 2
horas, após isto, centrifugou-se por 30 minutos, permanecendo a temperatura de
4ºC. E por fim, dispensou-se o sobrenadante, sendo o precipitado colocado em
centrífuga a vácuo para secagem do mesmo. A amostra foi mantida em ultrafreezer
(-70/-80ºC) até o momento da ré-hidratação.
4.4. Análise da expressão diferencial de proteínas
4.4.1. SDS-PAGE
A complexidade da mistura de proteínas solúveis totais extraídas foi,
primeiramente, analisada por eletroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS,
SDS-PAGE (LAEMMLI, 1970), 12%, gel unidimensional.
32
4.4.2. Eletroforese bidimensional
Para uma análise mais detalhada da expressão diferencial, isolamento,
sequenciamento e identificação das proteínas envolvidas na resposta ao estresse
oxidativo e no reparo de DNA, os extratos totais foram submetidos à eletroforese
bidimensional em gel de poliacrilamida (O’FARRELL, 1975). A eletroforese
bidimensional é uma técnica através da qual as proteínas são separadas por duas
propriedades, ponto isoelétrico e massa molecular, sendo dispostas em manchas
denominadas “spots”.
Foram utilizados 500 µg de proteína para cada gel bidimensional. A
focalização isoelétrica (IEF), primeira dimensão, das proteínas foi realizada em uma
plataforma IPGphor Ettan III (GE Healtcare). A IEF foi conduzida em tiras IPG. Estas
tiras apresentam um gradiente imobilizado de pH em gel de poliacrilamida fixado em
plástico(GE Healtcare). A faixa de pH utilizada foi pH 3 – 10 linear em tiras de 13
cm. Previamente à IEF, a amostra foi misturada com solução de ré-hidratação (Uréia
- 8 mol/L, CHAPS - 0,5%, Tampão IPG - 0,2%, DTT - 15 mM e Azul de bromofenol -
0,002% (p/v)) (GÖRG et al., 1998) para atingir o volume total de 250 µL a ser
aplicado no sarcófago. As tiras IPG foram ré-hidratadas passivamente por 16 horas,
diretamente, com a amostra. A solução foi aplicada no sarcófago e, em seguida,
removeu-se o plástico protetor das tiras. As tiras foram posicionadas com o gel
voltado para baixo e cobertas com óleo mineral (“Dry Strip Cover Fluid”). Após a ré-
hidratação, realizou-se a IEF, para tanto os sarcófagos foram dispostos no IPGphor.
A focalização ocorreu em três etapas de 500 Vhr, 1000 Vhr e 8000 Vhr, totalizando
15500 Vhr. Após a IEF, as tiras foram, imediatamente, equilibradas em 5 mL de
solução de equilíbrio (Uréia – 6 M, Glicerol - 30% (p/v), SDS - 2% (p/v), Tris-HCl -
50mM pH 8,8 e Azul de bromofenol - 0,002% (p/v) ) duas vezes durante 15 minutos.
Ao primeiro passo, foram adicionados 50 mg de DTT ao tampão de equilíbrio e ao
segundo 125 mg de iodoacetamida ao mesmo tampão. Após os dois passos de
equilíbrio, as tiras foram lavadas com água ultrapura e, posteriormente, submetidas
à segunda dimensão: eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS
(SDS-PAGE).
A eletroforese (segunda dimensão) das proteínas presentes nas tiras IPG foi
feita em gel de poliacrilamida na presença de SDS (SDS-PAGE), utilizando a
metodologia descrita por Laemmli (1970). Preparou-se um gel de separação na
33
concentração de 12,5% de poliacrilamida. A eletroforese foi realizada em géis de 18
cm x 16 cm em cuba tipo “Hoefer SE 600 Ruby” da Amersham Biosciences. As tiras
IPG foram mergulhadas por alguns minutos no tampão de corrida e, em seguida,
posicionadas horizontalmente no topo do gel, mantendo pleno contato com este. As
tiras foram cobertas com 2 mL de solução de agarose (Agarose - 0,5%, SDS - 1% e
traços de Azul de bromofenol), deixando-se solidificar por aproximadamente 5
minutos. A corrida foi feita em dois passos, o primeiro passo ocorreu a 10 mA/gel
por 15 minutos, e o segundo passo, a uma corrente de 30 mA/gel, até o azul de
bromofenol (frente do gel) atingir o limite inferior do gel. A temperatura foi mantida a
8ºC por meio de refrigeração.
4.4.3. Visualização dos géis
Os géis bidimensionais foram visualizados por meio de coloração com
Coomassie Blue coloidal. Para isto, os géis foram, primeiramente, mantidos durante
30 minutos em solução fixadora (Ácido acético - 40% e Etanol – 10%) e, em
seguida, corados com Coomassie permanecendo, pelo menos, 12 horas em solução
de Coomassie Brilliant Blue R-250 (LAEMMLI, 1970). Após isto, foram realizadas
sucessivas lavagens com água ultrapura para retirada do excesso de corante e
possível análise dos “spots” (pontos protéicos) corados.
Os géis obtidos foram digitalizados, utilizando-se um equipamento da marca
Labscan.
4.4.4. Análise dos géis
As análises dos géis bidimensionais foram feitas no Programa ImageMaster
2D Platinum, versão 6.0, adquirido da GE Healtcare. A detecção de pontos protéicos
foi feita, automaticamente, seguida de correções manuais para retirada daqueles
que não correspondiam a proteínas. As imagens de géis das amostras de cada
condição foram comparados para verificar diferença de expressão. Para considerar
uma proteína como induzida ou reprimida o critério utilizado foi o aparecimento ou
desaparecimento da proteína do gel. E, em relação à diferença quantitativa de
expressão, verificou-se o aumento ou diminuição de pelo menos duas vezes o
volume normalizado.
34
4.5. Identificação de proteínas diferencialmente expressas
4.5.1. Extração e digestão das proteínas dos géis bidimensionais
As proteínas de interesse foram retiradas do gel, digeridas com tripsina, e em
seguida, identificadas por meio de espectrometria de massa (MS) (GRAVES e
HAYSTEAD, 2002). A espectrometria de massa consiste na análise da massa de
fragmentos obtidos na digestão das proteínas com uma enzima proteolítica, como a
tripsina. O padrão de massas obtido (peptides mass fingerprint) é comparado em
bancos de dados para a identificação das proteínas (ROCHA et al, 2005).
A retirada de proteínas para posterior análise por espectrometria de massa foi
feita em fluxo laminar com auxílio de ponteiras de 200 µL cortadas com bisturi e
estéreis. Os spots correspondentes às proteínas de interesse foram retirados e
armazenados em tubos de 500 µL em congelador –70ºC até o momento da etapa de
tripsinização.
4.5.2. Digestão dos peptídeos extraídos
O preparo das amostras para análise por espectrometria de massas foi feito
conforme o seguinte protocolo, modificado de Westermeier (2002). Para remoção
dos corantes os pedaços de gel contendo as proteínas foram lavados em solução de
50% de Acetonitrila (ACN) / 25 mM de Bicarbonato de amônio pH 8,0. A suspensão
foi agitada e deixada em repouso durante 10 minutos. Este procedimento foi
repetido até total descoloração do gel. Para realizar a desidratação dos fragmentos
de géis foram feitas 3 lavagens com 25 µL de acetonitrila 100% e, em seguida, os
géis foram secados em sistema de centrifugação a vácuo (speed vac) durante 25
minutos. Na etapa de digestão enzimática os géis foram ré-hidratados com solução
contendo tripsina (10 u/mL) em 50 mM de tampão de bicarbonato de amônio pH 8,0.
A solução com enzima foi aplicada fria (4ºC), as amostras permaneceram em banho
de gelo durante 45 minutos e em seguida foram colocadas em estufa 37ºC durante
12 horas. Após este período, adicionou-se tampão bicarbonato de amônio pH 8,0
em quantidade suficiente para cobrir completamente os pedaços de géis. Para
extração dos peptídeos, produtos da digestão com tripsina, foram adicionados 20 µL
de solução bicarbonato de amônio 50 mM aos pedaços de géis, seguidos de
35
ultrassom durante 10 minutos. Após isto, adicionaram-se 20 µL de uma solução
contendo Acetonitrila (ACN) - 5% e Ácido trifluoracético (TFA) – 50% às amostras,
sendo mantidas em banho de ultrassom por mais 10 minutos. A solução
sobrenadante foi coletada e o procedimento de adição de ACN 5%, TFA 1/1 e banho
de ultrassom repetido duas vezes, sendo que em cada passo foi feita coleta da
solução sobrenadante. Após esse período, a solução total foi evaporada em sistema
a vácuo.
4.5.3. Sequenciamento dos peptídeos por análise espectrométrica
As análises espectrométricas dos peptídeos resultantes da digestão com
tripsina foram feitas em Equipamento Q-TOF Micro™, com Sistema nanoACQUITY
UPLC acoplado – na Unidade de Espectrometria de Massa e Química de Proteínas
(Uniprote-MS) da UFGRS (Universidade Federal do Rio Grande do Sul). Para a
identificação das proteínas foram consideradas as modificações de resíduos de
cisteína pelo tratamento com iodoacetamida. Foram utilizados os sítios MASCOT
(disponível em: <http://www.matrixscience.com/cgi>) e TagIdent (disponível em:
<http://us.expasy.org/tools/ tagident.html>). A busca pelo sítio MASCOT foi feita
utilizando os valores provenientes de PMF e a base de dados NCBInr, enquanto que
a busca pelo sítio TagIdent foi realizada utilizando os valores calculados de pI e MM,
a base de dados Swiss-Prot.
4.6. Rede de interações
Os interatomas foram gerados através do programa Stitch 2.0 (disponível em:
http://stitch.embl.de/), no qual se submeteram os nomes das proteínas identificadas
por espectrometria de massas e, por meio deste, foi possível analisar se existe
algum tipo de correlação ou interação entre elas, que já tenha sido descrita na
literatura, e o nível destas. Além disto, o programa também forneceu interações com
outras proteínas. Para cada linhagem, foi estabelecida uma rede de acordo com as
proteínas identificadas em cada condição de tratamento.
A busca foi direcionada para proteínas de Homo sapiens, desta forma, o
programa selecionou somente informações acerca desta espécie, contidas nos
bancos de dados, uma vez que, as células utilizadas foram de fibroblastos humanos.
36
5. Resultados
5.1 Análise da expressão diferencial de proteínas
A partir da análise dos géis bidimensionais das três linhagens tratadas, foram
escolhidos 215 pontos protéicos para a extração e seguinte identificação por
espectrometria de massas. Na linhagem MRC5, na qual foram selecionados, 54
pontos, sendo 14 do controle, 23 do tratamento com riboflavina sem irradiação e 17
com a riboflavina exposta à luz, observou-se o aumento de expressão das diversas
proteínas marcadas no controle (A), mesmo a partir do tratamento com a riboflavina
sem ser irradiada (B) (Figura 7). E o aparecimento e desaparecimento de alguns
spots nos diferentes tratamentos.
Em relação à linhagem deficiente em CSB, foram extraídos 116 spots, sendo
21 dos géis dos controles, 46 dos géis na condição riboflavina não-irradiada e 49 na
condição de tratamento em que a riboflavina foi exposta a fonte luminosa (Figura 8).
Assim como, na linhagem proficiente em reparo, foi visualizado alteração de
expressão de algumas proteínas, em relação ao controle não tratado (A), mesmo na
condição sem irradiação. Entretanto, ao contrário da MRC5, a maioria dos pontos
escolhidos nesta linhagem apresentou redução na expressão. No caso das células
deficientes na proteína de reparo XPC, foram retirados dos géis um total de 45
pontos (Figura 9), tendo sido 15 de cada condição de tratamento. Apesar de ter sido
a linhagem com o menor número de pontos extraídos, foi a que demonstrou o
resultado mais interessante por apresentar modificações na expressão de proteínas
que não foram visualizadas nas demais linhagens e pelas funções destas proteínas
que serão discutidas a seguir. Os números apresentados estão reunidos na tabela 1.
37
Figura 7: Géis bidimensionais das proteínas solúveis totais da linhagem celular MRC5: A) Células controle, B) Células tratadas com riboflavinanão-fotossensibilizada e C) Células tratadas com riboflavina fotossensibilizada. Os spots numerados representam as proteínas identificadas, oscírculos agrupam spots com mesma identidade protéica.
A B C
38
Figura 8: Géis bidimensionais das proteínas solúveis totais da linhagem celular CS1AN: A) Células controle, B) Células tratadas com riboflavinanão-fotossensibilizada e C) Células tratadas com riboflavina fotossensibilizada. Os spots numerados representam as proteínas identificadas, oscírculos agrupam spots com mesma identidade protéica.
A B C
39
Figura 9: Géis bidimensionais das proteínas solúveis totais da linhagem celular XP4PA: A) Células controle, B) Células tratadas com riboflavinanão-fotossensibilizada e C) Células tratadas com riboflavina fotossensibilizada. Os spots numerados representam as proteínas identificadas, oscírculos agrupam spots com mesma identidade protéica.
A B C
40
Tabela 1: Número de pontos protéicos extraídos de cada linhagem celular.
5.2. Proteínas identificadas por espectrometria de massas
Dos 215 possíveis peptídeos selecionados e extraídos dos géis das três
linhagens, somente 178 foram submetidos à espectrometria de massas, sendo
perdidas cerca de 1/6 das amostras preparadas. Após o sequenciamento dos
peptídos, as sequências foram analisadas no MASCOT, a partir do qual, obteve-
se que 161 destes spots correspondiam a proteínas. Ao serem identificadas, foi
verificado um total de 25 proteínas e as mesmas se distribuía em quatro grandes
grupos funcionais principais: chaperonas e resposta ao estresse; regulação,
sinalização e tradução; componentes do citoesqueleto e reparo de DNA, podendo,
ainda, participar de mais de um grupo, uma vez que, as proteínas são moléculas
envolvidas em diversos processos celulares.
Dentre as proteínas identificadas, observou-se que a maior parte destas foi
detectada nas três linhagens, em ambas as condições de tratamento, podendo
ocorrer ou não, alterações no padrão de expressão de uma linhagem celular para
outra. Foi visto também que as linhagens CS1AN e XP4PA não compartilham
nenhuma proteína sem que esta não apareça também na linhagem controle
MRC5 (Figura 10).
TratamentoLinhagem
Controlenão tratado
Rb nãofotossensibilizada
Rb fotossensibilizada Total
MRC5 14 23 17 54
CSB 21 46 49 116
XPC 15 15 15 45
Total 50 84 81 215
41
Interessantemente, como já foi dito anteriormente, entre as proteínas
detectadas nas células deficientes em XPC, ocorreram duas proteínas exclusivas,
ou seja, que nas condições do ensaio e através do método de detecção
empregados não foram detectadas nas outras linhagens. Entretanto, isto não
quer, obrigatoriamente, dizer que estas proteínas não estão sendo expressas nas
outras células, elas podem estar expressas em uma concentração que não foi
possível de ser visualizada.
Na linhagem MRC5, na condição em que as células foram expostas a
riboflavina, mas não foram irradiadas e em relação ao controle, houve um
aumento de expressão em 12 das 25 proteínas, nenhuma apresentou redução de
expressão, 3 não foram detectadas e 10 não sofreram alteração (Tabela 2).
Enquanto isto, ao ser exposta à fonte luminosa, foi observada a elevação da
expressão em 7 proteínas, 5 apresentaram diminuição, 3 não foram detectadas e
10 estavam com expressão semelhante ao controle. Aquelas que tiveram
aumento de expressão estão relacionadas, principalmente, com a resposta ao
estresse produzida pela riboflavina, mesmo sem ser irradiada, como a chaperona
Hsp60 e peroxirredoxinas, e também estão envolvidas com a regulação da
apoptose, como a nucleolina (Figura 11B), além daquelas que tem como papel
Figura 10: Diagramas contendo o número de proteínas identificadas em cada linhagem tratada ede acordo com as condições de tratamento, sendo: A) riboflavina não-fotossensiblizada e B)riboflavina fotossensibilizada.
B)A)
42
fundamental a reorganização da estrutura celular e transporte intracelular, mas
que podem estar relacionadas com o controle da apoptose, como a cofilina
(Figura 11E).
Em CS1AN, cujas células são deficientes na proteína CSB, em ambas as
condições de tratamento e em relação às outras duas linhagens, foi observado um
maior número de proteínas com diminuição de expressão. Um exemplo disto é a
chaperona Hsp60 que apresenta uma menor expressão na linhagem CS1AN,
enquanto que, nas demais, sofreu aumento de expressão. Na condição sem
exposição à luz, somente 3 proteínas apresentaram uma expressão maior em
relação ao controle, entre elas estão a superóxido dismutase, anexina e a Rad23.
Além disto, 7 não foram detectadas e 8 não variaram sua expressão. Ao ser
irradiada, os números permaneceram bem semelhantes, sendo 8 não detectadas,
7 sem variação, 3 com aumento, entre elas a transgelina (Figura 11D), que está
envolvida com a indução da apoptose e 7 com redução de expressão.
No que diz respeito à linhagem XP4PA, no tratamento sem ser irradiada, foi
observado o aumento de expressão de 12 proteínas, entre elas nucleolina e
Hsp60, 6 proteínas não foram detectadas, redução de 3 proteínas, sendo duas
delas peroxirredoxina e tiorredoxina, e 4 proteínas não sofreram alteração de
expressão. Já na condição de riboflavina fotossensibilizada, houve elevação da
expressão de 13 proteínas, 2 sofreram redução, 6 não-detectadas, e 4 sem
alterações. Além disto, nesta linhagem foi observado um aspecto importante, que
foi a detecção da expressão de proibitina (Figura 11F) que não ocorreu nas outras
linhagens.
43
Nome NCBI (número deacesso)
Massa(kDa)/pI
Função Riboflavina não-fotossensibilizada
Riboflavinafotossensibilizada
MRC5 CS1AN XP4PA MRC5 CS1AN XP4PA
Chaperonas e resposta ao estresse1 60 kDa chaperona mitocondrial
(HSPD1)NP_955472.1 61,1/5,70 Propicia a manutenção de peptídeos sob
condições de estresse+ - + + - +
2 70 kDa chaperona (HSPA5) NP_005338.1 72,4/5.06 Facilita a formação de complexos multiméricose possui atividade antiapoptótica
+ nd + - nd +
3 Fosfoproteína induzida porestresse 1 (STIP1)
NP_006810.1 58,8/6.40 Media a associação de HSC70 e HSP90 + = + + nd +
4 Peptidil-prolil cis-trans isomerase A(PPIA) (Ciclofilina A)
NP_066953.1 18,2/7.68 Acelera o modelamento de proteínas + - + = - +
5 Peroxirredoxina -1 (PRDX1) NP_001189360.1 22,3/8.27 Redução de peróxido de hidrogênio ealquilperóxidos
+ - = + - =
6 Proteína cognata da chaperona71kDa (HSPA8)
NP_006588.1 71,0/5,37 Pode inibir HSC70 por competição = = = = = =
7 Proteína dissulfeto-isomerase(P4HB)
NP_000909.2 57,1/5,98 Cataliza o rearranjo das pontes dissulfeto dasproteínas
= - + - - +
8 Superóxido dismutase [Cu-Zn](SOD1)
NP_000445.1 16,1/5,7 Cataliza a dismutação do superóxido = + nd = = nd
9 Tiorredoxina (TXN) NP_003320.2 12,0/4.82 Facilita a redução de outras proteínas = - - = - -
Componentes do citoesqueleto10 Actina (ACTG1) NP_001186883.1 42,0/5.29 Importante para motilidade celular + - + + - +11 Cofilina -1 (CFL1) NP_005498.1 18,7/8.22 Regula montagem e desmontagem dos
filamentos de actina+ nd + + nd +
12 Estatimina (STMN1) NP_981944.1 17,2/5,76 Promove montagem e desmontagem demicrotúbulos
= = - + = -
13 Transgelina -2 (TAGLN2) NP_003555.1 22,5/8.41 Organização do citoesqueleto e atua naregulação da apoptose juntamente com p53
= = = - + nd
14 Vimentina (VIM) NP_003371.2 53,6/5.06 Membro da família dos filamentosintermediários
= - + = - +
Tabela 2: Proteínas identificadas por espectrometria de massas nas três linhagens tratadas com riboflavina.
44
Legenda: Os símbolos representam: (+) aumento de expressão, (-) diminuição de expressão, (=) expressão inalterada e (nd) não-detectação.
Regulação, sinalização e tradução15 40S proteína ribossomal (RPSA) NP_001012321.132,9/4.79 Subunidade ribossomal = = = = = =16 Alfa-enolase (ENO1) NP_001419.1 47,4/7.01 Enzima multifuncional + nd nd - nd nd17 Anexina A1 (ANXA1) NP_000691.1 39,9/6,57 Regula a exocitose nd + nd nd + nd18 Calreticulina (CALR3) NP_659483.2 48,2/4.29 Previne a exportação de proteínas para o
Complexo de Golgi+ nd + - nd +
19 Fator de elongação 1-beta(EEF1B2)
NP_001032752.1 24,9/4,5 Influencia na fidelidade e nas taxas detradução
+ = + + = +
20 Galectina -1 (LGALS1) NP_002296.1 15,0/5.34 Regula proliferação e diferenciação celular + = - = = =
21 Nucleolina (NCL) NP_005372.2 76,6/4.60 Atua na transcrição de pré-rRNA e montagemde ribossomos e possui atividadeantiapoptótica
+ nd + nd nd +
22 Proibitina (PHB) NP_002625.1 29,8/5,57 Inibe a síntese de DNA, regula a apoptose eparticipa da sinalização celular
nd nd + nd nd +
23 Reticulocalbina-1 (RCN) NP_002892.1 38,8/4.86 Regula atividades dependentes de cálcio noRE
= nd nd = nd nd
24 Subunidade regulatória dafosfatase - Serina/treonina 2A 65kDa (PR65A)
NP_055040.2 66,0/5.00 Requerida para segregação cromossômica elocalização centromérica
= = nd = = nd
Reparo de DNA25 Proteína de reparo RAD23
(RAD23B)NP_002865.1 43,2/4,79 Atua como componente do complexo XPC nd + nd = + +
45
A) B)
D)
E) F)
Figura 11: Proteínas envolvidas com a regulação da apoptose nas três linhagens tratadas comriboflavina. RF-nf: Riboflavina não-fotossensibilizada; RF-f: Riboflavina fotossensibilizada.
C)
46
5.3. Interatomas
A partir da obtenção das redes de interações de cada um dos grupos
celulares, observou-se que na linhagem MRC5 ocorreu uma resposta celular
bastante integrada em ambas as condições de tratamento (Figuras 12 e 13). A
grande maioria das proteínas identificadas, com exceção de calreticulina (CALR3)
e reticulocalbina (RCN), na condição de riboflavina não-fotossensibilizada,
interage com, pelo menos, uma outra proteína, podendo haver conexões com
diversas, como é o caso da cofilina-1 (CFL1) e da alfa-enolase (ENO1).
Nas demais linhagens, CS1AN e XP4PA, na condição sem exposição à luz,
estabeleceu-se também um grande número de interações entre as proteínas, com
a não ocorrência de algumas ligações devido a ausência de proteínas, mas, ainda
assim, com uma resposta, relativamente, coordenada.
É importante observar também que o complexo regulatório formado por
subunidades de fosfatases está presente em quatro dos seis interatomas gerados,
podendo estar conectado ou não a rede principal. Este se liga a rede central,
relacionando-se com alfa-enolase na linhagem MRC5, provavelmente, está
envolvido com as diferentes respostas das células em questão.
Entretanto, a rede de interações mais interessante, dentre as seis geradas,
foi a da linhagem CS1AN, no tratamento com a riboflavina fotossensibilizada.
Nesta visualizou-se a perda da maioria das conexões, devido à ausência de
diversas proteínas relacionadas com a resposta ao estresse oxidativo, o que,
possivelmente, ilustra e justifica, mais uma vez, a sensibilidade deste tipo celular
em relação às outras duas linhagens.
Para cada interatoma gerado, o programa STITCH 2.0 agregou uma série
de outras proteínas, denominadas de parceiras previstas, que estabelecem
conexões com as proteínas identificadas. As 10 proteínas listadas na tabela 2,
também estão envolvidas em diversas vias na dinâmica celular, como a
subunidade 4 do proteossoma 26S (PSMD4) que atua no direcionamento de
moléculas marcadas para degradação, a qual interage diretamente com RAD23; a
nucleofosmina que apresenta um papel importante na regulação do ciclo celular,
XPC, entre outras. O aparecimento delas auxiliaram no entendimento da
47
participação das demais proteínas na resposta ao estresse oxidativo gerado pela
riboflavina.
48
A)
B)
C)
Figura 12: Interatomas das proteínas identificadas por espectrometria de massas nas três linhagens submetidas ao tratamento semfotossensibilização da riboflavina, gerados pelo programa STITCH 2.0 A) MRC5, B)CS1AN e C)XP4A.
49
A)
B)
C)
Figura 13: Interatomas gerados pelo programa STITCH 2.0 com as proteínas identificadas por espectrometria de massas nas três linhagenssubmetidas ao tratamento com fotossensibilização da riboflavina. A) MRC5, B)CS1AN e C)XP4PA.
50
Nome Função Interage com
10 kDa chaperona mitocondrial (HSPE1) Participa do enovelamento de proteínas e translocação de proteínas
para as organelas.
PHB, TXN,HSPA8, HSPD1, PRDX1,
LGALS1
Isoforma da proteína fosfatase 2A Serina/treonina
subunidade catalítica alfa (PPP2CA)
Modula a atividade de algumas quinases B56G, PR65A
Proteína quinase (MAP3K5) Componente de uma cascata de transdução de sinal. SOD1, HSPA5, TXN
Proteína de reparo de DNA - XPC (XPC) Envolvida na via de reparo por excisão de nucleotídeos do genoma
global (GG-NER), atuando na etapa de detecção e reconhecimento do
dano ao DNA.
RAD23B
Isoforma da proteína fosfatase 2A Serina/treonina
subunidade regulatória gama (B56G)
Está envolvida no controle negativo do crescimento e divisão celular. PR65A, PPP2CA
Chaperona da família BAG 1
(BAG1)
Inibe a atividade da chaperona HSP70/HSC70, promovendo
aliberação de substrato, além de apresentar atividade anti-apoptótica.
HSPA8, STIP1
Fator de elongação 1-gama (EF1G) Desempenha um papel no processo de consolidação do complexo de
outros componentes celulares.
RTP, STMN1, EEF1B2
Nucleofosmina (B23) Envolvida em diversos processos celulares como biogênese do
ribossomo, a duplicação do centrossoma, montagem de histona,
proliferação celular e regulação dos supressores tumorais p53/TP53.
NCL, ENO, STMN1
Precursor de basigin (OK) Estimula os fibroblastos adjacentes a produzir metaloproteinases de
matriz (MMP).
PPIA
Proteossoma 26S subunidade 4 (PSMD4) Reconhece moléculas marcadas para degradação. RAD23B
Tabela 3: Proteínas identificadas pelo STITCH 2.0 que estabelecem interação com as proteínas identificadas porespectrometria de massas e estão ligadas a estresse oxidativo e reparo de DNA.
51
6. Discussão
Diversos estudos têm demonstrado a participação de enzimas de outras
vias de reparo, como no caso da NER, no reparo de danos ocasionados por
estresse oxidativo, como por exemplo, a indução da PARP-1 em células tratadas
com riboflavina (ZANIOLO et al., 2010) e a proteína CSB atuando em uma rota
importante na regulação do BER mitocondrial (AAMANN et al., 2010). Além disto,
também tem sido vista a participação de CSB no reparo de lesões oxidativas
como 8-oxodG (SUNESEN et al., 2002; OSTEROD et al., 2002), 8-oxodA (TUO et
al., 2002) e FapyG e FapyA (MUFTUOGLU et al., 2009) e XPC envolvida no
reparo de 8-oxodA e 8-oxodG atuando como um co-fator de OGG1 (D’ERRICO et
al., 2006).
Baseando-se nos dados de viabilidade celular com as linhagens de
fibroblasto humano proficiente (MRC5) e deficientes (CS1AN, XP12RO e XP4PA)
no sistema de reparo NER obtidos por Melo (2010), observou-se que, as
linhagens deficientes em CSB ou XPA (CS1AN e XP12RO, respectivamente) são
mais sensíveis do que a linhagem proficiente. Em contraste , a linhagem XP4PA,
que é deficiente na enzima XPC, mostra-se resistente ao tratamento com
riboflavina.
Na linhagem MRC5, proficiente em reparo, dentre as proteínas
identificadas, em ambas as condições de tratamento, observou-se um aumento
da expressão de chaperonas HSP70, HSP60, calreticulina e tiorredoxina, entre
outras. Respostas ao estresse, em geral, são caracterizadas por módulos
conservados de sinalização interligados. Análises proteômicas identificaram um
núcleo mínimo de conservação da resposta ao estresse celular, apresentando um
sensor chave e rotas de sinalização para oxidorredutases e proteínas redox, que
se integram com a expressão de enzimas relacionadas a danos ao DNA e sua
reparação, chaperonas, proteínas de degradação, metabolismo de ácidos graxos
e de lipídios e metabolismo energético. Desta forma, diferentes tipos de estresse
(por exemplo, hipóxia, infecção viral, e privação de aminoácidos) convergem para
algumas vias comuns promovendo respostas gerais, como a adaptação redox,
alterações no metabolismo lipídico e de carboidratos, parada na tradução do
52
mRNA, inibição da síntese de proteínas, e aumento da degradação de proteínas
(KULTZ, 2005).
A linhagem deficiente em CSB, por sua vez, apresentou, de uma maneira
geral, um maior número de proteínas com expressão reduzida, corroborando com
este resultado, análises por microarrays da expressão gênica de uma linhagem
proficiente e duas linhagens deficientes em CSB expostas a estresse oxidativo
induzido por H2O2 demonstraram um padrão de redução ou indução tardia de um
grupo específico de genes envolvidos com a reciclagem de proteínas, regulação
do ciclo celular e transdução de sinal, sugerindo que, provavelmente, os
mecanismos relacionados com a deficiência de reparo e o fenótipo de
envelhecimento precoce observados em indivíduos CSB incluem a redução de
expressão de diversos genes (KING et al, 2003).
Em estudo recente, foi constatada uma regulação recíproca de CSB e p53
na interação com a cromatina. Observou-se que em condições celulares normais,
nos quais os níveis de p53 são mais baixos, a presença de CSB interfere na
atuação de p53. Por outro lado, sob condições de estresse, os altos níveis de p53
independem da presença de CSB e acarretam na diminuição da interação de CSB
com a cromatina, devido ao “seqüestro” da extremidade de reconhecimento do
dano, que se encontra na extremidade C-terminal que é a mesma que interage
com p53, entretanto a extremidade responsável pelo reconhecimento do dano
permanece livre, permitindo o papel de reparo de CSB. Desta forma, sugere-se
que a ausência de CSB pode influenciar na atividade pró-apoptótica de p53,
devido ao acúmulo de danos e a parada da transcrição (LAKE et al., 2011). Além
disto, devido a sensibilidade destas células ao estresse oxidativo constatada,
mais uma vez, pelo decréscimo de viabilidade após ser exposta ao tratamento
com riboflavina (MELO, 2010), o acúmulo de danos está induzindo a morte celular
e, simultaneamente, a degradação de proteínas nestas células (GOLDBERG,
2003). A ocorrência desta etapa da apoptose, provavelmente, justifica o aumento
de expressão de RAD23 devido ao envolvimento desta proteínas no
direcionamento de moléculas marcadas para degradação, por esta possuir um
domínio (UBA) que reconhece proteínas ubiquitiniladas e outro domínio (UBL) que
interage com a subunidade do proteossoma 26S (HIYAMA et al, 1999; revisado
por: HARTMANN-PETERSEN E GORDON, 2004; DANTUMA et al., 2009; WADE
53
e AUBLE, 2010). Esta elevação também foi observada na linhagem XP4PA, na
condição de tratamento na qual houve fotossensibilização da riboflavina, mesmo
na ausência de XPC, o que já foi observado em outros estudos (SUGASAWA et
al, 1997; MASUTANI et al, 1997). No caso da linhagem deficiente em XPC,
aparentemente, não está ocorrendo apoptose, uma vez que, não houve redução
na viabilidade desta célula ao ser tratada com riboflavina, então o aumento da
expressão de RAD23 deve estar relacionado com a degradação de proteínas
oxidadas.
No que diz respeito à linhagem XP4PA, apesar de sua deficiência em XPC,
é possível sugerir uma correlação das proteínas identificadas com a resistência
apresentada por estas células. Analisando-se os proteomas obtidos, observa-se a
elevação da expressão de três proteínas, relacionadas com o bloqueio da
apoptose, somente nesta linhagem na condição de tratamento em que a
riboflavina foi fotossensibilizada, sendo proibitina, nucleolina e a proteína
dissulfeto-isomerase. Por outro lado, proteínas que apresentam uma função
principal, como a organização do citoesqueleto, no caso da transgelina, mas que,
recentemente, tem sido constatado seu envolvimento com a ativação da
apoptose, não foram detectadas nesta linhagem.
A proibitina (PHB) pertence a uma família de proteínas altamente
conservadas e expressas ubiquamente, conhecida como Band-7 ou família de
domínio da proibitina, funcionalmente, relacionadas a diversos processos, tais
como regulação da transcrição, proliferação celular, desenvolvimento e função
mitocondrial (MISHRA et al., 2005). Em condições normais, PHB é encontrada no
núcleo das células e na área perinuclear correspondente a mitocôndria (FUSARO
et al., 2003; ZHU et al., 2010), tendo sido identificada também circulante na
corrente sanguínea de camundongos injetados com células tumorais
(MENGWASSER et al., 2004). Em células eucarióticas, foi constatada a formação
de um complexo protéico de, aproximadamente, 1 mDa, localizado na membrana
interna da mitocôndria e constituído por duas subunidades, denominadas PHB1 e
PHB2. Este complexo atua na estabilização do genoma e participa da
morfogênese mitocondrial (NIJTMANS et al., 2000) e recentemente, tem sido alvo
de estudos, por provavelmente, atuar como um modulador que responde ao
estresse oxidativo (LEE et al., 2010).
54
A ausência da expressão de PHB1 impede a proliferação e
induz anoikis (perda de adesão da matriz extracelular) e apoptose em células de
hepatoma humano (SÁNCHEZ-QUILES et al., 2010). Além disto, foi demonstrado,
histologicamente, que PHB1 e PHB2 são superexpressas em uma variedade de
tumores, dentre os quais estão de mama, próstata, cólon, testículo e pele
(COATES et al., 2001; BACK et al., 2002). Estudos demonstraram também que a
redução de PHB aumenta a sensibilidade das células cancerosas à apoptose
(CHOWDHURY et al., 2007; GREGORY-BASS et al., 2008). Liu e colaboradores
(2004), primeiramente, identificaram aumento na expressão de PHB em
mitocôndrias de cardiomiócitos sob situação de estresse (LIU et al., 2004). Em
outro estudo, no qual utilizaram o mesmo tipo celular submetido a peróxido de
hidrogênio e transfectados para superexpressar esta proteína, foi comprovado
que PHB protegeu a mitocôndria dos danos induzidos pelo estresse oxidativo,
suprimindo a via apoptótica mediada pela mitocôndria. Esta supressão ocorreu
por meio da elevação da síntese de ATP, estabilização do potencial da membrana
mitocondrial (MMP) e inibição da liberação de citocromo c da mitocôndria (LIU et
al., 2009). Em células β do pâncreas tratadas com etanol, o nível de proteína
PHB aumentou e foi, predominantemente, encontrada na mitocôndria (KIM et al.,
2009). Este achado é consistente com os relatos em células de câncer de mama
mostrando que PHB é exportada do núcleo e direcionada para mitocôndria em
situações de apoptose (FUSARO et al., 2003; ZHU et al., 2010).
Em relação aos mecanismos apoptóticos envolvendo a cascata de
caspases, foi constatado que uma deficiência de PHB1 induz apoptose em células
PLC/PRF/5, tendo sido observado que o mecanismo é dependente do
processamento de PARP e ativação das caspases 7 e 12 e independente de
caspase 3 e 9 (SÁNCHEZ-QUILES et al, 2010). Por outro lado, o aumento da
expressão da proibitina também foi relacionada com regulação da cascata de
apoptose, por meio da ativação da transcrição de p53, induzindo a expressão da
caspase-7 (LAH, et al., 2011; RASTOGI, et al., 2006).
As diferentes respostas observadas, tanto em células normais e
transformadas quanto em diferentes tipos de tumores, sugere um duplo efeito
desta proteína no controle das atividades celulares em que está envolvida, como
é também o caso de outros oncogenes, fatores de crescimento e proteínas
55
reguladoras do ciclo celular e pode ser distinta em células transformadas e
quiescente. A translocação de PHB1 do núcleo para as mitocôndrias nas
linhagens de células expostas a estímulos pró-apoptóticos foi relacionada com
sua capacidade de prevenir a morte celular (GREGORY-BASS et al., 2008). No
entanto, o mecanismo envolvido na translocação e proteção contra estresse
oxidativo continua por ser determinado. É possível que modificações pós-
traducionais de PHB estejam envolvidas na translocação entre o núcleo e as
mitocôndrias, ou em sua função protetora contra o estresse oxidativo. Diferentes
modificações pós-traducionais podem recrutar diferentes parceiros de interação,
gerando diferentes respostas que podem ser, aparentemente, contraditórios,
como as funções antiproliferativa e proliferativa do PHB relatadas anteriormente
(MISHRA et al., 2010). Na linhagem XP4PA, provavelmente está ocorrendo algum
tipo de regulação ou modificação pós-traducional que promove a atividade anti-
apoptótica da proibitina.
A nucleolina é uma das principais fosfoproteínas nucleolares que
pertence a uma grande família de proteínas de ligação ao RNA, atua em
mecanismos como tradução do rDNA, maturação de rRNA e transporte do núcleo
para o citoplasma (GINISTY et al., 1998). Além destes, recentemente, tem sido
relacionada com a proliferação celular e diversos estudos tem indicado
nucleolina/C23 como um dos componentes-chave na regulação dos mecanismos
de apoptose (OTAKE et al., 2005; PENG et al., 2008; CHRISTIAN et al., 2009).
Em trabalho empregando siRNA para reprimir a expressão desta proteína
em células HeLa e em cultura de fibroblastos humanos primários, observou-se
uma diminuição significativa nos níveis de nucleolina (redução de 2 vezes, dois
dias depois da transfecção), as células tiveram sua taxa de proliferação reduzida
e um número significativo de células entrou apoptose (BOUVET et al., 2007).
Além disto, foi constatado em células endoteliais tratadas com H2O2 que a
superexpressão de nucleolina acarretou em um decréscimo de 75% na taxa de
apoptose destas células, assim como, a diminuição de 40% da atividade da
caspase-3 e, ao mesmo tempo, a redução na expressão do fator pró-apoptótico
Bax, enquanto que, sua deficiência ocasionou uma expressão aumentada do
gene deste fator (DENG et al, 2010). Ainda, foi observado em cardiomiócitos
expostos a estresse oxidativo induzido por H2O2, que a nucleolina interage com
56
HSP70, regulando a atividade antiapoptótica desta chaperona e, novamente,
influenciando na atividade da caspase-3 (XIAO et al, 2010).
Entretanto, apesar da nucleolina ser fortemente relacionada com a
apoptose pelo fato de sua clivagem estar, intrinsecamente, ligada a ativação
deste processo, não se sabe ao certo, qual o mecanismo de atuação desta
proteína. Takagi e colaboradores (2005) demonstrataram a participação da
nucleolina no controle da atividade de p53 após dano ao DNA, por meio de sua
ligação à região 5’ do mRNA desta molécula provocando anelamento, e,
consequentemente, impedindo a tradução da mesma (TAKAGI et al., 2005).
Outros trabalhos tem sugerido, que a nucleolina estaria atuando na estabilização
do mRNA de Bcl-2, proteína que suprime o início do processo de morte celular
(CHAO E KORSMEYER, 1998), uma vez que, foi observado que a redução de
nucleolina provocou a diminuição de sua expressão, sendo a estabilização do Bcl-
2 um provável mecanismo através do qual a nucleolina inibe a apoptose (OTAKE
et al., 2005; BOWDEN et al, 2008).
A nucleolina, assim como a proibitina, também está desempenhando um
papel de proteção nas células deficientes em XPC, atenuando a apoptose. O
aumento de expressão de nucleolina associado a uma elevação de HSP70, na
linhagem MRC5, na ausência de irradiação e, o decréscimo de ambas após a
exposição a luz, pode ser explicado por um possível recrutamento destas
proteínas para a manutenção da homeostase intracelular.
A proteína dissulfeto-isomerase (PDI ou P4HB) é uma proteína
multifuncional que cataliza a formação, a clivagem e o rearranjo das pontes
dissulfeto, facilitando o dobramento das proteínas, atuando como uma chaperona
e foi, originariamente, relatada como sendo limitada ao retículo endoplasmático
(NOIVA, 1999). Em células MCF-7 (células de câncer de mama) nocauteadas
para PDI, foi constatada a indução de apoptose por meio da liberação de
citocromo c da mitocôndria, e ativação das caspase-9, caspase-6 e caspase-7 e
PARP (KOTAKE et al., 2011). Também foi observado que PDI atua protegendo
cardiomiócitos submetidos a hipóxia tanto in vivo quanto in vitro, por meio da
redução da taxa de apoptose (BOREN et al., 2009). A função enzimática redox de
PDI, como a catálise de pontes dissulfeto, pode ser responsável pelos efeitos
observados de proteção. Como formação da ligação dissulfeto requer oxigênio e é
57
comprometida por espécies reativas de oxigênio, os problemas de enovelamento
de proteínas do RE pode ocorrer devido ao suprimento reduzido de oxigênio
durante a oclusão coronária e do estresse oxidativo (NI et al., 2007).
Dentre as proteínas que não foram detectadas na linhagem XP4PA devido
a sua reduzida expressão, tem-se a transgelina, também chamada de SM22a, é
uma proteína de ligação à actina, envolvida na diferenciação celular e na
organização do citoesqueleto, tendo sido originalmente descrita como,
predominantemente, expressa em células musculares lisas (LAWSON et al.,
1997). Foi observado que a expressão de transgelina é diminuída em alguns tipos
de células de cânceres, como de mama, de cólon e de próstata (revisado por
ASSINDER et al., 2010). Em outro estudo, utilizando-se células de câncer
colorretal, também foi constatada a supressão da expressão desta proteína,
sendo sugerido que esta foi ocasionada pela metilação do promotor do seu gene,
mecanismo observado em outros supressores de tumor como BRCA1, Rb ou
também poderia estar sendo suprimida por meio de alguma regulação pós-
transcricional ainda desconhecida (ZHAO et al., 2009). Por outro lado, em células
de câncer de próstata transformadas para superexpressar transgelina, ocorreu um
aumento da translocação de p53 do núcleo para o citoplasma, ocasionando um
aumento da p53 citoplasmática, juntamente, com um aumento de expressão de
Bax e redução de Bcl-2, conseqüentemente, induzindo apoptose (CHEN et al.,
2010).
Outra proteína não detectada em XP4PA, foi a anexina 1 (ANXA1), que,
estruturalmente, pertence a uma família de proteínas ligadoras de fosfolipídeos e
cálcio, expressas ubiquamente e presentes em diversos organismos, desde
mamíferos até fungo e plantas (revisado por PARENTE E SOLITO, 2004). Estas
proteínas foram inicialmente descritas como potentes inibidores da atividade da
fosfolipase A2 (PLA2), cuja síntese é controlada por glicocorticóides hormônios
sintéticos. Mais tarde, ANXA1 foi implicada em vários processos, como na
regulação do tráfego de membrana e exocitose, em interações do citoesqueleto,
na transdução do sinal mitogênico, proliferação celular e diferenciação, bem como
apoptose (ANTONICELLI et al., 2003). O primeiro indício do envolvimento de
ANXA1 na apoptose foi relatado em um estudo que mostrou o aumento de
expressão de ANXA1 em células alveolares de ductos mamários em apoptose na
58
regressão pós-lactacional (MCKANNA, 1995). Foi visto, em seguida, que ANXA1
exógena facilitou a apoptose induzida por H2O2 em timócitos de rato (SAKAMOTO
et al., 1996). Outros estudos constataram que a superexpressão de ANXA1 em
células U-937 e células epiteliais bronco-alveolares induz apoptose associada a
ativação de caspase-3 (ANTONICELLI et al., 2003; SOLITO e PERRETTI et al.,
2003). Desta maneira, a não-detecção desta proteína na linhagem deficiente em
XPC, possivelmente, pode estar relacionada com uma regulação negativa deste
processo de morte celular.
Um resultado interessante, foi o aumento de expressão da cofilina (CFL1)
nas linhagens MRC5 e XP4PA, uma vez que, diversos estudos vem
demonstrando o papel de sua forma oxidada na ativação da apoptose. A cofilina é
uma das principais proteínas responsáveis pela motilidade celular, sendo membro
da família Cofilina/ADF (Actin Despolimeryzing Factor/Fator de Despolimerização
da Actina) que regula a dinâmica de actina, aumentando a taxa de
despolimerização de actina e filamentos de actina (CHEN et al., 2000), e é
regulada por fatores como pH, fosforilação, ligação de fosfoinositídeos e
compartimentalização subcelular (CONDEELLIS et al., 2004). Chua e
colaboradores (2003) demonstraram, por meio do tratamento de células HL-60
com estaurosporina, um inibidor de quinase utilizado para induzir apoptose, que a
cofilina é translocada para a mitocôndria no início do processo de apoptose e que
sua ausência bloqueia a liberação de citocromo c (LI et al., 2003). Em 2009, Klamt
e colaboradores constataram que a cofilina atua como mediadora da apoptose em
resposta ao estresse oxidativo, sendo uma nova atividade regulatória descrita
para esta proteina, posteriomente, o mesmo grupo descreveu como ocorre esta
mediação (KLAMT et al., 2009). A cofilina em sua forma desfosforilada sofre
oxidação em seus resíduos de cisteína, é translocada para a mitocôndria onde
estimula a abertura dos PTP’s (Poros de Transição de Permeabilidade),
promovendo a liberação de citocromo c e, consequentemente, a ativação da
apoptose (Figura 13) (SHACTER et al., 2010; CASTRO et al., 2010).
59
Provavelmente, esta proteína não estão sendo alvo de oxidação, mesmo estando
com uma expressão elevada, por intermédio da manutenção de sua forma
ativada, fosforilada, ou por algum outro mecanismo que necessita ser elucidado.
A partir dos resultados e das funções de cada uma destas proteínas
descritas acima, sugere-se que a presença de transgelina na linhagem CS1AN
pode estar envolvida com a indução de apoptose nestas células, sendo mais uma
via de ativação deste processo, além da via principal induzida pelo acúmulo dos
danos oxidativos no DNA, tanto mitocondrial quanto nuclear, devido à participação
de CSB no reparo de lesões oxidativas (AAMANN et al., 2010; OSTEROD et al.,
2002).
Assim como, a não-detecção de probibitina, nucleolina e PDI ocasionada,
provavelmente, por uma menor ou, até mesmo, ausência de expressão nestas
células, esteja contribuindo para sua maior sensibilidade ao estresse oxidativo.
Figura 14: Um modelo resumindo a forma como a oxidação de cofilina induz apoptose. Após aexposição a oxidantes, a cofilina oxidada e desfosforilada perde sua afinidade com a actina ese transloca para a mitocôndria onde induz, por um mecanismo desconhecido, a abertura doPTP. Pequenos solutos e água a entram na matriz mitocondrial, levando à permeabilizaçãomitocondrial e liberação de fatores pró-apoptóticos, como citocromo c. No citosol, o citocromo cinterage com outras moléculas para gerar o apoptossomo, uma plataforma molecular paraativação da caspase-9. A maturação catalítica de caspase-9 ativa caspase-3 e da morte celularpor apoptose. (Retirada e modificada de SHACTER et al., 2010).
Legenda: PTP, Poro de Transição dePermeabilidade; MME, MembranaMitocondrial Externa; EIM, EspaçoIntermembrana; MMI MembranaMitocondrial Interna; VDAC, CanalAniônico Voltagem-Dependente; Cyclo D,ciclofilina D; ANT, Adenina NucleotídeoTranslocase.
Actina-F
Actina-GDissociação da cofilina
Cofilina oxidadae desfosforilada
Translocaçãopara mitocôndria
- Abertura de PTP- Permeabilizaçãomitocondrial
MMEEIMMMIMatriz
MMEEIMMMIMatriz
Liberação do citocrompo cAtivação do apoptossomo
Cofilina (ativa)
Quinases Fosfatases
Fosfo-cofilina(inativa)
Oxidantes
ATP-actina
ADP-actina
Cofilina fosforilada
Cofilina desfosforilada
Cofilina desfosforilada e oxidada
Citocromo c
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Por outro lado, na linhagem XP4PA, parece estar ocorrendo um
mecanismo de “fuga” da apoptose, através do qual proteínas envolvidas com a
ativação deste processo estão, aparentemente, sendo silenciadas, enquanto, que
as relacionadas com a proteção celular e bloqueio de apoptose se encontram com
sua expressão aumentada. O modelo a seguir sugere um mecanismo de atuação,
das proteinas discutidas anteriormente, estabelecendo conexões com a via
íntrinseca e extrínseca da apoptose e seus constituíntes básicos (Figura 14).
Dependendo da linhagem celular e do padrão de expressão destas proteínas, o
modelo pode ser anti-apoptótico, como no caso da linhagem XP4PA ou pró-
apoptótico, no que diz respeito a CS1AN.
Figura 15: Modelo esquemático sugerindo a atuação das proteínas envolvidas com oprocesso de apoptose. As linhas tracejadas representam as conexões entre estas proteínas eos participantes da via intrínseca da apoptose. Em cinza escuro estão as proteínasrelacionadas com o bloqueio da apoptose e em preto as envolvidas com a ativação desteprocesso.
61
7. Conclusões
A partir dos resultados obtidos, pode-se concluir que a linhagem MRC5
apresenta elevação de expressão na maioria das proteínas envolvidas com a
defesa celular, sendo uma resposta esperada para uma linhagem celular normal
submetida a estresse. Já a linhagem CS1AN, ao contrário da linhagem anterior,
demonstrou uma resposta desarticulada, não sendo possível estabelecer muitas
interações entre as proteínas identificadas, podendo ser uma explicação para sua
sensibilidade a tratamentos com agentes oxidantes e aumento da morte celular
provavelmente por aumento das vias pró-apoptose. A linhagem XP4PA, sob
estresse oxidativo apresentou maior expressão de proteínas bloqueadoras da
apoptose, assim como, houve a inibição ou redução da expressão de outras
envolvidas com a ativação deste processo de morte celular, sugerindo um
mecanismo de “fuga” da apoptose nesta linhagem deficiente em XPC, o que pode
ajudar a explicar a alta susceptibilidade de pacientes XPC a desenvolvimento de
cânceres, além de contribuir para a compreensão dos mecanismos de atuação de
NER em danos oxidativos.
62
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