MARIANA MOLINA

Abordagem para anlise protemica de neurnios contendo neuromelanina na substncia negra, isolados

por microdisseco a laser

Dissertao apresentada Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo para obteno do ttulo de Mestre em Cincias

Programa de Fisiopatologia Experimental Orientador: Prof. Dr. Lea Tenenholz Grinberg

So Paulo

2015

Dados Internacionais de Catalogao na Publicao (CIP)

Preparada pela Biblioteca da

Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo

reproduo autorizada pelo autor

Molina, Mariana Abordagem para anlise protemica de neurnios contendo neuromelanina na substncia negra, isolados por microdisseco a laser / Mariana Molina. -- So

Paulo, 2015.

Dissertao(mestrado)--Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo. Programa de Fisiopatologia Experimental.

Orientadora: Lea Tenenholz Grinberg.

Descritores: 1.Neurnios 2.Substncia negra 3.Neuromelanina 4.Microdisseco e captura a laser 5.Protemica

USP/FM/DBD-412/15

NORMALIZAO ADOTADA

Esta dissertao est de acordo com as seguintes normas, em vigor no

momento desta publicao:

Referncias: adaptado de International Committee of Medical Journals Editors

(Vancouver).

Universidade de So Paulo. Faculdade de Medicina. Diviso de Biblioteca e

Documentao. Guia de apresentao de dissertaes, teses e monografias.

Elaborado por Anneliese Carneiro da Cunha, Maria Julia de A. L. Freddi, Maria

F. Crestana, Marinalva de Souza Arago, Suely Campos Cardoso, Valria

Vilhena. 3a ed. So Paulo: Diviso de Biblioteca e Documentao; 2011.

Abreviaturas dos ttulos dos peridicos de acordo com List of Journals Indexed

in Index Medicus.

DEDICATRIA

As minhas avs

Fontes de inspirao. Sustentculos da minha vontade de persistir.

Aos meus pais

Quo difcil expressar a minha gratido. rdua a tarefa de exprimir em

palavras tudo o que fizeram e fazem por mim. Incansavelmente me apoiam e

so responsveis pela realizao de muito dos meus sonhos, para isso,

renunciaram aos prprios. Sinto-me no dever de agradecer-lhes

incessantemente.

A minha irm Danielle

Fao minhas, as palavras de Elton John e Bernie Taupin: How wonderful life is

while youre in the world.

Ao meu irmo Raphael

Quando eu crescer, eu quero ser como voc! Inspirao de trabalho, dedicao

e carinho.

Eu me sinto indefinivelmente grata e honrada por ter vocs.

AGRADECIMENTOS

minha orientadora, Prof. Dr. Lea Tenenholz Grinberg, exemplo de

profissional, de mulher e de pessoa. O meu profundo agradecimento pela

oportunidade e o privilgio que tive em ser sua orientanda que muito contribuiu

para o enriquecimento da minha formao acadmica e cientfica.

minha co-orientadora, Prof. Dr. Renata Elaine Paraizo Leite, por ter me

conduzido nos caminhos da cincia de forma brilhante, desde os tempos de

iniciao cientfica. Agradeo pela disponibilidade, estmulo constante e o

imprescindvel apoio na elaborao deste trabalho.

Meus agradecimentos, cordialidade e respeito aos professores, Dr. Wilson

Jacob Filho, Dr. Carlos Augusto Pasqualucci e Dr. Ricardo Nitrini pelo apoio,

por todos os auxlios e pela ampla colaborao com o Grupo de Estudos em

Envelhecimento Cerebral. Grandes fontes de inspirao.

Ao Prof. Dr. Helmut Heinsen por sua pacincia e disposio indefectvel em

ajudar e toda a sua colaborao com esse projeto.

Aos professores e coordenadores do Grupo de Estudos em Envelhecimento

Cerebral, Dr. Claudia Suemoto, Dr. Jos Marcelo Farfel, Dr. Renata Ferretti

Rebustini pela disponibilidade, ensinamentos e apoio cientfico.

Ana Tereza Di Lorenzo Alho, Camila Nascimento Mantelli, Luzia Lima,

Ktia Cristina Oliveira, mais do que colegas do Gerolab, amigas que

transmitiram, alm de contedos, sentimentos de amizade, solidariedade,

segurana e confiana. inestimvel percorrer o caminho da cincia ao lado

de vocs!

Roberta Diehl Rodriguez, pelo apoio irrestrito. A minha gratido e amizade.

querida Marta Crocci, pela prontido em ajudar, pelo apoio afetuoso e pela

amizade.

Ao Gustavo Ribeiro pela presteza e discrio.

Keila Maria pelo apoio, amizade e a preocupao.

Prof. Dr. Katrin Marcus, Dr. Caroline May, Dr. Stefan Helling, Sarah Plum,

Simone Kutschki, Jale Stoutjesdijk, Prabal Subedi, Janine Brunner, Katrin

Barlog e a todos do Centro de Protemica Mdica da Universidade de Bochum,

pela colaborao, por me receberem e por me ensinarem pacientemente tudo o

que sei sobre protemica. O meu mais sincero Vielen Dank.

Aos professores, Dr. Alexandre Valotta da Silva, Dr. Jackson Cioni Bittencourt e

Dr. Luiz Roberto Giorgetti de Britto pelo brilhantismo que conduziram a minha

banca de qualificao, com suas valiosas contribuies.

Ao Prof. Dr. Jarbas Arruda Bauer, por toda sua competncia e por partilhar

seus conhecimentos.

Ao Prof. Dr. Chin Jia Lin e Natlia Gomes Gonalves, sempre solcitos e

dispostos a ajudar.

Ao Eduardo Alho por seus valiosos ensinamentos durante a visita a

Universidade de Wrzburg.

Ao Andr Schwambach Vieira, ps doutorando da FCM da UNICAMP,

prestativo, abriu as portas do laboratrio de Gnetica Molecular para que eu

pudesse realizar as microdisseces no momento em que o microscpio da

FMUSP no estava disponvel.

Anna Carla Goldberg e ao Thiago Pinheiro Arrais Aloia e pela amabilidade

em dispor o seu laboratrio no Centro de Pesquisa Experimental no Instituto

Israelita de Ensino e Pesquisa Albert Einstein para que eu pudesse realizar as

microdisseces no momento em que ambos os microscpios da FMUSP e da

UNICAMP no estavam disponveis.

todos os membros e ex-membros do Grupo de Estudos em Envelhecimento

Cerebral. Pela dedicao admirvel, companheirismo e apoio. O trabalho de

toda equipe foi imprescindvel no desenvolvimento deste trabalho.

Aline Nishizawa, Daniela Souza Farias, Perola Branca, Fernanda Marinho

Campos, Karen Cristina por me receberem gentilmente no laboratrio de

patologia cardiovascular quando precisei realizar os cortes em criostato.

Dr. Ins Liguore Padro, que cedeu generosamente seu tempo para me

ensinar um pouco sobre histologia do sistema nervoso e as alteraes

vasculares.

Aos funcionrios do programa de ps-graduao em fisiopatologia

experimental pela ateno e disposio.

Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior pela

concesso da bolsa de mestrado.

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico pelo apoio

financeiro.

Aos funcionrios do Servio de Verificao de bitos da Capital pela

colaborao para com o Grupo de Estudos em Envelhecimento Cerebral.

Aos familiares doadores, solidrios mesmo em meio ao luto. Este trabalho

existe a partir deles e dever retornar para eles.

SUMRIO

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SMBOLOS

LISTA DE GRFICOS

LISTA DE FIGURAS

LISTA DE TABELAS

RESUMO

SUMMARY

1. INTRODUO ............................................................................................. 1 1.1 Envelhecimento populacional ................................................................ 2 1.2 Envelhecimento e a doena de Parkinson............................................. 5 1.3 Substncia Negra .................................................................................. 7 1.4 Microdisseco a laser e a protemica................................................ 13 2. OBJETIVOS ............................................................................................... 18 3. MATERIAIS E MTODOS ......................................................................... 20 3.1 Procedncia dos casos........................................................................ 21 3.2 Procedimentos do BEHGEEC ............................................................ .21 3.3 Critrios de seleo de casos para o presente estudo ...................... ..26 3.4 Estabelecimento do protocolo para a realizao da tcnica de microdisseco e captura a laser ..................................................................... 26 3.5 Otimizao do protocolo de preparao das amostras para espectrometria de massas ............................................................................... 32 3.6 Isolamento das amostras atravs da tcnica de microdisseco a laser.................... .............................................................................................. 34 4. RESULTADOS .......................................................................................... 36 4.1 Protocolo para a realizao da tcnica de MCL .................................. 37 4.2 Otimizao do protocolo de preparao das amostras para espectrometria de massas ............................................................................... 40 5. DISCUSSO .............................................................................................. 43 5.1 Plano anatmico ideal para a MCL da substncia negra..................... 45 5.2 Processo de congelamento para MCL................................................. 46 5.3 Espessura do corte para MCL ............................................................. 47 5.4 Colorao para MCL............................................................................ 48 5.5 Microdisseco e captura a laser ........................................................ 50 5.6 Preparao das amostras para espectrometria de massas ................. 52 6. CONCLUSES .......................................................................................... 55 7. CONSIDERAES FINAIS ....................................................................... 57 8. ANEXOS .................................................................................................... 60

Anexo A ............................................................................................................ 61 Anexo B ............................................. ................................................................62 Anexo C ........................................................................................................... 63 9. REFERNCIAS ............................................................................................ 78

LISTA DE ABREVIATURAS, SMBOLOS E SIGLAS

5-HT 5-hidroxitriptamina

ngstrm

l Microlitros

m Micrmetros

m2 Micrmetros quadrados

m Micrmetros cbicos

Ach Acetilcolina

ACN Acetonitrila

AF cido Frmico

BEHGEEC Banco de Encfalos Humanos do Grupo de Estudos em Envelhecimento Cerebral

CDR Questinrio para Avaliao Clnica da Demncia

CG Cromatografia Gasosa

CL Cromatografia Lquida

cm Centmetros

CPM Centro de Protemica Mdica

DA Doena de Alzheimer

DP Doena de Parkinson

ESI Electrospray Ionization

FMUSP Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo

GABA cido Gama-Aminobutrico

Glu Glutamato

GPe Globo Plido externo

GPi Globo Plido interno

HC Hospital das Clnicas

HCl cido Clordrico

HE Hematoxilina e Eosina

HPLC High Performance Liquide Chromatography

IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatstica

IT Ion Trap

LC-MS/MS Liquid Chromatography - Mass Spectrometry/Mass Spectrometry

MALDI Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization

MCL Microdisseco e Captura a Laser

mm Milmetro

Min Minuto

MS Mass Spectrometry

ms Milissegundos

m/z Massa/carga

NA Noradrenalina

ng Nanogramas

NINDS National Institute of Neurological Disorders and Stroke

NIH National Institutes of Health

NL Neuritos de Lewy

nm Nanmetros

ONU Organizao das Naes Unidas

pH Potencial Hidrognionico

pmol Picomol

RP Reversed Phase

sec Segundos

SIM Selected-Ion Monitoring

SVOC Servio de Verificao de bitos da Capital

SN Substncia Negra

SNpc Substncia Negra pars compacta

SNpd Substncia Negra pars diffusa

SNpr Substncia Negra pars reticulata

TA Temperatura Ambiente

TOF Time Of Flight

UPLC-TUV

Ultra Performance Liquid Chromatography - Tunable UV Detector

LISTA DE GRFICOS

Grfico 01 Projees da populao brasileira ............................................ 4

LISTA DE FIGURAS

Figura 01 Porcentagem da populao com 60 anos ou mais, estimada para 1950-2014 e projetado para 2050 ........................................................... 2

Figura 02 Populao de idosos estimada em 2014 e projetada para 2015 ................................................................................................................ 3

Figura 03 Fotografia da substncia negra ................................................... 6 Figura 04 Localizao da substncia negra ................................................ 7 Figura 05 Diagrama dos tipos neuronais na substncia negra .................... 8 Figura 06 Modelo esquemtico das conexes sinpticas dos neurnios da

substncia negra pars compacta ............................................................ 9 Figura 07 Representao do mesencfalo atravs de um plano de corte

horizontal ............................................................................................... 11 Figura 08 Regies enceflicas contendo clulas produtoras de

neuromelanina ...................................................................................... 12 Figura 09 Exemplo do sistema de HPCL acoplado ao espectrmetro de

massas e diagrama de espectrometria de massas em tandem ............ 16 Figura 10 Procedimento do corte do tronco enceflico para a

representao do mesencfalo. ............................................................ 27 Figura 11 Procedimento de corte no criostato ........................................... 29 Figura 12 Imagem representativa do sistema PALM MicroBeam .............. 30 Figura 13 Seleo da rea para realizar a MCL ........................................ 35 Figura 14 Diferena neuroanatmica dos neurnios da substncia negra

.............................................................................................................. 37 Figura 15 Comparao da otimizao do procedimento de congelamento

para MCL .............................................................................................. 38 Figura 16 Otimizao da espessura ideal para o isolamento de neurnios

da substncia negra .............................................................................. 39 Figura 17 Anlise por espectrometria de massas da substncia negra .... 42

LISTA DE TABELAS

Tabela 01 Regies amostradas pelo protocolo do BEHGEEC .................. 24

Tabela 02 reas imunocoradas e anticorpos rotineiramente utilizados no BEHGEEC ............................................................................................. 25

Tabela 03 Viso geral dos procedimentos de congelao ........................ 28

Tabela 04 Procedimento de colorao violeta de cresila .......................... 30

RESUMO

Molina M. Abordagem para anlise protemica de neurnios contendo neuromelanina na substncia negra, isolados por microdisseco a laser. [dissertao]. So Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de So Paulo; 2015. Atualmente observa-se que a proporo de pessoas com 60 anos ou mais est crescendo mais rpido do que a de outras faixas etrias. Um dos resultados desta transio epidemiolgica o aumento das doenas cujo fator de risco o envelhecimento, entre elas, a doena de Parkinson. Embora muitas regies exibam os sinais neuropatolgicos da doena de Parkinson, a degenerao dos neurnios, contendo neuromelanina, da substncia negra considerada como sendo uma caracterstica importante, representando o critrio cardinal para o diagnstico. No entanto, ainda no est claro por que certas regies do crebro, como a substncia negra, so vulnerveis em algumas doenas neurodegenerativas e alguns neurnios vizinhos, s vezes morfologicamente indistinguveis, permanecem preservados. Anlises moleculares de populaes de neurnios podem conduzir a uma melhor compreenso sobre a fisiologia dos mesmos, bem como os mecanismos envolvidos nos processos de doena. Na era ps genmica, realizar anlises protemicas so de grande interesse cientfico, pois permitem avanos no conhecimento dos processos biolgicos. A tcnica de microdisseco e captura a laser tem sido uma ferramenta importante e cada vez mais utilizada para aquisio de populaes puras de clulas a partir de seces histolgicas, evitando que reas no pertencentes ao tecido alvo sejam dissecadas. A unio destes mtodos pode contribuir de maneira relevante para o entendimento fisiopatolgico dos neurnios contendo neuromelanina da substncia negra. No entanto, para que a microdisseco e captura a laser e as anlises protemicas sejam eficazes, imprescindvel a aplicao de um protocolo bem estruturado. Dentro desse contexto, o presente trabalho tem como objetivo criar um protocolo de microdisseco a laser de neurnios contendo neuromelanina em indivduos cognitivamente normais, para subsequente anlise protemica. Os casos utilizados neste estudo so provenientes do Banco de Encfalos Humanos do Grupo de Estudos em Envelhecimento Cerebral. Para o desenvolvimento da nossa proposta, contamos com a colaborao do Centro de Protemica Mdica da Universidade de Bochum, Alemanha. O protocolo foi desenvolvido baseado em outros previamente descritos na literatura e otimizado de acordo com objetivos pretendidos. Analisamos o plano anatmico de amostragem do tecido, o mtodo de congelamento, a espessura do corte para a microdisseco, a soluo utilizada para a coleta do tecido durante a microdisseco e o mtodo de digesto proteoltica para posteriores anlises protemicas. Atravs de ensaios comparativos, alcanamos os resultados desejados e os mesmos foram validados atravs de anlises por espectrometria de massas. Consequentemente, tambm fomos capazes de reconhecer fatores tcnicos que possivelmente impossibilitariam um efetivo estudo do proteoma. Descritores: neurnios, substncia negra, neuromelanina, microdisseco e captura a laser, protemica

SUMMARY Molina M. An approach to proteomics analysis of neurons containing neuromelanin in the substantia nigra, isolated by laser microdissection [dissertation]. So Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de So Paulo; 2015.

Currently the worldwide proportion of people aged 60 years and over is growing faster than any other age group. This strikingly epidemiological transition results in an increase of aging related diseases, including Parkinson's disease (PD). Although many brain areas exhibit the neuropathological signs of Parkinson's disease, the degeneration of neuromelanin containing cells in the substantia nigra is considered a hallmark feature, representing cardinal diagnostic criteria for PD. However, why certain brain regions -- such as the substantia nigra -- are vulnerable in some neurodegenerative diseases, while some neighboring morphologically indistinguishable neurons remain preserved, is still unclear. Molecular analysis of specific neuronal populations can lead us to a better understanding about the physiological role played by these neurons and mechanisms involved in diseases processes. In a post-genomic era, proteomic analyses are of great scientific interest since they allow a better understanding of the biological processes. The laser capture microdissection technique has also became an important tool in biological research, being increasingly used for acquisition of pure populations of cells from histological sections, preventing the dissection of areas outside the target tissue. The combination of these methods can significantly contribute to understand the pathophysiological role of the containing neuromelanin neurons of the substantia nigra. However, for an effective application of both techniques, laser capture microdissection and proteomic analysis, it is essential the application of an efficient protocol. In this context, this study aims to establish a protocol for laser microdissection of containing neuromelanin neurons in cognitively normal individuals for subsequent proteomic analyses. We selected cases from the Brain Bank of the Brazilian Aging Brain Study. A collaboration with the Medical Proteome Center, University of Bochum, Germany took part during the development of our proposal. Our protocol was developed based on previous published protocols and optimized according the intended aims. We analyzed anatomical planes for neuronal collection, freezing methods, thickness of tissue for microdissection sections, solution for tissue collection during laser microdissection and the proteolytic digestion methods. Through our comparative tests, we have achieved the desired results and validated them by mass spectrometry analyses. Consequently, we were also able to exclude technical factors that could possibly preclude one effective proteome analysis. Descriptors: neurons, substantia nigra, neuromelanin, laser capture microdissection, proteomics.

1. INTRODUO

2

1.1 Envelhecimento populacional

Em todo o mundo, observa-se que a proporo de pessoas com 60 anos

ou mais est crescendo mais rpido que a de qualquer outra faixa etria. Este

processo que se iniciou no final do sculo XIX em alguns pases da Europa,

estendeu-se pelos pases desenvolvidos e nas ltimas dcadas, pelos pases

em desenvolvimento (Carvalho e Garcia, 2003; Organizao das Naes

Unidas (ONU), 2014) (Figura 01).

Figura 01. Porcentagem da populao com 60 anos ou mais, estimada para 1950-2014 e projetado para 2050. Modificado de Organizao das Naes Unidas, 2014.

Em 1950, estimava-se cerca de 205 milhes de idosos no mundo, sendo

que apenas trs pases possuam mais do que 10 milhes de indivduos

idosos: China (42 milhes), ndia (20 milhes) e Estados Unidos (20 milhes)

(ONU, 2002). Em 2014, o nmero de pessoas com 60 anos ou mais aumentou

cerca de quatro vezes, um crescimento de quase 13 milhes de idosos por ano

e projees realizadas pelo Departamento das Naes Unidas para Assuntos

Econmicos e Sociais indicam que at 2100 a populao mundial dever

triplicar, aumentando para aproximadamente trs bilhes (ONU, 2014).

3

Atualmente o processo de envelhecimento populacional tem ocorrido de

maneira mais acentuada em regies menos desenvolvidas. At 2050,

estimado que a populao de idosos na frica triplique, podendo atingir 212

milhes, na Amrica Latina e Caribe dever alcanar o nmero de 196 milhes

e na sia essa populao poder ser de 1,2 bilhes (ONU, 2014). Alm disso,

observa-se um aumento expressivo na populao com 80 anos ou mais. Em

2014, entre a populao idosa, cerca de 14% dos indivduos tinham 80 anos ou

mais. Em 2050, espera-se que essa populao seja de aproximadamente 392

milhes de pessoas, totalizando 19% da populao idosa (ONU, 2014) (Figura

02).

Figura 02. Populao de idosos, estimada em 2014 e projetada para 2050. Modificado de ONU, 2014.

Entre os pases mais populosos, o Brasil apresenta um dos processos

mais agudos de envelhecimento populacional (Giatti, 2003). Segundo o

Instituto Brasileiro de Geografia e Estatstica (IBGE), em 2002, a populao

com 60 anos ou mais era de aproximadamente 14 milhes de pessoas. Em

2013, a populao idosa brasileira alcanou o nmero de 22 milhes e as

estimativas so de que at 2050 a populao idosa poder ser superior a 66

4

milhes, representando quase 30% da populao brasileira total (Grfico 01)

(IBGE, 2013).

Grfico 01. Projees da populao brasileira (2000-2050). Arquivo pessoal. Fonte dos dados: IBGE (2013).

O processo de envelhecimento populacional conhecido como transio

epidemiolgica deve-se, principalmente, ao declnio da fecundidade e ao

aumento na expectativa de vida (Leme, 1997; ONU 2002) duas tendncias que,

normalmente esto associadas ao desenvolvimento social e econmico

(Ramos et al., 1987; ONU, 2013).

Em relao ao declnio da fecundidade, nos pases desenvolvidos a

mdia da taxa de fecundidade, entre 1950-1955 era de 2,8 filhos por mulher e

entre 2000 a 2005 esta mdia diminuiu para 1,5 filhos por mulher (ONU, 2002).

J nos pases menos desenvolvidos o declnio da fecundidade comeou mais

tarde e assim como o processo de envelhecimento populacional, ocorreu mais

rpido. A maior reduo do nvel de fecundidade ocorreu, em geral, durante as

ltimas trs dcadas do sculo XX. Nos ltimos 50 anos, a taxa de fecundidade

total mdia nessas regies caiu mais de 60%, de 6,2 filhos por mulher em

1950-1955 para 2,9 em 2000-2005 (ONU, 2002).

O aumento da longevidade tambm contribui para o envelhecimento da

populao. Globalmente, a expectativa de vida ao nascer dever aumentar de

0

20.000.000

40.000.000

60.000.000

80.000.000

100.000.000

120.000.000

140.000.000

160.000.000

180.000.000

2000 2050

Projees da Populao Brasileira (2000-2050)

0-59 60-90+

5

69 anos, para 76 anos em 2045-2050 e para 82 anos entre 2095-2100 (ONU,

2013). De acordo com recentes anlises realizadas pelo IBGE, no Brasil a

expectativa de vida em 1940 no atingia os 50 anos de idade. J em 2004 a

expectativa de vida ao nascer alcanava cerca de 71,2 anos, e em 2040

estima-se que a expectativa alcance a mdia de 80 anos (IBGE, 2008).

Um dos resultados dessa transio epidemiolgica aumento na

incidncia e prevalncia de doenas relacionadas ao envelhecimento, entre

elas as doenas neurodegenerativas. importante ressaltar que, embora as

doenas neurodegenerativas afetem principalmente pessoas idosas, elas no

so parte do envelhecimento normal (Nelson et al., 2011). O carter

progressivo e irreversvel de tais doenas associado ausncia de tratamentos

eficazes e ao grande impacto social e econmico, tm atrado muita ateno.

1.2 O envelhecimento e a doena de Parkinson

A idade um fator de risco bem definido para diversas doenas

neurodegenerativas (Brown et al., 2005; Mariani et al., 2005; Qiu, 2007;

Farooqui e Farooqui, 2009; Muangpaisan et al., 2011). Tais doenas afetam a

qualidade de vida dos idosos e causam sofrimento fsico e psicolgico diante

da perda da capacidade funcional (Weintraub e Stern, 2005; Kato-Narita et al.,

2011; Schenkman et al., 2011). As doenas neurodegenerativas so

consideradas a principal causa de incapacidade na populao idosa

(Jorgensen et al., 2007; Snijders et al., 2007).

Segundo um relatrio realizado em 2015 pelo National Institute of

Neurological Disorders and Stroke (NINDS) do National Institutes of Healthy

(NIH), milhes de pessoas em todo o mundo so afetadas por algum tipo de

doena neurodegenerativa, sendo a Doena de Parkinson (DP) uma das mais

prevalentes. A DP afeta aproximadamente 1-2% das pessoas com 65 anos ou

mais (Healy et al., 2008; Bekris et al., 2010). As estimativas do NIH (2015)

sugerem que cerca de 50.000 americanos so diagnosticados com DP cada

ano, embora algumas estimativas relatem prevalncias maiores. Obter uma

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Muangpaisan%20W%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21696087

6

estimativa precisa do nmero de casos difcil, porque nos estgios iniciais da

doena muitas pessoas atribuem os seus sintomas ao envelhecimento normal

e no procuram atendimento mdico (Mittel, 2003; NIH, 2015).

Neuropatologicamente a DP caracterizada pela progresso anatmica

no randmica associada perda neuronal, por depsitos de agregados

proteicos anormais intracelulares e por um padro de vulnerabilidade seletiva

caracterstico (Dickson 2007; Double et al., 2010; Grinberg et al., 2011). At o

momento, pouco se sabe sobre a associao entre a deposio de protenas e

a perda neuronal.

Embora muitas regies do encfalo exibam os sinais neuropatolgicos

da DP, a perda de clulas na substncia negra , frequentemente, considerada

como sendo a caracterstica neuropatolgica mais importante (Gibb, 1991;

Gibb e Lees, 1991; Damier et al. 1999b; Zecca et al., 2002; Braak et al., 2004;

Double, 2012), representando um critrio cardinal para o diagnstico da DP

(Figura 03). No entanto, at o momento, no se sabe por que certas regies,

como a substncia negra, so vulnerveis enquanto outras populaes

neuronais vizinhas e, s vezes, morfologicamente indistinguveis podem

permanecer preservadas por anos e at dcadas (Double et al., 2010).

Figura 03. Fotografia da substncia negra em indivduos normais (A) e portadores de doena de Parkinson onde se observa a perda de colorao da substncia negra (B). Modificado de Winkler, 2014.

1.3 Substncia Negra

7

A Substncia Negra (SN) uma estrutura mesenceflica em formato

oval achatada localizada no aspecto dorsal do pednculo cerebral que pode ser

identificada anatomicamente atravs de um plano de corte sagital e/ou

horizontal (Figura 04), devido presena de um pigmento escuro.

Figura 04. Localizao da substncia negra em um plano de corte horizontal (A) e sagital (B). Retirado de: www.thehumanbrain

Braak e Braak em 1986 identificaram trs territrios na SN: pars

compacta (SNpc), pars reticulata (SNpr) e pars diffusa (SNpd) e definiram trs

tipos de neurnios (Figura 05), baseados na forma, grau de pigmentao, tipos

de processos celulares e tamanho:

Neurnios do tipo I: encontrados principalmente na pars compacta.

Esses neurnios tm aproximadamente 50 m de dimetro, so fusiformes ou

poligonais, com 2 a 6 dendritos finos e esparsos que ocasionalmente se

ramificam. Eles contm um grande nmero de grnulos de neuromelanina e

corpsculos de Nissl na poro perifrica que se estendem para a regio

proximal dos dendritos.

Neurnios do tipo II: encontrados principalmente na pars reticulata. Eles

variam em tamanho e forma, embora sejam menores quando comparados aos

neurnios do tipo I. Clulas bipolares e bastante alongadas so

http://www.thehumanbrain/

8

frequentemente verificadas, mas multipolares tambm podem ser encontradas.

O nmero de dendritos primrios depende do formato do corpo celular e o

dimetro desta clula de aproximadamente 34 m. Este tipo celular no

apresenta depsitos de neuromelanina, porm um considervel nmero destes

neurnios possuem grnulos de lipofucsina.

Neurnios do tipo III: so geralmente pequenos, com aproximadamente

16m de dimetro. Alguns finos dendritos se originam da superfcie do

neurnio e irradiam em vrias direes. Os dendritos no possuem espinhas, e

do origem a alguns prolongamentos. Contm grnulos de lipofucsina que so

menores quando comparados aos grnulos de neuromelanina dos neurnios

do tipo I e aos grnulos de lipofucsina dos neurnios do tipo II.

Figura 05. Diagrama dos tipos neuronais na substncia negra. Modificado de Braak e Braak, 1986

Adicionalmente, a SN composta por populaes distintas de neurnios

dopaminrgicos e GABArgicos. As populaes de neurnios GABArgicos e

dopaminrgicos so encontrados na pars reticulata (SNpr) e na pars compacta

da SN (SNpc) respectivamente (Double et al., 2010).

9

As clulas dopaminrgicas da pars compacta projetam-se principalmente

para o estriado, bem como para o ncleo subtalmico, globo plido e para a

pars reticulata (Cossette et al., 1999; Tepper e Lee, 2007). A SNpc recebe

projees de diferentes regies enceflicas, como estriado, globo plido

(Tepper e Lee, 2007), pars reticulata (Tepper et al., 1995), entre outros. Um

resumo esquemtico dessas conexes bem como seus neurotransmissores,

pode ser consultado na Figura 06.

Figura 06: Modelo esquemtico das conexes sinpticas dos neurnios da substncia negra pars compacta (SNpc). Os neurotransmissores envolvidos Glu (Glutamato), GABA (cido Gama-Aminobutrico), 5-HT (5-hidroxitriptamina), NA (Noradrenalina), Ach (Acetilcolina) esto indicados por diferentes cores de setas. Abreviaes: SNpr (Substncia Negra pars reticulata), GPe (Globo Plido externo), GPi (Globo Plido interno). Adaptado de Guatteo et al., 2009.

10

No mesencfalo, alm da SNpc, outras duas regies possuem neurnios

dopaminrgicos: a rea tegmental ventral e o campo retrorubral. Essas trs

regies constituem o grupo mais proeminente de clulas dopaminrgicas

cerebrais, aproximadamente 90% do total, sendo considerada a maior fonte de

dopamina no sistema nervoso central dos mamferos (Chinta, 2005; Gardaneh,

2010). Outras regies onde se encontram neurnios dopaminrgicos so o

diencfalo e o bulbo olfatrio. Apesar de possurem o mesmo

neurotransmissor, essas regies so anatmica e funcionalmente

heterogneas (Chinta, 2005).

A SNpc pode ser dividida em uma srie de sub-regies, sendo que a

definio e terminologia destas sub-regies variam de autor para autor.

Utilizando uma combinao de fatores anatmicos e neuroqumicos, alguns

autores definiram quatro regies: parte medial (tambm referido como o grupo

ventromedial), parte lateral (tambm conhecida como nigrosomes 3), dorsal

(tambm referida como nigrosomes 4, 5 e a matriz) e ventral (tambm referida

como nigrosomes 1 e 2) (McRitchie et al., 1996; Damier et al., 1999a).

A degenerao dos neurnios dopaminrgicos responsvel pelos

sintomas clssicos da DP e surgem quando houve aproximadamente 60-70%

de perda neuronal (Hodge e Butcher, 1980; Mari e Defer, 2003; McAauley,

2003; Obeso et al., 2014). Em condies fisiolgicas, indiretamente esses

neurnios tem uma funo importante no controle do movimento voluntrio

(Chinta e Andersen, 2005).

Alguns autores sugerem que a degenerao encontrada na DP afeta,

principalmente, a camada ventral (aproximadamente 70-90% de perda

neuronal) em comparao com o dorsal (25-70% de perda neuronal) (Fearnley

e Lees, 1991; Hirsch et al., 1997; Damier et al., 1999b; Obeso et al., 2014)

(Figura 07).

11

Figura 07. Representao do mesencfalo atravs de um plano de corte horizontal. Do lado esquerdo a substncia negra saudvel, e do lado direito a substncia negra na DP. Nota-se o diferente padro de vulnerabilidade entre as camadas da substncia negra. Modificado de Double, 2012.

Uma caracterstica importante dos neurnios dopaminrgicos da

substncia negra humana a presena do polmero neuromelanina. A

neuromelanina comea a acumular-se dentro dos neurnios a partir dos 3 anos

de idade (Cowen, 1986) e esse processo continua ao longo da vida (Zucca et

al., 2014). Alguns estudos mostraram que o nmero de neurnios pigmentados

diminui com a idade (McGeer et al., 1977; Fearnley e Lees, 1991) enquanto

outros afirmam no haver perda dependente da idade (Muthane et al., 1998;

Kubis et al., 2000).

A neuromelanina produzida por neurnios catecolaminrgicos em trs

regies do encfalo humano: substncia negra, lcus cerleo e formao

reticular (Fedorow, et al., 2005) (Figura 08).

12

Figura 08. Regies enceflicas contendo clulas produtoras de neuromelanina: (A) substncia negra mesencfalo (B) locus coeruleus ponte (C) formao reticular bulbo. Modificado de Fedorow et al., 2005

Vrios estudos tm sido realizados com o objetivo de compreender

melhor o papel da neuromelanina no envelhecimento normal e no processo

neurodegenerativo (Lindquist et al., 1987; Fasano et al., 2006; Bisaglia et al.,

2009; Zhang et al., 2013). Uma hiptese a de que a neuromelanina

desempenhe um papel protetor, evitando danos de substncias nocivas como,

ons metlicos redox-ativos, toxinas e excesso de catecolaminas citoslicas s

clulas (Zucca et al., 2004; Zucca et al., 2014). No entanto, tambm tem sido

demonstrado um potencial txico para neuromelanina atuando como ativadora

da micrglia endgena e, por consequente, causando inflamao (Zhang et al.,

2013). Outra hiptese seria de que a neuromelanina em excesso poderia inibir

a funo do proteassoma (Shamoto-Nagai et al., 2004).

Segundo Karlsson e Lindquist (2013) a ligao de txicos a

neuromelanina, inicialmente protege as clulas, mas como tal ligao

reversvel, ela poderia provocar o acmulo e consequente liberao do produto

txico gradualmente no citosol. Apesar de inmeras e diferentes hipteses

13

terem sido propostas, at ento, no est clara a sua funo no encfalo

humano.

Para preencher esta lacuna no conhecimento sobre a etiologia, os

mecanismos da DP e a funo da neuromelanina no encfalo humano de

grande relevncia o desenvolvimento de estudos topogrficos mais focalizados

- que permitam isolar populaes especficas de neurnios, ao invs da anlise

de grandes estruturas e homogenados preferencialmente associados

anlises bioqumicas de ponta. Uma maneira eficiente de fazer isto aplicar as

ferramentas da disseco a laser e protemica em amostras bem

caracterizadas de tecido humano cerebral.

1.4 Microdisseco e captura a laser e a protemica

A tcnica de Microdisseco e Captura a Laser (MCL) foi desenvolvida

em 1996, por pesquisadores do National Cancer Institute dos EUA (Emmert-

Buck et al., 1996) e tornou-se amplamente utilizada como uma ferramenta na

pesquisa biomdica, potencializando o uso de tcnicas j existentes.

A MCL permite a aquisio de populaes puras de clulas ou tecidos

de determinadas regies microscpicas. Atualmente, existem dois tipos de

laser para realizar a MCL: infravermelho (IV) e ultravioleta (UV). Eles

compartilham princpios fundamentais comuns: visualizao e seleo da rea

a ser microdissecada atravs de um microscpio, transmisso de laser para

excisar as clulas selecionadas, mecanismo que permite a catapultagem, ou

seja, o lanamento da amostra e a presena de um tubo que capta a regio

alvo (Chung e Shen, 2015).

A MCL tem a vantagem de poder ser adaptada a uma diversidade de

tipos celulares e mtodos de colorao, tais como violeta de cresila (Bevilacqua

et al., 2010), hematoxilina e eosina (Xu et al., 2002), imuno-histoqumica (He et

al., 2013), imunofluorescncia (Murakami et al., 2000), entre outros que

facilitam a visualizao histolgica (Chung e Shen, 2015). O tecido a ser

microdissecado pode ser fixado em formalina e embebido em parafina, pode

14

ser espcimes congelados, cultura de clulas e preparaes citolgicas, como,

esfregaos ou clulas citocentrifugadas (Curran e Murray, 2002; Guo et al.,

2007; Rodriguez et al., 2008; Chowdhuri et al., 2012; Mustafa et al., 2012;

Mukherjee et al., 2013; Chung e Shen, 2015).

Tal tcnica reduz a probabilidade de contaminao, possui baixo contato

de manipulao e evita problemas relacionados heterogeneidade do tecido

(Emmert-Buck et al., 1996; Murray e Curran, 2005; Murray, 2007; Vogel, 2007;

Pietersen et al., 2011). Este fato particularmente relevante para o tecido

enceflico, que consiste em vrios tipos celulares morfologicamente e/ou

neuroquimicamente distintos cercados por vrios tipos de clulas, como por

exemplo, clulas gliais (oligodendrcitos, microglia e astrcitos). Portanto, a

capacidade de isolar populaes de clulas especficas, como por exemplo,

neurnios surgiu recentemente como uma alternativa promissora (Banks et al.,

1999; Craven e Banks, 2001; Mouldous et al., 2003; Caudle et al., 2008;

Boone et al., 2013; Kumar et al., 2013) e unido a tcnicas moleculares, pode

acentuadamente melhorar a compreenso de diversos processos biolgicos

(Kummari et al., 2015).

A MCL tem sido cada vez mais utilizada em diversas reas de pesquisa

biomdica e suas aplicaes nestas reas so baseadas principalmente em

biologia molecular, como a gentica e protemica (Kerk et al., 2003; Chung e

Shen, 2015; Sethi et al., 2015). A combinao da MCL e tcnicas protemicas

podem fornecem uma viso valiosa sobre possveis caminhos e mecanismos

envolvidos na patognese de diversas doenas neurodegenerativas (Standaert,

2005; Chung e Shen, 2015; Sethi et al., 2015). No entanto, apesar das

inmeras vantagens oferecidas pela MCL, este mtodo ainda no foi

amplamente incorporado no campo da neurocincia.

A protemica baseada em espectrometria de massas fundamentalmente

modificou o modo como os sistemas biolgicos so estudados. Essa tcnica

permite a anlise de milhares de protenas, incluindo os diversos processos

relacionados sua funo (Farley e Link, 2009) tais como, a localizao

especfica, as interaes protena-protena, o turnover e as modificaes ps-

traducionais (PTMs) (Aebersold e Mann, 2003; Altelaar et al., 2013).

15

A tcnica de espectrometria de massas identifica analitos que foram

purificados e/ou fracionados por cromatografia. A cromatografia pode estar

acoplada ao espectrmetro de massas e o uso desta alternativa vem

crescendo de forma exponencial. Vrios tipos podem ser utilizados, como por

exemplo, Cromatografia Gasosa (CG) ou Cromatografia Lquida (CL). A

cromatografia lquida de alta eficincia, do ingls High Performance/Pressure

Liquide Chromatography (HPLC) o mtodo de CL mais comum de separao.

Neste tipo, o analito passa por dois processos: I) fase lquida, onde a amostra

dissolvida e II) fase estacionria, geralmente constituda de uma ou vrias

colunas com diferentes fases estacionrias compostas de materiais porosos e

filtros (Wuhrer, 2009).

A espectrometria de massas, do ingls Mass Spectrometry (MS)

consiste basicamente na ionizao de um composto e na avaliao da razo

de massa/carga (m/z) dos ons (Hoffmann, 1996; Ho et al., 2003). O

equipamento composto de uma fonte de ionizao, um ou mais analisadores

de massas e um detector, conectado a um computador contendo softwares

especficos para as anlises dos dados.

Existem dois principais mtodos de ionizao, o MALDI (Matrix-Assisted

Laser Desoption/Ionization) usado para amostras em estado slido e o ESI

(Electrospray Ionization) utilizado para amostras em estado lquido. As fontes

de ionizao so utilizadas para gerar ons peptdicos ou proteicos, atravs de

transferncia de prtons (H+) para as molculas, sem alterar sua estrutura

qumica (Ho et al., 2003; Hommerson et al., 2011).

No analisador, o on acelerado em campo eltrico, separado pela

razo m/z. O on pode ainda ser selecionado de acordo com a m/z previamente

determinada e fragmentado atravs de um processo chamado Mass-

Spectrometry/Mass-Spectrometry (MS/MS) ou espectrometria de massas em

tandem. Os analisadores de massa podem ser do tipo: Time Of Flight (TOF);

quadrupolo ou Ion Trap (IT) (Louris et al., 1987; Adahchour, 2005; Chen et al.,

2010). Independentemente do tipo, nos analisadores a massa molecular dos

ons avaliada.

16

O exemplo do HPLC acoplada ao espectrmetro de massas bem como,

o diagrama de espectrometria de massas em tandem (MS/MS) pode ser

consultado na Figura 09.

Figura 09. (A) exemplo do sistema de HPCL acoplado ao espectrmetro de massas (B) diagrama de espectrometria de massas em tandem. A amostra injetada no espectrmetro de massas, ionizado e acelerado. Em seguida, so analisados (MS1). Os ons dos espectros MS1 so seletivamente fragmentados e novamente analisados por espectrometria de massas (MS2). Modificado de Thermo Scientific, 2014.

Enquanto a identificao de protenas importante para entender os

processos biolgicos, a anlise direta das protenas em amostras obtidas a

partir da tcnica de microdisseco a laser de grande relevncia, pois reduz a

complexidade do crebro ao permitir a obteno de reas ou clulas

especficas.

A literatura, ainda carece de descries sobre metodologias e

padronizaes utilizando eficientemente essas duas tcnicas. Diante deste e

17

de outros questionamentos, ns propomos e testamos um protocolo para a

realizao da MCL baseado em outros trabalhos publicados previamente

(Emmert-Buck et al., 1996; Fend e Raffeld, 2000; De Souza et al., 2004;

Cummings et al., 2011; Sturm, et al., 2012). Nosso foco foram os neurnios da

pars compacta da substncia negra de encfalos humanos para posteriores

anlises protemicas. Foram utilizados utilizando casos clinica e

neuropatologicamente normais provenientes da casustica do Banco de

Encfalos Humanos do Grupo de Estudos em Envelhecimento Cerebral da

Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo (BEHGEEC-FMUSP),

criado em 2003 com o objetivo de contribuir com o estudo do envelhecimento

cerebral e melhor entendimento dos processos relacionados senescncia e

senilidade cerebral (Ferretti et al., 2009). Ns optamos por utilizar casos

cognitivamente normais, pois a criao de uma base normativa

extremamente importante antes que se queira compreender o processo

patolgico. As investigaes ao nvel proteico tm contribudo para ajudar a

identificar, caracterizar e entender essas diferenas e tem sido cada vez mais

utilizadas (Urquhart et al., 1997; Watarai et al., 2000; Zhou et al., 2002; Tribl et

al., 2005; Alberio et al., 2010). Alm disso, podem permitir a identificao de

alvos para o diagnstico precoce e tratamento da doena (Liao et al., 2004;

Kitsou et al., 2008).

Os resultados desse trabalho podem ser aplicados em outras propostas

de estudo utilizando tecido enceflico, j que o estabelecimento de um

protocolo padronizado crucial para o sucesso de qualquer experimento no

campo da protemica (Gonzlez-Fernndez et al., 2010).

18

2. OBJETIVOS

19

I. Estabelecer um protocolo para a realizao da MCL em tecido cerebral

humano e subsequente anlise protemica;

II. Validar este protocolo por meio da MCL e anlise protemica em

neurnios contendo neuromelanina na substncia negra de indivduos

sem alteraes clnicas e neuropatolgicas.

20

3. MATERIAIS E MTODOS

21

3.1 Procedncia dos casos

A Comisso de tica em Pesquisa da Faculdade de Medicina da

Universidade de So Paulo (FMUSP) aprovou o protocolo de pesquisa do

presente estudo (n 361/10), apresentado pelo Departamento de Patologia. O

termo de aprovao est apresentado no Anexo (A).

Este projeto conta com a colaborao do Centro de Protemica Mdica

da Universidade de Bochum, Alemanha, aprovado pelo Comit Nacional de

tica em Pesquisa CONEP sob o registro n 16380 conforme o Anexo (B).

Os casos selecionados para o presente estudo so pertencentes a

casustica do BEHGEEC.

3.2 Procedimentos do BEHGEEC

Os casos includos no BEHGEEC so provenientes de autpsias

realizadas no Servio de Verificao de bitos da Capital (SVOC). O SVOC

realiza as autpsias em indivduos que tenham falecido de morte natural ou

indivduos em que, a causa de morte no foi definida em vida. No Brasil, o

servio de autpsia mandatrio para os casos de bitos de causa mal

definida.

Na chegada do cadver ao SVOC, as famlias devem comparecer ao

servio para reclamao do corpo e sua liberao para que ento, sejam

iniciados os procedimentos de autpsia. Os procedimentos de autpsia e a

liberao dos documentos duram em mdia 3 horas (Grinberg et al., 2007).

Caso o indivduo atenda aos critrios de seleo do BEHGEEC, os

familiares, presentes no SVOC, so convidados a participar do estudo. Nesse

momento, so explicados os objetivos do estudo, sua relevncia e todos os

procedimentos de pesquisa pretendidos. Aps consentimento informado, um

22

membro da famlia assina, voluntariamente, o Termo de Consentimento Livre e

Esclarecido e o caso ento includo no estudo. Os procedimentos do estudo

so realizados apenas aps a autorizao do responsvel, mediante a

assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Ferreti et al.,

2009).

3.2.1 Critrios de seleo do BEHGEEC

Ter idade, na data do falecimento, igual ou maior a 50 anos;

Possuir um familiar responsvel ou cuidador, com contato mnimo

semanal durante os seis meses anteriores ao bito;

Possuir um informante (familiar responsvel ou cuidador) capaz de

prestar informaes consistentes a respeito do histrico de sade do sujeito;

No ser portador de doenas cerebrais que impossibilitem a avaliao

macroscpica cerebral, como acidente vascular enceflico hemorrgico;

No ser portador de doena avanada no perodo de trs meses

anteriores morte, responsveis por causar hipxia ou hipofluxo cerebral;

No possuir histria de parada cardiorespiratria prolongada nos trs

meses anteriores ao bito;

No possuir pH do lquido cefalorraquidiano menor que 6,5 indicando

acidose grave devido ao estado agonal.

3.2.2 Avaliao Clnica

Durante o procedimento de autpsia, a avaliao clnico-funcional do

indivduo realizada atravs de uma entrevista clnica semiestruturada. O

responsvel indicado por relatar as informaes pode ser um familiar, um

cuidador, ou algum que tenha tido um contato prximo com o sujeito por pelo

23

menos seis meses anteriores ao bito, de modo que, as informaes possam

ser confiveis.

Os indivduos so entrevistados de segunda a sexta-feira, em uma sala

privada, por uma equipe de entrevistadores treinados e supervisionados por um

enfermeiro gerontlogo (Grinberg et al., 2007). Durante a entrevista, o

entrevistador julga se as informaes obtidas so confiveis com o objetivo de

decidir se o caso ser ou no includo no estudo. O gerontlogo responsvel

por revisar a entrevista aps o trmino para avaliar a consistncia dos dados

coletados. Posteriormente essas entrevevistas so discutidas em uma reunio

de consenso diagnstico por uma equipe de mdicos (especialistas em

neurologia e geriatria) e enfermeiros gerontlogos (Ferretti et al., 2009).

O protocolo de coleta de dados consiste em uma srie de escalas e

questionrios validados, cuja funo avaliar os aspectos cognitivos,

comportamentais, funcionais e socioeconmicos, bem descritos e utilizados

mundialmente (Grinberg et al., 2007; Ferretti et al., 2009). Para a avaliao

global do domnio cognitivo utilizado o questionrio Clinical Dementia Rating

(CDR) descrito por Morris (1993). O protocolo de entrevista completo pode ser

consultado no Anexo C.

3.2.3 Processamento do encfalo

Aps a abertura da calota craniana durante o procedimento de autpsia

so realizados os seguintes procedimentos: I) coleta do lquido

cefalorraquidiano, para posterior aferio do pH; II) coleta de sangue para

estudos bioqumicos e genticos; III) aferio do volume do encfalo pelo

mtodo de Arquimedes; IV) aferio da massa do encfalo em balana digital.

Em seguida o encfalo levado para a sala de procedimentos no

laboratrio do BEHGEEC dentro de um saco zip imerso em uma cuba com gelo

e gua refrigerada para conservao do tecido. Um conjunto de 17 regies

representado e congelado a temperatura de -80C. Essas amostras

eventualmente sero utilizadas para procedimentos bioqumicos e genticos.

24

O hemisfrio contralateral fixado em formol a 4% tamponado com

fosfato de potssio (pH= 7,4) por no mximo 15 dias. Durante o

processamento, tambm verificado se h presena de leses vasculares.

Aps esse perodo, o material enceflico seccionado em intervalos de 1 cm e

um conjunto mnimo de 19 reas so amostradas, sendo posteriormente

embebidas em blocos de parafina para o diagnstico neuropatolgico.

As regies amostradas e os respectivos procedimentos abordados pelo

protocolo do BEHGEEC esto descritas na Tabela 01.

Tabela 01. Regies amostradas pelo protocolo do BEHGEEC. Adaptado de Grinberg et al., 2007

reas Enceflicas Amostradas Embebidos

em parafina

Armazenados

a -80C

Amgdala e crtex entorrinal X X

Bulbo olfatrio X X

Cerebelo incluindo o ncleo denteado X X

Centro semi oval X

Formao hipocampal anterior X

Hipocampo na altura do corpo geniculado lateral e

giro temporal inferior X X

Hipocampo contra lateral X

Ncleo basal incluindo o ncleo basal de Meynert, na

altura da comissura anterior X

Giro do cngulo X

Giro frontal mdio X X

Giro frontal superior e giro do cngulo X

Giro orbitofrontal X

Giro parahipocampal X

Giro temporal mdio e superior X X

Lbulo parietal inferior e superior X X

Medula Oblonga X

Mesencfalo incluindo substncia negra X

Plexo coride X X

Ponte incluindo o lcus cerleo X

Sulco calcarino (rea visual primria) X X

Tlamo X

Territrio de transio entre as artrias cerebrais

anterior e mdia X

Territrio de transio entre as artrias cerebrais

mdia e posterior X

25

3.2.4 Diagnstico neuropatolgico

Os fragmentos enceflicos embebidos em parafina so seccionados em

espessura de 5m e colocados em lminas silanizadas (3-Aminopropil-trietoxi-

silano) para a colorao de Hematoxilina e Eosina (HE) e aplicao do

protocolo de imuno-histoqumica.

A imuno-histoqumica de rotina realizada usando anticorpos contra os

seguintes peptdeos ou protenas: -amilide, tau hiperfosforilada, -sinuclena

e TDP-43. O mtodo utilizado avidina-biotina por imunoperoxidase, a

revelao feita atravs do cromgeno 3,3-diaminobenzidina e a

contracolorao atravs de hematoxilina de Harris. As reas imunocoradas e

respectivos anticorpos esto demonstrados na Tabela 02.

Regio do encfalo Contra

Protena Amilide

Contra Protena

Tau

Contra Protena -sinuclena

Contra Protena TDP-

43

Giros frontais mdio e inferior

X X

Giros temporais superior e mdio

X X X

Hipocampo, na altura do corpo geniculado lateral e giro parahipocampal adjacente

X X X X

Amigdala e crtex adjacente X X X X

Mesencfalo com substncia negra

X X X

Ncleos da base, na altura da comissura anterior

X

Ponte com locus ceruleus X

Bulbo na altura da oliva X X

Cerebelo X

Bulbo olfatrio X

X = rea imunocorada Tabela 02. reas imunocoradas e anticorpos rotineiramente utilizados no BEHGEEC. Adaptado de Grinberg et al., 2007

26

O exame anatomopatolgico realizado por neuropatologista cego a

todos os dados clnicos obtidos. So utilizados critrios mundialmente aceitos

para o diagnstico de doenas neurodegenerativas (Braak e Braak 1991; Mirra

1996; Mckeith et al., 1997) e j descritos por trabalhos publicados pelo nosso

grupo (Grinberg et al., 2007; Farfel et al., 2013).

3.3 Critrios de seleo de casos para o presente estudo

Alm dos critrios de incluso estabelecidos e descritos do BEHGEEC,

para este trabalho, foram adotados os seguintes critrios:

No possuir declnio cognitivo de acordo com o questionrio CDR;

No ser portador de nenhuma doena neurodegenerativa;

Apresentar o tronco enceflico morfologicamente intacto.

Para este estudo, 8 casos foram selecionados. Destes, um foi excludo,

visto que no apresentava o tronco enceflico morfologicamente intacto.

3.4 Estabelecimento do protocolo para a realizao da tcnica de

microdisseco e captura a laser

Durante o processamento enceflico de rotina do BEHGEEC, descrito no

item 3.2.3, o tronco enceflico foi separado do encfalo na altura do tlamo

(acima dos colculos superiores), seccionado sagitalmente, tendo como base o

sulco mediano dorsal, e congelado.

A representao do mesencfalo foi realizada com o tronco enceflico

congelado. Na poro rostral, o tronco enceflico foi seccionado na altura dos

colculos superiores. Na poro caudal, o tronco enceflico foi seccionado na

altura da ponte (Figura 10).

27

Figura 10. Procedimento do corte do tronco enceflico para a representao do mesencfalo. Arquivo pessoal.

3.4.1 Definio do plano anatmico ideal para a coleta dos neurnios

Diferente do processamento enceflico abordado rotineiramente no

protocolo do BEHGEEC, esta abordagem exigiu que o tronco enceflico de

dois indivduos cognitivamente normais fossem fixados por imerso em

formalina a 10% durante 4 semanas. Aps esse perodo, o material foi

desidratado em uma srie graduada de solues de etanol, embebidos em

celoidina usando um mtodo modificado, desenvolvido por Heinsen et al.

(2000) e seccionados com uma espessura 350 m.

Foram testados os planos horizontal e sagital. As lminas foram coradas

com galocianina (colorao de Nissl) e montadas com resina como

previamente descrito por Heinsen e colaboradores em 1991. O arranjo e a

densidade de clulas por fatia foram comparados na substncia negra segundo

o plano de corte em cada seco.

3.4.2 Definio do mtodo de congelamento para MCL

Mesencfalo

28

Para este tpico, mesencfalos de trs indivduos diferentes foram

selecionados e seccionados sagitalmente. Para essa abordagem, ambos os

lados foram utilizados (direito e esquerdo) diferindo do protocolo proposto pelo

BEHGEEC, resultando em 6 amostras. Trs protocolos de com diferentes

combinaes de passos de congelao foram testados: I) congelao em

freezer a -20 C durante 30 min, seguido de armazenamento a -80C; II)

congelamento e armazenamento a -80C; e III) congelamento por insero em

nitrognio lquido, seguido de armazenamento -80C (Tabela 03). Os casos

foram cortados e corados com violeta de cresila. Trs investigadores

independentes e cegos para o mtodo de congelao analisaram

qualitativamente as fatias com base na morfologia dos neurnios e a qualidade

do tecido.

Caso Lado Procedimento

1 Esquerdo -20C/-80C

Direito -80C

2 Esquerdo -20C/-80C

Direito Nitrognio lquido/-80C

3 Esquerdo -80C

Direito Nitrognio lquido /-80C

Tabela 03. Viso geral dos procedimentos de congelao

3.4.3 Definio da espessura do corte, colorao do tecido e

microdisseco a laser

O mesencfalo de um indivduo foi seccionado de acordo com o tpico

3.4. O tecido foi fixado por meio de resina do tipo Tissue-Tek (O.C.T Optimal

Cutting Temperature) em suporte de criostato. Posteriormente, foram

realizadas seces em criostato (Modelo CM 1850 UV, Nuloch GmbH,

Nuloch, Alemanha) a -20C de temperatura dentro da cmara (Figura 11).

29

Figura 11. Procedimento de corte no criostato. Arquivo pessoal.

Antes do corte, o tecido foi mantido por 15 minutos dentro do criostato

para estabilizar a temperatura. As seces foram colocadas em lminas com

membrana prpria para MCL (PALM MembraneSlides 1 mm PEN, Carl Zeiss

Microscopia GmbH, Gottingen, Alemanha). Para distinguir as clulas, os cortes

foram corados com violeta de cresila a 1% de acordo com o protocolo

estabelecido pela Carl Zeiss Microscopy GmbH (Carl Zeiss MicroImaging, LCM

Protocols Protein Handling for LC/MS), com pequenas modificaes. O

violeta de cresila um corante bsico, utilizado para evidenciar ncleos. Esta

tcnica de colorao recomendada para microdisseco a laser destinada a

subsequentes abordagens protemicas (Chaurand et al. 2004; Caldwell

e Caprioli, 2005). Para preparar a soluo, 1 grama de violeta de cresila (Cresyl

violet acetate, Sigma Life Sciences, St. Louis, EUA) foi diluda em 100 ml de

etanol a 50% e agitada por 12 horas atravs de uma placa de agitao. No dia

seguinte, a soluo foi filtrada para remover possveis partculas no

dissolvidas. A soluo foi mantida a 4C at a sua utilizao. O resumo do

protocolo de colorao pode ser consultado na Tabela 04.

30

Etapa Soluo Procedimento Durao Temperatura

1. Etanol 70% Incubao 2 min 4C

2. Violeta de Cresila

a 1% Incubao 30 s TA

3. --- Descartar excesso de

corante

4. Etanol 70% Mergulhar 3-5x 1 s 4C

5. Etanol 100% Mergulhar 1x s 4C

6. --- Secagem 1-2 min RT

TA = Temperatura Ambiente Tabela 04. Procedimento de colorao com violeta de cresila

Na sequncia foi realizada a MCL. O sistema de microdisseco

a laser composto por (1) um microscpio invertido; (2) uma fonte de

raios laser, acoplada a poro posterior do microscpio cujo feixe atravessa o

microscpio atravs da objetiva e atinge a lmina; (3) um computador

alimentado com um programa prprio, para controle das diversas funes do

microscpio e do laser (Figura 12). O sistema informatizado permite controle

direto de quase todas as atividades por computador, desde a observao dos

cortes histolgicos at a microdisseco em si. O software tambm possibilita

calcular as reas dos campos escolhidos.

Figura 12. Imagem representativa do sistema PALM MicroBeam. Modificado de PALM MicroBeam Microdissection System to Research Platform The New Standard in Modern Life Science Research.

31

O pulso de laser transporta a amostra selecionada da lmina para um

dispositivo de coleta (geralmente a tampa de um microtubo, que deve conter

um adesivo ou estar preenchido com uma soluo).

Nesta abordagem, ns testamos duas solues diferentes para a coleta

do material: I) gua ultrapura (TKA-Gene PURE, Thermo Scientific, Baltimore,

USA) e II) soluo a 50% de acetonitrila (Biosolve BV, Valkenswaard, Holanda)

diluda em gua.

A MCL foi realizada com o instrumento PALM MicroBeam (LCM PALM-

System, Carl Zeiss Microscopy, GmbH). Para a padronizao, a tampa do

microtubo foi preenchido com 50 l de uma das solues. Uma vez que o

estabelecimento do protocolo incluiu a subsequente anlise por espectrometria

de massas, logo aps de terminar a MCL, 2,5 l RapiGestSurfactante a 2%

(m/v) (Waters GmbH, Milford, MA, EUA) foi cuidadosamente adicionada na

tampa do tubo de modo que a concentrao final fosse de 0,1% (m/v) e que o

processo de desnaturao das protenas fosse iniciada. O tubo foi fechado e

armazenado de cabea para baixo a -80C.

Durante o procedimento de microdisseco se no fosse possvel a

coleta de toda a amostra desejada em uma nica lmina a lmina seguinte

tambm era utilizada com intuito de evitar a evaporao desnecessria da

soluo presente na tampa do tubo.

Foram testadas 4 espessuras para o isolamento dos neurnios e regies

da SN: 5 m; 10 m; 20 m e 30 m. A seleo da espessura ideal foi baseada

na capacidade de catapultar a regio/clulas e na capacidade de estabelecer

os parmetros do laser necessrios para um processo de catapultagem eficaz

dentro de um curto espao de tempo.

3.5 Otimizao do protocolo de preparao das amostras para

espectrometria de massas

3.5.1 Preparao e digesto das amostras para anlise por

espectrometria de massas

32

A digesto necessria para que todas as partes da protena fiquem

uniformemente expostas dissociao e ionizao, bem como, para aumentar

a eficincia desses processos. As proteases normalmente utilizadas so:

quimotripsina, pepsina, carboxipeptidases, aminopeptidases, tripsina. A tripsina

por exemplo, cliva resduos de arginina ou lisina.

Para a digesto das amostras, os tubos com o tecido coletado foram

incubados ainda de cabea para baixo em banhos de ultrassons durante 1

minuto, em seguida as amostras foram centrifugadas brevemente. Esta etapa

foi repetida. Posteriormente, as amostras foram incubadas a 95 C durante 5

min em um termomisturador e centrifugadas novamente. Um microlitro de 250

mM de 1,4-ditiotreitol (DTT, AppliChem GmbH, Darmstadt, Alemanha) foi

adicionado em cada amostra e essa mistura foi incubada durante 30 min a

60C. Subsequentemente, as amostras foram novamente incubadas com 1,4 l

de iodoacetamida a 0,55 M (AppliChem) em temperatura ambiente durante 30

min em cmara escura. A digesto foi iniciada por adio de 1:4 de tripsina

diluda em gua (Promega, Mannheim, Alemanha) durante 4 horas a 37C e

paralisadas com adio de 3,25 l de cido trifluoactico (TFA) a 10% durante

30 min a 37C. As amostras novamente foram centrifugadas durante 15 min a

14.000 rpm a 4C. O sobrenadante resultante foi transferido para uma nova

tampa e seco com auxlio do SpeedDry (RVC 2-25 CDplus, Martin Christ

Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Osterode, Alemanha). Finalmente, 30 l de

TFA a 0,1% foram adicionados a cada amostra.

3.5.2 Determinao da concentrao de protena, com a anlise de

aminocidos

Depois da digesto da amostra, as concentraes de protena foram

determinadas por anlise de aminocidos, como descrito por Plum et al.

(2013). Para este processo, 5 l de cada amostra foi completamente seco em

33

um tubo de vidro. Em seguida, as amostras foram dissolvidas pela adio de

10 l de de cido clordrico (HCl) a 20 mM. A anlise de aminocidos foi

realizada atravs de HPLC. De acordo com as instrues do fabricante,

utilizando o HPLC Acquity e AccQ-Tag (Waters GmbH). Para a derivao e

para permitir a converso de aminas primrias e secundrias em derivados

estveis, as amostras foram incubadas com 10 l de AccQ-Tag e 30 l

norvalina padro (concentrao final: 10 pmol/l) durante 10 min. Derivados de

aminocidos foram separados sobre uma coluna AccQ-Tag ultra RP (Reversed

Phase) e detectado pelo Acquity UPLC-TUV (Ultra Performance Liquid

Chromatography - Tunable UV Detector) (Waters GmbH). Os aminocidos

foram quantificados utilizando padres de aminocidos 10 pmol/l.

3.5.3 Anlise por espectrometria de massas

A anlise por Liquid Chromatography - Mass Spectrometry/Mass

Spectrometry (LC-MS/MS) foi realizada utilizando o sistema UltiMate 3000

RSLC nano LC (Dionex, Idstein, Germany) acoplado ao sistema Q Exactive

(Thermo Fisher Scientific, Bremen, Alemanha). O carregamento da amostra na

coluna (100 m 2 cm, tamanho de partcula 5 m, tamanho do poro 100 ,

C18, Thermo Scientific) foi realizada automaticamente a uma vazo de 30

l/min a 60C com TFA a 0,1%). A ligao entre o sistema de HPLC e Q

Exactive realizada online, e a ionizao foi realizada por electrospray. A

tenso de vaporizao dos ons foi ajustada para 1,600 V (+) e a temperatura

do capilar para 250C. O alcance de leitura foi definido como 350-1400 m/z

para o modo de leitura completa, e para as verificaes do tipo SIM (Selected-

Ion Monitoring), uma resoluo de 70.000 (a 200 m/z) foi criado.

Os fragmentos para anlise de MS/MS foram gerados utilizando a

dissociao induzida por coliso de alta energia (High-Energy Collision-Induced

Dissociation - HCD). Para a dissociao dos ons, uma energia de coliso

normalizada (Normalized Collision Energy - NCE) foi feita a 27%, a seguinte

anlise dos fragmentos foi realizada em um analisador do tipo Orbitrap.

34

Os dados primrios resultantes da anlise LC-MS/MS foram

interpretados usando Proteome Discoverer (verso 1.4.0.288), com base no

banco de dados UniProt (UniProt/SwissProt-Release 2013_05 of 01.05.2013;

541,561 (with decoys) (http://www.uniprot.org)) como referncias de

sequncias de protenas. A taxonomia foi definida como homo sapiens. O

banco de dados utilizado foi randomizado a fim de identificar o nvel de falso

positivo, ou, o conhecido, False Discovery Rate (FDR) foi ajustado para 0,01%.

Alm disso, as seguintes modificaes dinmicas foram assumidas: oxidao e

carbamidometil. Os arquivos em formato MGF resultantes foram analisados

com software Ingenuity Pathway Analysis (IPA; verso 18488943)

(http://www.ingenuity.com/products/ipa), utilizando a ferramenta de anlise de

ncleo.

3.6 Isolamento das amostras atravs da tcnica de microdisseco a

laser

Neste tpico, o tronco enceflico de um indivduo foi selecionado. A

regio toda da substncia negra pars compacta do hemitronco esquerdo foi

isolada. No hemitronco direito, apenas neurnios da substncia negra pars

compacta foram isolados (vide figura 13 para exemplo do isolamento da regio

(A) e apenas de neurnios (B)).

35

Figura 13. Seleo da rea para realizar a MCL.

O isolamento de ambos foi realizado seguindo os melhores resultados

do protocolo de MCL, descrito nos itens: 3.4.2 e 3.4.3. As anlises protemicas

foram realizadas tambm de acordo com o protocolo mais adequado,

apresentado na sesso: 3.5.

36

4. RESULTADOS

37

4.1 Protocolo para a realizao da tcnica de MCL

4.1.1 Definio do plano ideal para a MCL da substncia negra

Fundamentado na neuroanatomia da regio analisada, o plano sagital foi

o escolhido, por propiciar o reconhecimento mais fcil da camada da pars

compacta e dos neurnios. Alm disso, as fibras neuronais se encontram

dispostas de maneira que contribuem com o reconhecimento dos neurnios

(Figura 14).

Figura 14. Diferena neuroanatmica dos neurnios da substncia negra visualizados atravs de (A) plano horizontal (B) plano sagital. Magnitude: 20x. Cedido por Helmut Heinsen.

4.1.2 Mtodo de congelamento para MCL

A anlise qualitativa das lminas demostrou que h maior preservao,

integridade e melhor qualidade do material nas amostras congelados

primeiramente em nitrognio lquido e em seguida armazenadas em freezer -

80C. As fotos das lminas analisadas esto apresentadas na Figura 15.

38

Figura 15. Comparao da otimizao do procedimento de congelamento para MCL. Na figura A o tecido foi congelado em freezer -20C e armazenado a -80C. Figura B o tecido foi congelado diretamente a -80C. Na figura C o tecido foi congelado por imerso em nitrognio lquido e armazenado em -80C. Arquivo pessoal

39

4.1.3 Espessura do corte para MCL

Ensaios de quatro espessuras diferentes (5 m, 10 m, 20 m e 30 m)

revelaram que a preciso de corte a laser diminui com o aumento da

espessura. Ns utilizamos 5-10 m para isolar apenas neurnios e 10-20 m

para dissecar regies da substncia negra. Essas definies possibilitaram

melhor delimitao e exigiram apenas um nico tiro de laser para rea

microdissecada ser ejetada (Figura 16).

Figura 16. Otimizao da espessura ideal para o isolamento de neurnios da substncia negra. Quatro espessuras diferentes foram testadas: 5 m (A), de 10 m (B), 20 m (C) e 30 m (D). Arquivo pessoal.

4.1.4 Colorao do tecido

40

A utilizao do violeta de cresila como corante minimizou a colorao de

fundo, proporcionou que as clulas fossem facilmente reconhecidas e no

interferiu nas anlises protemicas.

4.2 Otimizao do protocolo de preparao das amostras para

espectrometria de massas

4.2.1 Otimizao da soluo de coleta das amostras microdissecadas

As clulas para anlises protemicas devem ser isoladas em soluo

otimizada. Foram testadas duas solues diferentes (gua e 50% de

acetonitrila) utilizando toda regio da substncia negra pars compacta. A

anlise por espectrometria de massa revelou quantidades iguais de protenas

identificadas, aps isolamento em gua ou acetonitrila. Por no observamos

diferenas relevantes, a gua foi soluo de coleta selecionada para realizar

a MCL pela facilidade de utilizao.

4.2.2 Ajustes na MCL para anlises por espectrometria de massas

Avaliamos a rea que deve ser isolada para uma adequada anlise por

espectrometria de massas. A rea necessria depende diretamente do tipo de

tecido e da espessura do mesmo. Pelo menos, 100ng de protenas devem ser

coletados para uma anlise eficaz por espectrometria de massas. Assim,

verificamos que, 25.000.000 de m2 de rea foi necessrio para analisar toda a

regio da substncia negra em fatias cortadas a 20m de espessura. Em

relao ao isolamento de apenas neurnios, um total de aproximadamente

2.500 neurnios (1.500.000 m2) foram isolados cortados a 10 m de

espessura.

41

4.2.3 Preparao das amostras e anlise por espectrometria de

massas

Neste trabalho, um protocolo padro de digesto com tripsina foi

realizado para estudar a substncia negra. Foram analisados os nmeros de

protenas identificadas, as suas localizaes e os tipos. Utilizando este

protocolo foi possvel identificar 1.144 protenas da substncia negra.

Analisando a regio toda da substncia negra pars compacta a maior

parte das protenas estavam localizadas no citoplasma (66%). As protenas que

foram associadas com a membrana plasmtica somaram 15% do total dos

grupos de protenas identificadas. Tambm foi avaliada a distribuio dos tipos

de protenas. No total, 13% das protenas foram identificadas como

transportadoras (11%) e como protenas de canal inico (2%).

Em relao s anlises de apenas neurnios encontramos padro

semelhante de distribuio. Do total de 303 protenas identificadas, 71%

estavam localizadas no citoplasma. Com relao s protenas associadas com

a membrana plasmtica, o resultado foi de 14%. No total, 12% foram

associadas a protenas transportadoras e 1% a protenas de canal, compondo

13% das protenas identificadas. Estes resultados indicam que o protocolo de

digesto com tripsina pode ser utilizado para investigaes protemicas do

encfalo humano. Na Figura 17, os resultados desta anlise esto resumidos,

de modo proporcionar uma viso do proteoma da substncia negra.

42

Figura 17. Anlise por espectrometria de massas da substncia negra. Um total de 1.144 protenas foram identificadas em todo o tecido da substncia negra (parte esquerda da figura), na parte superior da figura as anlises de acordo com a sua localizao e tipo (parte inferior da figura). Arquivo pessoal.

43

5. DISCUSSO

44

Neste trabalho, descrevemos e validamos uma abordagem para estudar

populaes de neurnios da substncia negra utilizando a tcnica de

microdisseco e captura a laser. Esta abordagem foi eficaz para aplicao

protemica e embora nosso enfoque tenha compreendido apenas os neurnios

com neuromelanina da substncia negra de humanos, este protocolo pode ser

adequado para outros tipos de clulas em seres humanos, bem como em

modelos animais.

A combinao de tcnicas que permitem a disseco precisa de clulas

individuais de um determinado tecido e posterior anlise molecular de grande

interesse na rea cientifica, pois permite uma compreenso mais profunda

sobre os sistemas biolgicos, bem como os mecanismos que desencadeiam

doenas. Em nosso meio sua contribuio promissora, pois pode colaborar

de forma relevante com entendimento do tecido cerebral, das doenas

relacionadas ao envelhecimento, sobretudo as doenas neurodegenerativas,

incluindo a doena de Parkinson.

Mudanas nas populaes neuronais especficas so comumente

mascarados em anlises globais, onde os encfalos inteiros ou partes dele ao

invs de grupos de clulas especficas so homogeneizados para posteriores

anlises. O mesmo ocorre em outros rgos. Em 2015, Datta e colaboradores

exemplificaram que micitos e fibroblastos possuem respostas diferentes

diante ao infarto do miocrdio, portanto avaliaes coletivas destes tipos

celulares podem no colaborar com a compreenso da doena.

Na pesquisa biomdica, muitas estratgias surgiram e tm sido

aplicadas, visando entender o que fisiolgico, patolgico e o limite entre

ambos. Entre estas tcnicas, se destaca a microdisseco e captura a laser,

desenvolvida em 1996 e que permite o isolamento de clulas especficas

dentro de um tecido (Emmert-Buck et al., 1996). Em combinao com mtodos

que permitem a anlise de pequenos volumes de amostras, novos insights

sobre cascatas patolgicas, opes de terapia, neuroproteo e biomarcadores

pr-clnicos podem se tornar possveis. No entanto, a combinao destas

tcnicas recentes apresentam limitaes, dependendo dos objetivos do estudo.

45

No presente estudo, ao focar em neurnios da substncia negra de

idosos cognitivamente e neuropatologicamente normais, nosso objetivo foi

superar alguns obstculos tcnicos e adequar o protocolo de modo que ele

possa ser usado em outras abordagens.

5.1 Plano anatmico ideal para a MCL da substncia negra

Em 1865, o psiquiatra e neuroanatomista francs Jules-Bernard Luys,

contribuiu significativamente com o entendimento da anatomia do crebro

humano. Em seu livro, Luys desvendou a organizao celular de vrios

componentes dos ncleos da base e apresentou as primeiras imagens dos

neurnios da substncia negra. Ele tambm observou que os neurnios da

substncia negra eram intensamente corados porque continham pigmentos

escuros (Luys, 18651 apud Parent e Parent, 2010). Aps o trabalho pioneiro de

Luys, outros pesquisadores forneceram descries detalhadas sobre a

substncia negra humana. Em 1910, Torata Sano subdividiu a substncia

negra em pars compacta, no qual abrigava uma populao de neurnios

densamente pigmentados, e pars reticulata, que continha um nmero menor de

neurnios pigmentados (Sano, 19102 apud Parent e Parent, 2010).

Desde ento, diversos autores tem caracterizado a substncia negra, as

definies e terminologias que incluem divises e sub-regies variam de autor

para autor (Braak e Braak, 1986; Fearnley e Lees, 1991; Gibb e Lees, 1991;

van Domburg e ten Donkelaar, 1991; McRitchie et al., 1995; McRitchie et al.,

1996; Damier et al., 1999a;).

No entanto, at o momento, na literatura no h um consenso sobre a

organizao interna da substncia negra humana, h falta de dados normativos

1 Luys JB. Recherches sur le systme nerveux crbro-spinal text. Baillire. 1865.

2 Sano D. Beitrag zur vergleichenden Anatomie der Substantia nigra, des Corpus Luysii und der Zona incerta.(Fortsetzung). European Neurology.1910;27(3);274-283.

46

validados especialmente para os indivduos mais idosos. Por esta razo, ns

utilizamos o mtodo de incluso em celoidina (Cabello et al., 2002) para

analisar a morfologia e determinar o melhor plano para a coleta dos neurnios.

A tcnica histolgica foi escolhida por ainda ser considerada o padro-

ouro para a descrio precisa da neuroanatomia e para a caracterizao do

tecido cerebral (Dauguet et al., 2007).

5.2 Processo de congelamento para MCL

A microdisseco e captura a laser revolucionou a anlise molecular de

tecidos complexos, porque combina a preciso topogrfica da microscopia com

o poder da genmica, protemica, entre outros. No entanto, o sucesso das

anlises moleculares ainda depende do desenho experimental e exige a

compreenso de cada etapa tcnica envolvida na preparao das amostras.

Ao realizar buscas de dados literrios, notrio que tecidos embebidos

em parafina e tecidos congelados so os mtodos de preparo mais comumente

utilizados para realizar a MCL. Na neurocincia, ambos so recursos

inestimveis para estudos moleculares das doenas que afetam o sistema

nervoso central, especialmente os distrbios neurodegenerativos (Wang et al.,

2013).

Em nosso trabalho, optamos por realizar anlises protemicas utilizando

tecido fresco congelado, fundamentados pelo fato de que, o tecido fresco

preserva a integridade do RNA e protenas (Goldsworthy et al., 1999) e

amostras de tecidos congelados so considerados padro-ouro para anlises

moleculares (Perlmutter et al., 2004) e imperioso para anlises protemicas.

Wang e colaboradores, em 2013, identificaram que o mtodo ideal para

extrao de DNA do tecido enceflico humano obtido a partir do tecido

congelado. Eles descreveram que embora o DNA possa ser extrado de ambas

amostras, eles alcanaram 100% na taxa de sucesso de extrao de DNA do

tecido congelado, comparado a 76% em tecido parafinizado.

47

Atravs da tcnica de cromatografia lquida, Scicchitano e colegas

(2009) compararam amostras embebidas em parafina e amostras congeladas e

verificaram que o rendimento de protenas foi menor nas amostras fixadas em

formalina. Eles ainda ressaltaram que so necessrios mtodos fiveis para a

obteno de perfis protemicos em amostras fixadas e embebidas em parafina,

j que as anlises protemicas de suas amostras foram confundidas, induzidas

pelo processo conhecido como cross-linking ou ligaes cruzadas.

Alm disso, a parafina no tem se mostrado compatvel com LC-MS/MS

porque requer um passo de desparafinizao, resultando na perda de protenas

(Hood et al., 2005; Hood et al., 2006).

Ainda buscando o mtodo ideal para preservar a integridade e a

morfologia do tecido em estudo, e para minimizar possveis erros em nossas

anlises, testamos diferentes protocolos de congelamento. De acordo com os

resultados obtidos neste trabalho, podemos afirmar que o melhor mtodo de

congelamento a imerso do tecido em nitrognio lquido e o imediato

armazenamento em freezer a -80C. A congelao lenta promove a formao

de cristais de gelo no interior do tecido, que se expande e promove o

rompimento das clulas e tecidos. Destacamos a importncia de congelar o

tecido rapidamente evitando assim a cristalizao da gua. A utilizao de

nitrognio lquido permite que a gua se transforme em estado vtreo, que no

se expande.

Em relao conservao do material, Ferrer et al. (2007) e

Kretzschmar (2008) relataram que amostras armazenadas em freezer a -80C

permanecem adequados para estudos moleculares por anos.

5.3 Espessura do corte para MCL

A MCL um processo que depende de vrios parmetros, cada um dos

quais deve ser otimizado para cada tipo de amostra. As configuraes so

influenciados pelo tipo de tecido a ser isolado. Portanto, essencial investigar

essas configuraes para cada coleta.

48

Para avaliar a capacidade de preciso do corte a laser, foram analisados

neste trabalho diferentes espessuras de corte. Muitos autores (Kerk, 2003;

Rodriguez et al., 2008) defendem que esta determinao um passo crucial

para estudos utilizando MCL. Em particular, a espessura de corte essencial

para o bom processamento da microdisseco a laser.

Nossos achados revelaram que a preciso do corte a laser diminui com

o aumento da espessura e esses resultados vo de acordo com os de Curran

et al., 2000; Wang et al., 2009; De Carlo et al., 2011. Estes autores

descreveram que so necessrias energias mais elevadas para seces de 20

m de espessura quando comparados a seces de 10 m. Alm disso, em

cortes mais espessos so necessrias duas ou trs emisses de laser para

cortar e catapultar o tecido.

Para Wang et al. (2009) a preciso do corte de 5 m e 10 m de

espessura possibilitou que at mesmo clulas muito pequenas fossem

isoladas, sem danificar o tecido adjacente.

Embora nosso achado de realizar os cortes a 10 m concorde com

outros trabalhos (Gyrkey et al., 1967; Dembinsky et al., 2007; Reidel et al.,

2011) muitos estudos (Mikulowska-Mennis et al., 2002; Hommel et al., 2003;

Park e Cunningham, 2007; Stephenson et al., 2007; St Martin et al., 2007;

Grndemann et al., 2008) so realizados utilizando diferentes espessuras,

indicando que, para diferentes objetivos e tecidos, diferentes espessuras

devem ser testadas.

5.4 Colorao para MCL

Desde a inveno original da MCL na dcada de 1990, esta tecnologia

continua a avanar e evoluiu consideravelmente em vrios aspectos. (Tangrea

et al., 2011; Jensen, 2013). No entanto, a resoluo ptica ainda limitada.

Se tem demonstrado na literatura, um grande nmero de procedimentos

de colorao para a MCL, entretanto, o uso lamnulas incompatvel (Fend et

al., 2000), pois impossibilita a microdisseco e captura das amostras. A

49

ausncia de lamnulas induz uma cor mais escura do tecido e produz uma

imagem pouco ntida da amostra. Para obter um melhor background, ou seja,

um fundo que no interfira na identificao das clulas, a amostra pode ser

incubada com uma concentrao mais elevada de soluo de colorao, no

entanto, este procedimento pode afetar negativamente a anlise protemica

(Gutstein e Morris 2007).

A colorao um mtodo muito til para reconhecer detalhes

histolgicos, distinguir diferentes padres de tecidos/clulas e tem importante

papel nas experincias com a tcnica de MCL (Fend et al., 2000; Wang et al.,

2006). No entanto, a especificidade do processo de colorao e o seu efeito

sobre a amostra, devem ser considerados (Standaert, 2005). A literatura

contm inmeros diferentes protocolos de colorao adequados para a tcnica

de MCL. Coloraes comuns incluem: Hematoxilina e Eosina (HE) (De Souza

et al., 2004; Dos Santos et al., 2007.); azul de toluidina (Lawrie et al., 2001;

Kirana et al., 2009; Sridharan e Shankar 2012; Kulkarni et al., 2013) e violeta

de cresila (Aaltonen et al., 2011; Boone et al., 2013). A tcnica de imuno-

histoqumica tambm utilizada para realizar a MCL (Fend et al., 1999) e

permite distinguir tipos de clulas individuais, como neurnios (Pietersen et al.,

2009).

A escolha do procedimento de colorao depende no s da amostra,

mas tambm, dos procedimentos adicionais de processamento da amostra e

dos objetivos do estudo. Tcnicas de colorao tm um impacto significativo

sobre as propriedades do tecido e pode influenciar amplamente a anlise do

proteoma. Portanto, em nosso estudo era essencial que a tcnica de colorao

no interfirisse com as protenas, que fosse compatvel com MCL e com

anlise por espectrometria de massas. Por exemplo, investigaes anteriores

demonstraram que a colorao de HE no compatvel com a anlise de

protemica (Ahram et al.