Universidade Federal do Rio Grande do Norte

Centro de Biociências

Departamento de Biologia Celular e Genética

Laboratório de Biologia Molecular e Genômica

Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia - RENORBIO

Análise proteômica de Chromobacterium violaceum: acúmulo

estacionário e diferencial após exposição à luz UVC

Aluna: Viviane Katielly Silva Medeiros

Orientador(a): Profª Drª Silvia Regina Batistuzzo de Medeiros

Área de Concentração: Biotecnologia em Saúde

NATAL

DEZEMBRO/2011

VIVIANE KATIELLY SILVA MEDEIROS

Análise proteômica de Chromobacterium violaceum: acúmulo

estacionário e diferencial após exposição à luz UVC

NATAL

DEZEMBRO/2011

Tese de Doutorado apresentada ao

Departamento de Biologia Celular e Genética da

Universidade Federal do Rio Grande do Norte

como requisito para a obtenção do título de

Doutor(a) em Biotecnologia.

Orientadora: Prof.a Dr.a Silvia Regina Batistuzzo

de Medeiros

VIVIANE KATIELLY SILVA MEDEIROS

Análise proteômica de Chromobacterium violaceum: acúmulo estacionário e diferencial após exposição à luz UVC

Tese de Doutorado apresentada ao Departamento de Biologia Celular e

Genética da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito para

a obtenção do título de Doutor(a) em Biotecnologia.

Aprovada em: / / ___________________________________________________ Prof.a Dr.a Silvia Regina Batistuzzo de Medeiros (Orientadora) Departamento de Biologia Celular e Genética – UFRN ___________________________________________________ Prof.a Dr.a Lucymara F. Agnez Lima Departamento de Biologia Celular e Genética – UFRN ___________________________________________________ Prof.º Dr.º João Paulo Matos Santos Lima Departamento de Bioquímica – UFRN ___________________________________________________ Prof.º Dr.º Carlos Priminho Pirovani Departamento de Ciências Biológicas, Genética e Bioquímica – UESC ___________________________________________________ Prof.º Dr.º Thalles Barbosa Grangeiro Departamento de Biologia - UFC

ii

Aos meus pais, Louro e Socorro,

que mesmo distante sempre

estiveram ao meu lado.

iii

Agradecimentos

Agradeço à Professora Silvia Batistuzzo pelos ensinamentos, paciência

e apoio.

Aos meus anjos de Ilhéus professor Priminho e Ângela. Priminho, um

exemplo de pessoa e pesquisador que me ajudou no momento em que mais

precisei e com quem aprendi a ser uma pesquisadora e, acima de tudo, uma

pessoa melhor. Ângela que me recebeu como uma irmã, me dando força e

coragem para não desistir frente às inúmeras dificuldades.

Aos meus amigos do LBMG que tornaram os dias estressantes bem

mais alegres. Em especial ao grupo prote-chromo (Daniel e Fábio) que me

recebeu de braços abertos, sempre dispostos a ajudar e a tornar os problemas

mais fáceis de serem resolvidos. Em especial a Fábio por todo o apoio e

incentivo, mesmo à distância compartilhou todos os momentos do

desenvolvimento desta tese, você é meu orgulho!

Aos colegas do grupo de células-tronco que participaram do primeiro

projeto da tese, obrigada pela ajuda e pelos bons momentos.

Aos amigos da UNIVASF Kyria, Luciana Andrade, Rodrigo, Serginho,

Luciana Macatrão e Karen, sem vocês eu não teria conseguido. Em especial a

Lu Andrade que mais que uma amiga, é como uma irmã pra mim.

A Tia Milagres, Ana e Linardo que deram apoio nos momentos mais

difíceis, vocês são mais que família.

Aos membros da banca por aceitarem participar desta defesa.

Ao CNPq pelo financiamento do projeto.

A FACEPE pela bolsa concedida.

iv

RESUMO

Chromobacterium violaceum é um bacilo de vida-livre, Gram-negativo

comumente encontrado no solo e nas águas de regiões tropicais e subtropicais.

Uma das principais características deste organismo é sua capacidade de

produzir o pigmento violaceína, o qual apresenta inúmeras atividades

biológicas. Em 2003, o genoma deste organismo foi completamente

sequenciado e revelou informações importantes sobre a fisiologia desta

bactéria. Porém, poucos estudos pós-genômicos tem sido realizados. Este

trabalho avaliou o perfil proteico de C. violaceum cultivada em meio LB a 28ºC,

o que permitiu a identificação de proteínas relacionadas a um possível sistema

de secreção ainda não identificado e caracterizado em C. violaceum, ao

sistema quorum sensing, a processos regulatórios da transcrição e tradução,

adaptação ao estresse e ao potencial biotecnológico. Além disso, a resposta

desta bactéria à radiação UVC foi avaliada. A comparação do perfil protéico,

analisado por eletroforese 2-D, do controle versus tratado possibilitou a

identificação de 52 proteínas que surgiram após a indução do estresse. Os

resultados obtidos permitiram a elaboração de uma via de resposta de C.

violaceum ao estresse gerado pela luz UVC. Esta via, que parece ser de

resposta geral ao estresse, envolve a expressão de proteínas relacionada à

divisão celular, metabolismo de purinas e pirimidinas, choque térmico ou

chaperonas, fornecimento de energia, regulação da formação de biofilme,

transporte, regulação do ciclo lítico de bacteriófagos, além de proteínas que

ainda não apresentam função caracterizada. Apesar da reposta apresentar

similaridades com a SOS clássica de E. coli, ainda não podemos afirmar que C.

violaceum apresenta uma resposta SOS-like, principalmente devido a ausência

da caracterização de um proteína LexA-like neste organismo.

Palavras-chave: C. violaceum, UVC, T6SS, proteome, resposta SOS, biofilme

v

ABSTRACT

Chromobacterium violaceum is a free-living bacillus, Gram-negative commonly

found in water and sand of tropical and subtropical regions. One of its main

characteristic it's the ability to produce the purple pigment named violacein, that

shows countless biological activities. In 2003, the genome of this organism was

totally sequenced and revealed important informations about the physiology of

this bacteria. However, few post-genomics studies had been accomplished.

This work evaluated the protein profile of C. violaceum cultivated in LB medium

at 28ºC that allowed the identification and characterization of proteins related to

a possible secretion system that wasn't identified and characterized yet in C.

violaceum, to the quorum sensing system, to regulatory process of transcription

and translation, stress adaptation and biotechnological potential. Moreover, the

response of the bacteria to UVC radiation was evaluated. The comparison of

the protein profile, analyzed through 2-D electrophoresis, of the control group

versus the treatment group allowed the identification of 52 proteins that arose

after stress induction. The obtained results enable the elaboration of a stress

response pathway in C. violaceum generated by the UVC light. This pathway,

that seems to be a general stress response, involves the expression of proteins

related to cellular division, purine and pirimidine metabolism, heat chock or

chaperones, energy supply, regulation of biofilm formation, transport, regulation

of lytic cycle of bacteriophages, besides proteins that show undefined function.

Despite the response present similarities with the classic SOS response of E.

coli, we still cannot assert that C. violaceum shows a SOS-like response, mainly

due to the absence of characterization of a LexA-like protein in this organism.

Key-words: C. violaceum, UVC, T6SS, proteome, SOS response, biofilm

vi

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Estrutura molecular da violaceína. 10 Figura 2. Estrutura esquemática do sistema de secreção tipo III indicando

proteínas que formam cada componente 13

vii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Principais categorias de proteínas de membrana relacionadas ao

transporte anotadas no genoma de C. violaceum 17 Tabela 2. Proteínas relacionadas à resposta SOS em C. violaceum 19

viii

LISTA DE ABREVIATURAS

DNA: ácido desoxirribonucléico

EROs: Espécies Reativas de Oxigênio

MMS: metilmetanosulfonato

MMC: mitomicina-C

TTSS: sistema de secreção tipo III

UVA: radiação ultravioleta A

UVB: radiação ultravioleta B

UVC: radiação ultravioleta C

i

SUMÁRIO

RESUMO iv

ABSTRACT v

LISTA DE FIGURAS vi

LISTA DE TABELAS vii

LISTA DE ABREVIATURAS viii

1. INTRODUÇÃO 7

2. REVISÃO DA LITERATURA 8

2.1. Breve histórico 8

2.2. Chromobacterium violaceum: um organismo com alto potencial

biotecnológico 9

2.3. A violaceína e suas propriedades 10

2.4. Patogenicidade 12 2.5. Tolerância ao estresse e adaptabilidade ambiental de C. violaceum 14

2.6. Proteínas de transporte em C. violaceum 16

2.7. Sistema SOS e C. violaceum 18

2.8. Proteômica como ferramenta para o entendimento do metabolismo

bacteriano 20 3. OBJETIVOS 22 3.1. Objetivo geral 22

3.2. Objetivos Específicos 22 4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 23 5. MANUSCRITOS 32

6. CONSIDERAÇÕES GERAIS 147

7. PERSPECTIVAS 148

22  

3. OBJETIVOS

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4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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31

J.; Brigido, M.M.; Brito, C.A.; Brocchi, M.; Buryti, H.A.; Camargo, A.A.; Cardoso,

D.D.P.; Carneiro, N.P.; Carraro, D.M.; Carvalho, C.M.B.; Cascardo, J.C.M.;

Cavada, B.S.; Chueire, L.M.O.; Creczynski-Pasa, T.B.; Cunha Junior, N.C.;

Fagundes, N.; Falcão, C.L.; Fantinatti, F.; Farias, I.P.; Felipe, M.S.S.; Ferrari,

L.P.; Ferro, J.A.; Ferro, M.I.T.; Franco, G.R.; Freitas, N.S.A.; Furlan, L.R.;

Gazzinelli, R.T.; Gomes, E.A.; Gonçalves, P.R.; Grangeiro, T.B.; Grattapaglia, D.;

Grisard, E.C.; Hanna, E.S.; Jardim, S.N.; Laurino, J.; Leoi, L.C.T.; Lima, L.F.A.;

Loureiro, M.F.; Lyra, M.C.C.P.; Madeira, H.M.F.; Manfio, G.P.; Maranhão, A.Q.;

Martins, W.S.; Mauro, S.M.Z.; Medeiros, S.R.B.; Meissner, R.V.; Moreira, M.A.M.;

Nascimento, F.F.; Nicolas, M.F.; Oliveria, J.G.; Oliveira, S.C.; Paixão, R.F.C.;

Parente, J.A.; Pedrosa, F.O.; Pena, S.D.J.; Pereira, J.O.; Pereira, M.; Pinto,

L.S.R.C.; Pinto, L.S.; Porto, J.I.R.; Potrich, D.P.; Ramalho Neto, C.E.; Reis,

A.M.M.; Rigo, L.U.; Rondinelli, E.; Santos, E.B.P.; Santos, F.R.; Schneider,

M.P.C.; Seuanez, H.N.; Silva, A.M.R.; Silva, A.L.C.; Silva, D.W.; Silva, R.;

Simões, I.C.; Simon, D.; Soares, C.M.A.; Soares, R.B.A.; Souza, E.M.; Souza,

K.R.L.; Souza, R.C.; Steffens, M.B.R.; Steindel, M.; Teixeira, S.R.; Urmenyi, T.;

Wassen, R.; Zaha, A.; Simpson, A.J.G. The complete genome of

Chromobacterium violaceum reveals remarkable and exploitable bacterial

adaptability. Proc. Natl. Acad. Sci. USA v.100, p. 11660-11665, 2003.

UEDA, H.; NAKAJIMA, H.; HORI, Y.; GOTO, T.; OKUHARA, M. FR901228, a

novel antitumor bicyclic depsipeptide produced by Chromobacterium violaceum.

Biosci. Biotechnol. Biochem. 58, 1579–1583, 1994.

WOOLEY, P.G. Bacillus violaceus manila (a pathogenic organism). Bull John

Hopkins Hospital v. 16, p. 89-93, 1905.

ZIMMERMAN, B. Review of Bergonizi on Chromobacterium, Bo. Centralbl. v.4, p.

1528-1530, 1881.

142

6. CONSIDERAÇÕES GERAIS

Os resultados obtidos nos dois manuscritos apresentados auxiliaram no

entendimento mais detalhado acerca do metabolismo basal de C. violaceum e

nas mudanças deste metabolismo frente ao estresse gerado pela radiação UV.

Os artigos são pioneiros no estudo proteômico deste organismo e abre

possibilidades no que se refere aos estudos pós-genômicos realizados até

então.

143

7. PERSPECTIVAS

Outros experimentos além dos apresentados nesta tese foram

realizados. Entre eles podemos citar a proteômica de uma cepa mutante no

operon de síntese da violaceína, exposta ou não a radiação UVC.

A proteômica desta cepa mutante sem exposição à radiação UVC foi

realizada com o intuito de auxiliar no entendimento da função deste pigmento

no contexto fisiológico bacteriano. O gel de referência das proteínas desta

bactéria mutante apresentou 365 spots. Quando comparado com o gel de

referência da cepa selvagem (Artigo: Medeiros, et. al., 2011) foram observados

apenas 165 spots em comum. Os resultados da expressão diferencial na

ausência da violaceína mostram que este pigmento bloqueia a produção de

algumas proteínas, todavia na sua ausência surgem 200 spots, os quais já

foram tripisinisados e estão sendo identificados por MS.

A exposição da cepa mutante à radiação UVC também foi realizada. No

controle foram identificados 148 spots e 243 no tratado, onde apenas 81 spots

foram comuns a ambas. Todos os spots que sugiram após o tratamento foram

tripsinisados e 73 foram identificados, correspondendo a 57 proteínas

diferentes. A análise da resposta da bactéria na ausência da violaceína poderá

ser útil para verificar a existência de um possível papel protetor deste pigmento

frente ao estresse gerado pela luz UVC.

Estes resultados possibilitarão a publicação de, pelo menos, mais dois

artigos científicos oriundos desta tese de doutorado.