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Marcus Vinicius de Paula Pereira Júnior

Análise molecular de lesões causadas no DNA pela

fotoquimioterapia PUVA (psoralenos + ultravioleta A)

Dissertação submetida à Universidade Federal do Rio de Janeiro, visando à

obtenção do grau de Mestre em Ciências Biológicas (Biofísica)

Universidade Federal do Rio de Janeiro

Centro de Ciências da Saúde

Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho

2009

Livros Grátis

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Milhares de livros grátis para download.

Este trabalho foi desenvolvido sob orientação do Prof. Dr. Alvaro Augusto da

Costa Leitão e co-orientação da Profª Drª Claudia de Alencar Santos Lage, no

Laboratório de Radiobiologia Molecular do Instituto de Biofísica Carlos Chagas

Filho da Universidade Federal do Rio de Janeiro, com auxílios concedidos por:

CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico), CAPES

(Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) e FAPERJ

(Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de

Janeiro).

de Paula Pereira Jr., Marcus Vinicius

Análise molecular de lesões causadas no DNA pela fotoquimioterapia

PUVA (psoralenos + ultravioleta A) / Marcus Vinicius de Paula Pereira Júnior –

Rio de Janeiro: UFRJ/CCS/IBCCFº, 2009.

130f.; 30cm.

Orientadores: Alvaro Augusto da Costa Leitão e Claudia de Alencar Santos

Lage

Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Rio de Janeiro, Centro

de Ciências da Saúde, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, 2009.

Referências Bibliográficas: f 107-117.

1 Fotoquimioterapia PUVA. Lesões. DNA. I. Leitão, Alvaro Augusto da

Costa e Lage, Claudia de Alencar Santos. II. Universidade Federal do Rio de

Janeiro, Centro de Ciências da Saúde, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho.

III. Título.

“A humildade é o primeiro degrau para a sabedoria.”

São Tomás de Aquino

AGRADECIMENTOS

Em primeiríssimo lugar não poderia deixar de agradecer Àquele que todos

os dias me dá a força necessária para trilhar meus caminhos. Deus, meu criador

que, antes de tudo, agradeço por ter me oferecido o Dom, o Milagre da Vida.

Junto de Deus agradeço Àquele que me salvou e continua me salvando e

resguardando de todo mal: Jesus Cristo, Senhor da minha vida. E também minha

querida Mãe e Intercessora, Maria Santíssima, e toda a Milícia Celeste.

À obra de Deus que se faz aqui na Terra em minha vida: Meus

maravilhosos pais, Elisabete e Marcus Vinicius e meus irmãos José Roberto e

Danyelle (e meu cunhadão César), por toda força que me deram ao longo de todo

esse tempo. Vou agradecer eternamente a vocês pelo amor, pelo carinho

incondicional.

À minha grande e maravilhosa família, em especial, à minha avó Emilian,

minha tia e madrinha Valéria e meus primos Berta, Giovana e Alberto, sempre

pelo apoio e pelos momentos de alegria.

Aos meus grandes amigos da Família/Comunidade Pastoral da Crisma da

Paróquia Bom Jesus da Penha, onde, de domingo a domingo me passam, através

da alegria que vem de Deus, que vale a pena cada minuto de dedicação: “Nem as

torrentes das grandes águas, conseguirão apagar esse AMOR”.

Aos outros amigos: do Colégio Republicano, do Bahiense, da FIOCRUZ,

UFRJ e UNIRIO. Sempre serão lembrados, pois de maneiras sutis contribuíram

para o meu crescimento, para o meu amadurecimento.

Ao Prof. Dr. Alvaro Augusto da Costa Leitão pela orientação e pela

importantíssima contribuição para o meu crescimento dentro da pesquisa

científica.

À Profª Drª Claudia de Alencar Santos Lage por todos estes anos de

descoberta, de amizade e pelo grande incentivo.

Às Professoras Marcia Regina Soares da Silva (Instituto de Química -

UFRJ) e Luzineide Wanderley Tinoco (Núcleo de Pesquisas de Produtos Naturais

- UFRJ), por todas as ajudas e por me introduzirem nas áreas de Espectrometria

de Massas e Ressonância Magnética Nuclear, desmistificando as dificuldades de

ambas as técnicas.

À Margareth Sugano Navarro, responsável técnica pelo Laboratório de

Espectrometria de Massas (MAS), do Centro de Biologia Molecular e Estrutural

(CeBiME) do Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS) pela orientação na

utilização do espectrômetro.

Aos companheiros do Laboratório de Radiobiologia Molecular: Larissa,

Tula, Tatiana, Leonardo, Adriana, Luciana, Deise, Janine, Ritinha, Barbara,

Gabriel, Ivan, Renata, Juliana, Jéssica. Por estes já cinco anos de constante

convivência, incluindo grandes momentos de aprendizado e também pelos

momentos de descontração. E em especial: Mariana e Roberto, pela realização de

uma importante amizade, com direito a muitos momentos engraçados.

Aos companheiros do Laboratório de Genética Aplicada (INCA): Vanessa,

Vivian(s), Ana Júlia, Danielle, Lorena, Cintia, Rodrigo, Thayse e em especial à Drª

Gilda Brown e à Drª Denise Pereira. Pela ótima receptividade, pelos grandes

ensinamentos e pelos almoços engraçados no Centro da Cidade.

Ao Dr. Arthur Eugen Kümmerle, do Laboratório de Avaliação e Síntese de

Substâncias Bioativas, da Faculdade de Farmácia da UFRJ, pela síntese de

H28MOP.

Aos financiadores que permitiram a exequibilidade desta dissertação:

FAPERJ, CNPq e CAPES.

E a todas as pessoas que, ao longo destes anos, contribuíram de alguma

forma para a realização da obra. Minha mais sincera gratidão!

Resumo

A fotoquimioterapia PUVA consiste na ação combinada entre moléculas de psoralenos

(furocumarinas) e a radiação ultravioleta A (UV-A – 320 a 400nm), sendo utilizada no

tratamento de diferentes desordens dermatológicas, como psoríase e vitiligo, e em

patologias mais graves como o linfoma cutâneo de células T. Os psoralenos são

compostos tricíclicos, que possuem uma estrutura planar básica e que apresentam duas

ligações duplas, sendo uma presente no anel furano (carbonos 4‟ e 5‟) e a outra no anel

pirona da molécula (carbonos 3 e 4) que, quando ativadas fotoquimicamente, podem

interagir com as bases pirimidínicas, resultando na formação de adutos com o DNA das

células. Estas ligações formadas, do tipo anel ciclobutano, são estruturalmente estáveis,

podendo ser formadas com as bases de apenas uma das fitas de DNA (monoadutos) ou,

havendo uma base pirimidínica na fita oposta do DNA, forma-se uma segunda ligação

(crosslink). O objetivo deste trabalho é estudar os efeitos da terapia PUVA na formação

de lesões no DNA por meio de ensaios que correlacionem a eficiência dos mecanismos

de reparo na remoção dos adutos PUVA e da utilização de ferramentas de análise destas

lesões. Experimentos de sobrevivência bacteriana foram realizados, utilizando cepas de

Escherichia coli, selvagem e mutantes em genes de reparo por excisão de nucleotídeos

(NER) uvrABC. Amostras de DNA bacteriano tratadas com PUVA foram extraídas e

analisadas via Espectrometria de Massas e foram realizados ensaios in vitro com

oligonucleotídeos tratados e analisados através de espectroscopia de Ressonância

Magnética Nuclear de 1H. Diferentes psoralenos foram utilizados nos experimentos,

dentre eles: 8MOP, seu análogo monofuncional H28MOP, PSO, ANG, DMC e TMP. Os

resultados indicaram que o mecanismo de reparo NER é importante na remoção dos

adutos PUVA, embora alguns resultados tenham indicado uma via alternativa de

reparação, com a participação da proteína UvrB. As análises de Espectrometria de

Massas sugeriram a formação de uma grande variedade de lesões (dímeros, monoadutos

e crosslinks) e os espectros de RMN também mostraram deslocamentos dos hidrogênios

dos psoralenos que interagiram com o DNA. Tais resultados levantaram a questão do

potencial genotóxico do tratamento PUVA. Os adutos formados, não sendo corretamente

processados pelas células, se acumulam no DNA, com efeitos que podem levar à

mutagenicidade e à geração de células neoplásicas. Desta forma busca-se a utilização de

psoralenos que provoquem menos lesões e que sejam eficientes no controle das doenças

de pele.

Abstract

PUVA photochemotherapy relays in the interplay between psoralen molecules

(furocoumarines) and ultraviolet A (UV-A - 320 to 400nm). This therapy is used to treat

dermatological disorders such as psoriasis and vitiligo, and lethal diseases such as

cutaneous T cell lymphoma. Psoralens are tricyclic compounds that have a basic planar

structure with two double bonds, each one in opposite rings, the 4‟ 5‟ bond in the furan ring

and the 3, 4 bond in the pyrone ring. When activated photochemically, these regions

interact with nucleic acids targets, especially with the pyrimidine bases, forming adducts

with the pyrimidine bases of DNA. These cyclobutane bonds, are structurally stable and

can be formed with either one of DNA strands (monoadducts) or with two opposite

pyrimidine bases, forming the interstrand crosslinks. The objective of this work is the study

of the PUVA effects on the formation of DNA lesions, correlating them with the efficiency of

repair mechanisms for the removal of PUVA adducts. Bacterial survival experiments

revealed the dependence on nucleotide excision repair (NER) to recover from PUVA-

induced damage. Additionally, DNA bacterial samples were treated with PUVA and DNA

extracted and analyzed by Mass Spectrometry and in vitro tests were performed with

oligonucleotides, processed and analyzed by 1H Nuclear Magnetic Resonance

spectroscopy. Depending on the psoralen structure, mass spectrometry analysis indicates

the formation of a pool of lesions (base dimers, monoadducts and crosslinks) and the

NMR spectra also indicate distortions arising from the interaction between psoralens and

DNA in different degrees. Altogether, these results show the genotoxic potential of PUVA

treatment. If the adducts formed are not correctly processed by the cells, they accumulate

in DNA, with effects that may lead to the generation of mutagenicity and neoplastic cells.

This motivate the search for less-genotoxic, highly cytotoxic psoralens to control skin

diseases.

Lista de abreviaturas, siglas e símbolos

1D Espectro unidimensional

2D Espectro bidimensional

3-CPs 3-Carbetoxipsoraleno

8MOP 8-Metoxipsoraleno

ANG Angelicina

ATP Adenosine triphosphate (Adenosina trifosfato)

dA Desoxiadenosina

dG Desoxiguanosina

DMC Dimetoxicumarina

DNA Deoxyribonucleic Acid (Ácido Desoxirribonucléico)

D.O.600 Densidade ótica em comprimento de onda de 600nm

dT Desoxitimidina

E. coli Escherichia coli

HPLC High Performance Liquid Chromatography

(Cromatografia líquida de alta eficiência)

H28MOP 4‟5‟-H-8-Metoxipsoraleno

J Joule

K Kelvin

kJ kiloJoule

kV kiloVolt

MHz MegaHertz

MS Mass Spectrometry (Espectrometria de Massas)

m/z Relação massa/carga

NER Nucleotide Excision Repair (Reparo por Excisão de Nucleotídeos)

NOESY Nuclear Overhauser Enhancement Spectroscopy

(Espectroscopia do Efeito Nuclear de Overhauser)

OH. Radical hidroxila

ppm Parte por milhão

Psi Pound force per square inch (Libra por polegada quadrada)

PSO Psoraleno

PUVA Fotoquimioterapia de psoralenos mais luz ultravioleta A

Q-Tof Quadrupole time of flight (Quadrupolo tempo de vôo)

RMN Ressonância Magnética Nuclear

TMP 4,5,8-Trimetilpsoraleno

V Volt

W Watt

WT Wild type (Tipo selvagem)

Sumário

1. Introdução.....................................................................................................................17

1.1 Considerações..................................................................................................17

1.2 Fotobiologia.......................................................................................................18

1.2.1 Radiação Ultravioleta..................................................................................18

1.3 Cumarinas.........................................................................................................20

1.3.1 Estrutura de psoralenos e angelicinas........................................................20

1.3.2 Fotorreatividade dos psoralenos.................................................................21

1.3.3 Ocorrência na natureza...............................................................................22

1.4 Histórico da utilização dos psoralenos..............................................................23

1.5 Mecanismo de ação de psoralenos e angelicinas.............................................26

1.5.1 Formas de ação de fotossensibilizadores...................................................26

1.6 Fototerapia........................................................................................................29

1.6.1 Fototerapia com PUVA................................................................................29

1.6.2 PUVA imersão ou banho PUVA..................................................................30

1.6.3 Indicações da fototerapia............................................................................31

1.6.3.1 Vitiligo....................................................................................................31

1.6.3.2 Psoríase................................................................................................32

1.6.3.3 Micose fungóide....................................................................................32

1.6.4 Contra-indicações da fototerapia................................................................33

1.6.5 Efeitos colaterais do tratamento PUVA.......................................................33

1.7 Reparo de DNA.................................................................................................34

1.8.1 Reparo de DNA por Excisão de Nucleotídeos em Escherichia coli

(NER).......................................................................................................................35

2. Caracterização do Problema........................................................................................38

3. Objetivos........................................................................................................................39

3.1 Objetivo geral....................................................................................................39

3.2 Objetivos específicos........................................................................................39

4. Material e Métodos........................................................................................................40

4.1 Cepas bacterianas............................................................................................40

4.2 Meios de cultura, soluções e tampões salinos..................................................40

4.3 Manutenção e crescimento das cepas bacterianas..........................................41

4.4 Psoralenos........................................................................................................42

4.5 Luz ultravioleta A (UV-A): Calibração e utilização.............................................43

4.6 Tratamento PUVA – Sobrevivência bacteriana.................................................43

4.7 Extração do DNA...............................................................................................44

4.8 Hidrólise do DNA...............................................................................................47

4.8.1 Etapa pré-hidrólise......................................................................................47

4.8.2 Hidrólises enzimáticas.................................................................................47

4.9 Análise por espectrometria de massas.............................................................48

4.9.1 Roteiro de operação do Q-Tof.....................................................................50

4.10 Experimentos para análise por ressonância magnética nuclear.....................53

4.10.1 Obtenção e preparo dos oligonucleotídeos de DNA.................................53

4.10.2 Interação psoralenos-oligonucleotídeos....................................................55

4.10.3 Dose de luz ultravioleta A (UV-A)..............................................................55

4.10.4 Análise da interação oligonucleotídeo-psoraleno por ressonância

magnética nuclear...................................................................................................56

5. Resultados.....................................................................................................................59

5.1 Sobrevivência bacteriana ao tratamento PUVA................................................59

5.1.1 Tratamento com diferentes psoralenos bifuncionais...................................59

5.1.2 O caso do tratamento com 8MOP e seu análogo monofuncional,

H28MOP..................................................................................................................61

5.1.3 Tratamento com a cumarina monofuncional

dimetoxicumarina....................................................................................................61

5.2 Lesões PUVA analisadas por espectrometria de massas................................63

IA) Bases Nitrogenadas.......................................................................................64

IB) Psoralenos isolados.......................................................................................65

5.2.1 Lesões geradas pelo tratamento com UV-A..............................................66

2) Dímeros...........................................................................................................66

5.2.2 Lesões geradas pelo tratamento PUVA 8MOP + UV-A............................68

3A) Picos de lesões esperadas...........................................................................68

3B) Picos indicando lesões inéditas....................................................................69

5.2.3 Lesões geradas pelo tratamento PUVA PSO + UV-A...............................74


4B) Picos indicando lesões inéditas....................................................................74

5.2.4 Lesões geradas pelo tratamento PUVA ANG + UV-A...............................80


5B) Picos indicando lesões inéditas.....................................................................80

5.2.5 Lesões geradas pelo tratamento PUVA DMC + UV-A................................86

6A) Picos de lesões esperadas............................................................................86


5.2.6 Lesões geradas pelo tratamento PUVA TMP + UV-A................................91

7A) Picos de lesões esperadas............................................................................91


5.3 Lesões PUVA analisadas por ressonância magnética nuclear.........................97

5.3.1 Deslocamentos gerados pelo tratamento PUVA 8MOP + UV-

A..............................................................................................................................97

1) Deslocamento dos hidrogênios de 8MOP........................................................98

5.3.2 Deslocamentos gerados pelo tratamento PUVA PSO + UV-

A..............................................................................................................................98

2) Deslocamento dos hidrogênios de PSO..........................................................99

5.3.3 Deslocamentos gerados pelo tratamento PUVA 8MOP + UV-

A..............................................................................................................................99

3) Deslocamento dos hidrogênios de ANG........................................................100

6.Discussão.....................................................................................................................101

7. Perspectivas................................................................................................................106

8. Referências Bibliográficas.........................................................................................107

Anexo I – Espectros de massa das amostras tratadas com

PUVA....................................................................................................................118

IA) Picos das massas que sugerem a formação de dímeros.....................118

IB) Picos das massas que sugerem a formação de monoadutos.............120

IC) Picos das massas que sugerem a formação de crosslinks..................122

Anexo II – Espectros de RMN das amostras controle e tratadas com

PUVA....................................................................................................................128

IIA) Espectros dos experimentos envolvendo 8MOP..........................................128

IIB) Espectros dos experimentos envolvendo PSO...................................129

IIC) Espectros dos experimentos envolvendo ANG...................................130

Índice de figuras

Figura 1: Estrutura dos psoralenos e angelicinas..................................................21

Figura 2: Sítios fotoativos dos psoralenos: monofuncionais e bifuncionais...........22

Figura 3: Interação dos psoralenos com a molécula de DNA através da formação

de ligações covalentes envolvendo as bases pirimídicas de DNA e o lado pirona

do psoraleno (A), com o lado furano (B) e, havendo uma timina na fita oposta do

DNA, as duas fitas (crosslink).................................................................................27

Figura 4: Reparo por excisão de nucleotídeos em Escherichia coli......................37

Figura 5 (A, B e C): Sobrevivência ao tratamento PUVA das cepas de Escherichia

coli selvagem e deficientes em uvrA, uvrB e uvrC, utilizando diferentes psoralenos

(PSO, ANG e TMP), em diferentes concentrações, com uma única dose de 30

kJ/m2 de UV-A.........................................................................................................60

Figura 6 (A, B e C): Sobrevivência ao tratamento PUVA das cepas de Escherichia

coli selvagem e deficientes em uvrA, uvrB e uvrC, utilizando diferentes psoralenos

(8MOP, H28MOP e DMC), em diferentes concentrações, com uma única dose de

30 kJ/m2 de UV-A....................................................................................................62

Índice de quadro e tabelas

Quadro 1: Cepas utilizadas nos experimentos de sobrevivência..........................40

Tabela 1: Gradiente de solventes – Corrida das amostras....................................51

Tabela 2: Tratamento com UV-A (30kJ/m2) – Extração de DNA logo após o

tratamento...............................................................................................................67

Tabelas 3 (A e B): Adutos formados no DNA da cepa selvagem (A) e mutante uvrB (B)

pelo tratamento com PUVA 8MOP (1μM) + UV-A (30kJ/m2) – Extração de DNA logo após

o tratamento........................................................................................................................71


pelo tratamento com PUVA 8MOP (10μM) + UV-A (30kJ/m2) – Extração de DNA logo

após o tratamento...............................................................................................................72


pelo tratamento com PUVA 8MOP (10μM) + UV-A (30kJ/m2) – Extração de DNA duas

horas após o tratamento.....................................................................................................73


pelo tratamento com PUVA PSO (1μM) + UV-A (30kJ/m2) – Extração de DNA logo após o

tratamento...........................................................................................................................77


pelo tratamento com PUVA PSO (10μM) + UV-A (30kJ/m2) – Extração de DNA logo após

o tratamento........................................................................................................................78


pelo tratamento com PUVA PSO (10μM) + UV-A (30kJ/m2) – Extração de DNA duas horas

após o tratamento...............................................................................................................79

Tabelas 9 (A e B): Adutos formados no DNA da cepa selvagem (A) e mutante uvrB (B) pelo

tratamento com PUVA ANG (10μM) + UV-A (30kJ/m2) – Extração de DNA logo após o

tratamento..................................................................................................................................83


tratamento com PUVA ANG (75μM) + UV-A (30kJ/m2) – Extração de DNA logo após o

tratamento..................................................................................................................................84


tratamento com PUVA ANG (75μM) + UV-A (30kJ/m2) – Extração de DNA duas horas após o

tratamento..................................................................................................................................85


tratamento com PUVA DMC (10μM) + UV-A (30kJ/m2) – Extração de DNA logo após o

tratamento..................................................................................................................................88


tratamento com PUVA DMC (75μM) + UV-A (30kJ/m2) – Extração de DNA logo após o

tratamento..................................................................................................................................89


tratamento com PUVA DMC (75μM) + UV-A (30kJ/m2) – Extração de DNA duas horas após o

tratamento..................................................................................................................................90


tratamento com PUVA TMP (1μM) + UV-A (30kJ/m2) – Extração de DNA logo após o

tratamento..................................................................................................................................94


tratamento com PUVA TMP (10μM) + UV-A (30kJ/m2) – Extração de DNA logo após o

tratamento..................................................................................................................................95


tratamento com PUVA TMP (10μM) + UV-A (30kJ/m2) – Extração de DNA duas horas após o

tratamento..................................................................................................................................96

17

1. Introdução

1.1 Considerações

A fotoquimioterapia PUVA é um tratamento baseado na combinação de dois

agentes, um químico, o psoraleno, e um físico, a radiação ultravioleta A (UV-A),

cujo efeito benéfico provém desta associação (Hönigsmann, 1990; Lauharanta,

1997). Embora os psoralenos já fossem utilizados como agentes

fotossensibilizantes desde o antigo Egito, sua aplicação clínica em conjunto com a

radiação UV-A data da década de 70, no tratamento de pacientes acometidos por

psoríase (Pathak & Fitzpatrick, 1992).

O tratamento PUVA induz a remissão de doenças da pele através de

repetidas reações fotoinduzidas, que ocorrem a partir da fotoativação do psoraleno

pela radiação UV-A. A absorção de fótons está confinada à pele, restringindo-se à

área de penetração característica da radiação UV-A. Contudo, existem evidências

de que o tratamento exerce efeitos sistêmicos sobre as células sanguíneas

circulantes, possuindo ação imunomodulatória (Duthie et al., 1999; Lauharanta,

1997).

A exposição da pele às radiações, sejam elas oriundas de fontes como o

sol, luzes de iluminação interna ou sistemas de fototerapia, é capaz de alterar sua

estrutura e funcionamento. Algumas destas alterações são deletérias, como a

indução do câncer de pele, certas alterações da função imune e o envelhecimento

precoce. Em outras circunstâncias os efeitos são benéficos, sendo utilizados na

fototerapia. Por vezes, esta exposição à radiação está associada às drogas

fotossensibilizantes (fotoquimioterapia), que promove maior eficiência do

tratamento (Hönigsmann, 1990; Lauharanta, 1997).

18

1.2 Fotobiologia

1.2.1. Radiação Ultravioleta

A radiação ultravioleta corresponde à região do espectro com comprimento

de onda entre 200 e 400 nm. Foi descoberta por Johann Ritter em 1801,

demonstrando a existência de uma ação química causada por um tipo de energia

oriunda da parte invisível do espectro subsequente ao violeta (Diffey, 2002). O

espectro das radiações solares que incide sobre a superfície da terra é composto

pelas radiações do infravermelho, da luz visível e daquelas do ultravioleta

(correspondente a 5% da luz solar que chega ao planeta), dentre outras. A

radiação ultravioleta apresenta grande interesse dentro da fotodermatologia,

principalmente quanto aos os efeitos biológicos causados, que variam

dependendo do comprimento de onda.

Por esta razão o espectro ultravioleta foi subdividido em três regiões, tendo

sido estabelecido em 1932, no "Meeting of the Second lnternational Congress on

Light" realizado em Copenhagen, convencionando-se o seguinte (Bethea et al.,

1999; Diffey, 2002; Hönigsmann, 1990; Kochevar, 1995; Tanew et al., 1999):

- UV-A: 400 - 320 nm

- UV-B: 320 - 290 nm

- UV-C: 290 - 200 nm

A subdivisão entre UV-B e UV-C, estabelecida em 290 nm, se deve ao fato

de que a radiação UV-C, tendo um comprimento de onda menor, não se encontra

na radiação solar incidente sobre a superfície terrestre, sendo detectada somente

em grandes altitudes da atmosfera. Isso a difere das radiações de comprimentos

de ondas maiores, UV-A e UV-B, que alcançam a superfície terrestre. A região do

UV-A foi posteriormente subdividida em: UV-A-I, compreendendo a faixa de 340 -

400 nm, e UV-A-II, compreendendo a faixa de 320 - 340 nm (Diffey, 2002;

Kochevar, 1995).

19

Tanto UV-B como UV-A agem sobre os queratinócitos. As moléculas que

absorvem a luz na pele são chamadas de cromóforos (Hönigsmann, 2001), sendo

a melanina o cromóforo mais importante. A partir da absorção da luz UV pelos

nucleotídeos e formação de fotoprodutos do DNA, iniciam-se então reações

fotoquímicas que levam às alterações bioquímicas nos tecidos, como a indução da

atividade de algumas enzimas, secreção de citocinas e reparo de estruturas

(Hönigsmann, 2001).

A radiação UV-A também induz a formação de dímeros de pirimidina no

DNA, porém, com baixa freqüência (Jiang et al., 2009). Em termos de comparação

com a radiação UV-C, uma dose de 106 J/m2 de UV-A é capaz de produzir em

média 284 dímeros a cada 4 X 106 pares de bases (genoma de Escherichia coli),

enquanto que a mesma dose de UV-C provoca a formação de 38 X 106 dímeros

neste genoma.

Diversos comprimentos de onda das radiações UV são intensamente

absorvidos pelos ácidos nucléicos devido à estrutura e às ligações químicas

existentes nestas macromoléculas. As macromoléculas de DNA absorvem

radiações com maior intensidade na região de 240 nm a 280 nm (Friedberg et al.,

2006), uma faixa que não chega ao nível do mar.

Fontes de UV-A comumente usadas na terapia PUVA são lâmpadas

fluorescentes ou lâmpadas alógenas metálicas de alta pressão. As lâmpadas

fluorescentes típicas de UV-A têm um pico de emissão em 352 nm, emitindo

também aproximadamente 0,5% no comprimento de UVB. Outro tipo de lâmpada

também utilizada tem um pico de emissão em 370 nm, com menos de 0,1 % de

emissão na faixa de UV-B. Recentemente, tubos com um pico de emissão em 325

nm e com uma emissão maior de UV-B, têm sido muito efetivos na terapia (Diffey,

2002).

As doses de UV-A são quantificadas em J/m2, normalmente determinadas

com um fotômetro, cuja máxima sensibilidade está entre 350 e 360 nm. Em um

sistema de tratamento, a radiação deve ser relativamente uniforme, para que a

dose não varie nos diferentes sítios anatômicos do paciente. A emissão de

radiação UV-B deve ser baixa o suficiente a fim de não alcançar a dose

20

eritematosa mínima (20 a 50 milijoules/cm2), antes que a radiação UV-A suficiente

seja absorvida para produzir reação de fotossensibilização ao psoraleno (Diffey,

2002; Hönigsmann et al., 1990; Mansur et al., 1986).

1.3 Cumarinas

As cumarinas são derivadas do metabolismo da fenilalanina, e

estruturalmente são lactonas do ácido cumarínico. Há três grandes classes de

cumarinas: as hidroxicumarinas simples, as furanocumarinas e as

piranocumarinas (Harbone, 1999).

As furocumarinas são compostos heterocíclicos que resultam da fusão do

anel furano com uma molécula de cumarina, podendo ser lineares ou angulares.

Em geral, o esqueleto de uma furocomarina linear é chamado de psoraleno e os

análogos angulares dos psoralenos, chamados angelicinas (Milisi et al., 2001)

(Figura 1).

1.3.1 Estrutura dos psoralenos e angelicinas

Os psoralenos são produtos naturais pertencentes à família das

furocumarinas. São referidos e utilizados na medicina, além do 8-metoxipsoraleno

(8-MOP), também chamado no meio clínico de metoxsaleno, o 5-metoxipsoraleno

(5-MOP), conhecido como bergapteno e o 4,5´,8-trimetilpsoraleno (TMP),

chamado de trioxsaleno (Bisagni, 1992; Gia et al., 1993; Kaufman & Hewitt, 1980;

Ledo & Ledo, 2000; Pathak & Fitzpatrick, 1992). O análogo angular mais comum

do psoraleno é a angelicina. Alguns dos derivados da angelicina são a 4,6,4‟-

trimetilangelicina (TMA) e a 4,5‟-dimetilangelicina (DMA), cujos nomes são

atribuídos, tal como ao psoraleno, numerando separadamente o anel do furano e o

do sistema de benzopirano (Miolo et al., 1999; Wulff et al., 1988). As estruturas

estão representadas na Figura 1.

21

Psoralenos:

Angelicinas:

Figura 1: Estrutura dos psoralenos e angelicinas.

1.3.2 Fotorreatividade dos psoralenos

Em função de sua fotorreatividade, os psoralenos podem ser classificados

em duas categorias: monofuncionais e bifuncionais (Musajo & Rodighiero, 1972).

Os psoralenos monofuncionais apresentam apenas uma das extremidades

fotorreativas da molécula. A dimetoxicumarina (DMC) é um exemplo clássico de

psoraleno monofuncional, pois não possui o anel furano em sua estrutura. Outro

exemplo é o análogo monofuncional da molécula de 8-metoxipsoraleno (8MOP), o

4‟5‟-H-8-metoxipsoraleno (H28MOP), cuja ligação dupla fotorreativa do anel furano

foi modificada quimicamente (Figura 2). Os psoralenos bifuncionais possuem as

duas ligações duplas fotoativas, uma no anel furano (carbonos 4‟ e 5‟) e outra no

anel pirona (carbonos 3 e 4). É o caso das moléculas de psoraleno (PSO) e

psoraleno 8-metoxipsoraleno

4,5‟,8-trimetilpsoraleno 5-metoxipsoraleno 3-carbetoxipsoraleno

angelicina 4,6,4‟-trimetilangelicina 4,5‟-dimetilangelicina

OO O

5'

4'

3'

2'

8

7

6

54

3

2

11'

OO O

OCH3

1

2

3

4 5

6

78

2'

3'

4'

5'

1'

OO O

O2CH2CH3C

5'

4'

3'

2'

8

7

6

54

3

2

11'

OO O

CH3

CH3

CH3

2

3

4 5

6

78

2'

3'

4'

5'

11'

OO O

OH3C

1'1

2

3

4 56

7

8

2'

3'

4'

5'

O O O

5'4'

3'2'

1'8

7

6

54

3

2

1

O O O

H3C

CH3

CH3

5'4'

3'2'

1'8

7

6

54

3

2

1

O O O

CH3

CH3

1

2

3

4 5

6

7

8 1'2'

3'

4' 5'

22

8MOP. As estruturas destes psoralenos, com a demarcação de suas regiões

fotoativas encontram-se abaixo (Figura 2).

Figura 2: Sítios fotoativos dos psoralenos: monofuncionais e bifuncionais

1.3.3 Ocorrência na natureza

Os psoralenos são biossintetizados na natureza por um vasto número de

plantas das famílias Umbelliferae (ou Apiaceae), Rutaceae, Moraceae e

Leguminosae (Bisagni, 1992; Caporale et al., 1981; Gia et al., 1993; Hubner et al.,

2003; Lage et al., 2003; Stanjek et al., 1999).

Das plantas da família Rutaceae, dentre as quais se incluem as árvores que

produzem os citrinos como a bergamota (Citrus bergamia) e o limoeiro (Citrus

limonus), podem ser extraídos diversos psoralenos que são muitas vezes

designados de forma diferente. Exemplos: o psoraleno não substituído, o 5-MOP

(bergapteno), o 8-MOP (xanthotoxin), o 5,8-MOP (5,8-dimetoxipsoraleno –

isopimpinellin), o BER (5-hidroxipsoraleno - bergaptol) e outros psoralenos

substituídos (Caporale et al., 1981; Stevenson et al., 2003).

OO O

OCH3

1

2

3

4 5

6

78

2'

3'

4'

5'

1'OO O

5'

4'

3'

2'

8

7

6

54

3

2

11'

O O

O

H3C

OCH3

1

2

3

45

6

78

2'

3'OO O

OCH3

1

2

3

4 5

6

78

2'

3'

4'

5'

1'

Dimetoxicumarina (DMC) 4‟5‟-H-8-Metoxipsoraleno (H28MOP)

Psoraleno (PSO) 8-Metoxipsoraleno (8MOP)

23

Todas as furocumarinas referidas para a família Rutaceae também são

comuns, com exceção do bergaptol nas plantas da família Umbelliferae. A

angelicina é muito comum nesta família e está presente na planta Angelica

archangelica L., que deu origem ao nome da molécula. Na mesma família de

plantas podemos encontrar a 5,6-dimetoxiangelicina (pimpinellin), na Pimpinella

major e a 5-metoxiangelicina (isobergapten) na espécie Heracleum persicum

(Aynehchi, et al., 1978). Na família Leguminosae apenas dois gêneros de plantas,

o Psoralea e o Coronilla, são conhecidos por conterem furocumarinas. As

espécies destes gêneros contêm geralmente, além do psoraleno não substituído,

a angelicina.

1.4 Histórico da utilização dos psoralenos

O uso de fármacos em associação com a luz ultravioleta para o tratamento

de doenças de pele remonta ao antigo Egito, Índia e Grécia. Registros de

tratamento da doença de pele chamada vitiligo encontram-se em documentos

escritos no Egito e na Índia, que relatam sua ocorrência nos anos 2000-1200 a.C.

As primeiras descrições do uso da fototerapia datam do século XV e dizem

respeito à prática dos hindus e emprego de plantas medicinais associado à

exposição ao sol para tratamento de vitiligo.

Eram usadas certas plantas como, por exemplo, Ammi majus L. (Egito),

Psoralea corylifolia L. (Índia), com as quais "curandeiros" faziam extratos de

folhas, sementes e raízes, que eram ingeridos como infusões ou aplicados na

pele, com posterior exposição do paciente ao sol (Pathak & Fitzpatrick, 1992). Em

1834, Kalbruner isolou o 5-metoxipsoraleno (5-MOP) do óleo de bergamota

(Fowlks, 1959).

Foi, porém, a partir de 1903, quando Niels Finsen recebeu o prêmio Nobel

pelo sucesso do tratamento de lúpus vulgar com a radiação UV, que a fototerapia

começou a ser realmente estudada e praticada para tratamento de várias

dermatoses.

24

Durante a Primeira Guerra Mundial (1914-1918) iniciou-se o tratamento de

úlceras com o uso de fototerapia e luz solar, observando-se bons resultados

(Roelandts, 2002). Em 1925, Goeckerman introduziu a combinação de alcatrão e

radiação ultravioleta para tratamento da psoríase (Menter et al., 1996). Em 1931,

foi relatado pela primeira vez que a luz do sol tinha um papel vital na interação

entre os psoralenos e as moléculas biológicas (Song & Tapley, 1979). Em 1933,

foi isolado da planta indiana Psoralea corylifolia, o Psoraleno (Horning & Reisner,

1950). Nos anos seguintes, extraíram-se e isolaram-se psoralenos de outras

plantas e desenvolveram-se estudos físico-químicos e clínicos na Universidade de

Harvard (EUA) e na Universidade de Pádua (Itália).

Na década de 1940, o Professor Abdel Monem El Mofty do Departamento

de Dermatologia da Escola Universitária de Medicina do Cairo usou pela primeira

vez o 8-metoxipsoraleno (8-MOP), em aplicação tópica ou administrada por via

oral, seguido de exposição à luz solar, no tratamento do vitiligo. Em 1948, Mofty

relatou os efeitos conseguidos com 8-MOP na terapia do vitiligo, sendo seguido

por Lener, que mostrou a possibilidade de tal substância ter seus efeitos

potencializados pela radiação UV, de 320-400nm, constituindo o tratamento

denominado PUVA. E somente três décadas depois, em 1974, é que os

dermatologistas da Escola de Medicina de Harvard administraram oralmente 8-

MOP para o tratamento da psoríase, em combinação com uma fonte artificial de

radiação UVA (320-400 nm), (Pathak & Fitzpatrick, 1992).

Foram desenvolvidos estudos clínicos entre 1975 e 1980 com dois mil

pacientes nos Estados Unidos da América, e cerca de três mil na Europa. Estas

investigações confirmaram um grau de eficácia elevado da terapia PUVA para o

tratamento da psoríase, quando administradas em doses adequadas de psoraleno

e de radiação (Pathak & Fitzpatrick, 1992).

Apesar de a terapia ter se tornado comum e permitir tratar cerca de 90%

dos doentes com psoríase, em 1975, os dermatologistas reconheceram que a sua

aplicação pode causar vários efeitos secundários como eritema e prurido e, em

tratamentos longos, pode provocar câncer de pele (Lauharanta, 1997; Ledo &

Ledo, 2000; Lowe et al., 1997). Em 1978, conseguiu-se um avanço decisivo com a

25

combinação da terapia PUVA e a administração oral de retinóides (análogos

sintéticos da vitamina A). Os retinóides aceleram o processo, reduzindo para 1/3 o

tempo da terapia e o número de aplicações e, para 1/2, a energia da radiação UV-

A necessária, diminuindo o risco de câncer. Outros compostos, como o 5-

metoxipsoraleno (5-MOP), também têm sido utilizados em substituição ao 8-MOP

por produzirem menores efeitos secundários (Pathak & Fitzpatrick, 1992).

No entanto, ainda hoje os efeitos secundários do tratamento PUVA

constituem um tema controverso, tendo mesmo sido demonstrado que os

psoralenos podem ser efetivos no tratamento do melanoma cutâneo (Leite et al.,

2004). Outros estudos demonstram que em determinadas condições, como por

exemplo, quando o fármaco não é ingerido, mas aplicado em banho, não há o

risco de câncer de pele. Este risco é minimizado, quando se usam outras terapias

em combinação com a PUVA, como o uso de retinóides (Lauharanta, 1997;

Pathak & Fitzpatrick, 1992).

Atualmente, o tratamento PUVA é utilizado em outras doenças além da

psoríase, tais como: dermatite atópica e da mão e outros eczemas, linfoma

cutâneo de células T (micose fungóide), pitiríase liquenóide, pustulose plantar,

vitiligo, esclerose sistêmica, artrite reumatóide e lúpus eritematoso sistêmico, entre

outras (Bordin, 1999; Ledo & Ledo, 2000; Leite et al., 2004).

A utilização da radiação, em conjunto com alguns fármacos, abriu o

caminho para novas possibilidades terapêuticas associadas a uma nova ciência: a

fotomedicina. Aqui se inclui a Terapia Fotodinâmica que tem tido um enorme

desenvolvimento nos últimos anos no que se refere ao tratamento de tumores na

pele, na língua, nos seios ou no cérebro (Ledo & Ledo, 2000; Pathak & Fitzpatrick,

1992).

Não obstante, os psoralenos têm também propriedades farmacológicas na

ausência de radiação, como no tratamento da depressão e da esclerose múltipla,

por bloquearem os canais de potássio (Miolo et al., 1999). Fora da área clínica, os

psoralenos são utilizados em estudos de biologia molecular, como reagentes

fotoquímicos para a investigação da estrutura dos ácidos nucléicos e na

agricultura no combate a pragas (LIano et al., 2003; Mal et al., 1998; Song &

26

Tapley, 1979; Stevenson et al., 2003). Convém ainda referir dos análogos

angulares dos psoralenos, as angelicinas, que são conhecidos pelas suas

propriedades antifúngicas (Sardari et al., 1999).

O interesse gerado por este tipo de compostos é bem demonstrado pela

aposta que grupos de diversos países, como Itália (Dalla Via et al., 2009;

Rodighiero et al., 1990), EUA (Song & Tapley, 1979), Austrália (MacLeod et al.,

1978), Alemanha (Hovest et al., 2006; Tatchen et al., 2004), Egito (Pathak &

Fitzpatrick, 1992), Rússia (Potapenko, 1991), Polônia (Zarebska et al., 2000),

Hungria (Vidàczy, 1992), Inglaterra (Bridges, 1971), Espanha (Gia, et al., 1992),

França (Averbeck et al., 1992), Suécia (Llano et al., 2003), Holanda (Henegouwen

et al., 1989), Brasil (Lage et al., 2003), entre outros, têm feito através da

investigação sobre a síntese e as propriedades de psoralenos e análogos com

propriedades terapêuticas superiores.

1.5 Mecanismos de ação de psoralenos e angelicinas

1.5.1 Formas de ação de fotossensibilizadores

As primeiras investigações datam de 1965 e foram realizadas pelo grupo de

Musajo e outros pesquisadores. O mecanismo molecular responsável pelos efeitos

biológicos do psoraleno e dos seus derivados, envolve as bases de pirimidina

(timina e citosina) dos ácidos nucléicos, que são os principais alvos de sua ação

fotoquímica (Bevilacqua & Bordin, 1973; Cole, 1970 e 1971; Song & Tapley, 1979).

Na primeira etapa do processo fotorreativo ocorre a intercalação dos

psoralenos entre as bases do DNA, na ausência de luz. Em seguida, quando o

psoraleno intercalado é excitado pela radiação eletromagnética, de comprimentos

de onda entre 320 e 400nm (UVA), forma-se um produto de adição [2+2] com o

ácido nucléico: cicloaduto C4. Os produtos da adição resultam da formação de

ligações covalentes entre as posições 5,6 da pirimidina pertencente ao ácido

nucléico e as posições 4',5' do furano ou 3,4 da pirona (Figura 1). As ligações

formam-se sobretudo com a base de timina. Foram isolados e caracterizados os

cicloadutos resultantes desta monoadição, tendo sido verificada uma preferência

marcante pela monoadição à dupla ligação do anel do furano (Lage et al., 2003).

27

Este resultado contraria os cálculos teóricos realizados por Song & Tapley (1979)

que apontavam a dupla ligação 3,4 da pirona como sendo a mais fotorreativa.

Na terceira etapa, os monoadutos do furano que apresentam uma

absorbância intensa entre 320 nm e 380 nm, quando são excitados por um

segundo fóton e se estiverem posicionados adequadamente em relação à

segunda cadeia da dupla hélice, podem formar um segundo anel ciclobutano entre

a segunda dupla ligação fotoativa e os carbonos 5 e 6 da outra base de pirimidina.

Desta reação, resultam diadutos e outros isômeros (formação de ligações

cruzadas entre cadeias; ICL - interstrand crosslink) (Dronkert & Kanaar, 2001;

Lage et al., 2003; Song & Tapley, 1979). Tais interações estão representadas na

figura 3.

Figura 3: Interação dos psoralenos com a molécula de DNA através da

formação de ligações covalentes envolvendo as bases pirimidínicas de DNA e o

anel pirona do psoraleno (A), o anel furano (B) e, havendo uma timina na fita

oposta do DNA, as duas fitas (crosslink). Figura adaptada de Hearst et al. (1984).

28

Caso a timina da fita oposta do DNA não esteja na posição adequada, os

psoralenos bifuncionais, ou seja, com dois sítios fotoativos, formam monoadutos

com a timina. A monoadição ao DNA pode ocorrer também através da inativação

da dupla ligação 3,4 do anel de pirona, ou 4',5' do anel de furano da molécula de

psoraleno, por exemplo, por substituição de um dos átomos de H (dessa ligação)

por um grupo relativamente volumoso.

Outros tipos de reações que podem ocorrer com o DNA, provocadas pelos

psoralenos, é a formação de ligações covalentes cruzadas DNA-proteínas (DNA-

protein crosslinks: DPC) (Bordin, 1999; Fossa et al., 2002; Marzano et al., 2000).

Muitos autores consideram que a formação de ligações cruzadas entre as

cadeias do DNA (ICL) é a causa da toxicidade e do risco de ocorrência de câncer,

em decorrência dos tratamentos com furocumarinas (Averbeck et al., 1992; Chilin

et al., 2001; Heindel & Laskin, 1995; Laquerbe et al., 1995; Marzano et al., 2000;

Wasserman & Berdahl, 1982). Na década de 70, os dermatologistas

reconheceram que a terapia PUVA poderia aumentar o risco de desenvolvimento

do câncer da pele, sendo o 8-MOP um dos psoralenos bifuncionais considerado

potencialmente cancerígeno (Pathak & Fitzpatrick, 1992). O 3-carbetoxipsoraleno

(3-CPs)(Figura 1), monofuncional, ao contrário do 8-MOP, é considerado

fototóxico, mas não mutagênico (Averbeck et al., 1992; Fossa et al., 2002) e forma

predominantemente monoadutos entre o anel de furano e a timina (Lage et al.,

2003; Song & Tapley, 1979).

Tomando como outro exemplo as angelicinas e derivados, verificou-se

também que não provocam ICL, essencialmente por razões geométricas e no

caso de terem vários substituintes metil, podem ser mais eficientes que o 8-MOP e

provocar menos efeitos secundários (Fossa et al., 2002; Jakobs & Christiaens,

1996).

29

Não obstante, alguns estudos revelaram que os derivados angulares podem

induzir ligações cruzadas DNA-proteínas (Bordin, 1999), o que reforça a hipótese

de Moron et al., de 1983: apesar das angelicinas não provocarem ICL, não se

deve excluir a hipótese de que estas possam ligar-se a outros substratos

biológicos através da dupla ligação ainda disponível. De fato, alguns

investigadores demonstraram que, além das ligações com o DNA, as

furocumarinas, em geral, podem também se ligar ao RNA e as proteínas. Outros

estudos revelaram que estas moléculas podem se ligar também a outras

biomoléculas como os lipídios das membranas celulares (Caffieri, 2002; Cole,

1970; Henegouwen et al., 1989; Potapenko, 1991; Song & Tapley, 1979;

Waskowska et al., 2000; Zarebska et al., 2000).

1.6 Fototerapia

1.6.1 Fototerapia com PUVA

O tratamento com PUVA é realizado pela associação de um psoraleno e

irradiação de UV-A originária de lâmpadas que emitem comprimentos de ondas

entre 320 e 400 nm.

Os psoralenos orais são metabolizados no fígado, com concentração

sanguínea máxima entre uma e três horas. Drogas que ativam as enzimas do

citocromo P-450 aceleram e aumentam seu metabolismo (Hönigsmann, 2001). A

eliminação é renal e ocorre em 12-24 horas (Hönigsmann, 2001; Morison, 1993).

O 5-MOP, 8-MOP e o 4,5,8 TMP podem ser usados tanto na forma sistêmica

como na tópica.

O 8-MOP geralmente é usado na dose de 0,4 mg/kg de peso, uma hora e

meia antes da fototerapia quando estiver na forma líquida ou de duas a três horas

antes se estiver na forma cristalina, e na dose de 0,6 mg/kg de peso duas horas

antes da fototerapia, quando na forma de comprimidos (Abel, 1999).

O PUVA tópico de rotina é realizado com a associação do Trioxsalen com a

luz UV-A, aplicado na pele, meia hora antes da realização da fototerapia. A dose

varia de 0,1%, em locais de pele mais fina, até 1%, como nas regiões plantares, e

o PUVA tópico é manipulado em loções cremosas ou alcoólicas. Para o PUVA

30

sistêmico, a dose inicial de UV-A normalmente é baseada na cor da pele do

paciente e na doença que vai ser tratada, e geralmente inicia-se com 0,5 a 1 J/m2.

Com relação ao PUVA tópico, a dose inicial da UV-A é de 0,12 a 0,5 J/m2.

Sabe-se que o eritema pós-PUVA pode ocorrer entre 48 e 72 horas após a sessão

e por isso o tratamento pode ser feito por aplicações de duas a três vezes por

semana (Morison, 1993). O aumento da dose da luz irradiada é determinado pela

intensidade do eritema provocado na sessão anterior e seu máximo também varia

de acordo com o tipo de pele e da doença.

Os valores absolutos necessários para completar a dose total (em

Joules/m2) são mais de 1.000 vezes maiores para UV-A comparado com UV-B;

por isso a necessidade dos psoralenos para facilitar a absorção de UV-A e não

prolongar demais o tratamento do paciente (Roelandts, 2002).

1.6.2 PUVA imersão ou banho PUVA

Essa modalidade de terapia foi idealizada para casos em que há indicação

de PUVA sistêmico, com o intuito de diminuir a dose de exposição à UV-A (Cooper

et al., 2000). É particularmente útil para pacientes que tomam outras medicações

sistêmicas (Cooper et al., 2000) ou com intolerância aos psoralenos aplicados de

maneira tópica (Abel, 1999). Os efeitos colaterais oculares e no trato

gastrointestinal são minimizados, pois não ocorre fotossensibilização nestes

órgãos. A concentração do psoraleno na pele é maior que no PUVA sistêmico,

proporcionando menor exposição à radiação UV (Hönigsmann, 2001). Utiliza-se o

8-MOP diluído em água morna, imergindo o local a ser tratado durante 15 a 20

minutos antes da irradiação UV-A. A solução contem 8-MOP a 1 mg/L, obtida

diluindo-se 20 mL de 8-MOP a 0,5% em álcool a 96º em 100 litros de água. Pode-

se também usar o trioxsaleno (TMP), porém em doses menores (Hönigsmann,

2001). A dose de UV-A é a mesma para PUVA tópico, iniciando-se com 0,12 - 0,5

J/cm2.

31

1.6.3 Indicações da fototerapia

A fototerapia é método de tratamento que pode ser utilizado em várias

doenças de pele, cujas principais indicações são as dermatoses inflamatórias e o

linfoma cutâneo de células T. Entre as diversas dermatoses, estão: vitiligo,

psoríase, linfoma cutâneo de células T (micose fungóide), dermatite atópica,

parapsoríase, esclerodermia, GVHD (doença enxerto versus hospedeiro).

1.6.3.1 Vitiligo

Dermatose caracterizada pela formação de manchas acrômicas, que são

em geral bilaterais e simétricas, apresentando etiologia desconhecida. Pode

ocorrer em qualquer idade, independente de sexo ou raça. Apresenta, na

população mundial, uma freqüência de 1%, sendo relativamente comum o

comprometimento familiar. Embora cause prejuízo mais a nível estético, pode

desencadear distúrbios psicossociais importantes.

Tal patologia se caracteriza pela diminuição ou total ausência de

melanócitos na região epidérmica, havendo proliferação desordenada de células

de Langerhans (formação granulomatosa), por vezes verificando-se infiltração

linfocitária. É uma doença que não se pode prever, sujeita a fases de erupção,

remissão e recrudescência, embora na maioria dos casos ocorra progressão lenta.

Sua duração é indefinida (Azulay & Azulay, 1997).

A destruição dos melanócitos na epiderme desencadeando tal patologia

pode ser explicada por três diferentes teorias:

- Atividade neurogênica: Inibição da melanogênese por mediadores

neuroquímicos, como a acetilcolina, que têm efeito tóxico sobre os melanócitos;

- Autoimunidade: Destruição dos melanócitos através de mecanismos

imunológicos e frequente associação do vitiligo com doenças auto-imunes e a

presença de soro contendo auto-anticorpos contra vários órgãos;

- Autodestruição: Destruição de melanócitos por substâncias presentes na

formação da melanina (quinonas e fenóis).

32

Embora não haja método terapêutico direcionado especificamente ao

vitiligo, a terapêutica PUVA funciona de forma eficiente, com a repigmentação

ocorrendo a partir de folículos pilosos e formação de ilhotas de pele repigmentada

dentro da área acrômica formada (Azulay & Azulay, 1997).

1.6.3.2 – Psoríase

Doença eritematoescamosa de evolução crônica, podendo haver fases de

remissão, às vezes com comprometimento articular, ocorrendo maior velocidade

de evolução dos queratinócitos. Com distribuição populacional mundial de 2%, é

muito pouco frequente em negros e, na infância, é mais frequente em homens.

Sua forma típica é assintomática e não se sabe se existe alguma causa que

favoreça o aparecimento desta patologia. Mas, via base hereditária e

provavelmente multifatorial, pode ser que seja de herança poligênica e que

requeira fatores ambientais para a sua formação. Fatores como luz, clima, drogas,

traumas, infecções, alterações metabólicas e endócrinas, bem como fatores

psicogênicos (no caso de psoríase latente), podem influenciar na instalação ou na

gravidade da doença.

No caso do desencadeamento da doença, por desequilíbrios transitórios

entre moléculas, o objetivo da terapêutica é a melhoria clínica e não a cura, sendo

o tratamento PUVA, neste caso, bastante eficaz (Azulay & Azulay, 1997).

1.6.3.3 – Micose fungóide

Representa uma manifestação clínica derivada de um processo

imunopatológico, o linfoma epidermotrópico de células T, de forma primária

cutânea, de evolução lenta, com invasão tardia de gânglios, progressão sistêmica,

que pode levar à morte. Patologia mais comum em homens com idade superior a

45 anos, suspeita-se desta doença ter base genética. Ocorre a destruição de

células de Langerhans, importantes na apresentação dos antígenos. Devido à sua

aparência eczematosa, discute-se a possibilidade de que a micose fungóide seja

um processo reativo à exposição prolongada de antígenos, levando à estimulação

e formação posterior de neoplasias.

33

O tratamento PUVA parece ter os melhores resultados no tratamento desta

doença, havendo casos de cura. A terapia PUVA, através da ação da luz UV-A na

pele normal, promove diminuição da população das células de Langerhans, o que

explica a melhoria clínica das lesões desta doença (Azulay & Azulay, 1997).

1.6.4 Contra-indicações da fototerapia

A fototerapia é contra-indicada para os pacientes com Xeroderma

pigmentosum; albinismo; dermatoses fotossensíveis, como lúpus eritematoso;

pênfigo e penfigóide bolhoso; antecedentes pessoais e/ou familiares de câncer de

pele (melanoma e não-melanoma) (Drake, 1994). Deve-se também ter cuidado

com os que já realizaram tratamentos anteriores com imunossupressores, pois é

sabido que, nesses casos, tais medicamentos potencializam os efeitos

carcinogênicos da fototerapia; os que já fizeram o uso prévio de arsênico ou foram

submetidos a radiação ionizante; aos com história prévia de intensa exposição

solar; antecedentes pessoais de catarata; com alterações hepáticas ou renais; que

usam marca-passo (contra-indicação mencionada em vários artigos, mas não se

tem uma explicação para tal). Em mulheres grávidas, o método PUVA está contra-

indicado devido aos possíveis efeitos teratogênicos do psoraleno (categoria C) e

em crianças só se permite a utilização de PUVA em situações especiais

(Hönigsmann, 2001).

1.6.5 Efeitos colaterais do tratamento PUVA

Os efeitos colaterais são divididos em agudos e crônicos (Laube & George,

2001). Os sintomas agudos podem estar relacionados aos psoralenos ou a própria

luz ultravioleta.

- Sintomas agudos: sintomas gastrointestinais, como náuseas (que podem

ser atenuadas com a ingestão de alimentos antes da medicação), cefaléia,

tontura, insônia e depressão; Efeitos fototóxicos: eritema, onicolise, hemorragia

subungueal (Hönigsmann, 2001); taquicardia, hipertricose e herpes simples.

34

- Sintomas crônicos: carcinogênese e fotoenvelhecimento, catarata,

alterações do pigmento da pele e formação de lentigos, alterações acastanhadas

de cor da pele (Hönigsmann, 2001).

Durante a exposição à luz UV-A, a região genital e a face devem ser

protegidas. Em homens já foi descrito o aumento do risco de aparecimento do

câncer da região genital (Abel, 1999; Drake et al., 1994). A face, por ser área já

fotoexposta, com mais possibilidades de dano solar, deve ser protegida a menos

que seja a área a ser tratada. Lentigos também são descritos após tratamento

com PUVA e geralmente seu aparecimento é observado entre 6 e 15 meses

depois do início do tratamento (Wang et al., 2001). Os olhos devem ser protegidos

com óculos contra UV pelo risco de o paciente vir a apresentar catarata, sendo

que o cuidado deve se estender durante todo o dia em que for feita a sessão

(Hönigsmann, 2001; Wang et al., 2001). É preciso ter cuidado com os remédios de

uso prévio para que não interfiram na absorção dos psoralenos, ou medicamentos

que são sabidamente fotossensibilizantes (Wang et al., 2001).

1.7 Reparo de DNA (Friedberg et al., 2006)

Os organismos são constantemente submetidos aos efeitos deletérios do

meio ambiente, pela ação de produtos químicos naturais ou artificiais, ou mesmo

daqueles provenientes do metabolismo celular. Como consequência ocorre a

inativação celular, que pode estar diretamente relacionada com lesões ocorridas

no DNA, que podem dar origem a mutações, afetando as regiões envolvidas na

expressão gênica.

Seria impossível a sobrevivência de qualquer organismo, se estas lesões

não fossem reparadas. Através dos tempos, os organismos desenvolveram

mecanismos capazes de eliminar lesões ocorridas em moléculas de DNA,

permitindo então a sobrevivência celular e, com isso, a manutenção das espécies

através do DNA preservado e transmitido corretamente de geração a geração. A

não reparação dessas lesões pode levar à mutagênese, ativação de oncogenes,

doenças degenerativas, envelhecimento e outras consequências. Por esta razão,

se torna fundamental estudar os mecanismos pelos quais as células e os

35

organismos reparam ou evitam as lesões causadas por tais agentes físicos e

químicos, mantendo assim as duas propriedades biológicas fundamentais do DNA

que são: a auto-replicação e a preservação da informação genética.

1.7.1 Reparo de DNA por excisão de nucleotídeos em Escherichia coli

(NER)

O mecanismo de reparo por excisão de nucleotídeos (NER) é um sistema

capaz de reconhecer uma grande quantidade de danos formados no DNA. Este

mecanismo já foi constituído in vitro a partir de proteínas purificadas, com

substratos definidos de DNA (Sancar & Rupp, 1983). Trata-se de um processo que

envolve várias etapas, onde os nucleotídeos lesados, formadores de produtos

como, os dímeros de pirimidinas e os fotoprodutos 6-4 (pirimidina-pirimidona), são

excisados do DNA enzimaticamente, como parte de fragmentos de

oligonucleotídeos que são liberados, e não como bases livres. Este processo leva

a formação de uma lacuna na fita de DNA, sendo preenchida por uma ressíntese

de um fragmento, utilizando a fita molde, finalizando com a religação à fita de

DNA, pela enzima DNA ligase (Sancar & Rupp, 1983).

Em Escherichia coli, o sistema NER tem sido muito estudado e envolve

cinco etapas básicas, a saber: Reconhecimento da lesão no DNA, incisão,

excisão, ressíntese e ligação, com a participação de, no mínimo, seis produtos

gênicos: As proteínas UvrA, UvrB, UvrC, UvrD (ou DNA helicase II), DNA

polimerase I e DNA ligase (Van Houten, 1990; Lin et al., 1997; Van Houten et al.,

2005).

A proteína UvrA, que tem atividade ATPásica independente de DNA, forma

um dímero em solução, na ausência de moléculas de ATP. Este dímero se liga à

proteína UvrB, havendo a formação do complexo UvrA2B, com o dímero de UvrA

fazendo o primeiro contato com a molécula de DNA e facilitando a transferência de

UvrB que, através do seu domínio de ligação ao DNA, irá se fixar na molécula.

Ocorre a ativação da atividade de ATPase críptica de UvrB quando da ligação

UvrA2B:DNA, havendo então o rastreamento, na direção 5‟3‟, do DNA, devido a

uma limitada atividade de helicase e deslocamento por certo trecho. Havendo

então o encontro da lesão, acredita-se que o dímero de UvrA hidrolise moléculas

36

de ATP e se dissocie do complexo de reconhecimento (UvrA2B) que estava

acoplado ao DNA, resultando em um resistente complexo UvrB-DNA (Van Houten,

1990; Friedberg et al., 2006; Lin et al., 1997; Moolenaar et al., 1998; Van Houten

et al., 2005). Após este processo, inicia-se uma atividade endonucleásica, com

paralelo recrutamento da proteína UvrC, que não tem afinidade específica pelo

dúplex de DNA, se ligando à UvrB (ligada ao DNA lesado), com a indução de uma

incisão dupla, uma na região 5‟ do DNA, a montante da lesão, e outra na região 3‟,

a jusante da lesão no DNA. É necessário que ocorra a interação entre UvrB e

UvrC, para que ocorra a incisão no lado 3‟ da lesão, que ocorre primeiramente,

havendo a incisão do lado 5‟ através do sítio catalítico unicamente de UvrC, com a

posição destas incisões variando de acordo com a lesão formada (Van Houten,

1990; Friedberg et al., 2006; Lin et al., 1997; Moolenaar et al., 1998; Van Houten

et al., 2005). Com a formação da incisão dupla, ocorre a ação da DNA helicase II

(UvrD), requerida também para a liberação de UvrC e do fragmento de

oligonucleotídeo incisado. Com a retirada do fragmento lesado, a enzima DNA

polimerase I, durante a síntese, remove a proteína UvrB da hélice de DNA não

danificada, finalizando com a ligação, através da DNA ligase, do DNA recém-

sintetizado ao DNA já existente, finalizando a reparação (Van Houten, 1990;

Friedberg et al., 2006; Lin et al., 1997; Moolenaar et al., 1998; Van Houten et al.,

2005). Todas as etapas do mecanismo de reparo por excisão de nucleotídeos

estão esquematizadas na Figura 4.

37

Figura 4: Reparo por excisão de nucleotídeos em Escherichia coli. Figura

adaptada de Sancar & Rupp (1983).

A UvrA B UvrB C UvrC D DNA Helicase II UvrD Pol 1 DNA Polimerase I

38

2. Caracterização do problema

Sabe-se que a fotoquimioterapia PUVA pode causar a formação de adutos

no DNA que podem comprometer o desenvolvimento regular das células. A longo

prazo, tais lesões podem provocar efeitos mais graves, inclusive, carcinogênicos,

como resultantes do acúmulo de lesões que desestabilizam as células.

Segundo Wang et al. (2001) pacientes que foram submetidos ao tratamento

PUVA apresentam cinco vezes mais chances de desenvolver melanoma. Nestes

casos de tratamentos de longa duração, fazem-se necessários exames

dermatológicos periódicos (Hönigsmann, 2001).

O tratamento PUVA provoca a formação de adutos entre os psoralenos

utilizados e o DNA, em função da excitação das moléculas de psoraleno pela

radiação ultravioleta A. Estes adutos formados tornam-se alvos para a ativação

dos mecanismos de reparação do DNA celular. O mecanismo de reparo NER,

descrito como importante na remoção de dímeros de pirimidinas e de cerca de

outros 20 tipos de lesões no DNA, parece que também é importante em remover

adutos formados no DNA (Sancar & Rupp, 1983; Cupido & Bridges, 1985).

Outros estudos mostraram que os adutos formados a partir do tratamento

PUVA envolvem ligações entre os psoralenos com as bases pirimídicas do DNA,

mais especificamente, com as timinas (Hearst et al., 1984). Estas lesões podem

provocar distorções nas fitas de DNA que, além de comprometer os processos

replicativos celulares, podem não ser corretamente reconhecidas pelos

mecanismos de reparação e, a longo prazo, provocar efeitos mutagênicos.

39

3. Objetivos

3.1 Objetivo geral

Estudar a formação de lesões no DNA submetido à fotoquimioterapia PUVA

e identificar estas lesões, correlacionando-as com o mecanismo de reparo por

excisão de nucleotídeos.

3.2 Objetivos específicos

- Caracterizar o papel do reparo por excisão de nucleotídeos (NER) na

remoção das lesões causadas no DNA de Escherichia coli por PUVA com

psoralenos já conhecidos e novos;

- Avaliar a formação de lesões no DNA genômico;

- Estudar as interações entre substratos de DNA e os psoralenos,

procurando evidenciar as possíveis distorções causadas no DNA, resultantes do

tratamento PUVA.

40

4. Material e Métodos

4.1 Cepas bacterianas

As cepas bacterianas utilizadas são derivadas de Escherichia coli K12 e

estão listadas abaixo com a designação da cepa e seus genótipos e fenótipos

relevantes.

Quadro I – Cepas utilizadas nos experimentos de sobrevivência

Designação Genótipo Fenótipo

AB1157 Selvagem (WT – Wild Type) Proficiente em mecanismos

de reparação

AB1886 uvrA6 Deficiente na proteína UvrA

– Reparo por Excisão de

Nucleotídeos

AB1885 uvrB5 Deficiente na proteína UvrB


Nucleotídeos

AB1884 uvrC34 Deficiente na proteína UvrC


Nucleotídeos

As cepas foram obtidas de Howard-Flanders (Universidade de Yale – USA)

4.2 Meios de cultura, soluções e tampões salinos

Os meios de cultura e os tampões salinos, utilizados para a manutenção

das cepas bacterianas e para os experimentos, estão relacionados a seguir:

Meio LB (Meio rico) – (Miller, 1992)

Cloreto de sódio (NaCl)1 ------------------------------------ 10,0 g

Bacto triptona2 ------------------------------------------------ 10,0 g

Extrato de levedura ------------------------------------------ 5,0 g

Água bidestilada (q.s.p.) ----------------------------------- 1000 mL

Agar Difco ------------------------------------------------------ 1,5% (meio sólido)

Ajuste do pH para 7,0, utilizando hidróxido de sódio (NaOH - MERCK)

41

1 Todos os sais utilizados foram adquiridos da MERCK Indústrias Químicas

(Brasil).

2 Todos os reagentes de meio de cultura utilizados foram adquiridos da DIFCO

Laboratories (USA).

(*) Quanto aos outros reagentes utilizados, os fabricantes são citados após a

especificação.

Tampão M9 – (Miller, 1992)

Fosfato de sódio diidratado (Na2HPO4 .2H2O) ------------------------------ 11,0 g

Dihidrogenofosfato de potássio (KH2PO4) ------------------------------------ 3,0 g

Cloreto de sódio (NaCl) ----------------------------------------------------------- 0,5 g

Cloreto de amônio (NH4Cl) ------------------------------------------------------- 1,0 g

Água bidestilada (q.s.p.) --------------------------------------------------------- 1000mL

O tampão salino é esterilizado em autoclave e, posteriormente,

suplementado com 0,1 mL de cloreto de cálcio (CaCl2) a 0,1 M e 0,1 mL de sulfato

de magnésio (MgSO4) a 1 M para cada 100 mL de tampão M9.

4.3 Manutenção e crescimento das cepas bacterianas

As cepas utilizadas estão armazenadas em estoque contendo volumes

iguais de glicerol 100% e das culturas bacterianas em fase estacionária. O

estoque é armazenado em criotubos no freezer à temperatura de -20 ºC. Para a

realização dos experimentos pequenos inóculos de 100 μL eram retirados do

estoque e adicionados a Erlenmeyers contendo 10 mL de meio LB líquido fresco

suplementado com o antibiótico estreptomicina, a 100 μg/mL, para crescimento

inicial, durante a noite, com incubação a 37ºC em agitação de 150 rpm. Todas as

quatro cepas utilizadas são resistentes à estreptomicina (Howard-Flanders et al.,

1965).

42

A partir destas primeiras culturas, novos inóculos foram feitos, com a

transferência de 0,25 mL (1:40) para 10 mL de LB líquido. As culturas foram

incubadas a 37ºC com uma agitação de 150 rpm até atingirem a fase exponencial

(2 X 108 células/mL). Aliquotas foram adicionadas em cubetas para leitura, em

espectrofotômetro, da D.O.600, com valor ótimo de 0,5.

4.4 Psoralenos

Os psoralenos abaixo relacionados foram armazenados a partir de

instruções determinadas pelos respectivos fabricantes. Os psoralenos foram então

pesados, de acordo com a molaridade da solução e diluídos em etanol absoluto

(MERCK), sendo armazenados em microtubos (Eppendorf) e devidamente

vedados com parafilme (Parafilm “M” Laboratory Film – Pecheney Plastic

Packaging).

- 8-Metoxipsoraleno (8MOP – P.M.: 216,19 g – Sigma-Aldrich);

- Psoraleno (PSO – P.M.: 186,16 g – Sigma-Aldrich);

- Angelicina (ANG – P.M.: 216,19 g – Sigma-Aldrich);

- 5,7-Dimetoxicumarina (DMC – P.M.: 206,2 g – Sigma-Aldrich);

- 4,5‟,8-Trimetilpsoraleno (TMP – P.M.: 228,2 g – Sigma-Aldrich).

- 4‟5‟-H-8-Metoxipsoraleno (H28MOP – P.M.: 218,19 g) (*)

(*) O H28MOP foi sintetizado a partir do bifuncional 8MOP, no Laboratório de

Avaliação e Síntese de Substâncias Bioativas da Faculdade de Farmácia da UFRJ pelo

Dr. Arthur Eugen Kümmerle.

Para cada um dos psoralenos foi feita uma primeira solução estoque, a 10

mM. A partir desta solução, foram preparadas as concentrações de tratamento:

- 8-MOP: 0,5, 1,0 e 10,0 μM;

- PSO: 0,5, 1,0 e 10,0 μM;

- ANG: 1,0, 10,0 e 75,0 μM;

- DMC: 1,0, 10,0 e 75,0 μM;

- TMP: 0,5, 1,0 e 10,0 µM;

- H28MOP: 1,0, 10,0 e 100,0 µM.

43

4.5 Luz ultravioleta A (UV-A): Calibração e utilização

Foi utilizada a lâmpada de luz-ultravioleta A Vilber Lourmat (215.L), 2 X 15

W – 365 nm tube, com potência de 60 W (número de série v039024) e uma taxa

de dose de 35 W/m2. Antes de sua utilização, a lâmpada foi previamente calibrada

com aparelho de dosimetria de radiação (Blak Ray modelo J-221). A dose

identificada pelo dosímetro foi da ordem de Joules por m2 por segundo (J/m2/s). A

dose pré-determinada de tratamento foi de 30 kJ/m2, a partir de experimentos de

sobrevivência bacteriana anteriores de variação de dose de UV-A.

4.6 Tratamento PUVA - Sobrevivência bacteriana

As células das cepas bacterianas, cultivadas em meio LB líquido até a fase

exponencial (108 células/mL; D.O.600nm = 0,5), foram transferidas para tubos Corex

e centrifugadas em uma velocidade de 8000 rpm, durante 10 minutos com a

temperatura variando entre 4 e 10 ºC (Rotor Sorvall SS34 – Du Pont Instruments).

Após esta etapa o sobrenadante foi descartado e o sedimento celular foi

ressuspenso em 10 mL de tampão M9.

Uma primeira alíquota de 2 mL foi separada, sendo o controle dos

experimentos (nenhum tratamento). O restante da cultura foi devidamente dividido

em pequenas placas de acrílico, contendo quatro poços, sendo parte desta cultura

(600 μL, em 1 poço) tratada somente com a dose de 30 kJ/m2 de luz-ultravioleta A,

sem a adição de psoraleno. Às outras partes da cultura, foram adicionados os

psoralenos na proporção de 1:100 (um volume de 6 μL de psoraleno para cada

600 μL de cultura bacteriana), seguidos da irradiação de 30 kJ/m2 de luz-

ultravioleta A.

Após o tratamento alíquotas de todos os experimentos foram retiradas para

extração de DNA. Outra parte foi retirada e diluída em tampão M9, sendo as

bactérias semeadas em placas de Petri contendo meio LB sólido. As placas foram

transferidas para estufa a 37ºC e mantidas por 18 horas. Após este tempo as

colônias bacterianas foram contadas, sendo as curvas de sobrevivência

construídas a partir da razão entre o número de células viáveis (N) após o

tratamento e o número inicial de células (N0).

44

Para a extração do DNA das bactérias, foi realizado um experimento

adicional: 0,25 mL de cultura tratada foi aliquotada e novamente inoculada em 10

mL de LB líquido fresco, para um novo crescimento durante duas horas, a 37 ºC e

agitação de 150 rpm. O tempo de duas horas foi pré-determinado como sendo um

possível intervalo de tempo eficaz para reparação, pelas células bacterianas das

lesões formadas pelo tratamento PUVA. Após o crescimento, as bactérias foram

novamente centrifugadas em tubos Corex, à velocidade de 8000 rpm, durante 10

minutos, com temperatura oscilando entre 4 e 10 ºC. O sobrenadante foi

descartado e o sedimento celular ressuspenso em 10 mL de tampão M9.

4.7 Extração do DNA

Após o tratamento PUVA, as culturas bacterianas foram submetidas a um

protocolo de extração e purificação do DNA. Foi utilizado o kit DNeasy® Tissue

(QIAGEN), eficiente na extração de DNA total de uma grande variedade de

materiais contendo DNA (tecidos animais, leveduras e bactéria). Os materiais

utilizados estão especificados em manual de instrução.

Complementando o kit, outros reagentes foram também utilizados e estão

descriminados abaixo:

- Proteinase K (Invitrogen): Serino-protease de amplo espectro, utilizada

para digestão de proteínas totais de uma solução. Para os experimentos foi feita

uma solução de concentração 20mg/mL de proteinase K (em água milliQ estéril e

estocada a -20 ºC).

- Ribonuclease A de pâncreas bovino (RNase A from bovine pancreas –

Sigma-Aldrich): Endonuclease que cliva moléculas de RNA fita simples de uma

solução. Uma solução de 30 mg/mL foi feita (em água MilliQ estéril, sendo

estocada a -20 ºC).

Os procedimentos de extração de DNA estão especificados abaixo:

- Após a centrifugação, as culturas bacterianas foram ressuspensas em um

volume de 180 μL do tampão de lise celular ATL (Tissue Lysis Buffer);

45

- Foi adicionado um volume de 20 μL de solução de proteinase K (20 mg/mL),

sendo misturado à cultura com auxílio do agitador de tubos tipo Vortex, e incubado

em banho-maria a 65 ºC durante 90 minutos. Novas misturas ocorreram de 30 em

30 minutos em agitador tipo vortex, para dispersar a amostra;

- Às amostras, foram adicionados volumes de 10 μL de RNase A (30 mg/mL),

sendo misturadas em agitador tipo Vortex e incubados por cinco minutos em

temperatura ambiente;

- Uma nova agitação de 15 segundos foi realizada, seguida da adição de 200 μL

de tempão de lise para purificação do DNA AL (Lysis Buffer for DNA purification),

forte agitação e incubação em banho-maria a 65 ºC, durante 20 minutos.

- Foi adicionado um volume de 200 μL de etanol absoluto (MERCK) às amostras,

sendo misturados com auxílio do agitador tipo Vortex;

- Estas misturas foram então pipetadas nas colunas de ligação e lavagem do DNA

(DNeasy Mini Spin Column), apoiadas em tubos coletores de 2 mL, e

centrifugadas em uma velocidade de 8000 rpm (Microcentrífuga Eppendorf)

durante dois minutos. O sobrenadante foi descartado no tubo coletor;

- As colunas, contendo o DNA ligado, foram transferidas para novos tubos

coletores de suporte e foi adicionado um volume de 500 μL de tampão de lavagem

AW1 (Wash Buffer 1), seguido de nova centrifugação, a 8000 rpm, durante dois

minutos, sendo o sobrenadante contido no tubo coletor descartado;

- As colunas foram novamente transferidas para outros tubos coletores e foi

adicionado um segundo volume de 500 μL de outro tampão de lavagem, AW2

(Wash Buffer 2), seguido de centrifugação a 13400 rpm, durante quatro minutos,

sendo descartado o sobrenadante contido no tubo coletor;

- As colunas contendo o DNA foram finalmente apoiadas em tubos eppendorf de

1,5 mL e um volume de 200 μL de tampão de eluição AE (Elution Buffer) foi

pipetado diretamente em cima da coluna contendo DNA, sendo incubado à

temperatura ambiente durante um minuto e, então, centrifugado por dois minutos a

8000 rpm. O DNA foi eluido e transferido para os microtubos eppendorf.

46

Após a extração do material genético, foi aliquotado um volume de 10 μL de

cinco amostras aleatórias para verificação da qualidade da extração do DNA. As

amostras foram aplicadas em gel de agarose 0,8%, para realização de

eletroforese, utilizando como tampão o Tris/borato/EDTA (TBE), 0,5X, 2 μL de

tampão de carregamento e coloração com 1 μL de brometo de etídio na

concentração de 1 μg/mL para visualização no transiluminador.

Tris/borato/EDTA (TBE) – Solução 5X – (Brody & Kern, 2004)

Tris base (2-amino-2-hidroximetil-propano-1,3-diol) -------------------------- 53 g

EDTA (Acido etilenodiamino tetra-acético)(0,5 M – pH 8,0) -------------- 20 mL

Ácido Bórico (H3BO3) --------------------------------------------------------------- 27,5 g

Água milliQ (estéril) -------------------------------------------------------------- 1000 mL

Para utilização em eletroforese o TBE deve ser diluído em 0,5X, em água

deionizada.

Tampão de carregamento de amostra de DNA – Solução 6X (10 mL)

(Sambrook & Maniatis, 1989)

Azul de bromofenol -------------------------------------------------- 0,025 g

Xilenocianol ------------------------------------------------------------ 0,025 g

Glicerol (87 %) ------------------------------------------------------------ 3,5 g

Aquecimento e agitação forte para dissolução.

Completar o volume com água milliQ estéril morna.

Separar alíquotas de 1 mL em tubos eppendorf, estoque a -20ºC.

Volumes de 2 μL foram utilizados para quantificação de todas as amostras,

através de leitura espectrofotométrica das soluções nos comprimentos de onda de

260 e 280 nm, para determinação da concentração total de DNA de cada amostra,

bem como do grau de pureza de cada uma delas.

47

4.8 Hidrólise do DNA

4.8.1 Etapa pré-hidrólise

Após a extração do DNA das culturas bacterianas, fez-se a hidrólise, ou

seja, a quebra de todo material genético. As amostras de DNA foram inicialmente

incubadas em solução tampão, apropriada para eficiência de atividade das

enzimas de hidrólise.

Tampão pré-hidrólise enzimática (Loureiro et al., 2002)

Tampão acetato pH 4,6 (200 mM) -------------------------------------- 10 μL

* Ácido acético ------------------------------------- 7 g/L

* Acetato de sódio ------------------------------------- 11,3 g/L

Cloreto de sódio (NaCl – 500 mM) ------------------------------------- 10 μL

Sulfato de zinco (ZnSO4 – 10 mM) ------------------------------------- 10 μL

Cloreto de magnésio hexaidratado (MgCl2 .6H2O – 100 mM) --- 10 μL

Água milliQ (estéril) --------------------------------------------------------- 47,5 μL

Para completar um volume final de 100 μL, foram adicionados 12,5 μL das

amostras de DNA extraídas.

4.8.2 Hidrólises enzimáticas

Com o DNA incubado em tampão pré-hidrólise, o próximo passo foi a

digestão do material genético, segundo Moysan et al. (1991). No caso da

formação de monoadutos e crosslinks, gerados pelo tratamento PUVA no DNA

bacteriano, por serem ligações covalentes e bem estáveis, não eram atingidas

pelas reações, mas sim as interações mais fracas como as ligações de hidrogênio

(que estão entre as bases opostas das fitas de DNA), as ligações fosfodiéster

(existentes entre os nucleotídeos adjacentes de uma mesma fita de DNA) e as

ligações glicosídicas (existente entre a desoxirribose e as bases nitrogenadas).

Os reagentes e os tampões utilizados no processo de hidrólise estão

relacionados abaixo:

48

- Desoxirribonuclease I, 1U/ μL (DNase I – Invitrogen): Estocada a -20ºC.

- Nuclease S1, 2 mg/ml (From Aspergillus oryzae – Sigma-Aldrich):

Estocada a -20ºC.

- Fosfatase alcalina, 20-50 unidades/mg (P4069 de Escherichia coli –

Sigma-Aldrich): Estocada a -20ºC.

A hidrólise foi iniciada com a adição de 1 μL de DNase I a cada uma das

soluções de DNA contendo o tampão pré-hidrólise e incubação a 37ºC durante

quatro horas. A DNase I é uma endonuclease que cliva moléculas de DNA de

forma não específica, atuando tanto em fitas simples como em fitas duplas de

DNA. Como produtos finais são formados di, tri e oligonucleotídeos 5‟-fosforilados

e 3‟-hidroxilados.

Após ação da DNAse I, foi adicionado em cada solução de DNA 1 μL da

enzima nuclease S1, com incubação a 37 ºC durante 16 horas. Esta enzima

hidrolisa ligações fosfodiéster de moléculas de DNA fita simples.

Antes da adição da fosfatase alcalina foi necessário o ajuste do pH das

soluções de DNA a serem hidrolisadas, uma vez que a enzima só funciona em pH

8,0. Para isto foi feita uma solução 0,2 N de hidróxido de sódio (NaOH) e

estabelecido um volume de 6 μL para adição em todas as amostras de DNA, para

ajuste do pH.

O último passo foi a adição de 2,2 μL de fosfatase alcalina em cada uma

das soluções de DNA, com incubação em 37ºC durante quatro horas. A fosfatase

alcalina age na quebra das ligações éster-fosfato presentes no DNA.

4.9 Análise por espectrometria de massas (MS) (Gozzo, 2005a)

O espectrômetro de massas é um instrumento utilizado para separação de

íons em fase gasosa de acordo com os valores da relação massa/carga (m/z) das

moléculas. O aparelho tem como importante ferramenta o analisador, que

promove a separação dos íons em fase gasosa. Tal ferramenta é operada em alto

vácuo e utiliza um campo, elétrico, magnético ou ambos, para transportar os íons

da região em que foram produzidos até outro local do aparelho, sendo

49

direcionados para o detector, responsável pela produção de sinais, que são

amplificados.

Com o transporte e a separação destes íons, em função dos campos

magnético ou elétrico (ou os dois combinados), o importante não é somente a

massa do íon formado, mas sim a relação massa/carga.

O aparelho utilizado foi um Q-Tof ultima API (Quadrupole Time of Flight -

Micromass, Manchester, Reino Unido) acoplado a um sistema capilar de

cromatografia líquida (NanoAcquity, Waters, Milford – Liquid chromatography

tandem Mass Spectrometry – LC-MS) e uma fonte ESI (Electrospray Ionization) de

nanofluxo.

A técnica de LC-MS une a separação eficiente da técnica de Cromatografia

Líquida de Alta Eficiência (HPLC – High Performance Liquid Chromatography) e a

detecção posterior pelo espectrômetro de massas. O HPLC torna-se importante,

pois remove possíveis interferências presentes nas amostras, que podem

prejudicar a eficiência de ionização.

A técnica de HPLC é uma ferramenta baseada na separação, quantificação

e análise da mistura de compostos químicos, principalmente quando se busca um

composto químico específico misturado entre diferentes substâncias.

A amostra, diluída em um solvente líquido (fase móvel) e que dá o nome à

técnica (cromatografia líquida), permeia através de um substrato sólido (fase

estacionária), havendo a eluição do soluto e resultando na detecção das

substâncias pelo detector de fluxo. A fase estacionária é composta de partículas

de tamanho praticamente uniforme, presentes em uma coluna cilíndrica.

No espectrômetro de massas, o analisador é do tipo quadrupolo, que

apresenta dois pares de suportes metálicos com diferentes potenciais elétricos,

sendo controlado por radiofrequência. Sua utilização é eficiente na detecção e na

resolução de uma grande variedade de massas. No quadrupolo ocorre a

separação dos íons das amostras, sendo separados em função de suas

respectivas massas. O potencial elétrico do analisador é controlado através da

aplicação de uma voltagem e a diferença de potencial promove a filtragem de

massas muito grandes ou muito pequenas (que são desestabilizadas e aderidas

50

aos suportes metálicos), sendo que os íons com uma relação massa/carga

determinada é que apresentam uma trajetória estável, passando do analisador

para o detector.

4.9.1 Roteiro de operação do Q-Tof (Gozzo, 2005b)

As amostras foram processadas no Laboratório de Espectrometria de

Massas (MAS), do Centro de Biologia Molecular e Estrutural (CeBiME) do

Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS), em Campinas, SP. As injeções

foram realizadas ao longo de quatro dias. O processamento das amostras e as

injeções foram acessoradas pela técnica responsável do Laboratório MAS,

Margareth Sugano Navarro, chefiado pelo Dr. Nilson Zanchin.

O analisador do espectrômetro possui acoplado o Software Mass LynxTM ,

versão 4.1 (SP3 Global Mass-Informatics - Copyright© 2004 Micromass Ltd.,

Waters). Este sistema interpreta a corrida das amostras no espectrômetro, com a

geração dos espectros indicativos das massas.

Inicialmente existe a calibração e preparação de toda aparelhagem,

incluindo espectrômetro e o HPLC acoplado, ligados ao sistema computacional. O

ajuste da voltagem, utilizada nos suportes metálicos do analisador para criação do

campo elétrico responsável pela separação dos íons e o seu fluxo em direção ao

detector. A voltagem deve ser aumentada paulatinamente, até chegar à voltagem

final de 9,1 kV, ótima para a utilização do Q-Tof. O ajuste do multiplicador de

elétrons e detector de massas (MCP – Microchannel Plate Detector) também deve

ocorrer, com voltagem ótima de 2400 V, bem como o ajuste da voltagem do

capilar no nanofluxo do electrospray, com valor ótimo entre 3,0 e 3,5 kV e a

temperatura interna do aparelho de 100 ºC e a voltagem do cone de 100 V.

Através do software MassLynx, o Q-Tof é habilitado em seu modo

operacional, sendo acoplado ao analisador e promovendo a obtenção do feixe

iônico. À conexão de saída do HPLC e da fonte de nanofluxo, encontram-se duas

fontes, sendo uma fonte para injeção do analito (para as amostras) e outra fonte

para amostras de referência (para a calibração).

51

Previamente à injeção das amostras de DNA, ocorre uma calibração inicial

com uma solução padrão de ácido fosfórico (H3PO4), injetada na coluna (voltagem

do capilar zerada).

O software permite também o controle do tempo de corrida das amostras ao

longo da coluna e também do gradiente de solventes pré-estabelecido, útil no

deslocamento das amostras ao longo da coluna. A pressão do sistema binário de

solvente do HPLC, para funcionamento correto, deve ter valores de pressão

oscilando entre 1300 e 1700 psi. O fluxo de amostra foi padronizado em um

volume de 600 nanolitros/min.

Quando as amostras são injetadas, inicialmente, ocorre um processo de

dessalinização (remoção dos constituintes salinos das amostras), utilizando a

coluna Waters BEH 130C18, de dimensões: 75 μm (75 micra) X 150 mm (15 cm),

com 1,7 μm de espessura. O gradiente da fase móvel foi isocrático, B – 50% de

acetonitrila, com 0,1% de ácido fórmico e A – água MilliQ estéril. As amostras

foram submetidas a um tempo de corrida de 40 minutos, ao longo da coluna, com

a utilização do seguinte gradiente de solventes:

Tabela 1: Gradiente de solventes – Corrida das amostras

Tempo (minutos) Fluxo (μL/min) % Solvente A % Solvente B

0 – 10 0,6 100 0

10 – 20 0,6 40 60

20 – 30 0,6 40 60

30 – 35 0,6 80 20

35 – 40 0,6 100 0

Ao final de cada injeção, tanto o fluxo capilar como também as voltagens de

controle do aparelho são zeradas e, posteriormente, com uma nova injeção, o

aparelho volta a ser habilitado operacionalmente.

52

Antes das injeções, as amostras foram centrifugadas a uma velocidade de

8000 rpm (Microcentrífuga Eppendorf) durante dois minutos, para remover

contaminantes da solução do DNA, crucial em evitar o entupimento do capilar por

onde atravessam as amostras, no aparelho. Alíquotas de 30 μL de volume das

amostras de DNA foram transferidas para pequenos frascos especiais (Waters) e

alocados em uma placa dentro do espectrômetro. Através do MassLynx foram

controladas as injeções das amostras, a partir de uma ordenação preestabelecida.

Abaixo, encontram-se relacionadas as amostras analisadas:

Amostras Controle:

* DNA das cepas AB1157 e AB1885, sem tratamento;

* DNA das cepas AB1157 e AB1885, tratadas somente com luz UV-A, 30

kJ/m2;

Amostras Tratadas:

* DNA das cepas AB1157 e AB1885, tratadas com PUVA 8-MOP 1 μM, com

extração do material logo após o tratamento;

* DNA das cepas AB1157 e AB1885, tratadas com PUVA 8-MOP 10 μM,

com extração do material logo após o tratamento;

* DNA das cepas AB1157 e AB1885, tratadas com PUVA 8-MOP 10 μM,

com extração do material duas horas após o tratamento;

* DNA das cepas AB1157 e AB1885, tratadas com PUVA PSO 1 μM, com





extração do material duas horas após o tratamento;

* DNA das cepas AB1157 e AB1885, tratadas com PUVA ANG 10 μM, com






53

* DNA das cepas AB1157 e AB1885, tratadas com PUVA DMC 10 μM, com






* DNA das cepas AB1157 e AB1885, tratadas com PUVA TMP 1 μM, com





extração do material duas horas após o tratamento.

4.10 Experimentos para análise por ressonância magnética nuclear

4.10.1 Obtenção e preparo dos oligonucleotídeos de DNA

As sequências dos oligonucleotídeos de DNA foram encomendadas e

obtidas pela IDT (Integrated DNA Technologies – Coralville, Iowa, Estados

Unidos), contendo 12 pares de bases na concentração de 1 μM de cada uma das

sequências, com o seguinte desenho de sequência:

PUVA Fwd: 5’-CGC GCT ACG GCG-3’ (DO260 : 80,0 – 739,9 nMoles – 2,7 mg)

PUVA Rev: 3’-GCG CGA TGC CGC-5’ (DO260 : 87,6 – 822,5 nMoles – 3,0 mg)

A sequência apresenta maior conteúdo de citosinas e guaninas, com uma

pequena região contendo timina e adenina. Esta sequência foi desenhada para

promover a interação dos oligonucleotídeos com os psoralenos no tratamento

PUVA. Esta interação deverá ocorrer principalmente com as timinas presentes no

meio da sequência, pois segundo Dall‟Acqua et al. (2004), os psoralenos

intercalam no DNA e, por ativação, interagem com as bases pirimidínicas.

54

Os oligonucleotídeos foram ressuspensos em água MilliQ estéril. À

sequência PUVA Fwd, foi adicionado um volume de 740 μL de água MilliQ estéril e

à sequência PUVA Rev foi adicionado um volume de 823 μL de água MilliQ estéril

resultando em concentrações finais, de cada uma das sequências, de 0,5 mM.

Posteriormente, os dois volumes foram misturados (volume final de 1563 μL),

finalizando em uma concentração de 0,5 mM de oligonucleotídeo não discriminado

(Independente das sequências).

A mistura das soluções de DNA foi submetida ao processo de anelamento.

Tampão de anelamento de oligos 25X

Tampão fosfato pH 8,0 (100 mM) ---------------------------------------- 81 μL

(Fosfato de sódio monobásico monoidratado 0,2 M (NaH2PO4.H2O) - 15,9

μL; Fosfato de sódio dibásico heptaidratado 0,2 M (Na2HPO4.7H2OK) - 284,1 μL -

Completar com 300 mL de água destilada, volume final de 600 mL)

Cloreto de sódio (5 M – NaCl) ----------------------------------------- 17,6 μL

Cloreto de magnésio (1 M – MgCl2) -------------------------------------- 18,0 μL

Foi adicionado um volume de 62 μL do tampão de anelamento ao volume

de mistura dos oligonucleotídeos (1563 μL) e, posteriormente, a mistura foi

submetida a um aquecimento em recipiente contendo volume de dois litros de

água, à 95 ºC, seguida de resfriamento lento durante a noite à temperatura

ambiente. Após resfriamento a amostra foi imediatamente congelada a -20 ºC

durante duas horas e, depois descongelada. Uma pequena alíquota (10 μL) foi

separada para verificação do anelamento, através de eletroforese em gel de

agarose 0,8%, TBE 0,5X, 2 μL de tampão de carregamento (item 4.7) contendo 1

μl de brometo de etídio na concentração de 1 μg/mL, para visualização no

transiluminador. Ao restante da amostra foi adicionado um volume de 5 μL de DSS

(ácido 4,4-dimetil-4-silapentano-1-sulfônico) 0,01%, utilizado como referência

interna em experimentos de RMN (Bhattacharya et al., 2002; Cavanagh et al.,

2007).

55

O tampão de anelamento possui os reagentes indispensáveis para o

pareamento e ligação posterior das sequências de DNA, em temperatura ótima de

95 ºC. A utilização de um grande volume de água é importante, pois o calor

específico da água faz com que, à temperatura ambiente, diminua sua

temperatura diminua lentamente, eficiente para o processo de anelamento dos

oligonucleotídeos. Inicialmente temperaturas mais altas favorecem a desnaturação

das sequências de DNA e, com diminuição progressiva da temperatura, a

renaturação das mesmas. O pareamento perfeito dos oligonucleotídeos ocorre ao

longo do resfriamento, com a diminuição lenta contribuindo também para a

correção de oligonucleotídeos mal pareados.

A mistura de oligonucleotídeos já anelados foi liofilizada e, posteriormente,

ressuspensa em 1500 μL de água deuterada de ampola (D2O – Cambridge

Isotopes Laboratories – D 99,96%). Para os experimentos de RMN de 1H, a água

deuterada é utilizada como solvente, para que não haja interferência do solvente

nos espectros de hidrogênio da amostra.

4.10.2 Interação psoralenos-oligonucleotídeos

As soluções de psoraleno foram preparadas em metanol deuterado

(CD3OD), para uma concentração final de 100 mM. Os três psoralenos utilizados

nos experimentos foram: 8-metoxipsoraleno (8-MOP), psoraleno (PSO) e

angelicina (ANG).

Foram preparadas soluções de 1 mM de cada um dos psoralenos em 500

μL de água deuterada. Para os estudos de interação dos psoralenos com os

oligonucleotídeos, as soluções de psoraleno foram adicionadas às soluções de

oligo, resultando em uma concentração final de 0,5 mM de oligonucleotídeo,

resultando em uma razão molar final de 2:1 psoraleno:oligonucleotídeo.

4.10.3 Dose de luz ultravioleta A (UV-A)

Para os experimentos de RMN, a dose pré-determinada de tratamento das

amostras com UV-A foi de 540 J/m2 (tempo de 20 segundos de dose,

aproximadamente).

56

4.10.4 Análise da interação oligonucleotídeo-psoraleno por

ressonância magnética nuclear

A espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) permite obter

informações sobre as estruturas moleculares e de interações intermoleculares.

Análises qualitativas e quantitativas utilizando o RMN incluem estudos de

moléculas biológicas e de interação do tipo ligante-proteína, ligante-DNA,

proteína-proteína e proteínas-DNA.

O requisito fundamental para a realização de experimentos de RMN em alta

resolução é usar um campo magnético estático forte, criado através de magnetos

solenóides supercondutores. Estes supercondutores são constituídos por uma liga

de nióbio e funcionam imersos em hélio líquido, a uma temperatura de 4ºK,

resfriado por nitrogênio líquido (77ºK). Todo este sistema está envolvido por uma

câmara a vácuo (Eraky et al., 2003).

O magneto é atravessado por um tubo central oco, que está à temperatura

ambiente, onde se situam bobinas elétricas (bobinas de shim), que geram

pequenos campos magnéticos utilizados na estabilização do campo magnético

central estático, processo este crucial na análise das amostras. No centro do

campo magnético gerado, rodeado pelas bobinas supercondutoras encontra-se a

sonda, onde fica a parte principal do espectrômetro de RMN.

A sonda contém bobinas de radiofrequência que atuam como antenas que

transmitem e recebem radiação eletromagnética. As amostras são colocadas em

tubos de vidro especiais, sendo encaixadas em um rotor (spinner), que desce

sustentada por coluna de ar ou nitrogênio, em direção ao centro do magneto, onde

o volume da amostra fica posicionado no centro das bobinas da sonda. Esta

posição é importante e deve ser corretamente ajustada no magneto.

Para manter a estabilidade do campo magnético (ajuste do Lock) são

usados solventes deuterados escolhidos de forma que não comprometam a

aquisição dos sinais das amostras. O sinal de deutério é usado como uma

referência para o campo magnético recebido pela amostra. Já o analito deve ser

solúvel no solvente, na concentração necessária para as análises. Para os

experimentos devem ser considerados diversos fatores: sensibilidade do núcleo

57

atômico a ser analisado, a sensibilidade do espectrômetro, a temperatura de

trabalho, o tipo de experiência, entre outros.

Foi utilizado o espectrômetro Bruker Avance de 600 MHz, com sonda de

tripla ressonância de 5 mm, do Centro Nacional de Ressonância Magnética

Nuclear Jiri Jonas (CNRMN), do Instituto de Bioquímica Médica, do Centro de

Ciências da Saúde, da UFRJ, para aquisição dos espectros 1D de RMN 1H. Os

experimentos foram monitorados pela Profª Drª Luzineide Wanderley Tinoco,

pesquisadora do Núcleo de Pesquisas de Produtos Naturais (NPPN), do Centro de

Ciências da Saúde da UFRJ.

Os tubos especiais para RMN devem estar adequadamente limpos, uma

vez que a presença de qualquer resíduo pode interferir na aquisição dos espectros

de hidrogênio. Os tubos foram inicialmente limpos com a utilização de ácido nítrico

(HNO3 - MERCK) por 60 minutos, seguido de lavagem com água corrente. Ao final

da lavagem os tubos foram internamente lavados com água MilliQ.

A solução de DNA ressuspensa em água deuterada foi aliquotada em três

diferentes volumes, de 500 μL cada. Uma solução de background (branco dos

experimentos) também foi preparada, contendo 20 μL do tampão de anelamento

em 480 μL de água deuterada.

Os espectros de RMN de 1H 1D permitem a detecção de diferenças dos

deslocamentos químicos dos hidrogênios das substâncias, em função das

diferenças nos ambientes químicos. Porém, espectros 1D para análise de

moléculas, como os oligonucleotídeos, são mais complexos, devido a

sobreposição dos sinais, sendo necessário adquirir espectros 2D para uma análise

mais detalhada.

Os espectros de RMN de 1H 1D foram adquiridos para as amostras

relacionadas abaixo:

Amostras Controle (Substâncias Puras):

* Solução background contendo água deuterada e tampão de anelamento

(branco do experimento);

* Oligonucleotídeo (0,5 mM) sem nenhum tratamento;

* Oligonucleotídeo (0,5 mM) irradiados com luz UV-A (540 J/m2);

58

* 8-MOP (1 mM) não irradiado e irradiado com luz UV-A (540 J/m2);

* PSO (1 mM) não irradiado e irradiado com luz UV-A (540 J/m2);

* ANG (1 mM) não irradiado e irradiado com luz UV-A (540 J/m2);

* Oligonucleotídeo (0,5 mM) + 8MOP (1 mM) não irradiado;

* Oligonucleotídeo (0,5 mM) + PSO (1 mM) não irradiado;

* Oligonucleotídeo (0,5 mM) + ANG (1 mM) não irradiado.

Amostras para Estudos de Interação (Psoralenos +

Oligonucleotídeos):

* Oligonucleotídeo (0,5 mM) + 8MOP (1 mM) irradiados com luz UV-A (540 J/m2);

* Oligonucleotídeo (0,5 mM) + PSO (1 mM) irradiados com luz UV-A (540 J/m2);

* Oligonucleotídeo (0,5 mM) + ANG(1 mM) irradiados com luz UV-A (540 J/m2);

Foram adquiridos espectros 2D (NOESY) das seguintes amostras:

* Oligonucleotídeo (0,5 mM) sem nenhum tratamento;

* Oligonucleotídeo (0,5 mM) + ANG (1 mM) não irradiado;

* Oligonucleotídeo (0,5 mM) + ANG (1 mM) irradiados com luz UV-A (540 J/m2).

Após aquisição, os espectros 1D foram processados através da utilização

do programa Spinworks, versão 2.5 (Kirk Marat, Universidade de Manitoba).

Na análise dos espectros 1D, foram consideradas as diferenças no

deslocamento químico dos hidrogênios das moléculas de 8-MOP, PSO, ANG e

dos deslocamentos de alguns hidrogênios do oligonucleotídeo, comparando os

espectros das amostras dos psoralenos e dos oligonucleotídeos puros e

misturados. As diferenças de deslocamento químico observadas para os

hidrogênios dos psoralenos e do oligonucleotídeo foram analisadas através de

gráficos de barras do Microsoft Excel 2002 (Copyright© Microsoft Corporation,

1985-2001).

59

5. Resultados

5.1 Sobrevivência bacteriana ao tratamento PUVA

5.1.1 Tratamento com diferentes psoralenos bifuncionais

Inicialmente as cepas selvagem e deficientes no sistema NER foram

submetida ao tratamento PUVA (material e métodos, item 4.6), utilizando

diferentes psoralenos, capazes de fazer tanto monoadutos quanto crosslinks.

Nos gráficos apresentados verifica-se um padrão dose-resposta para todos

os tratamentos (Figura 5A, PSO; Figura 5B, ANG e Figura 5C, TMP). Observa-se

claramente também a acentuada inativação das cepas deficientes no mecanismo

NER.

Observamos que os tratamentos utilizando a furocumarina angular ANG

(Figura 5B) não inativaram a cepa selvagem, mas afetaram as cepas deficientes

em uvrA, uvrB e uvrC. Novamente o reparo NER é importante para a reparação

destas lesões. No caso da ANG, entretanto, foram necessárias maiores

concentrações do que as utilizadas nos experimentos com seu análogo linear,

PSO.

60

Figura 5 – Sobrevivência ao tratamento PUVA das cepas de Escherichia coli selvagem e deficientes em uvrA, uvrB e uvrC, utilizando diferentes psoralenos: PSO (A), ANG (B) e TMP (C), em diferentes concentrações, com uma única dose de 30 kJ/m2 de UV-A. Após o tratamento as diferentes culturas foram diluídas e semeadas em placas contendo meio LB sólido (agar 1,5%) .

61

5.1.2 O caso do tratamento com 8MOP e seu análogo monofuncional,

H28MOP

Na figura 6A observa-se que, em função do aumento da concentração de

8MOP, não ocorre aumento de sensibilidade para a cepa selvagem, diferente das

cepas deficientes em NER. Sendo que, nas primeiras concentrações, embora os

mutantes uvrA e uvrC não sejam sensíveis, o mutante uvrB sofre uma redução

abrupta na sobrevivência. Na concentração mais alta ocorreu a redução similar na

sobrevivência das três cepas uvrA, uvrB e uvrC, indicando a importância do reparo

NER na remoção das lesões causadas pelo tratamento.

Diante deste resultado, procuramos testar duas hipóteses para explicá-lo:

- a fotorreação do 8MOP com o DNA gera uma maior proporção de monoadutos

em relação aos crosslinks, comparativamente aos outros psoralenos bifuncionais;

- a fotorreatividade do 8MOP é menor do que as dos demais psoralenos, de forma

que a quantidade total de fotoadutos é menor, mesmo em condições equimolares.

Para tanto, uma amostra de 8MOP foi submetida a uma reação de

saturação da dupla ligação do anel pirona, gerando um análogo 8MOP

monofuncional (H28MOP). O tratamento PUVA H28MOP foi capaz de reduzir a

sobrevivência apenas da cepa deficiente uvrB (figura 6B). Através destes

resultados, parece existir uma relação entre a fotorreatividade (8MOP

bifuncional e H28MOP monofuncional) e a sensibilidade das cepas submetidas

ao tratamento (Figuras 6A e 6B).

5.1.3 Tratamento com a cumarina monofuncional dimetoxicumarina

Os resultados dos tratamentos utilizando DMC são mostrados na figura 6C.

Foi verificado que os deficientes uvrA e uvrC comportam-se como a cepa

selvagem às diferentes concentrações de DMC no tratamento. A deficiência em

uvrB causa sensibilidade ao tratamento.

Estes resultados sugerem que os monoadutos formados pelos agentes

monofuncionais (provavelmente os que também são formados pelo 8MOP em

pequenas concentrações) seriam reparados por um sistema diferente de NER,

utilizando uma das enzimas do complexo (UvrB).

62

Figura 6 – Sobrevivência ao tratamento PUVA das cepas de Escherichia coli selvagem e deficientes em uvrA, uvrB e uvrC, utilizando diferentes psoralenos 8MOP (A), H28MOP (B) e DMC (C), em diferentes concentrações, com uma única dose de 30 kJ/m2 de UV-A. Após o tratamento as diferentes culturas foram diluídas e semeadas em placas contendo meio LB sólido (agar 1,5%).

63

5.2. Lesões PUVA analisadas por espectrometria de massas

Objetivando detectar as lesões produzidas no DNA pelos diferentes

tratamentos para tentar correlacionar as lesões produzidas com os efeitos

biológicos observados utilizamos a espectrometria de massas.

Após a injeção das amostras, os dados foram analisados através da

utilização do software MassLynx 4.1, da Waters, responsável pela geração dos

arquivos que contém os picos das massas geradas como resultado da ionização

das amostras.

Foram realizados diversos tratamentos, utilizando diferentes psoralenos, em

diferentes concentrações, em cada uma destas condições observamos a geração

de lesões específicas, resultantes da interação entre os psoralenos e o DNA das

bactérias.

Inicialmente foram identificados os picos das massas das bases

nitrogenadas de amostras de DNA das cepas bacterianas utilizadas, mas sem

tratamento, bem como dos psoralenos (controle). Os espectros estão agrupados a

seguir, mostrando as regiões de interesse das massas.

Os valores das massas foram determinados a partir da soma dos valores

isolados de cada molécula. Por exemplo: no caso de um monoaduto entre 8MOP

e timina, os valores de cada um foram somados em um único valor e adicionados

de mais uma unidade, referente à ionização no espectrômetro de massas.

64

IA) Bases Nitrogenadas

TIMINA

m/z124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134

%

0

100

25 17 (0.383) Cm (2:471) 1: TOF MS ES+ 456127.14

125.13

125.09124.11

127.10

127.07126.14

129.05

128.15

133.08129.12

131.08130.05 132.04

ADENINA

m/z130 131 132 133 134 135 136 137

%

0

100

26 1451 (32.154) Cm (1351:1821) 1: TOF MS ES+ 301136.05

131.04

130.05

130.99130.14 130.70

133.05

132.06131.07

131.11131.33

131.98132.09

132.98132.45

134.04

133.09

133.97133.61

135.07134.96

134.50

135.11

135.85135.41

137.13137.05

136.94136.53

137.16137.57

CITOSINA (mais Desoxirribose)

m/z225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235

%

0

100

2 507 (12.330) Cm (437:732) 1: TOF MS ES+ 1.73e3228.21

225.07

225.13

226.20225.20

226.06227.17

227.05

229.23229.10 233.13

230.16229.82 231.10

230.99232.20231.99

234.16233.20

234.96234.67

GUANINA

m/z151 152 153 154

%

0

100

26 1451 (32.154) Cm (1351:1821) 1: TOF MS ES+ 150152.05

151.03

151.00

150.13150.57150.52 150.93

151.10

152.02

151.83151.75

151.63151.29

153.02152.08

152.96152.14152.83

152.66152.32

153.16

154.00

153.98153.62

153.21153.56

65

IB) Psoralenos isolados

8MOP

m/z210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220

%

0

100

1 475 (12.384) Cm (414:712) 1: TOF MS ES+ 3.85e3217.21

213.17211.16

210.14

212.16

212.66214.21 215.19 216.22

219.15

218.22

PSO

m/z186 187 188 189

%

0

100

9 391 (12.081) Cm (340:565) 1: TOF MS ES+ 308189.08

187.06

186.23

186.19186.06

185.78185.51 185.99

186.95186.60186.55186.85

188.11

187.14

187.23 188.00

187.61187.40 187.66

188.14

188.60188.51188.35 188.99

189.13

189.60189.38

ANG

m/z186 187 188 189

%

0

100

44 515 (12.242) Cm (435:698) 1: TOF MS ES+ 458189.07

187.06

186.22186.05

185.78185.33 185.39

186.96186.44 186.62

188.10187.14

188.00187.87

187.23 187.45188.16

188.60 188.73

189.13

189.82189.59189.41

DMC

m/z206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226

%

0

100

27 969 (24.565) Cm (800:1179) 1: TOF MS ES+ 1.84e4207.09

206.09

221.12

208.09209.08 215.07

223.07

222.12 225.06224.07

TMP

m/z226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236

%

0

100

33 47 (1.291) Cm (2:396) 1: TOF MS ES+ 778229.24

227.05226.07

225.27227.26

228.05229.03

230.24235.19233.21231.24 236.21

66

5.2.1 Lesões geradas pelo tratamento com UV-A

Como controle, a cepa selvagem de E. coli foi tratada apenas com luz

ultravioleta A (30kJ/m2). Foram identificadas massas que sugerem a formação de

dímeros entre diferentes bases nitrogenadas, como resultado da irradiação com

UV-A. Embora se confirme cada vez mais a formação de dímeros de pirimidina

com a irradiação do DNA com UV-A (Jiang et al., 2009), foram encontrados picos

de massas que também sugerem a formação de dímeros entre bases purínicas e

de purinas com pirimidinas (tabela 2).

Alguns espectros com as massas determinadas e a Tabela 2 com todas as

massas dos dímeros possivelmente formados são mostrados a seguir.

2) Dímeros

Dímero de Timinas

Dímero de Citosinas

Dímero de Adeninas

m/z265 266 267 268 269 270 271 272

%

0

100

39 17 (0.384) Cm (2:470) 1: TOF MS ES+ 828271.24

267.25

265.16267.19

266.99266.18

271.18

269.22268.26 268.97

270.27269.97

272.25

272.19

67

a) Tabela 2: Dímeros gerados no DNA pelo tratamento com UV-A (30

kJ/m2) – Extração de DNA logo após o tratamento

Tabela 2 - Cepa selvagem

Dímeros

C-C

C-A

A-A

T-T

A-G

T-A

G-G

C-G

68

5.2.2 Lesões geradas pelo tratamento PUVA 8MOP + UV-A

Nos experimentos com 8MOP foram identificados picos de massas que

sugerem a formação de monoadutos e crosslinks envolvendo 8MOP e timinas,

lesões até então já esperadas como substrato para o tratamento PUVA. No

entanto, picos que sugerem a formação de novas ligações entre 8MOP e DNA

foram identificados: a formação de dímeros de pirimidinas e purinas e também

monoadutos e crosslinks com purinas.

A seguir, são mostrados alguns espectros de lesões identificadas nos

tratamento com 8MOP:

3A) Picos de lesões esperadas

Monoaduto 8MOP-T

Crosslink dT-8MOP-dT

m/z700 701 702 703 704 705 706 707 708 709 710 711 712 713 714 715

%

0

100

5 851 (22.450) Cm (746:1179) 1: TOF MS ES+ 1.50e3701.22

700.27

702.22 703.22

708.23705.24704.23707.31706.24

710.21709.22 711.35 714.35712.36 713.31

69

3B) Picos indicando lesões inéditas

Dímero de Citosinas

Dímero de Timinas

Dímero de Adeninas

Monoaduto 8MOP-A

Crosslink C-8MOP-A

m/z579 580 581 582 583 584 585 586 587 588

%

0

100

41 17 (0.384) Cm (1:471) 1: TOF MS ES+ 408579.14

580.13

581.12588.90

582.11583.11

70

Na concentração de 8MOP de 1 μM, com extração de DNA logo após o

tratamento (tabelas 3A e B), na cepa selvagem foram encontrados sete diferentes

tipos de dímeros, dois de monoadutos e oito de crosslinks. Já na cepa deficiente

em uvrB foram encontrados sete diferentes tipos de dímeros, três de monoadutos

e cinco de crosslinks. Na concentração de 8MOP de 10 µM (tabelas 4A e B), na

cepa selvagem foram encontrados oito diferentes tipos de dímeros, dois

monoadutos e quatro crosslinks. Já na cepa deficiente em uvrB foram encontrados

sete diferentes dímeros, dois monoadutos e cinco crosslinks. Parece também não

haver diferença entre a variedade de lesões da cepa selvagem e no deficiente em

uvrB.

Na concentração de 8MOP de 10 μM, com extração de DNA duas horas

após o tratamento (tabelas 5A e B), na cepa selvagem foram encontrados cinco

diferentes tipos de dímeros, um monoaduto e um crosslink. Já na cepa deficiente

em uvrB, foram encontrados oito diferentes tipos de dímeros, dois monoadutos e

dois crosslinks. Nesta condição de tratamento parecem existir diferenças entre as

cepas selvagem e deficiente. A variedade de lesões diméricas, monoadutos e

crosslinks diminui para a cepa selvagem.

Parece que, após as duas horas de tratamento, houve a diminuição na

variedade de lesões na cepa selvagem, sugerindo eficácia de reparação das

lesões. No entanto, no deficiente uvrB, apenas o número de crosslinks diminuiu.

As lesões, identificadas nos diferentes tratamentos, estão discriminadas nas

tabelas a seguir:

71

a) Tabelas 3 (A e B): Adutos formados no DNA da cepa selvagem (A) e

mutante uvrB (B) pelo tratamento com PUVA 8MOP (1 μM) + UV-A (30 kJ/m2)

– Extração de DNA logo após o tratamento

A

Dímeros Monoadutos Crosslinks

C-C

T-T

C-A

A-A

A-G

T-A

G-G

8MOP-T

8MOP-C

A-8MOP-G

G-8MOP-G

C-8MOP-C

C-8MOP-A

T-8MOP-T

T-8MOP-C

T-8MOP-G

T-8MOP-A

B


C-C

C-T

C-A

C-G

A-A

A-G

G-G

8MOP-T

8MOP-C

8MOP-A

A-8MOP-G

G-8MOP-G

C-8MOP-A

T-8MOP-C

T-8MOP-A

72

b) Tabelas 4 (A e B): Adutos formados no DNA da cepa selvagem (A) e



A


C-C

C-A

C-G

A-A

A-G

T-T

T-A

G-G

8MOP-T

8MOP-A

A-8MOP-G

G-8MOP-G

C-8MOP-A

T-8MOP-C

B


C-C

C-A

C-G

A-A

A-G

T-T

G-G

8MOP-T

8MOP-C

A-8MOP-G

G-8MOP-G

T-8MOP-A

T-8MOP-C

T-8MOP-G

73

c) Tabelas 5 (A e B): Adutos formados no DNA da cepa selvagem (A) e


– Extração de DNA duas horas após o tratamento

A


C-C

C-A

A-A

A-G

T-A

8MOP-T A-8MOP-G

B


C-C

C-A

C-G

A-A

A-G

T-T

T-A

G-G

8MOP-T

8MOP-C

A-8MOP-G

T-8MOP-C

74

5.2.3 Lesões geradas pelo tratamento PUVA PSO + UV-A

Nos experimentos com PSO também foram identificados picos com massas

que sugerem monoadutos e crosslinks envolvendo PSO e timinas, mas também a

formação de dímeros entre purinas e pirimidinas e também monoadutos e

crosslinks como resultado da interação entre PSO e purinas e pirimidinas.


tratamento com PSO:


Monoaduto PSO-T

Crosslink T-PSO-T


Dímero de timinas

75

Dímero de adeninas

Dímero T-A

Monoaduto PSO-G

Crosslink G-PSO-A

76

Na concentração de PSO de 1 µM, com extração de DNA logo após o

tratamento (tabelas 6A e B), no DNA da cepa selvagem foram encontrados sete

diferentes tipos de dímeros, três de monoadutos e dois de crosslinks. Já na cepa

deficiente em uvrB foram encontrados quatro diferentes tipos de dímeros, dois de

monoadutos e dois de crosslinks. Neste tratamento observa-se uma variedade

menor de dímeros identificados na cepa mutante, mas a proporção de

monoadutos e crosslinks praticamente se mantém. Na concentração de PSO de

10 μM (tabelas 7A e B) na cepa selvagem foram encontrados sete diferentes tipos

de dímeros, dois de monoadutos e dois de crosslinks. Já na cepa deficiente em

uvrB foram encontrados quatro diferentes tipos de dímeros, dois de monoadutos e

três de crosslinks. Parece que também na concentração de 10 μM de PSO, existe

menor variedade de dímeros identificados na cepa mutante, diferindo também a

formação de crosslink em um tipo a mais, comparando com a cepa selvagem.

Parece não haver correlação entre aumento de concentração de psoraleno com

presença dos diferentes tipos de lesões.

Na concentração de PSO de 10 μM, com extração de DNA duas horas após

o tratamento (tabelas 8A e B), na cepa selvagem foram encontrados sete

diferentes tipos de dímeros, dois de monoadutos e seis de crosslinks. Já na cepa

deficiente em uvrB foram encontrados sete diferentes tipos de dímeros, três de

monoadutos e quatro de crosslinks.

Ao contrário do que foi observado nos experimentos com o 8MOP, não

houve redução da quantidade de lesões no DNA da cepa selvagem após duas

horas de recuperação, sugerindo não ter havido reparo.


tabelas a seguir:

77

a) Tabelas 6 (A e B): Adutos formados no DNA da cepa selvagem (A) e

mutante uvrB (B) pelo tratamento com PUVA PSO (1 μM) + UV-A (30 kJ/m2) –

Extração de DNA logo após o tratamento

A


C-C

C-A

C-G

A-A

A-G

T-T

T-A

PSO-T

PSO-G

PSO-C

G-PSO-G

C-PSO-C

B


C-C

C-A

A-A

A-G

PSO-T

PSO-G

C-PSO-C

T-PSO-T

78

b) Tabelas 7 (A e B): Adutos formados no DNA da cepa selvagem (A) e

mutante uvrB (B) pelo tratamento com PUVA PSO (10 μM) + UV-A (30 kJ/m2)


A


C-C

C-A

C-G

A-A

A-G

T-T

T-A

PSO-T

PSO-G

G-PSO-A

C-PSO-C

B


C-C

C-A

A-A

T-A

PSO-T

PSO-G

G-PSO-G

C-PSO-C

T-PSO-T

79

c) Tabelas 8 (A e B): Adutos formados no DNA da cepa selvagem (A) e

mutante uvrB (B) pelo tratamento com PUVA PSO (10 μM) + UV-A (30 kJ/m2)

– Extração de DNA duas horas após o tratamento

A


C-C

C-A

C-G

A-A

A-G

T-T

G-G

PSO-T

PSO-G

G-PSO-G

G-PSO-A

C-PSO-C

C-PSO-G

A-PSO-A

T-PSO-T

B


C-C

C-A

C-G

A-A

A-G

T-T

T-A

PSO-T

PSO-G

PSO-C

G-PSO-G

G-PSO-A

C-PSO-C

T-PSO-T

80

5.2.4 Lesões geradas pelo tratamento PUVA ANG + UV-A

Nos experimentos com ANG, foram identificadas massas que sugerem a

formação de monoadutos entre ANG e timina (lesão já esperada), mas também

novos substratos. Foram identificadas massas que sugerem a formação de

dímeros envolvendo purinas e pirimidinas, monoadutos de ANG com purinas e,

interessantemente, crosslinks, que eram consideradas lesões impossíveis de se

formar entre ANG e as bases do DNA, uma vez que a estrutura angular da

molécula impediria tal ligação (Fossa et al., 2002).


tratamento com ANG:

5A) Pico de lesão esperada

Monoaduto ANG-T


Dímero de timinas

Dímero A-G

m/z519 520 521 522 523 524 525 526 527 528

%

0

100

53 17 (0.384) Cm (1:471) 1: TOF MS ES+ 4.07e3519.13

520.12

521.13

522.12

523.12

81

Dímero C-G

Monoaduto ANG-G

Crosslink C-ANG-C

Crosslink G-ANG-G

82

Na concentração de ANG de 10 μM, com extração de DNA logo após o

tratamento (tabelas 9A e B), na cepa selvagem foram encontrados seis diferentes

tipos de dímeros, dois monoadutos e três crosslinks. Já na cepa deficiente em

uvrB foram encontrados seis diferentes tipos de dímeros, dois monoadutos e um

crosslink. Na concentração de ANG de 75 µM (tabelas 10A e B), na cepa

selvagem foram encontrados sete diferentes tipos de dímeros, três de monoadutos

e quatro de crosslinks. Já na cepa deficiente em uvrB foram encontrados sete

diferentes tipos de dímeros, dois tipos de monoadutos e quatro tipos de crosslinks.

Comparando-se os resultados obtidos com as diferentes concentrações de ANG,

houve um pequeno aumento na formação das lesões nas duas cepas, mas com

destaque para o mutante uvrB, que apresentou maior aumento na formação de

crosslinks, na concentração de 75 μM.

Na concentração de ANG de 75 μM, com extração de DNA duas horas após

o tratamento (tabelas 11A e B), na cepa selvagem foram encontrados seis

diferentes tipos de dímeros, dois monoadutos e dois crosslinks. Já na cepa

deficiente em uvrB foram encontrados cinco diferentes tipos de dímeros, dois

monoadutos e um crosslink.

Nesta última condição de tratamento os dados sugerem uma leve

diminuição do número de lesões, tanto para a selvagem como para a deficiente

em uvrB, sendo que houve redução pela metade dos tipos de crosslinks na cepa

selvagem e diminuição significativa dos tipos de crosslinks no deficiente em uvrB.

Nos experimentos utilizando ANG os dados sugerem certa eficiência na

remoção dos crosslinks nas duas cepas. No caso dos dímeros e dos monoadutos,

não é possível a correlação de uma eficiência de reparo.


tabelas a seguir:

83

a) Tabela 9 (A e B): Adutos formados no DNA da cepa selvagem (A) e

mutante uvrB (B) pelo tratamento com PUVA ANG (10 μM) + UV-A (30 kJ/m2)


A


C-C

C-A

C-G

A-A

A-G

T-A

ANG-T

ANG-G

G-ANG-A

C-ANG-C

T-ANG-T

B


C-C

C-A

A-A

A-G

T-T

T-A

ANG-T

ANG-G

C-ANG-C

84

b) Tabelas 10 (A e B): Adutos formados no DNA da cepa selvagem (A)

e mutante uvrB (B) pelo tratamento com PUVA ANG (75 μM) + UV-A (30


A


C-C

C-A

C-G

A-A

A-G

T-T

T-A

ANG-T

ANG-G

ANG-C

G-ANG-G

G-ANG-A

C-ANG-C

T-ANG-T

B


C-C

C-A

C-G

A-A

A-G

T-T

T-A

ANG-T

ANG-G

G-ANG-A

C-ANG-C

T-ANG-T

T-ANG-A

85

c) Tabelas 11 (A e B): Adutos formados no DNA da cepa selvagem (A)

e mutante uvrB (B) pelo tratamento com PUVA ANG (75 μM) + UV-A (30

kJ/m2) – Extração de DNA duas horas após o tratamento

A


C-C

C-A

C-G

A-A

A-G

T-T

ANG-T

ANG-G

C-ANG-C

T-ANG-T

B


C-C

C-A

A-A

A-G

T-T

ANG-T

ANG-G

T-ANG-T

86

5.2.5 Lesões geradas pelo tratamento PUVA DMC + UV-A

Como resultado dos tratamentos com DMC (dimetoxicumarina), foram

identificadas massas que sugerem apenas a formação de um tipo de monoaduto,

entre DMC e timina (já esperado), e a formação inédita de dímeros. A molécula de

DMC, por não possuir o anel furano, não pode formar crosslinks e a estrutura de

DMC provavelmente impede a formação de outras interações, tais como

monoadutos com outras bases do DNA.


tratamento com DMC:

6A) Pico de lesão esperada

Monoaduto DMC-T


Dímero de timinas

Dímero de adeninas

87

Na concentração de DMC de 10 μM, com extração de DNA logo após o

tratamento (tabelas 12A e B), na cepa selvagem foram encontrados cinco

diferentes tipos de dímeros e um monoaduto. Já na cepa deficiente em uvrB foram

encontrados sete diferentes tipos de dímeros e também um monoaduto. Na

concentração de DMC de 75 µM (tabelas 13A e B) na cepa selvagem foram

encontrados seis diferentes tipos de dímeros e um monoaduto. Já na cepa

deficiente em uvrB foram encontrados sete diferentes tipos de dímeros e também

um monoaduto. Entre as duas concentrações praticamente não houve diferença

quanto ao número de lesões, com destaque apenas para um dímero a mais na

cepa selvagem (na concentração de 75 μM).

Na concentração de DMC de 75 μM, com extração de DNA duas horas

após o tratamento (tabelas 14A e B), na cepa selvagem e mutante uvrB foram

encontrados cinco diferentes tipos de dímeros e um de monoaduto.

Comparando os tratamentos, parece que após duas horas houve um leve

decréscimo do número de dímeros em ambas as cepas, mas não houve remoção

do monoaduto.


tabelas a seguir:

88

a) Tabelas 12 (A e B): Adutos formados no DNA da cepa selvagem (A)

e mutante uvrB (B) pelo tratamento com PUVA DMC (10 μM) + UV-A (30


A

Dímeros Monoadutos

C-C

C-A

A-A

A-G

G-G

DMC-T

B

Dímeros Monoadutos

C-C

C-A

A-A

A-G

T-T

T-A

G-G

DMC-T

89




A

Dímeros Monoadutos

C-C

C-A

A-A

A-G

T-T

T-A

DMC-T

B

Dímeros Monoadutos

C-C

C-A

A-A

A-G

T-T

T-A

G-G

DMC-T

90




A

Dímeros Monoadutos

C-C

C-A

C-G

A-A

A-G

DMC-T

B

Dímeros Monoadutos

C-C

C-A

C-G

A-A

A-G

DMC-T

91

5.2.6 Lesões geradas pelo tratamento PUVA TMP + UV-A

Nos experimentos com TMP (4,5‟,8-trimetilpsoraleno), apenas um tipo de

monoaduto foi encontrado, entre TMP e timina, um tipo de lesão já esperado,

assim como crosslink entre TMP e timinas, também encontrada. No entanto

também foram identificados dímeros e crosslinks, envolvendo purinas e

pirimidinas.

A complexidade estrutural de TMP, impedindo sua interação com o DNA,

pode ser a razão da não identificação de outros tipos de monoaduto envolvendo

TMP e as outras bases.


tratamento com TMP:


Monoaduto TMP-T

Crosslink T-TMP-T


Dímero de timinas

92

Dímero de citosinas

Dímero de guaninas

Crosslink C-TMP-C

Crosslink C-TMP-G

93

Na concentração de TMP de 1 μM, com extração de DNA logo após o

tratamento (tabelas 15A e B), no DNA da cepa selvagem foram encontrados seis

diferentes tipos de dímeros, um monoaduto e cinco crosslinks. Já na cepa

deficiente em uvrB, foram encontrados seis diferentes tipos de dímeros, um

monoaduto e quatro crosslinks. Nesta concentração de TMP a única diferença foi

um tipo a menos de crosslink no deficiente em uvrB. Na concentração de TMP de

10 µM (tabelas 16A e B), na cepa selvagem foram encontrados sete diferentes

tipos de dímeros, um monoaduto e dois crosslinks. Já na cepa deficiente em uvrB,

foram encontrados seis diferentes tipos de dímeros e um monoaduto. Quando

comparado com o tratamento utilizando a concentração de 1 μM de TMP, houve

um pequeno aumento do número de dímeros e uma diminuição significativa do

número de crosslinks.

Na concentração de TMP de 10 μM, com extração de DNA duas horas após

o tratamento (tabelas 17A e B), na cepa selvagem foram encontrados seis

diferentes tipos de dímeros, um monoaduto e dois crosslinks. Já na cepa

deficiente em uvrB, foram encontrados cinco diferentes tipos de dímeros, um

monoaduto e um crosslink.

Neste tratamento ocorreram pequenas diferenças entre a cepa selvagem e

o deficiente em uvrB. Em comparação com os outros tratamentos, houve pequena

diminuição do número de dímeros e a formação de um crosslink no deficiente em

uvrB.

Os picos com as massas identificadas das lesões, nos diferentes

tratamentos, estão discriminados nas tabelas a seguir:

94

a) Tabelas 15 (A e B): Adutos formados no DNA da cepa selvagem (A)

e mutante uvrB (B) pelo tratamento com PUVA TMP (1 μM) + UV-A (30 kJ/m2)


A


C-C

C-A

C-G

A-A

A-G

T-T

TMP-T C-TMP-C

C-TMP-G

C-TMP-T

C-TMP-A

T-TMP-T

B


C-C

C-A

A-A

A-G

T-T

TMP-T C-TMP-T

C-TMP-A

T-TMP-T

G-TMP-G

95


e mutante uvrB (B) pelo tratamento com PUVA TMP (10 μM) + UV-A (30


A


C-C

C-A

C-G

A-A

A-G

T-T

G-G

TMP-T C-TMP-G

C-TMP-A

B


C-C

C-A

C-G

A-A

A-G

T-T

TMP-T NÃO IDENTIFICADOS

96


e mutante uvrB (B) pelo tratamento com PUVA TMP (10 μM) + UV-A (30


A


C-C

C-A

A-A

A-G

T-T

G-G

TMP-T C-TMP-A

T-TMP-T

B


C-C

C-A

A-A

T-T

G-G

TMP-T T-TMP-T

No Anexo I, ao final do trabalho, estão todos os espectros das massas

encontradas que são relativos a lesões formadas a partir dos tratamentos

realizados (páginas 118 a 127).

97

5.3. Lesões PUVA analisadas por ressonância magnética nuclear

(RMN)

Após o anelamento dos oligonucleotídeos, foram adicionados diferentes

psoralenos e, posteriormente a irradiação. As diferentes condições foram então

observadas através das análises por RMN. As mudanças de ambiente químico

provocadas pela perturbação dos átomos de hidrogênio das amostras devido aos

diferentes tratamentos geram diferenças nos valores de deslocamentos químicos.

Os espectros de RMN de 1H adquiridos foram processados e analisados

com a utilização do programa SpinWorks 2.5.5 Copyright© (1999-2006, Kirk Marat,

University of Manitoba, Canadá). A análise dos espectros foi feita através da

comparação dos valores de deslocamento químico observadas para as amostras

dos psoralenos puros com aqueles obtidos quando na presença dos

oligonucleotídeos, utilizando ou não (controles) doses diferentes de radiação UV-

A.

Para os estudos de interação entre os psoralenos e os oligonucleotídeos de

DNA as amostras foram preparadas na proporção de 2:1 (oligo-psoraleno), na

concentração de 0,5 mM. Imediatamente após a adição dos psoralenos, a amostra

contendo a mistura foi irradiada com uma dose de UV-A de 540 J/m2.

5.3.1. Deslocamentos gerados pelo tratamento PUVA 8MOP + UV-A

A interação entre 8MOP e o oligo de DNA promoveu alguns deslocamentos

dos hidrogênios de 8MOP. Quando da adição de oligo, sem UV-A, ocorreram

deslocamentos dos hidrogênios H(B) e H(D) (Hidrogênios dos carbonos 4‟ e 5‟ do

anel furano do 8MOP), e também de um dos hidrogênios do carbono 3 do anel

pirona da molécula [H(E)]. O sinal do hidrogênio do anel central da molécula de

8MOP [H(C)] também se deslocou. Após a dose de UV-A de 540 J/m2 apenas

H(F), referente ao sinal dos hidrogênios do radical metoxi de 8MOP, sofreu

deslocamento. Tais resultados sugerem a provável interação de 8MOP com o

oligo de DNA, embora a dose de UV-A não fora suficiente para novos

deslocamentos dos hidrogênios das extremidades da molécula de 8MOP.

98

A seguir os valores dos deslocamentos dos hidrogênios de 8MOP, em

função das diferentes condições dos experimentos:

1) Deslocamentos dos hidrogênios do 8MOP

8MOP sem oligo

H(A): 8,12 H(B): 7,88 H(C): 7,67 H(D): 7,01 H(E): 6,47 H(F): 4,26

8MOP + oligo – Sem irradiar

H(A): 8,12 H(B): 7,87 H(C): 7,64 H(D): 7,00 H(E): 6,45 H(F): 4,26

8MOP + oligo + UVA (540 J/m2)

H(A): 8,12 H(B): 7,87 H(C): 7,64 H(D): 7,00 H(E): 6,45 H(F): 4,25

5.3.2. Deslocamentos gerados pelo tratamento PUVA PSO + UV-A

A interação entre PSO e o oligo de DNA também gerou alguns

deslocamentos dos hidrogênios de PSO. Quando da adição de oligo, sem UV-A,

ocorreram deslocamentos dos hidrogênios H(C) (hidrogênio do anel central da

molécula de PSO) e H(E) (Um dos hidrogênios – carbono 5‟ - do anel furano de

PSO). Após a dose de UV-A de 540 J/m2 os hidrogênios H(B) (carbono 4) e H(D)

(carbono 4‟), um dos hidrogênios das duas extremidades de PSO, se deslocaram;

houve também um segundo deslocamento de H(C). Tais resultados sugerem uma

provável interação das duas extremidades do PSO com o oligo de DNA.

A seguir os valores dos deslocamentos dos hidrogênios de PSO, em função

das diferentes condições dos experimentos:

99

2) Deslocamentos dos hidrogênios de PSO

PSO sem oligo

H(A): 6,46 H(B): 8,16 H(C): 7,63 H(D): 7,00 H(E): 7,85 H(F): 7,95

PSO + oligo – Sem irradiar

H(A): 6,46 H(B): 8,16 H(C): 7,65 H(D): 7,00 H(E): 7,86 H(F): 7,95

PSO + oligo + UVA (540 J/m2)

H(A): 6,46 H(B): 8,14 H(C): 7,66 H(D): 7,01 H(E): 7,86 H(F): 7,95

5.3.3. Deslocamentos gerados pelo tratamento PUVA ANG + UV-A

A interação entre ANG e o oligo de DNA também foi observada nestes

experimentos. Quando da adição de oligo, sem UV-A, não ocorreram

deslocamentos dos hidrogênios de ANG. No entanto, com a dose de UV-A de 540

J/m2 todos os hidrogênios da molécula sofreram deslocamentos, em especial os

deslocamentos significativos de H(A) e H(E), que são hidrogênios dos anéis furano

(carbono 3‟) e pirona (carbono 4) da molécula de ANG. Tais resultados sugerem

fortemente uma atividade bifuncional de ANG, com provável interação dos dois

lados da molécula com o oligo de DNA.

A seguir os valores dos deslocamentos dos hidrogênios de ANG, em função

das diferentes condições dos experimentos:

100

3) Deslocamento dos hidrogênios de ANG

ANG sem oligo

H(A): 7,20 H(B): 7,89 H(C) + H(D): 7,60 H(E): 8,16 H(F): 6,48

ANG + oligo – Sem irradiar

H(A): 7,22 H(B): 7,88 H(C)+ H(D): 7,60 H(E): 8,16 H(F): 6,48

ANG + oligo + UVA (540 J/m2)

H(A): 7,00 H(B): 7,87 H(C)+ H(D): 7,64 H(E): 8,11 H(F): 6,46

Os espectros de RMN 1H, processados pelo software SpinWorks 2.5.5,

estão no Anexo II, ao final deste trabalho (páginas 128 a 130).

101

6. Discussão

Já é sabido que os psoralenos utilizados em terapias são agentes

fotossensibilizadores que causam lesões no DNA, daí o seu emprego

terapeuticamente. Todavia, tais lesões podem ser reparadas ou não, podendo

gerar mutantes que podem causar alguns tipos de câncer em longo prazo, assunto

de grande discussão na atualidade (Saladi & Persaud, 2005).

Através dos resultados de experimentos envolvendo o tratamento PUVA e

sobrevivência bacteriana, observa-se a importância do mecanismo de reparo por

excisão de nucleotídeos (NER) na remoção dos adutos formados entre os

psoralenos e o DNA bacteriano. Os resultados destes experimentos, utilizando as

cepas de Escherichia coli submetidas ao PUVA, contribuem para a melhor

compreensão da ação do complexo endonuclease UvrABC, inicialmente descrito

como reparador da formação de dímeros de pirimidina em DNA, a partir de

experimentos de interação com proteínas purificadas UvrA, UvrB e UvrC (Sancar

& Rupp, 1983). Tais experimentos in vitro mostraram a importância do mecanismo

NER na remoção de uma diversidade de tipos de lesões em DNA.

Outros experimentos in vitro evidenciaram a participação do mecanismo

NER na remoção de monoadutos formados por 8MOP e TMP no DNA. O

complexo UvrABC forma incisões em ambos os lados da fita de DNA, bem como

em ambos os lados dos monoadutos formados. Outros estudos relataram que a

sequência de DNA é importante na orientação do crosslink formado entre o

psoraleno e as fitas de DNA (Jones & Yeung, 1998; Ramaswamy & Yeung, 1994;

Van Houten et al., 1986).

Os resultados dos ensaios de sobrevivência bacteriana ao tratamento

PUVA deste trabalho sugerem que as lesões formadas por angelicina, psoraleno e

trimetilpsoraleno requerem integralmente o sistema clássico UvrABC de

reparação. Os experimentos envolvendo 8-metoxipsoraleno em maiores

concentrações também demonstram a importância do sistema UvrABC na

correção das lesões.

No entanto, diferente dos resultados já existentes na literatura, parece que

algumas lesões são reparadas por uma via alternativa à via clássica de reparo

102

NER. Em menores concentrações de 8MOP, e nos experimentos com o análogo

monofuncional do 8MOP (H28MOP) e também com a dimetoxicumarina (DMC)

sugerem que a enzima UvrB tem um papel importante na remoção das lesões

promovidas por estes fotossensibilizadores.

Os resultados sugerem que a atuação parcial ou integral do sistema NER

pode estar relacionada com as estruturas dos psoralenos e do tipo de produto da

formado, monoadutos ou crosslinks, destes com o DNA das bactérias. Alguns

artigos relatam que, a partir de uma deformação provocada pelos psoralenos nas

fitas de DNA, a proteína UvrB pode ser requisitada, mas sem a necessidade do

auxílio de UvrA (Moolenaar et al., 2000; Zou et al., 2001). Neste caso, a proteína

UvrB é essencial para a reparação de adutos formados em DNA, como resultado

do tratamento PUVA e a partir de uma via independente do NER clássico,

proposto inicialmente para a reparação de dímeros de pirimidina, induzidos por

UV-C.

A proteína UvrB poderia ser requisitada para o processamento de algumas

lesões, sendo levada à lesão por outra enzima (no lugar de UvrA), ou a sua

ligação poderia ser direta à lesão, a partir de uma deformação causada no DNA e

que poderia ser um importante substrato de atuação isolada de UvrB. Assim

sendo o processamento, ou não, por NER vai depender de cada tipo de dano

formado e, principalmente, quanto às distorções formadas. Segundo Zou et al.

(2001), alguns substratos que geram grande deformação no DNA (e uma

separação irregular das fitas), podem ser diferentemente processados, havendo

apenas a atuação de UvrB, independente ou não de UvrA (que pode não

reconhecer estas deformações).

Gonçalves (2001), através de experimentos de sobrevivência celular, já

havia descrito a importância de UvrB na finalização do reparo, em consonância

com a atuação da DNA Polimerase I, estando acoplada ao processo final de

replicação do DNA, gerando um novo fragmento de DNA e o fechamento da

lacuna. Tais informações reforçam a atuação abrangente de UvrB, requerida ao

longo de grande parte do processo NER (Friedberg et al., 2006).

103

Os resultados das análises por espectrometria de massas de lesões em

DNA bacteriano, formadas pelo tratamento PUVA, utilizando os diversos

psoralenos corroboram os dados de sobrevivência, mostrando a possibilidade da

formação de uma grande variedade de lesões. A formação dos dímeros bem como

a diversidade dos monoadutos e crosslinks mostra a possibilidade da geração de

vários substratos para ação de proteínas de reparo, inclusive, o mecanismo NER.

Alves (2007), através de experimentos in vitro de tratamento PUVA, com a

utilização de amostras de DNA purificado e posterior análise por espectrometria de

massas, já havia descrito a presença de uma grande variedade de lesões

(dímeros, monoadutos e crosslinks), com especial destaque para os substratos

inéditos de DNA (bases purínicas) interagindo com os psoralenos.

A formação da grande variedade de dímeros no tratamento PUVA pode ser

explicada pelo resultado de uma fraca interação entre os psoralenos e o DNA no

caso de um segundo fóton de UV-A. Com o primeiro aduto formado entre as bases

do DNA e os psoralenos, a outra extremidade dos psoralenos bifuncionais pode se

encontrar em um ambiente não quimicamente propício para a formação de um

crosslink (como a presença de uma citosina ou as bases purínicas adenina e

guanina, bases até então não caracterizadas como sendo substrato para este tipo

de aduto). Desta forma, este segundo fóton de UV-A, ao invés de excitar

fotoquimicamente o lado ainda reativo do psoraleno transfere a sua energia para

as ligações químicas destas bases adjacentes, promovendo então a formação dos

dímeros.

Até mesmo o tratamento utilizando o monofuncional DMC levou ao

surgimento de dímeros, indicando que duplas ligações posicionadas no ambiente

de dupla hélice podem absorver UV-A e transferir a energia para as bases,

fotoadicionando-as entre si.

Quanto à análise por espectrometria de massas da eficiência de reparo,

apenas os experimentos utilizando o 8MOP sugerem a importância de NER na

remoção de algumas lesões após o tempo de duas horas de tratamento. No

entanto, para os outros tratamentos, não foi possível correlacionar a variedade das

lesões com o tratamento de cepas bacterianas selvagem e a mutante uvrB, nem

104

com relação ao tempo dado de duas horas após tratamento para atuação dos

mecanismos de reparo.

O fato de não ter sido possível correlacionar a eficiência de reparo e a

identificação das lesões, por espectrometria de massas, em todos os tratamentos

realizados, esbarra em uma possível limitação da técnica. Ou seja, mesmo lesões

estando presentes nas amostras, mas não sendo ionizadas pelo espectrômetro,

dariam a impressão da reparação eficaz de tais lesões pelas células.

A diversidade de lesões encontradas para 8MOP, PSO e TMP

(principalmente monoadutos e crosslinks) complementa os resultados de

sobrevivência bacteriana aos tratamentos utilizando tais psoralenos, sendo o

mecanismo NER importante na remoção destas lesões. DMC e H28MOP, sendo

estruturalmente monofuncionais, evidenciam uma via alternativa de reparação,

com a participação de UvrB na remoção dos monoadutos (lesões identificadas

para DMC pelo massas).

No entanto, uma particularidade é necessária na interpretação dos

resultados de ANG. Embora possuindo as duas ligações duplas fotoativas em

seus anéis furano e pirona, sua estrutura molecular angular permitiria apenas a

formação de monoadutos entre ANG e as bases do DNA (Bordin et al., 1975).

Porém os resultados de sobrevivência, aliados às análises via espectrometria de

massas sugerem uma propriedade bifuncional da molécula. Em comparação com

PSO e 8MOP, a ANG (em concentrações maiores) também requer a participação

de UvrABC, o que seria importante na remoção tanto de monoadutos como

também de prováveis crosslinks formados. E através da análise em

espectrometria de massas foram identificados picos que sugerem, além da

formação de monoadutos, também crosslinks.

Além disso, as análises por espectrometria de massas foram importantes,

pois através destes diferentes tratamentos, foram observadas lesões como

resultado de ligações entre os psoralenos e bases de DNA não descritas como

sendo substratos-alvo para este tipo de tratamento. As referências existentes

descrevem as ligações entre psoralenos e bases pirimídicas, em especial, timinas

(Hearst et al., 1984). Tais resultados são importantes para o entendimento de que

105

existe a possibilidade de atuação de mecanismos alternativos de reparação das

lesões no DNA provocadas pelo tratamento PUVA.

Os resultados das análises iniciais dos espectros de RMN também dão

relevância à possibilidade diferencial do processamento do DNA pelos

mecanismos de reparo, como resultantes das diversas possibilidades de lesões e

distorções no DNA. Os resultados dos tratamentos utilizando o 8MOP mostram

que esta molécula promove deslocamentos significativos dos hidrogênios do

oligonucleotídeo de DNA. Desta forma os resultados sugerem que o acoplamento

da molécula de 8MOP, causa grandes perturbações ao DNA.

Por outro lado, os experimentos com ANG demonstram grandes

deslocamentos dos hidrogênios desta molécula quando interagem com o

oligonucleotídeo de DNA. Neste caso, diferente da ação perturbadora de 8MOP, a

molécula de ANG (estruturalmente angular quanto à sua conformação química), é

perturbada, para acoplar de maneira devida ao DNA, sendo mais uma evidência

de um possível potencial bifuncional de ANG. Estes dois resultados distintos

demonstram a geração provável de dois novos substratos entre DNA e psoraleno

como alvo da ação das enzimas de reparação

Todos estes resultados explicitam o potencial genotóxico do tratamento

PUVA e abrem a questão do quão eficiente pode ser o tratamento em caráter

imediato e, em longo prazo, quais poderiam ser os efeitos mutagênicos deste

tratamento. Com os indícios de que, após mais de 20 anos do estabelecimento da

terapia PUVA e da exposição dos indivíduos ao tratamento, observa-se o aumento

do risco da geração de desordens melanogênicas (Stern, 2001), principalmente

para os pacientes expostos a altas doses de PUVA, faz-se importante a

consideração de se melhorar os procedimentos do tratamento, diminuindo riscos e

aumentando os benefícios.

106

Análise dos resultados dos experimentos de sobrevivência

complementados com os dados de espectrometria de massas e RMN, sobre o

entendimento das lesões formadas pela terapia PUVA, sugere que os monoadutos

seriam lesões citotóxicas de menor efeito mutagênico em longo prazo, quando

comparado com crosslinks. E em se tratando de células doentes (comprometidas

com as diferentes patologias tratadas com PUVA), mesmo danos citotóxicos mais

discretos podem inviabilizar a progressão destas células, apresentando efeitos

mais significativos e diminuindo efeitos citotóxicos maiores para as células

normais, contribuindo no uso da terapia em Dermatologia.

7. Perspectivas

- Experimentos de mutagênese bacteriana, e análises de espectrometria de

massas e Ressonância Magnética Nuclear com o monofuncional H28MOP, para

correlacionar posteriormente com os dados de seu análogo bifuncional, 8MOP.

- Experimentos complementares para análise por espectrometria de massas

da correlação entre a eficiência do reparo NER e a remoção das lesões

provocadas pelo tratamento PUVA no DNA genômico das bactérias proficientes e

deficientes em NER;

- Experimentos de sobrevivência celular através do tratamento in vitro de

cultura de linfócitos e a análise do perfil de expressão gênica de certos genes de

reparo NER humano, confirmando a importância deste tipo de reparo em células

humanas na remoção dos adutos PUVA;

- Finalizar as análises de RMN dos experimentos de 2D, permitindo um

estudo mais detalhado da interação entre as bases nitrogenadas dos

oligonucleotídeos de DNA e os diferentes psoralenos;

- Realizar novos experimentos de 1H-RMN (espectros 1D e 2D), utilizando

outros contextos de sequência de oligonucleotídeos de DNA (oligo TA e oligo GC),

verificando se, com a mudança dos substratos de DNA, existem diferenças

estruturais de interação psoralenos-DNA.

107

8. Referências Bibliográficas

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ANEXO I - Espectros de massa das amostras tratadas com PUVA

IA) Picos das massas que sugerem a formação de dímeros

DÍMERO ENTRE CITOSINAS (C-C)

m/z222 223 224 225 226 227 228 229 230 231

%

0

100

1 36 (0.946) Cm (1:413) 1: TOF MS ES+ 5.56e3223.09

222.12

225.07

224.09 229.25

227.06226.08230.25

DÍMERO CITOSINA-TIMINA (C-T)

m/z230 231 232 233 234 235 236 237 238 239

%

0

100

3 1201 (30.031) Cm (1201:1668) 1: TOF MS ES+ 418238.01

237.22230.22

230.02

235.17233.19231.21231.05 233.05232.18

234.99234.02

234.23237.03

236.02 236.18

239.02

238.14 238.87

DÍMERO CITOSINA-ADENINA (C-A)

m/z242 243 244 245 246 247 248 249 250 251

%

0

100

1 36 (0.946) Cm (1:413) 1: TOF MS ES+ 1.10e3247.24

242.12245.22243.26

243.12242.22

244.21 246.22

251.21

249.22

248.24

251.08

250.22

DÍMERO CITOSINA (mais Desoxirribose)-GUANINA (mais Desoxirribose) (C-G)

m/z491 492 493 494 495 496 497 498 499 500 501 502

%

0

100

3 742 (20.112) Cm (739:1200) 1: TOF MS ES+ 2.00e3495.39

491.20

490.39

493.01491.30

492.28491.62

493.28 495.24494.30

494.03 494.81

496.39

495.82

498.40497.34

496.84 497.84

501.25499.19500.26500.01

500.77

502.00 502.36

DÍMERO TIMINA-TIMINA (mais Desoxirribose) (T-T)

m/z365 366 367 368 369 370 371 372 373 374 375

%

0

100

1 36 (0.946) Cm (1:413) 1: TOF MS ES+ 1.66e4369.17

371.16370.17

372.16 373.14

374.14

119

DÍMERO TIMINA-ADENINA (T-A)

m/z260 261 262 263 264 265

%

0

100

6 540 (11.902) Cm (471:746) 1: TOF MS ES+ 1.82e3263.12

260.17

260.10259.25

261.07

261.19

262.12261.96

264.13263.22

264.63

DÍMERO ADENINA-ADENINA (A-A)

m/z268 269 270 271 272 273 274 275

%

0

100

1 1160 (30.183) Cm (1153:1616) 1: TOF MS ES+ 533271.30

271.23

269.32269.02268.30

270.32270.02 271.00

273.22

272.30272.23 273.14

275.28

274.22

274.02

275.20

DÍMERO ADENINA-GUANINA (mais Desoxirribose) (A-G)

m/z400 401 402 403 404 405 406 407 408 409

%

0

100

1 877 (23.936) Cm (713:1152) 1: TOF MS ES+ 3.98e3403.19

400.27

401.39401.25

402.40402.26

405.20

404.20

407.18406.21

407.39409.25408.20

DÍMERO GUANINA-GUANINA (mais Desoxirribose) (G-G)

m/z418 419 420 421 422 423 424 425 426 427

%

0

100

1 36 (0.946) Cm (1:413) 1: TOF MS ES+ 346419.37

418.10

417.42

419.06

418.45

420.37

420.06 423.48421.37421.04

423.33422.39 425.43424.31 426.44 427.07

120

IB) Picos das massas que sugerem a formação de monoadutos

MONOADUTO ENTRE 8MOP E TIMINA (mais Desoxirribose) (8MOP-T)

m/z455 456 457 458 459 460 461 462 463 464 465

%

0

100

1 1160 (30.183) Cm (1153:1616) 1: TOF MS ES+ 675459.24

455.17 456.21 457.18 458.87458.22

460.23

459.30

459.91

461.22

460.33 462.23

461.86463.20

464.88464.20463.88

MONOADUTO ENTRE 8MOP E CITOSINA (8MOP-C)

m/z440 441 442 443 444 445 446 447 448 449 450

%

0

100

1 475 (12.384) Cm (414:712) 1: TOF MS ES+ 2.99e3444.30

441.32

440.31

443.32443.20

442.31

441.82

445.18

446.18445.31

445.81

446.31 447.18447.31 448.30

447.65

449.27

MONOADUTO ENTRE 8MOP E ADENINA (mais Desoxirribose) (8MOP-A)

m/z461 462 463 464 465 466 467 468 469 470 471 472

%

0

100

41 704 (20.124) Cm (699:1164) 1: TOF MS ES+ 1.69e3468.40

463.14

461.27

460.83

462.28

461.83

465.24464.15463.26

463.80

465.18

464.80

465.37 467.39467.16

466.40466.23

465.80

468.16

469.39469.21

468.85

471.34471.16470.25

469.83 470.78

472.29472.17

472.78

MONOADUTO ENTRE PSO E TIMINA (mais Desoxirribose) (PSO-T)

m/z420 421 422 423 424 425 426 427 428 429 430 431 432 433 434 435 436 437 438 439 440 441

%

0

100

7 17 (0.385) Cm (2:470) 1: TOF MS ES+ 1.08e4429.09

430.09431.09

432.09433.08

MONOADUTO ENTRE PSO E GUANINA (PSO-G)

m/z335 336 337 338 339 340 341 342 343 344 345 346 347 348 349 350 351 352

%

0

100

7 1031 (26.320) Cm (756:1198) 1: TOF MS ES+ 3.78e3338.35

335.23

334.22

337.23

336.25

345.25343.16

341.03

339.35

340.22

341.28

342.27 344.17

347.23

347.14346.26 349.19

348.23

351.26

350.19 352.20

121

MONOADUTO ENTRE PSO E CITOSINA (mais Desoxirribose) (PSO-C)

m/z410 411 412 413 414 415 416 417 418 419 420 421 422 423 424 425 426 427 428 429 430

%

0

100

7 547 (12.531) Cm (471:755) 1: TOF MS ES+ 4.26e3414.25

413.09410.18

412.25411.17413.23

415.26

415.05

429.10

416.26

420.21419.25418.25417.25

419.75

428.25425.16421.20

423.19422.23 424.27427.25

426.18

430.27

430.09

MONOADUTO ENTRE ANG E TIMINA (ANG-T)

m/z307 308 309 310 311 312 313 314 315 316 317 318 319 320 321 322 323 324 325 326 327

%

0

100

13 6 (0.230) Cm (2:402) 1: TOF MS ES+ 3.40e3313.13

311.11

314.13315.12

327.09316.13 325.12320.93 321.29

MONOADUTO ENTRE ANG E GUANINA (ANG-G)

m/z331 332 333 334 335 336 337 338 339 340 341 342 343 344 345 346 347 348 349 350 351 352 353

%

0

100

8 607 (20.955) Cm (579:919) 1: TOF MS ES+ 1.57e4338.35

333.17331.21 337.23335.23

339.35

341.28341.03 345.25343.22 349.19347.23346.14 351.25

MONOADUTO ENTRE ANG E CITOSINA (mais Desoxirribose) (ANG-C)

m/z407 408 409 410 411 412 413 414 415 416 417 418 419 420 421 422 423 424 425 426 427

%

0

100

42 799 (25.015) Cm (634:1023) 1: TOF MS ES+ 4.19e3413.28

407.33 409.23

408.33

413.13411.10

410.22

415.26

414.28

415.05

427.30

421.22416.27

417.24 419.32418.27 420.35

425.30423.29

422.21 424.28 426.30

MONOADUTO ENTRE DMC E TIMINA (DMC-T)

m/z329 330 331 332 333 334 335 336 337 338 339 340 341 342 343 344 345 346 347 348

%

0

100

27 532 (12.153) Cm (460:799) 1: TOF MS ES+ 5.04e3333.16

331.20

329.21330.20 331.70

332.20

344.21335.18334.17 339.18337.07

336.19

338.53

338.08340.20 342.19341.18 343.18

348.22347.22345.19 346.21

122

MONOADUTO ENTRE TMP E TIMINA (TMP-T)

m/z345 346 347 348 349 350 351 352 353 354 355 356 357 358 359 360 361 362 363 364 365

%

0

100

33 47 (1.291) Cm (2:396) 1: TOF MS ES+ 8.87e3355.10

356.11 357.10 359.07

358.10 360.07 363.32361.07

IC) Picos das massas que sugerem a formação de crosslinks

CROSSLINK ENTRE CITOSINA, 8MOP E CITOSINA (C-8MOP-C)

m/z550 551 552 553 554 555 556 557 558 559 560 561 562 563 564 565 566 567 568 569 570

%

0

100

5 851 (22.450) Cm (746:1179) 1: TOF MS ES+ 1.70e3555.26

551.46

550.29552.47 553.34 554.14

556.27567.31

557.26564.29563.52560.29

559.27558.25562.27561.52

565.27566.25

569.27568.27

CROSSLINK ENTRE CITOSINA, 8MOP E TIMINA (C-8MOP-T)

m/z450 451 452 453 454 455 456 457 458 459 460

%

0

100

1 877 (23.936) Cm (713:1152) 1: TOF MS ES+ 2.33e3454.21

451.23450.22 453.23452.22451.42

456.22455.23

459.34

459.24

457.24 458.26

CROSSLINK ENTRE CITOSINA, 8MOP E ADENINA (C-8MOP-A)

m/z579 580 581 582 583 584 585 586 587 588

%

0

100

1 36 (0.946) Cm (1:413) 1: TOF MS ES+ 584579.19

580.20

581.17

582.18583.17

CROSSLINK ENTRE TIMINA, 8MOP E TIMINA (T-8MOP-T)

m/z700 701 702 703 704 705 706 707 708 709 710

%

0

100

1 877 (23.936) Cm (713:1152) 1: TOF MS ES+ 1.14e3701.35

700.37

702.36703.36

705.38704.36 708.36707.44706.41 709.47

123

CROSSLINK ENTRE TIMINA, 8MOP E GUANINA (T-8MOP-G)

m/z491 492 493 494 495 496 497 498 499 500 501 502 503

%

0

100

43 589 (13.935) Cm (472:770) 1: TOF MS ES+ 1.21e3494.28

491.25

491.10

492.26

491.61

493.26

493.00493.93

498.28497.21

496.27495.24

494.76 495.41

496.41

497.29

497.78

501.27499.26

498.76

500.27

499.94

499.62

500.77

503.10

502.27

501.77502.93

CROSSLINK ENTRE TIMINA, 8MOP E ADENINA (T-8MOP-A)

m/z593 594 595 596 597 598 599 600 601 602

%

0

100

4 532 (12.400) Cm (471:736) 1: TOF MS ES+ 2.16e3594.34

594.00

593.33

593.14593.83

600.33595.33

594.68

595.01

598.33597.32596.31

595.83 596.83

597.46598.14

600.08599.28598.52

599.83 601.33

600.60 600.84 601.66 601.84

CROSSLINK ENTRE GUANINA, 8MOP E GUANINA (G-8MOP-G)

m/z519 520 521 522 523 524 525 526 527 528

%

0

100

1 36 (0.946) Cm (1:413) 1: TOF MS ES+ 7.03e3519.20

518.23

520.20

521.20

522.20

523.21

CROSSLINK ENTRE GUANINA, 8MOP E ADENINA (G-8MOP-A)

m/z500 501 502 503 504 505 506 507 508 509

%

0

100

1 36 (0.946) Cm (1:413) 1: TOF MS ES+ 3.56e3503.17

504.17 505.16

506.16

507.15508.16

CROSSLINK ENTRE CITOSINA, PSO E CITOSINA (C-PSO-C)

m/z405 406 407 408 409 410 411 412 413 414 415 416 417 418 419 420 421 422 423 424 425 426 427 428

%

0

100

7 547 (12.531) Cm (471:755) 1: TOF MS ES+ 5.16e3409.16

405.22

406.25

407.16 408.24

414.25

413.09410.18

412.25411.17413.23

415.26

416.26

420.21419.25418.25417.25 425.16421.20

423.19422.23 424.27427.25

426.18

124

CROSSLINK ENTRE CITOSINA, PSO E GUANINA (C-PSO-G)

m/z674 675 676 677 678 679 680 681 682 683 684 685 686 687 688 689

%

0

100

10 4 (0.249) Cm (2:366) 1: TOF MS ES+ 227681.23

682.25

683.24

686.83684.23

685.23686.22 687.21

CROSSLINK ENTRE TIMINA, PSO E TIMINA (T-PSO-T)

m/z663 664 665 666 667 668 669 670 671 672 673 674 675 676 677 678 679 680 681

%

0

100

11 844 (25.031) Cm (677:986) 1: TOF MS ES+ 1.53e3671.49

662.47

669.48663.46 667.40664.46

663.91665.44 666.39 668.37

670.45

678.49674.50672.49

673.51

672.94

675.52 677.41

676.40 677.90

679.47

679.22 680.44681.43

CROSSLINK ENTRE GUANINA, PSO E GUANINA (G-PSO-G)

m/z480 481 482 483 484 485 486 487 488 489 490 491

%

0

100

7 17 (0.385) Cm (2:470) 1: TOF MS ES+ 350489.07

490.07

490.91 491.05

CROSSLINK ENTRE GUANINA, PSO E ADENINA (G-PSO-A)

m/z469 470 471 472 473 474 475 476 477 478 479 480 481 482 483 484 485 486 487 488 489 490 491 492

%

0

100

11 844 (25.031) Cm (677:986) 1: TOF MS ES+ 3.54e3473.36

469.34 471.34

470.35 472.33

481.39

474.35 481.27

476.21475.35 479.29477.22478.23

480.04

485.12

482.39

483.30 484.38486.12 489.34488.36487.32 491.32490.32

CROSSLINK ENTRE ADENINA, PSO E ADENINA (A-PSO-A)

m/z571 572 573 574 575 576 577 578

%

0

100

11 844 (25.031) Cm (677:986) 1: TOF MS ES+ 550573.41

571.43571.33

571.07

572.35

571.55

572.44573.17

572.92

576.41575.34

574.40

574.16573.87

575.16574.85

576.30575.49

575.84

577.39

577.15

576.82

578.40577.54

578.30577.59

578.12

577.85

578.55

125

CROSSLINK ENTRE CITOSINA, ANG E CITOSINA (C-ANG-C)

m/z407 408 409 410 411 412 413 414 415 416 417 418 419 420 421 422 423 424 425 426 427 428 429 430

%

0

100

14 482 (12.345) Cm (415:663) 1: TOF MS ES+ 2.07e4409.18

407.17

410.19429.11

415.27414.27411.20 413.99

416.26 427.15425.18421.37420.22419.28418.27417.26422.20 423.21

428.28430.12

CROSSLINK ENTRE TIMINA, ANG E TIMINA (T-ANG-T)

m/z664 665 666 667 668 669 670 671 672 673 674 675 676 677 678 679 680 681 682 683 684

%

0

100

13 900 (24.856) Cm (729:1104) 1: TOF MS ES+ 742671.50

664.48

663.46667.42

665.42 666.41670.41

669.43668.38 670.93

679.44678.50672.50 674.53

673.49

677.41

675.54676.40

678.39681.41680.44 682.41 683.43

684.46

CROSSLINK ENTRE TIMINA, ANG E ADENINA (T-ANG-A)

m/z666 668 670 672 674 676 678 680 682 684 686 688 690 692 694 696

%

0

100

16 500 (12.241) Cm (413:647) 1: TOF MS ES+ 3.17e3680.42

679.41670.40

667.40

666.39669.40

668.38

677.39

675.40670.91 674.41

673.42676.39

677.89

692.42691.43690.45686.42680.92 682.41

683.42

685.39

688.92688.41

687.41

692.91696.40694.40

CROSSLINK ENTRE GUANINA, ANG E GUANINA (G-ANG-G)

m/z483 484 485 486 487 488 489 490 491 492 493 494 495 496

%

0

100

13 6 (0.230) Cm (2:402) 1: TOF MS ES+ 331489.08

490.07

490.91

490.88491.06

492.07493.06

CROSSLINK ENTRE GUANINA, ANG E ADENINA (G-ANG-A)

m/z580 581 582 583 584 585 586 587 588 589 590 591

%

0

100

44 705 (20.295) Cm (699:1098) 1: TOF MS ES+ 662589.33

580.30

579.51

579.67

587.32

581.30

580.60

582.33

582.26

581.58

585.56585.32

583.30

582.84

583.54584.33

584.23

585.25

584.80

586.32

585.93

586.56

588.33

587.55588.82

589.82 590.32590.41

590.83

126

CROSSLINK ENTRE CITOSINA, TMP E CITOSINA (C-TMP-C)

m/z448 449 450 451 452 453 454 455 456 457 458 459

%

0

100

33 735 (20.012) Cm (735:1143) 1: TOF MS ES+ 1.18e3451.40

451.25

447.37448.16

447.98

449.25

448.29

448.98

449.40450.30

450.90

455.21

453.26452.40

452.26452.90

453.33454.19

453.95

454.40

454.90

457.30455.34

456.21

456.07456.89

458.27

458.81

CROSSLINK ENTRE CITOSINA, TMP E TIMINA (C-TMP-T)

m/z580 581 582 583 584 585 586 587 588 589 590 591

%

0

100

35 576 (15.571) Cm (410:713) 1: TOF MS ES+ 1.51e3582.37

580.38

580.03

581.35

580.76

581.79

589.37582.88

587.36586.38583.36

585.38584.38583.85

585.07584.94

586.17 586.88 588.38

587.52589.12

590.36

589.87 591.08

CROSSLINK ENTRE CITOSINA, TMP E GUANINA (C-TMP-G)

m/z600 601 602 603 604 605 606 607 608 609 610 611 612 613 614 615 616 617 618 619 620 621 622 623 624 625

%

0

100

33 47 (1.291) Cm (2:396) 1: TOF MS ES+ 1.13e3607.27

608.26

609.25

610.25

611.25612.26

CROSSLINK ENTRE CITOSINA, TMP E ADENINA (C-TMP-A)

m/z584 585 586 587 588 589 590 591 592 593 594 595 596 597 598 599 600 601 602 603

%

0

100

33 581 (15.651) Cm (397:734) 1: TOF MS ES+ 1.84e3591.40

589.39

587.38586.39583.38585.38

583.89 586.89 588.39590.38

589.89

594.39

594.07593.39

592.41

591.55

595.39 603.40598.39597.40

596.38 598.20

600.40598.57

599.37

601.40

600.88

602.38

CROSSLINK ENTRE TIMINA, TMP E TIMINA (T-TMP-T)

m/z474 475 476 477 478 479 480 481 482 483 484

%

0

100

33 735 (20.012) Cm (735:1143) 1: TOF MS ES+ 1.27e3481.30

474.27

475.26

474.39 476.34

476.26

475.87

481.20477.22

476.92

479.29477.34

478.30477.86

478.85

480.19

480.08480.43

481.41

482.29

481.85483.38

482.41

482.87

484.29

483.85

484.40

127

CROSSLINK ENTRE GUANINA, TMP E GUANINA (G-TMP-G)

m/z526 527 528 529 530 531 532 533

%

0

100

35 714 (20.000) Cm (714:1105) 1: TOF MS ES+ 510531.33

526.31

526.26

526.15525.83

527.31

526.45

526.92

529.34528.31527.40 528.24 529.19

528.42530.32529.42

529.84

531.19

530.95

531.42532.32

531.49531.90

532.42

532.91532.82

128

ANEXO II – Espectros de RMN das amostras controle e tratadas com PUVA

IIA) Espectros dos experimentos envolvendo 8MOP

8MOP (1 mM)

8MOP (1 mM) Irradiado (540 J/m2)

Oligo (0,5 mM) + 8MOP (1 mM) Irradiado (540 J/m2)

Oligo (0,5 mM) + 8MOP (1 mM)

Oligo (0,5 mM) Irradiado (540 J/m2)

Oligo (0,5 mM)

129

IIB) Espectros dos experimentos envolvendo PSO

PSO (1 mM)

PSO (1 mM) Irradiado (540 J/m2)

Oligo (0,5 mM) + PSO (1 mM)

Oligo (0,5 mM) + PSO (1 mM) Irradiado (540 J/m2)


Oligo (0,5 mM)

130

IIC) Espectros dos experimentos envolvendo ANG

ANG (1 mM)

ANG (1 mM) Irradiado (540 J/m2)

Oligo (0,5 mM) + ANG (1 mM)

Oligo (0,5 mM) + ANG (1 mM) Irradiado (540 J/m2)


Oligo (0,5 mM)

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