eletroforese 2011 pdf
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ELETROFORESE
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1. Características básicas;2. O fluxo determinante;3. Fatores envolvidos;4. O ponto isoelétrico;5. Tipos de eletroforese:
Eletroforese livre,
Eletroforese em suporte semi-sólido,Eletroforese em suporte sólido,Eletroforese capilar,Focalização isoelétrica,Eletroforese com SDS,Eletroforese bidimensional,
Eletroforese de alta voltagem,Immunobloting,Iontoforese.
6. Revelação;7. Analise qualitativa e quantitativa;8. Aplicações e procedimentos experimentais
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OBJETIVOS:ELETROFORESE
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DEFINIÇÃO:Processo de separação e/ou caracterização dos componentes deum sistema, baseado na carga elétrica livre das partículas, ondeocorre a migração diferencial das mesmas quando submetidas aum campo elétrico.
PRINCÍPIO:Para que uma partícula se mova no campo elétrico é necessárioque possua carga, isto é, excesso ou deficiência de elétrons,resultando em carga elétrica livre.
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A eletroforese é especialmente útil como método analítico. Suavantagem é que as proteínas podem ser separadas e visualizadas,permitindo determinar rapidamente o número de proteínas presentes em uma mistura ou o grau de pureza de uma preparação particular deproteínas.
A eletroforese permite também a determinação de propriedadescruciais de uma proteína, tais como o seu ponto isoelétrico e sua massarelativa podem ser estimados.
Técnicas especializadas de eletroforese como Western blotting ,
eletroforese bi-dimensional e mapeamento peptidico podem ser usadaspara detectar produtos gênicos extremamente escassos, encontrarsimilaridades entre eles e detectar e separar isoenzimas.
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Fracionamento e caracterizaçãoAminoácidosPeptídeosProteínas (lipo e glico)NucleotídeosÁcidos carboxílicosAdoçantesVitaminasCorticoides
PesticidasOutras partículas que apresentem cargasem função do pH do meio.
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Componentes que possuem carga elétrica livre migram para pólo decarga oposta a sua. Portanto, partículas carregadas positivamentemigram para o pólo negativo (cátodo) e partículas carregadasnegativamente migram para o pólo positivo (ânodo).
Na eletroforese a força elétrica, F el , que move a macromolécula (osácidos nucléicos, e as proteínas também podem ser separados deste modo) éo potencial elétrico, , vezes a carga líquida da molécula, q .
A força que pára a migração da macromolécula é a fricção, F f , que éproporcional a velocidade da partícula, V , vezes o coeficiente de fricção, f fr :
No caso do campo elétrico constante, as duas forças se balanceiam e amolécula migra com a velocidade constante.
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Eletroforese é o fluxo de partículas carregadas = o fluxo migracional.
A forca que atua sobre as moléculas com cargas elétricas é proporcional
ao valor da carga e o gradiente do potencial elétrico .O fluxo, J , é proporcional a:
a carga (q) ,
a Concentração das moléculas (C) ,
a Área que o fluxo atravessa (A) ,
a Mobilidade das moléculas (u)
o Gradiente do potencial elétrico
x
qCAu J
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A velocidade com que uma partícula se movimenta no campo elétricodepende de vários fatores: densidade de carga elétrica livre: principal fator, diretamente proporcional.
potencial elétrico aplicado: diretamente proporcional. A voltagem aplicada deve ser adequada paraseparar o mais rapidamente possível, antes que a difusão espalhe oscomponentes. Voltagem muito alta, porém, aquece o sistema e prejudicaa separação
raio da partícula: inversamente proporcional viscosidade do meio: inversamente proporcional
FATORES QUE CONDICIONAM A VELOCIDADE DA MIGRAÇÃOELETROFORÉTICA:
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Outros fatores também influenciam na velocidade de migração:
pH do meio (tampão);
força iônica do tampão;
interação com a fase fixa; tipo de suporte;
grau de embebição (absorção) do suporte;
temperatura;
FATORES QUE CONDICIONAM A VELOCIDADE DA MIGRAÇÃOELETROFORÉTICA:
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PONTO ISOELÉTRICO de uma proteína é o valor do pH no qualas cargas positivas e negativas (da proteína) se equivalem. Não
tendo carga elétrica efetiva, e portando, não migrando na presença
do campo elétrico.
Existem aminoácidos que além da carboxila e do grupo amina possuemoutros grupos dissociáveis:
Histidina (grupo imidazol, pK=8,3), Cisteína (grupo sulfidrila, pK=8,3),Tirosina (grupo hidroxifenol, pK=10,1) e Arginina (grupo guanidil,pK=12,5).As proteínas são poliaminoácidos e, portanto, possuem o comportamentomúltiplo dos aminoácidos componentes.
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Proteínas pI
Pepsina Ovalbumina
Soroalbumina Urease -Lactoglobulina Hemoglobina Mioglobina Quimotripsinogênio Citocromo C
Lisozima
-1.0 4.6
4.9 5.0 5.2 6.8 7.0 9.5 10.7
11.0
PONTO ISOELÉTRICO
Quase todas as proteínas possuíram o ponto isoelétrico exato,por exemplo:
O ponto isoelétrico da pepsina que está apresentado na tabela é -1.Há alguma coisa errada?
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As imunoglobulinas não possuem ponto isoelétrico fixo.Faça uma pesquisa e descubra o porquê.
ESQUEMA DA DISTRIBUIÇÃO DAS PROTEINAS SÉRICAS PELOSPONTOS ISOELETRICOS
pI 4,7-5.4 pI 5,4-5,8 pI 6,3-8,3
Albumina
Alfa 1- globulina Beta - globulina Gama-globulina
Alfa 2- globulina Beta - lipoproteína
Alfa – lipoproteína
Memorize os pontos isoelétricos das proteínas séricas.Para qual pólo elétrico elas vão migrar em pH 9?, pH 4? e pH 6?
O ponto isoelétrico da Gama-globulina está na faixa de 6.3-8.3.Há alguma coisa errada?As imunoglobulinas todas não possuem o ponto isoelétrico fixo.
Fazer pesquisa e descobrir porque. 12
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MÉTODOS ELETROFORÉTICOS:
ELETROFORESE SEM SUPORTE: denominada eletroforese livre.
Nesse sistema as substâncias são separadas em meio totalmente líquido, em tubo emforma de “U”. Para se obter um quadro completo da mistura, escolhe-se um pH onde amaioria das proteínas tenha a mesma carga, porém com densidade de carga emobilidade diversa. O índice de refração nessa fronteira muda pela passagem dasproteínas. Os movimentos de convecção provocados pela dissipação do calor exigemaparelhos e instalações especiais. É um método em desuso.
Diagrama esquemático da célula de Tiseliuspara medir a mobilidade eletroforética pelométodo do movimento de fronteiras. No exemplo é mostrada duas diferentes espéciesde proteínas carregadas negativamente, comdiferentes mobilidades eletroforéticas, dissolvidasem solução tampão. Neste caso todas as
proteínas migram para o ânodo. As mais rápidasassumem as fronteiras (1) tanto ascendentequanto descendente, ultrapassando, as maislentas (2). Como resultado forma-se duasfronteiras em movimento ascendente e duasfronteiras em movimento descendente.
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ELETROFORESE EM SUPORTE SÓLIDO
ELETROFORESE EM SUPORTE:
A solução aquosa de proteínas é imobilizada em uma matriz solida ou semi-sólida (material poroso e hidratado que apresenta rigidez mecânica) eliminandoa convecção e os distúrbios de vibração. Diminui a difusão das substâncias, oque facilita a sua completa separação. Metodologia mais simples, de maiorresolução e que necessita de menores quantidades de amostra em relação aeletroforese livre.
ELETROFORESE EM SUPORTE SÓLIDO: Os suportes sólidos mais usados são papel de filtro (EPF) e acetato decelulose (EAC), por serem materiais relativamente inertes que não interagemcom as proteínas migrantes nem ocasionam o seu retardamento. O acetato decelulose tem a vantagem sobre o papel de filtro proporcionando melhorfracionamento, inclusive na separação de beta-globulina e beta-lipoproteína, oque não é possível em papel, e maior rapidez na separação. O processo deeletroforese é mantido até que os componentes tenham sido separados emzonas nítidas. A posição e quantidade das proteínas, pode ser avaliada por umdensitômetro.
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ELETROFORESE EM SUPORTE SÓLIDO
(a). Diagrama esquemático do instrumental utilizado. A amostra é aplicadano centro do papel previamente umedecida pela própria solução tampão. Asextremidades do papel são mergulhadas na solução tampão, na qual oseletrodos estão imersos e aonde será aplicado o campo elétrico.
(b) Representação esquemática do eletroforetograma completo. Veja queos íons positivos (cations) migram em direção ao cátodo e os íons negativosem direção ao ânodo. Moléculas com carga resultante nula, permanecem noponto de aplicação da amostra.
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ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI SÓLIDO
Os suportes semi-sólidos mais usados são os géis de agar, agarose e poliacrilamida. Épossível maior resolução eletroforética quando o suporte ou material da matriz poderetardar ou excluir moléculas protéicas em função dos seus tamanhos moleculares.
ELETROFORESE EM GEL ÁGAR OU AGAROSE (EA): o processo é semelhante aodescrito para eletroforese em acetato de celulose. Uma variação dessa técnica, bastanteutilizada é a IMUNOELETROFORESE. Nessa técnica após a separação eletroforética da
amostra, faz-se uma reação antígeno-anticorpo (Ag-Ac), lava-se a preparação pararetirar as proteínas solúveis, restando os complexos Ag-Ac insolúveis (precipitados nogel), que são visualizados através de coloração específica. A analise imunoeletroforéticapermite definir ou caracterizar uma substância através de suas propriedadeseletroforéticas (mobilidade), diferenças na velocidade de difusão (coeficiente de difusão)e pelas propriedades imunológicas (especificidade).
ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA (EGPA). A eletroforese é realizadaem géis feitos de polímeros entrecruzados de poliacrilamida. O gel de poliacrilamida éum suporte que funciona com uma peneira molecular, promovendo a filtração da amostrapela rede do gel, reduzindo a velocidade de migração das proteínas em proporçãoaproximada à massa de cada uma delas. Nesse caso há associação da separação porcarga e por massa relativa. Nesse sistema, proteínas com mesmas cargas são
separadas por suas massas relativas. s16
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ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI SÓLIDO
Aparelhos e peças para eletroforese vertical
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ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI SÓLIDOFORMAÇÃO DO GEL DE POLIACRILAMIDA – polimerização
Gel de poliacrilamida
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ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI SÓLIDOProcedimento esquemático
As amostras (misturas dasproteínas a ser analisadasestão colocadas com ajudadas micropipetas, nospoços do gel (1-3). Ocampo elétrico estáaplicado (4) e as proteínasmigram com velocidades
diferente (5, 6) dependendodas cargas elétricas livres etamanhos.
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ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI SÓLIDOEM GEL ÁGAR OU AGAROSE ou POLIACRILAMIDA
Slab-eletroforese – eletroforese em camada fina do gel
Há dois tipos de géis: no topo o gel é comporos grandes e serve para concentrar asamostras; no baixo o gel é com porosmenores e serve para separação as proteínasou outros componentes do analise.
Esquema do gel em camada fina entre duasplacas de vidro. Aplicaçãodas amostras e resolução dasproteínas após revelação.
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ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI-SÓLIDORevelação
A) corante Coomassie blue; B) coloração por prata
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A) brometo de etídio; B) nitrato de prata; C) marcação radioativa;
D) quimiluminescência; E) Coomasie Blue; F) fast blue BB salt.
ELETROFORESE
ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI SÓLIDO Revelação
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ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI SÓLIDO Revelação
Com Luz UV Com corantes fluorescentes
Visualização dos ácidos nucléicos
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ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI SÓLIDO Revelação
Em Laboratorio
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ELETROFORESE EM SUPORTE SEMI SÓLIDO Revelação
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Eletroforese ácidos nucléicos
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Eletroforese na presença do SDS
Um método eletroforético comumente utilizado para a determinação da pureza e do pesomolecular de proteínas faz uso de detergente dodecilsulfato de sódio (SDS). O SDS liga-seà maioria das proteínas, provavelmente por interações hidrofóbicas em quantidadesgrosseiramente proporcionais ao peso molecular de cada proteína e, em geral, naproporção de uma molécula de SDS para cada dois resíduos de aminoácidos. O SDS ligadoadiciona uma grande carga negativa à molécula de proteína, tornando insignificantes ascargas intrínsecas da mesma.
[CH 3 -(CH 2 ) n -CH 2 -O-SO 3 - ] Na +
Dodecilsulfato de sódio (SDS)
A conformação nativa das proteínas é alterada quando o SDS liga-se a elas e a maioriaadquire, então, uma mesma forma geométrica, isto as tornam muito semelhantes entre si e,por esta razão, passam a ter uma mesma relação entre a carga elétrica e a massa. Assim, aeletroforese na presença de SDS separa as proteínas quase exclusivamente com base nasua massa, com os polipeptídios menores migrando mais rapidamente. Proteínas tratadascom SDS, perdem a carga intrínseca e adquirem carga negativa constante em relação amassa relativa. Sendo negativas, são atraídas para o ânodo e a separação ocorre segundoa massa relativa. As proteínas menores migram na frente, o inverso da cromatografica por
gel-filtração. 27
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ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDANA PRESENÇA DE DODECIL SULFATO DE SODIO (EGPA-SDS).
Exemplo do gráfico padrão para
determinação da massa relativa
Eletroforetograma
Etapas:1. medida das distancias percorridas (todas as proteínas e corante Lider);2. Calculo de Rf (migração relativa = Dp/DL);3. construção do gráfico Padrão, onde eixo Y – migração relativa e eixo X – Logaritmo damassa relativa das proteínas padrão;4. Utilizando valor do Rf da proteína desconhecida, determine o Logaritmo da massamolecular .
Descubra a massa relativa daproteína desconhecida, noEletroforetograma ao lado.
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L o g d a M a s s a R e l a t i v a
Migração Relativa
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FOCALIZAÇÃO ISOELÉTRICA OU ELETROFOCALIZAÇÃO
A focalização isoelétrica é um procedimento usado para determinar o pontoisoelétrico (pI) de uma proteína. Talvez seja o método mais eficiente de
eletroforese.Nesse método, inicialmente, os anfólitos (uma mistura de ácidos e basesorgânicos, de pequena massa) são aplicados no suporte (um gel), apósaplicarmos um campo elétrico num tempo curto (pré-corrida) para distribuir osanfólitos ao longo do gel e estabelecer um gradiente linear de pH no gel de
poliacrilamida ou agarose.
Uma mistura de moléculas compontos isoelétricos diferentes é
aplicada (1). As moléculasmigram (2) até cada uma delaschegar ao local com o valor dopH igual ao seu pI (3).
1
2
3
3
Separação das moléculas em acordo com pontos isoelétricos
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FOCALIZAÇÃO ISOELÉTRICA OU ELETROFOCALIZAÇÃOResultado
Quando uma mistura protéica é colocada nogel de poliacrilamida ou agarose cadaproteína migra para o cátodo ou anodo atéatingir o pH, que é igual ao seu pI (pHisoelétrico), formado uma área estacionária.Assim, proteínas com diferentes pontosisoelétricos distribuem-se de forma diferenteao longo do gel, formado uma áreaestacionária.O processo da revelação é similar ao
processo utilizado na nossa aula pratica compapel da celulose como suporte sólido:corante revelador e solução descorante.
A separação das moléculasde acordo com seus
pontos isoelétricos. 30
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Combinando dois métodoseletroforéticos :
a focalização isoelétrica (IEF ) e
a eletroforese na presença de SDS)
em géis bidimensionais consegue-sea resolução de misturas maiscomplexas de proteínas. Este métodocomposto é mais sensível do que afocalização isoelétrica ou a eletroforeseem SDS sozinhos. A eletroforese
bidimensional separa as proteínas depeso molecular idêntico, que diferemem ponto isoelétrico, ou proteínas compI similar, porém massas relativasdiferentes.
Eletroforese bidimensional. O principio
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Combinando os dois métodos: 1. focalização isoelétrica (IEF ) e
2. eletroforese na presença de SDS
A eletroforese bidimensional separa as
proteínas de mesma massa relativa quediferem em pontos isoelétricos, ouproteínas com pI similares, porém massasdiferentes.
Revelado com o corante Coomassie.
Eletroforese bidimensional
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Coloração por prata Corantes fluorescentes
Eletroforese bidimensional - Revelação
Cada pontinho representa um proteína diferente. A intensidade dacoloração indica a quantidade da proteína.
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ELETROFORESE DE ALTA VOLTAGEM
Aplica-se alta voltagem (ate 10 mil volts) ao sistema paraseparação de pequenas moléculas com rapidez, antes que elas
possam se difundir. Utilizada para aminoácidos e pequenospolipeptídios.
Fonte externo para eletroforese34
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“ IMMUNOBLOTING” é um poderoso método de diagnostico.
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“ IMMUNOBLOTING” é um poderoso método do diagnostico.
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Analise dos eletroforetogramas. Densitometros são fotocolorímetros específicos.
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Eletroforese das proteínas séricas: correlações clínico-patológicas.Densitogramas = curvas de absorbância
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Eletroforese das proteínas séricas: correlações clínico-patológicas.Densitogramas = curvas de absorbância
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Determinação as quantidades relativas de cada proteína nas analiseseletroforeticos
Como podemos calcular as quantidades relativas de cada proteína na amostra analisada, baseados
apenas nos densitogramas ? Isto pode ser resolvido de duas formas.
Baseado na área do gráfico. Primeiro tem que traçar uma linha na base do gráfico ligando os pontosiniciais e finais. Depois, podemos utilizar o conceito de integral e derivação de funções, mas podemosutilizar um artifício geométrico para resolver nosso problema: basta traçarmos retas paralelas aos eixos xe y, cobrindo todo o gráfico (formando uma malha). Feito isto, passaremos a trabalhar como seusássemos um papel milimetrado (quanto mais próximas essas linhas umas das outras, mais exata será
a medida obtida). Para descobrir as áreas aproximadas das curvas do gráfico, devemos então contar onúmero de quadrados contidos no gráfico. Quando o quadrado estiver apenas parcialmente contido nográfico, a ele será atribuído valor 0,5. Quando o quadrado estiver totalmente contido no gráfico, a eleserá atribuído valor 1. Após a contagem, soma-se os valores, obtendo as áreas relativas das curvas.Outra possibilidade é aproxima o cada curva (pico) com uma ou mais figuras geométricas e calcula asáreas delas. Área somatória assumida como 100%. Área de cada pico – X%.
Com uma balança analítica. Primeiro traçamos uma linha na base do gráfico e com uma tesoura,
podemos simplesmente recortar o gráfico e obter um pedaço de papel na forma dele. Em seguida pesa-se esse recorte e anota-se a o peso obtido (PG =peso total), referente a todo gráfico. Depois, recorta-secada Gaussiana (picos) do gráfico e pesa-se separadamente. Para se saber a quantidade relativa dasproteínas, basta estabelecer relações matemáticas entre os pesos anotados e o peso total, PG.
Usar esse noção para analisar a fração relativa das proteínas séricas a partir dos densitogramasde eletroforese apresentados na pagina anterior.
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Uma imunoeletroforese cruzada bidimensional.
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A eletroforese das proteínas do soro, dentro de certos limites, tem importantepapel na investigação clínica. A análise do diagrama eletroforético poderá serfeita por uma simples inspeção visual da fita, após coloração, ou através dosdados quantitativos obtidos por eluição da fita e leitura em fotocolorímetro ou
pela leitura da fita no densitômetro.
A eletroforese do soro do adulto normal, usando tampão pH 8,6 de forçaiônica 0,05, resulta na separação de 5 componentes protéicos:
fração albumina, alfa-1, alfa-2, beta e gama globulina.
A fração albumina é a que mais se distancia do ponto de aplicação no sentidodo pólo positivo. As frações globulinas são designadas pela ordem demobilidade decrescente. Uma vez que a densidade da coloração dasdiferentes frações é proporcional as suas concentrações, a fração albumina éque se mostra mais densa.
Eletroforese das proteínas séricas:
correlações clínico-patológicas
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FRAÇÕES PROTEICAS - VALORES NORMAIS:
Albumina 3,5 a 5,3 g/100 ml ou 52% a 68%
Globulinas: Alfa 1 0,2 a 0,2 g/100 ml ou 3,4% a 5,3%Alfa 2 0,4 a 0,7 g/100 ml ou 6% a 10%Beta 0,7 a 0,9 g/100 ml ou 10% a 13%
Gama 1,0 a 1,7 g/100 ml ou 14% a 21%
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correlações clínico-patológicas
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GLOBULINA ALFA-1 AUMENTADA: Enfermidades agudas, crônicas dequalquer natureza (por exemplo, resfriados, furunculose); síndromenefrótica; processos inflamatórios agudos. Neoplasias e outros;síndrome com destruição tissular; efermidade de Hodgkin; úlcera
péptica; gastroenterites agudas; colites ulcerosas e carcinoma gástrico.GLOBULINA ALFA-1 DIMINUÍDA: Cirrose hepática, periarteritescrônicas, hepatites por vírus, má absorção e má nutrição.
CLOBULINA ALFA-2 AUMENTADA: Síndrome nefrótica, icterícia
obstrutiva, tuberculose pulmonar e extrapulmonar, mieloma múltiplo,enfermidade de Hodgkin, nefrose e glomerilonefrite, enfermidades docolágeno, diabete melitus, úlcera péptica, gastroenterites agudas,colites ulcerosas e carcinoma gástrico
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GLOBULINA ALFA-2 DIMINUÍDA: Hepatites por vírus, cirrose hepática,síndrome de má absorção e má nutrição. BETA CLOBULINA AUMENTADA: Especialmente em todos os processos emque há hiperlipemia como: síndrome nefrótica, mixedema, icterícia obstrutiva emieloma múltiplo.
BETA GLOBULINA DIMINUÍDA: Leucemias mielogênicas e momocíticas,colites ulcerosas, nefrose e glomerulonefrites. GAMA CLOBULINA AUMENTADA: Inflamações crônicas (entre elasendocardites bacterianas e hepatites crônicas), necroses hepáticas,enfermidades do colágeno com excessão da perioarterite nodosa, calazar(leishmaniose), linfogranuloma venéreo, cirrose crônica (ê característica a
quase ausência de demarcação entre os picos beta e gama), sarcoidoses,artrite reumatóide, plasmocitoma e macroglobulinemia.GAMA GLOBULINA DIMINUÍDA: Baixa resistência por infecções, leucemiaslinfáticas, úlceras gástricas, colites ulcerosas, enterites agudas, câncer doestômago, nefroses, glomerulonefrites e enfermidades de má absorção enutrição.
Eletroforese das proteínas séricas:correlações clínico-patológicas
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Eletroforese em capilar: apresentação esquemática
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Eletroforese em capilar
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Tipos de eletroforese em capilar:
Eletroforese zonal em capilar (EZC): é a forma mais simples de eletroforese em
capilar e também é conhecida como em eletroforese em solução. A separação sebaseia na diferença da razão massa/carga das substâncias. O fundamental na EZC é ahomogeneidade da solução tampão e a uniformidade na intensidade do campo elétricoao longo do capilar. O controle do pH do meio é muito importante uma vez que eleinterfere na dissociação dos grupamentos acídicos e protonação dos grupamentosbásicos do soluto.
Eletroforese em gel no capilar (EGC): é uma adaptação da eletroforese em geltradicional só que ocorrendo no interior do capilar, que é preenchido com uma soluçãode polímeros criando uma peneira molecular. Deste modo é possível separar pelotamanho substâncias que apresentam a razão massa/carga similar. Está técnica écomumente empregada na determinação do peso molecular de proteínas e na análisede seqüenciamento de DNA.
Focalização isoelétrica em capilar (FIC): possibilita que moléculas anfóteras comoproteínas sejam separadas em um gradiente de pH estabelecido entre o cátodo e oanodo. As moléculas irão migrar até onde sua carga resultante seja zero. No pontoisoelétrico as moléculas estacionam em uma zona focada, que pode ser localizadautilizando um detetor de pressão ou por meios químicos. A FIC é muito utilizada paracaracterização de proteínas.
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Estudo clínico do plasma e outros líquido do organismo demamíferos (EAC ou EPF);
Resolução de misturas complexas de proteína, ácidos nucléicos
e aminoácidos (EGPA, EGPA-SDS, FI);
Determinação da pureza e homogeneidade molecular (EGPA,EGPA-SDS, FI);
Determinação do pI das proteínas (FI);
Determinação da massa relativa (EGPA-SDS).
APLICAÇÕES:
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Determinação de alterações em amostras submetidas a ação de
agentes químicos (drogas) ou físicos (radiações) - (EGPA, EGPA-SDS,FI);
Genética molecular (EGPA** ou EGPA-SDS)- testes de paternidadeentre outros;
Testes mais refinados para diagnóstico (“immunoblotting” - testepara HIV) - (EGPA ou EGOA-SDS);
Veterinária (EGPA, EGPA-SDS, FI) - usado para avaliar alteraçõespatológicas em animais;
Taxonomia** (EGPA, EGPA-SDS, FI) - Classificação de espécies.
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Obstáculos para penetração da pele: A resistência do estrato córneo (camada maisextrema da pele) impede a entrada de medicamentos: moléculas grandes têm muitadificuldade em atravessar a epiderme para os vasos sangüíneos da derme.Soluções: Os equipamentos utilizados nesse caso denominam-se os aparelhospara iontoforese e estão apresentados na figura seguinte. O aparelho utiliza pulsosde eletricidade praticamente indolores que tornam a pele permeável.
IontoforeseA eletroforese pode ser utilizada para “injeção” de
medicamentos através da pele.
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https://reader003.{domain}/reader003/html5/0212/5a8088a4bb474/5a8088c
Estrutura da pele
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Estrutura da pele
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Iontoforese
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Iontoforese é um processo de facilitação da penetração dos tecidosbiológicos para substâncias ionizadas (com cargas elétricas livres)quando submetidas a aplicação do potencial elétrico adequado.
As substâncias são geralmente os fármacos (antiinflamatórios,
esteróides e anestésicos locais). Iontoforese é usada paratransportar quantidades clinicamente significativas dos fármacospara região cutânea e subcutânea do tecido.
A análise experimental e clínica demonstram a importância deste
método na clínica, fisioterapia, dermatologia, otorrinolaringologia,oftalmologia, odontologia, e neurologia.
Iontoforese
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ELETROFORESE
ELETROFORESE
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Mecanismos: Ionização e Eletroosmose
As drogas colocadas em meio aquoso são compostos iônicos que sedissociam em partículas carregadas positivamente e negativamente,portanto serão atraídos por eletrodos de sinal contrário.
Ionização -> ex. (fosfato de dexametasona sódica)(-) íon fosfato de dexametasona e (+) íon sódio.
Iontoforese
A identificação da droga prediz a polaridade do eletrodo que será usados
para mover ou entregar a droga ao tecido.Drogas positivas são colocadas sob o eletrodo positivo (anodo) e drogasnegativas, sob o cátodo (eletrodo negativo)
O eletrodo ativo contém a droga e o eletrodo oposto é chamado deeletrodo dispersivo.
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ELETROFORESE
Eletroosmose
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1. Eletroforese;2. Electroosmose com cargas
elétricas fixas negativas. Osporos seletivamente
preenchidas com cátions quefaz acontece o fluxo da água(junto com os cátions) nadireção do pólo negativo =catodo.
3. Eletroosmose com cargaselétricas fixas positivas. Os
poros seletivamentepreenchidas com anions quefaz acontece o fluxo da água(junto com os anions nadireção do pólo positivo =anodo.
Esse fluxo leva as moléculasneutras e, também influi na
migração das moléculas comcargas elétricas livres:freando aquelas que semovimenta contra fluxo daágua e acelerando amigração outras que semovimenta na mesma
direção do que a água.
Eletroosmose
1.
2.
3.
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Então na eletroosmose o fluxo do solvente acontece enquanto o campoelétrico é aplicado sobre um meio poroso (membrana, pele....) com cargas
elétricas fixas nas paredes dos poros.Por isso razão os suportes (solido ou semi-solido) para o eletroforesesempre estão feitos dos materiais sem as cargas elétricas fixas nos poros.
Eletroosmose
Em pH fisiológico (~7), a pele apresenta excesso de cargas negativas quefacilita migração dos cátions e o fluxo do solvente/água (junto com as
substâncias dissolvidas) para o catodo.Fluxo: de anodo para catodo.
A pele é isoelétrica (número das cargas positivas igual ao número das cargasnegativas) em pH entre 3 e 4 (Costello, et al 1995).
Por isso o fluxo da água se reverte em pH <3, porque nessas condições apele apresenta excesso de cargas positivas que facilita migração dosanions e o solvente (junto com as substâncias dissolvidas) para o anodo.Fluxo: de catodo para anodo. Fonte da energia elétrica
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Iontoforese: ELETROFORESE
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Iontoforese:Eletroforese + Eletroosmose
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Princípios da Iontoforese
A taxa de penetração da droga aumenta com:
Aumento da carga da drogaAumento da corrente iônicaDecréscimo da massa molecular do íon
(íons pequenos e leves apresentam maior
mobilidade)
www.dexrx.com
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Curdy, C., Kalia, Y.N., & Guy, R.H
A resistência oferecida pela pele reside na camadasuperficial da epiderme, ou seja, estrato córneo, quelimita a perda de água do corpo.
O estrato córneo é o maior obstáculo para a entrega
de drogas transdérmica.
Princípios da Iontoforese
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• Banga, 1998 A espessura da pele é de aproximadamente 2 a 3 mm e o
estrato córneo tem 10-15 μm.
Os espaços intercelulares estão completamente cheios delamelas que são compostas por lipideos, ceramidas,colesterol e ácidos graxos em quantidades praticamenteiguais.
A morfologia dos lipídeos é importante para a função debarreira do estrato córneo.
Princípios da Iontoforese
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• Robinson, A.J & Snyder-Mackler, L., 1995
Muitos compostos são carregados positivamente ounegativamente. Quando estes compostos são colocados emsoluções apropriadas, dissociam-se em componentes que secomportam como íons. Estes íons podem ser influenciados pelocampo elétrico aplicado a solução, onde eles podem ser atraídospelos pólos de sinais contrários. A força elétrica de repulsãodestas cargas é a força motriz para a iontoforese.
Princípios da Iontoforese
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Teoria da Iontoforese
A densidade de corrente é medida pela correnteaplicada dividido pela área em centímetros quadrado doeletrodo.
A quantidade de drogas entregue depende da correntetotal aplicada multiplicada pelo tempo.
A corrente contínua unidirecional causa irritação na pele,sendo tolerada em no máximo 1 mA/cm quadrado.
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Iontoforese vs InjeçãoA iontoforese é um tratamento não invasivo é orisco para a pele é baixo.
A iontoforese permite um tratamento sem dor parapacientes que não suportam injeções.
A iontoforese minimiza os traumas que ocorrem
nas injeções.
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Iontoforese vs Via OralA iontoforese permite a aplicação de drogas sem queelas sejam absorvidas pelo trato gastrointestinal
A iontoforese é permite a aplicação de drogastranspondo o metabolismo hepático.
A iontoforese diminui os riscos de superdosagem.
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Área de Aplicação
Precauções e Contra-indicaçõesOs riscos para o paciente é baixo, mas, ela não pode ser empregadano tratamento nas seguintes condições:
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Marcapasso cardíacosEstimulação na área torácicaEstimuladores implantadosSobre as carótidas no pescoçoÁrea faríngeaSangramentos
Diminuição ou ausência desensação.
CâncerHiper ou hipotensão não
controladaDoenças vascularesperiféricasTromboflebitesGestaçãoOsteoporoseObesidade morbidaDesordens epiléticas
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Fatores de AbsorçãoFatores fisiológicos
As condições do leito vascular é importante, pois a
vasoconstricção leva a uma diminuição do fluxo, enquantoa vasodilatação, aumenta-o.
Existem pequenas diferenças no fluxo de drogas por
iontoforese em mulheres e homens.
A quantidade e o tipo de pêlos também afeta o fluxo dedrogas na iontoforese.
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Penetração e DistribuiçãoA penetração dos íons
A penetração dos íons depende do tipo de tecido.
A profundidade é de aproximadamente 1 centimetro.
Alguns íons penetram até nos capilares subcutâneos.
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Aplicações ClínicasInflamação com dor constante
Fosfato sódico de Dexametasona a 0.4% (polaridade negativa)entregue via cátodo em 3 aplicações semanais durante 4 semanas
Diclofenaco a 5% (polaridade negativa) entregue via cátodo em 3 aplicações semanais durante 4 semanas
Cetoprofeno a 10% (polaridade negativa) entregue via cátodo em 3 aplicações semanais durante 5 semanas
Hidrocloreto de Lidocaína a 4% (polaridade negativa) entregue via cátodo em 3 aplicações semanais durante 3 semanas
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Aplicações Clínicas
Artrite Reumatóide
Salicilato de Sódio a 2% (polaridade negativa) entregue via ânodo em 3 aplicações semanais durante 4 semanas.
Metacolina a (polaridade negativa) entregue via ânodo em 3 aplicações semanais durante 4 semanas.
Citrato de Potássio a 2% polaridade negativa) entregue via ânodo em 3 aplicações semanais durante 4 semanas
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Aplicações Clínicas
Espasmos Musculares
Sulfato de Magnésio a 2% (polaridade positiva) entregue via cátodo em 3 aplicações semanais
durante 4 semanas Baclofeno a 0.5% polaridade negativa) entregue via ânodo
em 3 aplicações semanais durante 8 semanas
Cloreto de cálcio a 2% ( polaridade positiva) entregue via cátodo em 3 aplicações semanais durante 4 semanas
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Aplicações Clínicas
Cicatrização
Iodeto de Potássio a 10% ( polaridade positiva) entregue via cátodo em 3 aplicações semanais durante 4 semanas.
Cloreto de Sódio 3% (polaridade negativa) entregue via cátodo
em aplicações por 4 semanas
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Aplicações Clínicas
Depósitos de Cálcio
Ácido Acético a 4% (polaridade negativa) entregue via cátodo em 3 aplicações semanais em 4 a 8 semanas
Neuropatias
Gabapentina a 6% (polaridade negativa) entregue via cátodo em 3 aplicações semanais em 2 a 8 semanas
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Aplicações Clínicas
Verrugas
Salicilato de sódio a 2% (polaridade negativa) entreguevia cátodo a cada 6 a 9 dias em 3 seções de
tratamento.Gôta
Citrato de lítio a 3% (polaridade positiva) entregue via
ânodo em 3 a 5 aplicações por uma semana
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Concentração da DrogapH da solução da droga Preservativos
Fonte de corrente elétrica e intensidade de correnteIntensidade de corrente
IMPORTANTE RELEMBRAR QUE NAIONTOFORESE AS SOLUÇÕES NÃO DEVEM TERÍONS COMPETIDORES.
Variáveis da Iontoforese
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Variáveis da Iontoforese
Concentração da droga
O movimento de íons aumenta com a concentração do soluto
no eletrodo doador.
pH da Droga
O pH é essencial para entrega da droga e comforto dopaciente. A soluções ótimas que predominam na formaionizada.
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Variáveis da Iontoforese
Preservativos
Os Preservativos na formulação podem ser transferidos paraa pele durante a iontoforese. Isto pode causar eritemaslocalizados.
Os Preservativos criam competição iônica que resulta na
redução de entrega da droga.
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Variáveis da IontoforeseTipo de fonte de corrente elétrica
Sistemas de corrente constante são mais confiáveis que os
de voltagem constante.
Intensidade de corrente
A intensidade de corrente aumenta o fluxo de íons.
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Efeitos colaterais do IontoforeseReação Alcalina
Queimaduras químicas podem ser induzidas sob os
eletrodos. Este tipo de queimadura pode ser causada porreações ácidas ou básicas.
Reações Alcalinas são mais comuns e resulta da
acumulação de hidróxido de sódio sob o cátodo.
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Efeitos colaterais da IontoforeseQueimaduras na pele
A corrente elétrica através da pele cria o movimento deíons. Este movimento de íons conduz a alteração do pH dapele.
As queimaduras podem ser causadas pela corrente e não
pela medicação.
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R d i d i d iELETROFORESE
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Reduzindo os riscos de queimar a
pelePara reduzir a incidência de irritação a pele:
1) Limpeza com sabão, água ou álcool antes da aplicação.
2) SATURAR OS ELETRODOS garantindo que não haja áreassecas. Preencha os eletrodos adequadamente.
3) Fazer as apliçações iontoforéticas somente em pele íntegra.
4) Reduzir a densidade de corrente por aumento no tamanho doeletrodo e decréscimo de corrente.
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I di õELETROFORESE
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Indicações
• Inflamação• Dores• Depósitos do Cálcio
• Cicatriz e aderências
• Edemas• Ferimentos e infecções• Hiperidrose
Indicação Meios Elétrodo Tempo (minuto)
Corrente (miliampère)
HiperidroseEdemaVasodilataçãoÚlcera de Varicose
Bater a águaHialuronidaseHistaminaMetacolina
Ânodo (+)Ânodo (+)Ânodo (+)Ânodo (+)
15203-520
15-2020
2-105-30
http://www.beauty-cosmetic-guide.com/lang/pt/skin-surgery/iontophoresis.htm
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(Robinson & Snyder-Mackler, 1995)• Pele danificada• Diminuição de sensação na pele• Sensibilidade a droga administrada• Sensibilidade a corrente direta• Marcapassos cardíacos e outros implantes
• Arritmias Cardíacas
Contra-indicações
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O aparelho para iontoforese
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Fatores quais influenciaram na penetração
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1 Concentração da substancia2 Densidade do corrente elétrico
3 Duração do processo
4 Impedância da pele
5 Lipofilicidade/hidrofilitidade e o peso molecular do fármaco6 Mobilidade do fármaco e a condutividade da solução
7 Valencia (numero maximo/densidade das cargas elétricas)
8 Valor de pH
9 Estado de ionização (depende do pK e pH)10 Efeito do Iontoforese na metabolização e degradação do
fármaco na pele
iontoforetica dos fármacos
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ELETROFORESE
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Descreva o princípio da técnica de eletroforese e o procedimento detalhadode análise eletroforetica de uma amostra de proteínas.
Como determinar a quantidade relativa das proteínas num eletroforetograma?
Como a eletroforese pode ser utilizada em exames que auxiliam no processo
de diagnóstico?Qual é o significado de cada um dos parâmetros que compõem a equação de
fluxo migracional?
Qual é o fator mais relevante que determina a movimentação das proteínas
do soro na eletroforese da aula pratica?
Quais fatores influenciam na velocidade de migração da partícula durante aeletroforese?
Lista de exercícios
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ELETROFORESE
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1. Defina ponto isoelétrico. Como determiná-lo experimentalmente de maneirarápida e com maior precisão? Qual é o tipo de substância que torna istopossível?
2. Descreva resumidamente os tipos de eletroforese. Em que situações seaplicam?
3. Em que tipo de eletroforese a massa relativa das proteínas tem maior
importância? Explique como e que tipo de substância torna esse fator o maisrelevante?
4. Como revelar a localização das proteínas num eletroforetograma?5. Como determinar a quantidade relativa das proteínas reveladas numa
eletroforetograma?6. Que é e como funciona o densitômetro?7. Os corantes utilizados numa eletroforese (Lider e Revelador) possuem quais
propriedades?
Lista de exercícios
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ELETROFORESE
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Analise eletroforetica das proteinas do plasma de um paciente
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PROCEDIMENTO
ELETROFORESE
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PROCEDIMENTO
MATERIAL NECESSÁRIO:
Cuba de acrílico para eletroforese, c/ponte de 11cm de largura,ajustável a 8,5 cm;Fonte de corrente continua (200-300 V);
Densitômetro (O densitômetro é um aparelho baseado na propriedade dasmoléculas de absorver a luz diretamente proporcional à concentração das
moléculas numa solução (espectrofotômetro específico));
Estufa, Fita de acetato de celulose 2,5x14 cm (Cellogel), Papéis defiltro, Pipeta automática, Tesoura, Pinça
Placas de Petri, Amostra (soro)
Corante líder (marcador da mobilidade máxima de qualquer partícula(molécula) numa eletroforese).
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PROCEDIMENTOELETROFORESE
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MATERIAL NECESSÁRIO:
Tampão de corrida: - veronal sódico: 5,15g +EDTA 2,6g por 1 litrode água - pH=8,6, força iônica= 0,075
Solução corante revelador: Amido negro 0,5g+metanol 45%+
ácido acético 10% em água.
Solução descorante: metanol 47,5% + ácido acético 5% em água
Solução desidratante: metanol
Solução transparentizante: Metanol 85%+ ácido acético 14%+glicerol 1%
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PROTOCOLO ELETROFORESE
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1 – Observar o sinal do polo elétrico marcado na canaletas da cuba. Colocar tampão
de corrida nos dois lados da cuba, até a metade aproximadamente.
2 - Retirar com auxílio de pinça, a fita de acetato de celulose do pacote em que amesma é acondicionada, mergulhá-la no tampão de corrida e agitar (movimento devai-vem) durante 3-5 minutos.
3 – Retirar a fita da solução tampão com uma pinça (prendedo por umaextremidade), segurando-a na posição vertical em cima da cuba; remover o excessode tampão da fita, tocando-a levemente na outra extremidade com uma folha depapel de filtro. Escolher o lado permeável da fita.
Obs: somente uma das faces da fita é permeável - a opaca.
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ELETROFORESE
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PROTOCOLO
4 - Sempre com o auxílio de pinça, esticar muita bem a fita na ponte.Observar que ambas as extremidades estejam em contato com asolução tampão e que o lado permeável da fita estar situado paracima.
5 - Fechar a cuba e ligar a fonte por 3-5 minutos, para equilibrarainda mais os poros da fita com a solução tampão.
6 - Desligar a fonte. Pipetar a amostra do soro com a pipetaautomática e com a mesma colocar numa placa de Petri, misturandocom o corante Líder. (O corante Líder é um corante que não temafinidade por proteínas, mas migra com maior velocidade do que as
proteínas. A distância percorrida pelo corante serve como uma distânciapadrão.) Aplicar uma pequena (5 microlitros) amostra, distante 1-2cm do pólo negativo (POR QUE? Explicar!). Marcar a posição daaplicação da amostra picotando com a tesoura os dois lados lateraisda fita (ponto de partida).
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PROTOCOLO ELETROFORESE
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7 - Fechar a cuba e ligar a fonte por 30 minutos. Observar acorridapelo movimento do corante lider.
8 - Desligar a fonte, marcar a posição do corante líder picotandocom a tesoura de um lado lateral da fita (chegada). Segurar a fitacom a pinça no meio da fita e cortá-la em ambas as extremidades (~1cm acima do ponto de partida e ~1 cm abaixo do de chegada).Coloque a fita na placa de Petri e aplicar a solução corante revelador
(no nosso caso é Amido negro), por 2 minutos!
9 – Devolver o corante revelador para o recipiente e aplicar asolução descorante agitando. Fazer várias lavagens à temperaturaambiente e duas com solução descorante quente, com finalidade deremover o excesso do corante revelador. A fita deve ficar novamentebranca, exceto os locais onde tem proteína. OBS: O corante lídertambém é removido.
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PROTOCOLOELETROFORESE
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PROTOCOLO
Analise do Eletroforetograma
Medidas necessarios para identificação das proteinas.Distancia percorrida e Migração Relativa,
Rf = DP/DL
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PROTOCOLO
ELETROFORESE
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PROTOCOLO
10. Retirar a fita do descorante e estendê-la na parte de cima de umaplaca de Petri.
Medir a migração das proteínas com régua e calcula a migração relativa(Rf), definida como Rf= DP /DL , onde DP é distancia percorrida porproteína, mm, e DL é distancia percorrida por corante líder, mm. Compare seus dados com o padrão de migração relativa das proteínasnas nossas condições, as quais são: 1. Gama-globulina- ~0.320.07; 2. Beta- globulina~0.600.07;
3. Alfa2-globulina~ 0.730.06; 4. Alfa1-globulina~ 0.840.04;5. Albumina-~ 0.940.03
A partir da comparação indicar a localização das frações básicas àsproteínas do soro no seu eletroforetograma.
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PROTOCOLO
ELETROFORESE
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PROTOCOLO
11 – Na preparação da fita para leitura no densitômetro, antes devemos colocá-la por 30 segundos em metanol puro e logo em seguida, por 1 minuto na
solução transparentizante.
12 - Retirar a fita do solução transparentizante, estendê-la na parte de cima deuma placa de Petri e deixar na estufa
13 - Retirar da estufa, esperar esfriar, colocar na mesa de um densitômetro para realização da leitura e determinação da quantidade (relativa ou absoluta)de cada proteína.
até que a fita fique transparente (aproximadamente 1 minuto).
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PROTOCOLO ELETROFORESE
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O densitômetro é um aparelhobaseado na propriedade dasmoléculas de absorver a luz
diretamente proporcional àconcentração das moléculas numasolução (espectrofotômetroespecífico).
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PROTOCOLO ELETROFORESE
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O resultado da leitura da fita está apresentadocomo um gráfico (chamada “densitograma” quesoma de várias Gaussianas “picos”) onde asáreas sombreadas por cada Gaussiana (pico)representam a quantidade de proteína (ouqualquer outra substância que absorva a luz).
Soma todas as áreas = 100% das proteinasanalisadas;Área de qualque um - X
O densitômetro é construído para medidas da absorbância aolongo da fita com as proteínas coradas.
FRAÇÕES PROTEICAS - VALORES NORMAIS:
Albumina 3,5 a 5,3 g/100 ml ou 52% a 68%Globulinas: Alfa 1 0,2 a 0,2 g/100 ml ou 3,4% a 5,3%
Alfa 2 0,4 a 0,7 g/100 ml ou 6% a 10%Beta 0,7 a 0,9 g/100 ml ou 10% a 13%Gama 1,0 a 1,7 g/100 ml ou 14% a 21%
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PROTOCOLO ELETROFORESE
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Agora que temos o gráfico obtido com a análisedensitométrica das corridas eletroforéticas, umpequeno problema se apresenta: Como podemos
calcular as quantidades relativas de cada proteína nasolução da corrida, baseados apenas no gráfico? Istopode ser resolvido de duas formas: 1. Primeiro traçamos uma linha na base do gráfico(azul) e separamos os picos (vermelho). Depois asáreas de cada pico podem ser obtidas através daaproximação por uma ou mais figuras geométricas.
Para saber a quantidade relativa das proteínas, bastaestabelecer relações matemáticas entre as áreas decada pico e a área total.2. Outra possibilidade é utilizar uma balança analíticae uma tesoura. Podemos simplesmente recortar ográfico e obter um pedaço de papel na fodo gráfaico.
Em seguida pesamos esse recorte e anotamos opeso obtido (PG=peso total), referente a todo gráfico.Depois recorta-se cada Gaussiana (picos) do gráfico(as linhas vermelhas) e pesa-se separadamente.Para saber a quantidade relativa das proteínas, bastaestabelecer relações matemáticas entre os pesosanotados e o peso total.
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BibliografiaELETROFORESE
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1. Laboratório para o clínico. Livraria Atheneu Editora, 19912. Diagnósticos clínicos e conduta terapêutica para examines laboratoriais. Todd,Sanford, Davidsohn, Editora Monole Ltda, 1982.
3. Eletroforese . Peulo Cesar Nahum4. Diagnóstico clínico e tratamento para métodos laboratoriais. J.B.Henry, Editora
Mamole Ltda, 1999.
5. Na Bancada. Manual de iniciação cientifica em laboratórios de pesquisasbiomédicas. Kathy Barker, Editora ArtMed, 20026. http://www.piercenet.com/Proteomics/browse.cfm?fldID=21518847-2D72-475F-A5B9-
B236EC5B641E 7. http://www.biocompare.com/tutorials/2DE_tutorial/html/background.asp 8. http://en.wikipedia.org/wiki/Electroosmosis 9. http://www.beauty-cosmetic-guide.com/lang/pt/skin-surgery/iontophoresis.htm 10. http://chsfpc5.chem.ncsu.edu/~franzen/CH795I/lectures/transdermalPC/tsld002.htm
Bibliografia
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