eletroforese · 2 eletroforese É um processo que consiste na separação dos componentes de um...

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Eletroforese

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Eletroforese� É um processo que consiste na separação dos componentes de um sistema através da aplicação de um campo elétrico. � É usado para separar e analisar biomoléculas.

� Princípio: Substâncias em solução que possuem carga elétrica livre,

deslocam-se quando submetidas a um campo elétrico de sentido invariável.

� Para que uma partícula se mova é necessário que possua carga elétrica livre, isto é, excesso ou diferença de elétrons.

� Portanto: - para o ânodo (+) dirigem-se os ânions- para o cátodo (-) dirigem-se os cátions

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EletroforeseE

N E

N

N

NE P E

ii

ii

ii i i

i

= = =∑

∑ ∑

� As moléculas são separadas umas das outras conforme o tamanho, a carga elétrica e a forma.

� Separa-se partículas de mesma carga, porém com quantidades diferente de carga.

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�Moléculas grandes migramlentamente, enquanto moléculas pequenas movem-se rapidamente.

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EletroforeseE

N E

N

N

NE P E

ii

ii

ii i i

i

= = =∑

∑ ∑

� Suportes:

Meio sólido: - Papel- Acetato de celulose

Meio semi-sólido: - Gel de amido- Gel de agarose- Gel de poliacrilamida

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E

N E

N

N

NE P E

ii

ii

ii i i

i

= = =∑

∑ ∑ ( )2

2 22 2/

3 3 2 3A A A A

c mPV N mu N m N c N average kinetic energy molecule

= = = =

Eletroforese

�Marcadores de peso molecular são usadospara estimar o tamanho das moléculasdas amostras.

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Eletroforese: a concentração do gel

�A concentração do gel definirá o tamanho dos poros a serematravessados pelasmoléculas emmigração.

�Geis muitoconcentrados oferecerãomaior resistência àmigração das moléculas.

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Eletroforese

� LipoProteínas – unidade de transporte lipídico

� Identificação de 4 faixas lipoproteicas

- Quilomicrons

- Lipoproteína Beta

- Lipoproteína Pré-beta

- Lipoproteína Alfa

- Ultracentrifugação

- Separação por eletroforese

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Eletroforese

� Hemoglobina

- Hemoglobina S

- Hemoglobina C

- Talassemia Beta

- Hemoglobina anormais- Carga elétrica- Ponto isoelétrico

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Eletroforese

� Hemoglobina S

- Indivíduos heterozigotos (AS)- Traço siclêmico- Geralmente assintomáticos

- Hemoglobinopatia estrutural* substituição do ácido glutâmico pela valina

- Indivíduos homozigotos (SS)- Anemia hemolítica congênita( anemia falciforme)

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Eletroforese

� Proteínas: - aminoácidos como eletrólitos

� Proteínas séricas:- Albumina- Globulinas (α1, α2, β, δ)

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Eletroforese: métodos de leitura

Densitometria

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Espectrofotometria

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energia frequência de infra- visível ultra- raios-X raios-γγγγ radiante rádio vermelho violeta _______________________________________________________________________________________ Técnica NMR Absorção Absorção Absroção Absorção Técnicas radio- Analítica Microondas Fluorescência Difração métricas Fosforescência Fotometria de chama Espectroscopia de emissão _______________________________________________________________________________________ Interação desintegração vibração e excitação eletrônica dos elétrons desintegração com a do rotação das átomos de uma moléculs internos são do núcleo matéria núcleo moléculas deslocados

_______________________________________________________________________________________

Aplicações da espectroscopia

Rotação

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• A região do espectro do ultravioleta é na faixa de 200 a 400 nme a da luz visível é entre 400 e 800 nm.

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O que faz com que alguns raios interajam e outros passem através das coisas?

Dois requerimentos devem ser observados para que uma determinadaradiação possa ser absorvida por uma molécula:

1 - A radiação incidente deve ser de frequência equivalente aquela rotacional ou vibracional, eletrônica ou nuclear da molécula,

2 - A molécula deve ter um dipolo permanente ou um dipolo induzido, ou seja, deve haver algum trabalho que a energia absorvida possa fazer.

Interação da radiação com a matéria

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Leis de absorção

IoI1

Io = 100I1 = 50

Io = 100 I1 = 50I2 = 25

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Esquema dos principais componentes de um espectrofotômetro

• A amostra deve estar em um recipiente (cubeta) de quartzo quando a radiação for na região espectral do ultravioleta. Quando for na região da luz visível usa-se os de vidro por ter uma melhor dispersão.

• Os detectores devem ser altamente sensíveis.• Os dados obtidos pelo detector são enviados para um

dispositivo de processamento de dados.