alfa-amilase — fisiologia vegetal
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7/31/2019 Alfa-amilase Fisiologia Vegetal
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Sntese e actividade da
- amilaseEfeito do cido giberlico, do cidoabscsico e do clcio em sementes de
Hordeum vulgare L.
Fisiologia Vegetal
Joo Rodrigues, Liliana Raeiro, Maria Pires
Faculdade de Cincias da Universidade do Porto
Licenciatura em Bioqumica
Ano lectivo 2011/2012
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Fisiologia Vegetal
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IntroduoA -amilase uma enzima induzida pelo embrio das sementes, sendo responsvel
pela hidrolisao das suas reservas, no endosperma, nomeadamente o amido.
O cido giberlico (GA), que produzido no embrio das sementes, aps estas
passarem por um perodo de embebio em gua, transportado at aleurona e
escutelo, onde induz a sntese da -amilase, entre outras hidrolases.Na presena do GA, os nveis de mRNA total que codificam a -amilase aumentam, o
que revela uma correlao entre a produo de GA e produo de -amilase.
O cido abcsico (ABA) uma fito-hormona que, quando presente no embrio induz a
produo de um inibidor da -amilase, constituindo assim um regulador da taxa de
crescimento. Alm disso, induz a sntese de inibidores de protase bacteriolgica,
constituindo o sistema de defesa do embrio.
A -amilase uma metaloenzima que contm Ca2+. A ligao de um catio Ca2+
enzima um processo irreversvel e necessrio para manter tanto a actividade como
a estabilidade desta.
A cicloheximida um inibidor da sntese proteica que actua ao nvel da transcrio do
DNA de clulas eucariticas. A presena deste composto nas sementes inibe a
sntese da -amilase, inibindo o crescimento celular do embrio.
Assim, a realizao desta experincia tem como objectivo a verificao do papel do
GA na sntese da -amilase e a aco do GA, do ABA e do Ca2+ nos nveis de
actividade da dita enzima e consequentemente, no desenvolvimento embrionrio da
semente.
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Materiais e Mtodos
Preparao e tratamento das sementes
1. Procedeu-se desinfeco de 250 sementes de cevada com lixvia a 10%,
seguindo-se de lavagens sucessivas com gua destilada. Manteve-se as sementes em
papel de filtro humedecido, em obscuridade, durante 24h, temperatura de 4C.
2. Seccionou-se transversalmente as sementes e separou-se as suas metade com e
sem embrio.
3. Numeraram-se placas de Petri de 1 a 6, fazendo duplicados, e pipetou-se 5 mL das
seguintes solues, respectivamente:
placas 1 e 2: tampo HEPES 0,01 M, pH 6;
placa 3: GA 10-6 M em tampo HEPES;
placa 4: GA 10-6 M + CaCl2 10 mM em tampo HEPES;
placa 5: GA 10-6 M + 1 M em tampo HEPES;
placa 6: GA 10-6 M + cicloheximida em tampo HEPES;
4. Colocaram-se em cada uma dessas placas 15 metades de sementes. Na placa 1
colocaram-se as metades com embrio e nas restantes as sem embrio.
5. Vedou-se as placas com parafilme e incubou-se na obscuridade durante 48h.
6. Procedeu-se ao congelamento das amostras at data da extraco.
Preparao dos extractos para a quantificao de protenas
1.Em gelo, homogenizou-se as sementes em tampo de cido ctrico-citrato de sdio
10mM, pH 5.
2.Transferiu-se e centrifugou-se o extracto a 5000rpm, no frio.
3.Conservou-se o sobrenadante em gelo.
Quantificao de protenas pelo mtodo de Bradford
1.Preparou-se 6 solues de albumina com concentraes crescentes e com o
intervalo de 0,2 mg/mL entre elas.
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2. Adicionou-se reagente de Bradford a 100 microL de cada sobrenadante diludo e
deixar repousar temperatura ambiente.
3. Leu-se a absorvncia a 595 nm.
Quantificao da actividade da alfa amilase nos diferentes grupos
de sementes
1. Marcar os tubos de acordo com a seguinte tabela:
Tubos TratamentoVolume
extracto (mL)
Volume
amido (mL)
Tempo de
reaco (min)
1Controlo com
embrio0,5 1 2
2Controlo sem
embrio0,5 1 4
3 GA 0,5 1 1
4 GA+Ca2+ 0,5 1 2
5 ABA+GA 0,5 1 3
6 Ciclohexamida+GA 0,5 1 37 Controlo T0 0,5 1 0*
8 Branco 0,5 0**Correco
A580nm
*- Adicionar HCl antes de adicionar amido
**- Adicionar 1 mL de H20 destilada em substituio do amido
2. Pipetou-se o extracto e a soluo de amido para cada tubo de ensaio. Aps o
tempo de reaco tabelado adicionou-se HCl a 1M, excepto ao tubo 9.
Adicionou-se Lugol.
3. Mediu-se a absorvncia das solues a 580nm.
4. Determinou-se a quantidade de alfa-amilase e exprimiu-se os resultados
graficamente.
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Resultados
TuboAbs. a
595nm
Concentraoproteica(g/mL)
Tempode
reaco(min)
Abs. a580nm
% de amidohidrolisado/mL/min
% de amidohidrolisado/min/g de
protena
1 0,7296 151,61 2 0,3483 28,46 0,375
2 0,5902 120,94 4 0,3226 15,03 0,248
3 0,6106 125,43 2 0,2859 32,32 0,515
4 0,5416 110,25 2 0,3773 26,67 0,484
5 0,5720 116,94 2 0,3090 30,89 0,528
6 0,5771 118,06 3 0,2672 22,32 0,378
7 - - 0 0,8086 - -
Discusso dos resultadosAps a execuo laboratorial, obtivemos os resultados anteriores. Porm,
confrontados com os esperados, estes resultados so ligeiramente diferentes, quer em
termos de % de amido hidrolisado/min/g de protena (apesar de estarem
relativamente proporcionais) quer no tubo 5, onde seria de esperar uma menor
actividade, devido presena do cido abscsico. Isto pode dever-se ao facto
de____(?).
No tubo 7, foi adicionado HCl antes do amido para que no ocorresse actividade
enzimtica e desta forma, o tubo servisse como controlo.
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No tubo 8, foi adicionada H2O em vez de amido para que no haja substrato para
hidrolisar, apesar de haver -amilase presente, servindo este tubo para fazer o branco
(zero) na realizao da espectrofotometria.
No tubo 1, a percentagem de amido hidrolisado revela que ocorreu a actividade normal
da -amilase pois este tratamento s continha a parte da semente com embrio.
No tubo 2, a percentagem de amido hidrolisado foi menor, alis, a menor de todos os
tratamentos, como seria de esperar, pois continha a parte da semente sem embrio. A
pequena percentagem deve-se ao facto da semente j ter no seu interior alguma
quantidade de
-amilase, que acabou por hidrolisar algum amido.No tudo 3, a actividade da -amilase foi das maiores, pois adicionamos GA, alm do
que j existia na semente. Desta forma comprovamos a nossa hiptese de como este
aumenta a actividade da enzima, hidrolisando maiores quantidades de amido,
induzindo desta forma o crescimento da semente.
No tudo 4, a actividade enzimtica deveria ter sido muito semelhante do tudo 3
porm isso no se verificou. Neste tubo adicionamos GA e Ca2+, activador da -
amilase. Por os resultados serem menores que os esperados podemos assumir ou
houveram erros na execuo do trabalho ou o tempo de reaco e a quantidade de io
clcio foram insuficientes. (???)
No tudo 5, a percentagem de amido hidrolisado foi maior relativamente ao tudo 3, o
que no seria de esperar. Era de esperar menor actividade da enzima pois foi
adicionado, alm de GA que produziria os mesmos efeitos que anteriormente, ABA
que provoca a inibio da -amilase, fazendo diminuir a sua actividade.
No tubo 6, em que existe a presena de cicloheximida, inibidora da sntese proteica e
consequentemente, da enzima -amilase, os resultados foram os esperados dado que
a percentagem de amido hidrolisado foi menor. No poderia ser menor que a do tubo 2
porque nesse no existia qualquer fito-hormona, ao passo que neste adicionamos na
mesma GA, levando a que existisse ainda uma pequena quantidade de -amilase.
Bibliografia
http://www.plantphysiol.org/content/80/2/350.full.pdfhttp://www.plantphysiol.org/content/91/1/415.full.pdf
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http://www.jbc.org/content/264/32/19392.full.pdfhttp://www.nature.com/nchembio/journal/v6/n3/full/nchembio.304.htmlhttp://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c4859?lang=pt®ion=PT
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