alfa-amilase — fisiologia vegetal

7/31/2019 Alfa-amilase Fisiologia Vegetal

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Sntese e actividade da

- amilaseEfeito do cido giberlico, do cidoabscsico e do clcio em sementes de

Hordeum vulgare L.

Fisiologia Vegetal

Joo Rodrigues, Liliana Raeiro, Maria Pires

Faculdade de Cincias da Universidade do Porto

Licenciatura em Bioqumica

Ano lectivo 2011/2012


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IntroduoA -amilase uma enzima induzida pelo embrio das sementes, sendo responsvel

pela hidrolisao das suas reservas, no endosperma, nomeadamente o amido.

O cido giberlico (GA), que produzido no embrio das sementes, aps estas

passarem por um perodo de embebio em gua, transportado at aleurona e

escutelo, onde induz a sntese da -amilase, entre outras hidrolases.Na presena do GA, os nveis de mRNA total que codificam a -amilase aumentam, o

que revela uma correlao entre a produo de GA e produo de -amilase.

O cido abcsico (ABA) uma fito-hormona que, quando presente no embrio induz a

produo de um inibidor da -amilase, constituindo assim um regulador da taxa de

crescimento. Alm disso, induz a sntese de inibidores de protase bacteriolgica,

constituindo o sistema de defesa do embrio.

A -amilase uma metaloenzima que contm Ca2+. A ligao de um catio Ca2+

enzima um processo irreversvel e necessrio para manter tanto a actividade como

a estabilidade desta.

A cicloheximida um inibidor da sntese proteica que actua ao nvel da transcrio do

DNA de clulas eucariticas. A presena deste composto nas sementes inibe a

sntese da -amilase, inibindo o crescimento celular do embrio.

Assim, a realizao desta experincia tem como objectivo a verificao do papel do

GA na sntese da -amilase e a aco do GA, do ABA e do Ca2+ nos nveis de

actividade da dita enzima e consequentemente, no desenvolvimento embrionrio da

semente.


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Materiais e Mtodos

Preparao e tratamento das sementes

1. Procedeu-se desinfeco de 250 sementes de cevada com lixvia a 10%,

seguindo-se de lavagens sucessivas com gua destilada. Manteve-se as sementes em

papel de filtro humedecido, em obscuridade, durante 24h, temperatura de 4C.

2. Seccionou-se transversalmente as sementes e separou-se as suas metade com e

sem embrio.

3. Numeraram-se placas de Petri de 1 a 6, fazendo duplicados, e pipetou-se 5 mL das

seguintes solues, respectivamente:

placas 1 e 2: tampo HEPES 0,01 M, pH 6;

placa 3: GA 10-6 M em tampo HEPES;

placa 4: GA 10-6 M + CaCl2 10 mM em tampo HEPES;

placa 5: GA 10-6 M + 1 M em tampo HEPES;

placa 6: GA 10-6 M + cicloheximida em tampo HEPES;

4. Colocaram-se em cada uma dessas placas 15 metades de sementes. Na placa 1

colocaram-se as metades com embrio e nas restantes as sem embrio.

5. Vedou-se as placas com parafilme e incubou-se na obscuridade durante 48h.

6. Procedeu-se ao congelamento das amostras at data da extraco.

Preparao dos extractos para a quantificao de protenas

1.Em gelo, homogenizou-se as sementes em tampo de cido ctrico-citrato de sdio

10mM, pH 5.

2.Transferiu-se e centrifugou-se o extracto a 5000rpm, no frio.

3.Conservou-se o sobrenadante em gelo.

Quantificao de protenas pelo mtodo de Bradford

1.Preparou-se 6 solues de albumina com concentraes crescentes e com o

intervalo de 0,2 mg/mL entre elas.


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2. Adicionou-se reagente de Bradford a 100 microL de cada sobrenadante diludo e

deixar repousar temperatura ambiente.

3. Leu-se a absorvncia a 595 nm.

Quantificao da actividade da alfa amilase nos diferentes grupos

de sementes

1. Marcar os tubos de acordo com a seguinte tabela:

Tubos TratamentoVolume

extracto (mL)

Volume

amido (mL)

Tempo de

reaco (min)

1Controlo com

embrio0,5 1 2

2Controlo sem

embrio0,5 1 4

3 GA 0,5 1 1

4 GA+Ca2+ 0,5 1 2

5 ABA+GA 0,5 1 3

6 Ciclohexamida+GA 0,5 1 37 Controlo T0 0,5 1 0*

8 Branco 0,5 0**Correco

A580nm

*- Adicionar HCl antes de adicionar amido

**- Adicionar 1 mL de H20 destilada em substituio do amido

2. Pipetou-se o extracto e a soluo de amido para cada tubo de ensaio. Aps o

tempo de reaco tabelado adicionou-se HCl a 1M, excepto ao tubo 9.

Adicionou-se Lugol.

3. Mediu-se a absorvncia das solues a 580nm.

4. Determinou-se a quantidade de alfa-amilase e exprimiu-se os resultados

graficamente.


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Resultados

TuboAbs. a

595nm

Concentraoproteica(g/mL)

Tempode

reaco(min)

Abs. a580nm

% de amidohidrolisado/mL/min

% de amidohidrolisado/min/g de

protena

1 0,7296 151,61 2 0,3483 28,46 0,375

2 0,5902 120,94 4 0,3226 15,03 0,248

3 0,6106 125,43 2 0,2859 32,32 0,515

4 0,5416 110,25 2 0,3773 26,67 0,484

5 0,5720 116,94 2 0,3090 30,89 0,528

6 0,5771 118,06 3 0,2672 22,32 0,378

7 - - 0 0,8086 - -

Discusso dos resultadosAps a execuo laboratorial, obtivemos os resultados anteriores. Porm,

confrontados com os esperados, estes resultados so ligeiramente diferentes, quer em

termos de % de amido hidrolisado/min/g de protena (apesar de estarem

relativamente proporcionais) quer no tubo 5, onde seria de esperar uma menor

actividade, devido presena do cido abscsico. Isto pode dever-se ao facto

de____(?).

No tubo 7, foi adicionado HCl antes do amido para que no ocorresse actividade

enzimtica e desta forma, o tubo servisse como controlo.


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No tubo 8, foi adicionada H2O em vez de amido para que no haja substrato para

hidrolisar, apesar de haver -amilase presente, servindo este tubo para fazer o branco

(zero) na realizao da espectrofotometria.

No tubo 1, a percentagem de amido hidrolisado revela que ocorreu a actividade normal

da -amilase pois este tratamento s continha a parte da semente com embrio.

No tubo 2, a percentagem de amido hidrolisado foi menor, alis, a menor de todos os

tratamentos, como seria de esperar, pois continha a parte da semente sem embrio. A

pequena percentagem deve-se ao facto da semente j ter no seu interior alguma

quantidade de

-amilase, que acabou por hidrolisar algum amido.No tudo 3, a actividade da -amilase foi das maiores, pois adicionamos GA, alm do

que j existia na semente. Desta forma comprovamos a nossa hiptese de como este

aumenta a actividade da enzima, hidrolisando maiores quantidades de amido,

induzindo desta forma o crescimento da semente.

No tudo 4, a actividade enzimtica deveria ter sido muito semelhante do tudo 3

porm isso no se verificou. Neste tubo adicionamos GA e Ca2+, activador da -

amilase. Por os resultados serem menores que os esperados podemos assumir ou

houveram erros na execuo do trabalho ou o tempo de reaco e a quantidade de io

clcio foram insuficientes. (???)

No tudo 5, a percentagem de amido hidrolisado foi maior relativamente ao tudo 3, o

que no seria de esperar. Era de esperar menor actividade da enzima pois foi

adicionado, alm de GA que produziria os mesmos efeitos que anteriormente, ABA

que provoca a inibio da -amilase, fazendo diminuir a sua actividade.

No tubo 6, em que existe a presena de cicloheximida, inibidora da sntese proteica e

consequentemente, da enzima -amilase, os resultados foram os esperados dado que

a percentagem de amido hidrolisado foi menor. No poderia ser menor que a do tubo 2

porque nesse no existia qualquer fito-hormona, ao passo que neste adicionamos na

mesma GA, levando a que existisse ainda uma pequena quantidade de -amilase.

Bibliografia

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