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Agradecimentos
Gostaria de agradecer a todas as pessoas que me ajudaram ao longo do meu percurso
académico, especialmente à minha família e aos meus amigos.
Gostaria de agradecer também a toda a equipa da Alfama por todo o apoio, amizade e
ajuda no laboratório.
Um agradecimento especial aos meus orientadores de estágio, ao Professor Carlos Romão
pela orientação científica, ao Professor Carlos Afonso pela disponibilidade e orientação científica
e à Dra. Marta Norton de Matos pela orientação científica e laboratorial.
Gostaria de agradecer também à professora Margarida Salema pelo apoio e orientação
académica.
Obrigada a todos.
3
Resumo
O monóxido de carbono é uma molécula que até há pouco tempo atrás se pensava ser
tóxica e nociva. No entanto, há cerca de 60 anos descobriu-se que esta molécula é produzida
endogenamente em pequenas quantidades sob certas condições patofisiológicas. Desde então
foram efectuados estudos que provaram que o CO era uma molécula com efeitos benéficos e
encorajaram o seu uso como fármaco.
Esta molécula tem a limitação de não poder ser administrada como gás. Como alternativa
tem-se assistido ao desenvolvimento de moléculas que incorporem o CO e o libertem em
condições fisiológicas. Estas moléculas designam-se por CORM’s.
Os aldeídos terciários constituem uma classe de CORM´s em se verifica a libertação de
CO. Neste trabalho vão ser desenvolvidos alguns tipos de aldeídos terciários e irá estudar-se o
seu comportamento em situações análogas aos meios biológicos.
Também foram desenvolvidas pró-drogas de aldeídos para evitar que as interacções do
aldeído com componentes biológicos e/ou a sua rápida metabolização, impedissem a libertação
de CO.
Palavras-chave: Monóxido de carbono, aldeídos terciários, pró-drogas, radicais.
4
Abstract
Carbon Monoxide has always been known as a toxic and noxious molecule. However,
about 60 years ago, it was found that this molecule was produced endogenously in small
quantities, under certain pathological conditions. Since then, many investigations have proved its
beneficial effects and these findings encourage its use as a drug.
Because CO administration as a gas has many limitations, the development of compounds
that incorporate and release CO under physiological conditions has started. These molecules are
known as CO releasing molecules (CORM’s).
Tertiary aldehydes are a class of CORM’s that release CO. In this work several types of
tertiary aldehydes were prepared and tested as CO releasing molecules. Its stability and reactivity
in biological media was also investigated.
Aldehydes can react with some biomolecules and are rapidly metabolized in biological
systems. Therefore, several types of prodrugs were developed to prevent its inactivation as
CORM´s.
Keywords: Carbon Monoxide, tertiary aldehydes, Prodrugs, radicals.
5
Índice Agradecimentos............................................................................................................................................................ 2
Resumo.......................................................................................................................................................................... 3
Abstract......................................................................................................................................................................... 4
Índice............................................................................................................................................................................. 5
Listas de símbolos e de abreviaturas .......................................................................................................................... 6
Índice de Figuras.......................................................................................................................................................... 7
Índice de Gráficos ........................................................................................................................................................ 8
1. Introdução........................................................................................................................................................... 9 1.1 Efeitos biológicos do CO ............................................................................................................................ 9 1.2 Aldeídos como CORM’s............................................................................................................................ 12 1.3 Moléculas para Pró-drogas ...................................................................................................................... 16
2. Parte Experimental .......................................................................................................................................... 20 2.1 Sínteses...................................................................................................................................................... 20
2.1.1 Aldeídos ............................................................................................................................................... 21 2.1.2 Pró-drogas ............................................................................................................................................ 28
2.2 Medição da libertação de CO................................................................................................................... 36 2.3 Estudos de Interacção de Pivaldeído com Aminoácidos........................................................................... 37
3. Resultados ......................................................................................................................................................... 38 3.1 Sínteses...................................................................................................................................................... 38
3.1.1 Aldeídos ............................................................................................................................................... 38 3.1.2 Pró-drogas ............................................................................................................................................ 42
3.2 Medição da libertação de CO................................................................................................................... 45 3.2.1 Aldeídos ............................................................................................................................................... 45 3.2.2 Pró-drogas ............................................................................................................................................ 46
3.3 Estudos de Interacção de Pivaldeído com Aminoácidos........................................................................... 51
4. Anexos ............................................................................................................................................................... 55
Referências Bibliográficas ......................................................................................................................................... 56
6
Listas de símbolos e de abreviaturas
CO – monóxido de carbono; OH – Oxigenase Hémica; CORM’s – CO Releasing Molecules;
ADN – ácido desoxirribonucleico; ROS – reactive oxygen species, espécies radicalares; RPMI –
meio aquoso de cultura de tecidos desenvolvido por Moore et. al no Roswell Park Memorial
Institute; UV – Ultravioleta; IV – Infra vermelho; RMN – Ressonância Magnética Nuclear; TLC
– Thin Layer Cromatography (cromatografia em camada fina); ALIQUAT ® 336 – composto com
a seguinte formula química CH3N+[(CH2)7CH3]3Cl-.
7
Índice de Figuras
Figura 1:Esquema da degradação do Hemo catalizada pela Oxigenase Hémica....................................................... 10 Figura 2: Acroleína e crotonaldeído. .......................................................................................................................... 12 Figura 3: Mecanismo de formação de hidrato a partir de aldeído.............................................................................. 13 Figura 4: Mecanismo de formação de Hemiacetais e acetais por catálise ácida12. .................................................... 13 Figura 5: Mecanismo de reacção de aldeídos com aminas12, . .................................................................................... 13 Figura 6: Reacção de Tióis com Aldeídos. .................................................................................................................. 14 Figura 7: Decarbonilação de aldeídos em meio ácido15, . ........................................................................................... 14 Figura 8: Decarbonilação de aldeídos em meio básico. ............................................................................................. 14 Figura 9: Decarbonilação de aldeídos usando catalisador organometálico. ............................................................. 15 Figura 10: Estabilização de radicais por hiperconjugação. ....................................................................................... 15 Figura 11: Estabilização de radicais por ressonância. ............................................................................................... 15 Figura 12: Esquema geral de síntese de pró-drogas cíclicas. ..................................................................................... 16 Figura 13: estrutura geral de tiazolidinas. .................................................................................................................. 16 Figura 14: Hidrólise do anel de tiazolidina................................................................................................................. 17 Figura 15: Hidrólise do anel de oxazolidina. .............................................................................................................. 18 Figura 16: Hidrólise do anel de Imidazolidin-4-onas. ................................................................................................ 18 Figura 19: Esquema de reacção de síntese de 1-Metil ciclo-hexanocarbaldeído, usando a base t-BuOK. ................ 21 Figura 20: Esquema de reacção de síntese de 1-Metil ciclo-hexanocarbaldeído, usando a base NaH. ..................... 21 Figura 21: Esquema de reacção de síntese de 1-Metil ciclo-hexanocarbaldeído, usando t-BuNH2/EtMgBr. ............ 22 Figura 22: Esquema de reacção de síntese de 3-(4-isopropil fenil)-2,2-dimetilpropanal. .......................................... 23 Figura 23: Esquema da reacção de síntese de 2,2-dimetil-3-(4-metil-fenil)propanal................................................. 24 Figura 24: Esquema de reacção de síntese de 2,2-dimetil-3-fenilpropanal ................................................................ 25 Figura 25: Esquema de reacção de síntese de 3-hidroxi-2,2-dimetilpropionaldeído.................................................. 26 Figura 26: Esquema de reacção de síntese de Ácido 4-(2,2-Dimetil-3-oxo-propil)-benzenosulfónico ....................... 26 Figura 27: Esquema de reacção de síntese de 4-Etil-4-formil-hexanoato de metilo ................................................... 27 Figura 28: Esquema da reacção de síntese de Ácido 2-tert-butil-1,3-tiazolidina-4-carboxílico................................. 28 Figura 29: Esquema da reacção de síntese de 2-tert-Butil-tiazolidina ....................................................................... 28 Figura 30: Esquema da reacção de síntese de Ácido 2-tert-butil-1,3-tiazinano-4-carboxilico................................... 29 Figura 31: Esquema da reacção de síntese de 2-tert-butil-2,3-dihidro-1,3-benzotiazole ........................................... 30 Figura 32: Esquema da reacção de síntese de Ácido 2-tert-butil-5,5-dimetil-1,3-tiazolidina-4-carboxilico .............. 30 Figura 33: Esquema da reacção de Síntese de 2-tert-butil-1,4-dihidro-2H-3,1-benzoxazina ..................................... 31 Figura 34: Esquema da reacção de síntese de 2-tert-butil-3,4-dimetil-5-fenil-1,3-oxazolidina.................................. 32 Figura 35: Esquema da reacção de síntese de 2-tert-Butil-oxazolidina-4-carboxilato de metilo ............................... 32 Figura 36: Esquema da reacção de síntese de 1-(2-tert-butil-imidazolidin-5-ona) acetato de sódio ......................... 33 Figura 37: Esquema de reacção de síntese de 2-tert-butil-6-oxohexahidropirimidina-4-carboxilato de potássio. .... 34 Figura 38: Esquema da reacção de Síntese de 2-tert-butil-5-fenil-1,3-dioxolan-4-ona .............................................. 35 Figura 39: Esquema da reacção de síntese de 2-tert-butil-5-metil-1,3-dioxolan-4-ona ............................................. 36 Figura 40: Mecanismo geral de síntese de aldeídos terciários. .................................................................................. 38 Figura 41: Esquema da reacção de substituição nucleófila pelo ciclohexanocarbaldeido. ........................................ 39 Figura 42: Reacção de auto condensação do ciclohexanocarbaldeído....................................................................... 39 Figura 43: Formação do anião do isobutiraldeído e possíveis reacções como nucleófilo.......................................... 39 Figura 44: Reacção de auto-condensação do isobutiraldeído41.................................................................................. 40 Figura 45: Mecanismo geral de síntese de 2,2-dimetil-3-fenilpropanaldeidos. .......................................................... 40 Figura 46: Mecanismo de reacção de síntese de 3-hidroxi-2,2-dimetilpropionaldeído .............................................. 41 Figura 47: Mecanismo de reacção de clorosulfonação prevista mas que não resultou. ............................................. 41 Figura 48: Mecanismo de reacção de síntese de 4-Etil-4-formil-hexanoato de metilo que não resultou.................... 42 Figura 49: Mecanismo da reacção de polimerização de acrilato de metilo................................................................ 42 Figura 50: Mecanismo geral da reacção de formação de moléculas com sistemas de anéis com S, N....................... 42 Figura 51: Mecanismo da reacção de síntese de sistemas de anéis com N, O. ........................................................... 43 Figura 52: Mecanismo geral da reacção de formação de moléculas com sistemas de anéis com N, N. ..................... 44 Figura 53: Mecanismo geral da reacção de formação de moléculas com sistemas de anéis com O, O. .................... 45 Figura 54: Ácido 2-tert-butil-1,3-tiazolidina-4-carboxílico e ..................................................................................... 47 Figura 55: Mecanismo de abertura do anel de 2-tert-Butil-tiazolidina....................................................................... 47 Figura 56: Ácido 2-tert-butil-1,3-tiazinano-4-carboxilico .......................................................................................... 48
8
Figura 57: 2-tert-butil-1,3-tiazolidin-4-carboxilato de metilo .................................................................................... 48 Figura 58: Estabilização do anel por ressonância do anel aromático. ....................................................................... 48 Figura 59: Estabilização do anel por pontes de hidrogénio........................................................................................ 49 Figura 60: Anel de tiazolidina não estabilizado, ......................................................................................................... 49 Figura 61: 2-tert-Butil-oxazolidina-4-carboxilato de metilo....................................................................................... 50 Figura 62: L-Arginina ................................................................................................................................................. 51 Figura 63: L-Lisina...................................................................................................................................................... 52 Figura 64: L-Cisteína .................................................................................................................................................. 53 Figura 65: L-Alanina ................................................................................................................................................... 54
Índice de Gráficos Gráfico 1: Perfil de libertação de CO de aldeídos ...................................................................................................... 45 Gráfico 2: Cinética de libertação de CO dos vários compostos cíclicos..................................................................... 46 Gráfico 3: Perfil de libertação de CO de 2-tert-Butil-oxazolidina-4-carboxilato de metilo ....................................... 50 Gráfico 4: Interacção de Pivaldeído com L-Arginina ................................................................................................. 51 Gráfico 5: Interacção de Pivaldeído com L-Lisina...................................................................................................... 52 Gráfico 6: Interacção de Pivaldeído com L-Cisteína .................................................................................................. 53 Gráfico 7: Interacção de Pivaldeído com L-Alanina................................................................................................... 54 Gráfico 8: Relação linear entre a área obtida e o volume de CO em cada frasco. ..................................................... 55
9
1. Introdução
1.1 Efeitos biológicos do CO
Acredita-se que esta molécula teve um papel importante na criação de vida
nomeadamente na formação de aminoácidos e ácidos nucleícos, em conjunto com azoto e
oxigénio. Descoberto no séc. XVIII, o monóxido de carbono é conhecido como sendo um gás
incolor, inodoro, sem sabor, não corrosivo e no entanto tóxico e poluente. É originado pela
combustão de matéria orgânica - madeira, carvão e gás natural. Este gás tem uma afinidade pela
hemoglobina 245 vezes maior que o O2, e a morte por envenenamento de CO ocorre com
percentagem de CO-Hb entre 50% a 80%. A partir de 20% de CO-Hb começam a aparecer os
primeiros sintomas de intoxicação – tonturas, dores de cabeça e dificuldade em respirar. O
antídoto para este envenenamento é o próprio O2 e a remoção da fonte de CO. Para além de se
ligar à hemoglobina o CO também inibe a actividade do Citocromo P450 e Citocromo C oxidase
e estimula a peroxidação de lípidos.1,2
No entanto, no início dos anos 50, Sjöstrand provou experimentalmente que o CO era
produzido em pequenas quantidades, endogenamente. Esta produção de CO era activada sob
certas condições patofisiológicas, através da decomposição de hemoglobina.
Esta decomposição é mediada pela enzima Oxigenase Hémica (OH), a qual existe em três
isoformas: OH-1, induzida em situações de stress em todos os tecidos, OH-2, constitutiva e
presente nos sistemas vascular e nervoso, e OH-3, constitutiva mas não tão conhecida como as
outras duas. Pensa-se que esta última não tem actividade catalítica e que funciona a nível de
detecção de oxigénio.3
A decomposição de hemoglobina catalizada por OH origina por cada mole de CO
formado uma mole de ião ferroso (Fe2+) e uma mole duma molécula constituída por 4 anéis de
pirrole.
Num primeiro passo a decomposição da hemoglobina envolve também a acção de
NADPH, O2 e Citocromo P450 reductase para originar Biliverdina-IXα. Num 2º passo, através da
acção de Biliverdina reductase existente no retículo endoplasmático, ocorre a redução da
Biliverdina-IXα para originar Bilirrubina-IXα:
10
Hemo - (Ferroprotoporfirina IX)
N N
NNFe
CH3
CH2
CH3 CH3
CH3
CH2
O O- O
O-
NH
N
NH
NH
CH3CH2
CH3 CH3
CH3
CH2
O OH OOH
O O
NH
NH
NH
NH
CH3CH2
CH3 CH3
CH3
CH2
O OH OOH
O O
NADPH, 3 O2
Oxigenase Hémica
NADPH, H+
Bilibverdina reductase
+CO, NADP+, 3 H2O, Fe2+
Biliverdina-IXαBilirrubina-IXα
Figura 1:Esquema da degradação do Hemo catalizada pela Oxigenase Hémica
Estas duas moléculas, devido aos anéis pirrole e à sua conjugação de duplas ligações, são
consideradas os antioxidantes endógenos mais poderosos, inibindo a peroxidação de lípidos e
capturando radicais peróxido. O ião Fe2+ libertado, sendo um oxidante, estimula a síntese de
Ferritina, uma proteína de armazenamento de ferro que o mantém sob forma solúvel e não
tóxica,4 actuando assim como antioxidante.
Esta degradação do hemo constitui a fonte de cerca de 86% do CO gerado pelo corpo
humano, sendo os restantes 14% atribuídos à peroxidação de lípidos, foto-oxidação, fontes
xenobióticas, e bactérias.5 A produção de CO, em condições normais, é cerca de 1 - 6 µmol Kg-1
dia-1. No entanto, em condições de desregulação homeostática, como doenças hemolíticas, asma,
fibrose cística e diabetes, a isoforma inductível da oxigenase hémica (OH-1) é sobre-expressa
levando ao aumento significativo da concentração de CO, sendo esta uma forma do corpo reagir
contra as agressões.6
De facto, foi observado em vários modelos de doenças como a hipertensão pulmonar e
sistémica, a rejeição de transplante cardíaco, renal e intestino delgado, a preservação de órgãos
para transplante, entre outros, que a indução de OH-1 tem bons resultados. Tendo em conta estes
resultados tornou-se então oportuno desenvolver um modo de distribuir CO no organismo de
forma controlada. A via gasosa apresenta dificuldades pois por inalação o CO iria complexar à
hemoglobina gerando os problemas de toxicidade já referidos e impossibilitando a distribuição do
gás nos alvos celulares.
11
Contrariamente ao seu análogo e muito estudado óxido nítrico (NO), o CO é uma
molécula extremamente estável.
Tal como o CO, o NO começou por ser considerado um gás nocivo e poluente, até se
descobrir que tinha propriedades benéficas em várias situações como a regulação de pressão
sanguínea em mamíferos e controlo de processos celulares que ocorrem nos sistemas
cardiovascular, imunitário e nervoso. O óxido nítrico é também gerado endogenamente através da
conversão de L-arginina em L-citrulina, catalisada pelas enzimas Oxido Nítrico Sintase (NOS).
No entanto, níveis de NO muito elevados podem levar ao desenvolvimento de doenças. Um
aspecto químico interessante deste gás é que em sistemas biológicos pode ser convertido por
redução ou oxidação a NO – ou NO+ e curiosamente o ião NO+ é isoelectrónico com o CO.
Devido à reactividade do NO e dos seus percursores nitrito e nitrato a síntese de moléculas
libertadoras de NO não apresenta dificuldades.
No entanto encontrar moléculas libertadoras de CO constitui um desafio. De facto o CO é
uma molécula inerte que não reage com substratos de modo reversível e rápido. A sua
incorporação em substratos envolve ligações fortes que em meio biológico é difícil quebrar para
libertar CO. Mas, uma vez que esta molécula apresenta acentuados efeitos benéficos, tornou-se
necessário a investigação e desenvolvimento de CORM’s (CO releasing molecules) moléculas
libertadoras de CO.
Conhecem-se já algumas moléculas libertadoras de CO in vivo, As moléculas mais
evidentes para este fim são os complexos organometálicos com ligandos carbonilo, havendo já
patentes que reclamam o uso destes compostos para libertação de CO.7,8 Um outro exemplo é o
diclorometano que in vivo é metabolizado a CO, estando o seu uso para este objectivo também
patenteado.9
12
1.2 Aldeídos como CORM’s
Os aldeídos são compostos orgânicos com um grupo carbonilo terminal e pelo menos um
protão ligado a este grupo. Este hidrogénio aumenta a reactividade do grupo carbonilo, o carbono
adquire uma carga parcial positiva levando ao aumento da densidade electrónica no átomo de
oxigénio. Devido a esta diferença de densidade electrónica estes compostos são susceptíveis a
ataque por nucleófilos.
Os aldeídos são moléculas vulgares na natureza, com diversas funções e actividades.
Podem ser encontrados no corpo humano em vários órgãos, plantas, sementes, frutas e
microrganismos. São responsáveis pela transmissão de sinais no reino animal, protecção de
plantas contra bactérias e fungos, conservação, sabor e aromas de alimentos.10
Podem ser produzidos endogenamente, sendo produtos de peroxidação de lípidos e de
oxidação de ADN, glicólise, metabolitos de neurotransmissores, e produtos enzimáticos.
No entanto, certos aldeídos podem ser considerados tóxicos e poluentes, sendo produzidos
por combustão de matéria orgânica.
O comportamento dos aldeídos pode variar muito dependendo dos grupos adjacentes ao
carbonilo: no caso dos aldeídos saturados a sua reactividade está ligada apenas ao grupo
carbonilo, enquanto que os aldeídos α,β- insaturados são mais reactivos podendo facilmente
reagir com proteínas, lípidos e aminoácidos através de reacção de adição de Michael. Devido à
presença de dois centros reactivos (carbonilo e dupla ligação), estes aldeídos podem ser tóxicos,
por exemplo a acroleína e crotonaldeído.11
O
H
O
H
Figura 2: Acroleína e crotonaldeído.
Em sistemas biológicos, o grupo carbonilo de aldeídos pode sofrer várias reacções.
Em solução aquosa estes compostos encontram-se parcialmente hidratados, dependendo a
fracção de hidrato do tamanho da cadeia alquilo. A hidratação influencia também a reactividade
dos aldeídos. Em certas reacções são mais reactivas as formas hidratadas, por exemplo na
formação de ligações cruzadas entre proteínas, noutras situações a forma livre é mais reactiva.11
13
RO
HR
O-
H
OH2+OH2
R
OH
H
OH
-H+
+H+
Hidrato Figura 3: Mecanismo de formação de hidrato a partir de aldeído.12
Com álcoois a reacção é semelhante à da água, formando-se hemiacetais e acetais. Esta
reacção ocorre sob catálise ácida e é reversível com hidrólise ácida. Aldeídos pequenos e não
ramificados são mais susceptíveis a esta adição, no entanto aldeídos grandes precisam de
remoção de água para deslocar o equilíbrio para formação de acetal. Os acetais não são atacados
por bases, sendo por isso usados na protecção química de aldeídos.
RO
H
R1 O+
H
HR
OH
H
OH+R1
Hemiacetal
R
OH
H
OR1
OHR1RO+
H
H
OHR1R1 OH2
+
R
OH2+
H
OR1 R
O+
H
R1
OHR2R
OH +
H
OR1
R2
R
O
H
OR1
R2
Acetal
OHR2
Figura 4: Mecanismo de formação de Hemiacetais e acetais por catálise ácida.12
A adição de aminas a aldeídos pode originar produtos diferentes, dependendo da
substituição das aminas. Aminas primárias formam iminas e aminoalcoóis e aminas secundárias
formam hemiaminais, ou enaminas. Estas reacções são catalisadas por ácidos.
RO
HR
O-
H
NH2+
R1NH2 R1
R
OH
H
NHR1
-H+
+H+
H+
R
OH2+
H
NHR1 R
HNH+
R1 R
HN
R1
NH2 R2
NHR2
R
H NHR1
AminoálccolImina
Aminal
-H+
Figura 5: Mecanismo de reacção de aldeídos com aminas.12, 13
14
Na reacção de tióis com aldeídos, catalisada por ácidos de Lewis (TiCl4, SiCl4, etc.) pode-
se obter hemimercaptais ou ditioacetais. Os hemimercaptais são geralmente instáveis e não se
conseguem isolar. Pelo contrário, os tioacetais são bastante estáveis. Da mesma forma que os
álcoois, os tióis são usados como grupo protector, mas para a sua desprotecção a hidrólise ácida
não basta, necessitando de outros reagentes para serem desprotegidos, HgCl2, H2O2-HCl, etc..14
RO
H SH R1
R
OH
H
SR1
SR2
R
H SR1
ácido de Lewis
SH R2
Hemimercaptal Tioacetal Figura 6: Reacção de Tióis com Aldeídos.
A decarbonilação15 é um outro tipo de reacção dos aldeídos que consiste na perda do
grupo carbonilo do aldeído. Esta pode ocorrer sob várias formas:
Em meio ácido, a espécie atacante é o H+, havendo saída do ião HCO+, que ao perder um
protão forma CO, ou combinando com OH – duma base ou de água pode formar ácido fórmico. O
H + HBCH+
O
HH + B- + O+H
-H+
CO
OB
H
B-
Figura 7: Decarbonilação de aldeídos em meio ácido.15, 16
Em meio básico também ocorre a decarbonilação de aldeídos aromáticos:
O
HX
X+ OH
- OH
HX
X
O-
OH -
O-
HX
X
O-
+ OH2C
-
X
X
HCOO-
OH2
X
X+ OH -
Figura 8: Decarbonilação de aldeídos em meio básico.17
A decarbonilação de aldeídos alifáticos e aromáticos também pode ocorrer mediada por
catalisadores organometálicos de ródio ou paládio.
15
RO
H
Ph3P
Rh+
PPh3
PPh3
Cl PPh3
Rh- PPh3Cl
O
RHH R +
Ph3P
RhPPh3
ClCO
Figura 9: Decarbonilação de aldeídos usando catalisador organometálico.
Os aldeídos alifáticos são também decarbonilados por processos radicalares usando como
iniciadores radicalares: o calor ou a luz. A decarbonilação mediada por calor requer temperaturas
elevadas, acima de 500ºC, impraticável para libertação de CO in vivo.
Radicais são espécies caracterizadas por terem pelo menos um electrão desemparelhado
que pode estar localizado num carbono ou em outros átomos. São espécies muito reactivas e com
um tempo de vida relativamente pequeno. O seu tempo de vida depende da estabilização do
radical que pode ser efectuada de dois modos: por hiperconjugação ou ressonância.18
Hiperconjugação corresponde à estabilização do radical pela interacção de electrões
duma ligação σ (C-H ou C-C) com uma orbital p/π vazia ou parcialmente vazia. Quanto mais
substituído for o carbono onde se situa o radical maior a hiperconjugação e maior a estabilidade
do radical.
C
H
R
H H
H
R
H H
HR
H
HHH
H Figura 10: Estabilização de radicais por hiperconjugação.
A estabilização de radicais também aumenta por ressonância De facto os radicais alílicos
e benzílicos são muito estáveis. A estabilidade por ressonância é também aumentada pela
planaridade da espécie radicalar, uma vez que há um máximo de ressonância nesta forma. CH2 CH
CH CH
CH2
CH2
Figura 11: Estabilização de radicais por ressonância.
16
1.3 Moléculas para Pró-drogas
Os aldeídos podem ser afectados em meio biológico por interacção com diversas
moléculas. Então colocou-se a hipótese de protecção reversível de aldeídos com várias
substâncias.10
Pró-drogas são compostos biologicamente inactivos que libertam o composto activo
quando metabolizados. As pró-drogas podem ser desenhadas para aumentar a absorção, reduzir
toxicidade, diminuir a velocidade de actuação da droga ou para actuarem num local específico.19
Existem na literatura várias referências a pró-drogas aplicadas a grupos carbonilo. Estas
podem ser cíclicas ou não cíclicas, e o aldeído pode ser libertado por via química ou enzimática.
As amidas, esteres, sulfatos e fosfatos são exemplos de pró-drogas metabolizadas por via
enzimática. Estas libertam o composto activo através da acção de esterases, amidases, sulfatases e
fosfatases,20 respectivamente.
Neste trabalho vai ser dada mais importância às pró-drogas metabolizadas por via
química. Exemplos de pró-drogas deste tipo resultam da conjugação de aldeídos com moléculas
bifuncionalizadas formando compostos cíclicos:
X Y
RH
HXYH + R
H
O
n
n
Figura 12: Esquema geral de síntese de pró-drogas cíclicas.
Na literatura encontram-se vários tipos de moléculas com este tipo de estrutura usadas
como pró-drogas. Por exemplo as bases de Mannich cíclicas: Tiazolidinas, Oxazolidinas e
Imidazolidin-4-onas.
Tiazolidinas são bases de Mannich cíclicas com o fragmento S-C-N.
S NH
R Figura 13: estrutura geral de tiazolidinas.
17
As tiazolidinas são preparadas pela condensação do aldeído com β-aminotióis.
A cisteína e cisteamina são exemplos de β-aminotióis que podem ser usados para esta
condensação. Estes aminotióis são agentes radioprotectores, no entanto o seu uso é limitado
devido a efeitos de toxicidade. Posto isto adoptou-se o método de pró-droga para administração
destes compostos. As tiazolidinas são hidrolisadas e libertam no organismo o aminotiol e o
aldeído (ou cetona). Na forma de tiazolidina, os efeitos laterais foram evitados mantendo a
actividade radioprotectora apesar de menos eficiente.21
A L-cisteína é também um percursor na biossíntese de glutationa, estimulando também a
sua formação. Sabe-se que a glutationa tem um efeito hepatoprotector contra alguns xenobióticos
como paracetamol. As tiazolidinas, podendo ser usadas como pró-drogas da L-cisteína, possuem
também um efeito de protecção de toxicidade ao nível do fígado. Por hidrólise do anel há
libertação do aminoácido e do aldeído.22
S NH
R
OH
O
SH N
R
OH
O
SH NH2
OH
O
RO
H+
OH2
Figura 14: Hidrólise do anel de tiazolidina.
A estrutura da tiazolidina pode ser modificada por acetilação do azoto. Esta alteração
estabiliza o anel e transforma a tiazolidina numa pró-droga dupla. Para a libertação da cisteína é
necessário ocorrer a clivagem enzimática do grupo acetilo e só depois é que há a hidrólise do
anel.
As oxazolidinas podem ser sintetizadas por condensação de β-aminoalcoóis com aldeídos
e caracterizam-se por terem um fragmento O-C-N num anel de 5 membros.
Bundgaard et al. analisou a cinética de hidrólise de pró-drogas de efedrina e aldeídos
aromáticos, tendo concluído que este tipo de moléculas são potencias pró-drogas para
aminoalcoóis e compostos com grupo carbonilo. Esta protecção do aldeído com aminoalcoóis
pode também ser vantajosa para evitar possíveis reacções laterais do aldeído, por exemplo
18
oxidação a ácido.23 A hidrólise do anel é um equilíbrio que depende do pH e a da concentração
das espécies em solução. O mecanismo proposto para a hidrólise do anel é:
O N
R
R3 R2
R1OH N
+
R
R2R3
R1 OH NH
R2
R1
R3
RO
H+OH2
OH3+
+
Figura 15: Hidrólise do anel de oxazolidina.
As tiazolidinas são mais estáveis que as oxazolidinas devido à maior nucleofilicidade e à
menor repulsão electrónica do enxofre.
Outras alternativas para pró-drogas de aldeídos são as imidazolidin-4-onas. Estas
moléculas contêm o fragmento N-C-N num anel de 5 membros e um grupo carbonilo adjacente a
um dos azotos.
Foram feitos vários estudos com vários exemplos destes compostos com o objectivo de
avaliar a sua viabilidade como pró-drogas para péptidos. Os péptidos têm vários problemas de
transporte e sofrem metabolização por enzimas. Sendo assim, este método é eficaz para tornar a
droga mais lipofílica e menos susceptível à degradação por enzimas.24,25
A velocidade de hidrólise das imidazolidin-4-onas é influenciada pelo pH, pela estrutura
do péptido e pela reactividade do aldeído ou cetona. A hidrólise destes compostos envolve um
intermediário imina que é facilmente hidrolisado libertando os percursores.26
NH N
R2
R1 O
R4
R3
NH+N
-
R2
O
R1 R4
R3 NH2 NH
O
R4
R1
R3
O
R2+NH
NH
R2
O
R1 R4
R3OH
OH2
Figura 16: Hidrólise do anel de Imidazolidin-4-onas.
Para além destes exemplos de pró-drogas existem na literatura outras moléculas que
incorporam o aldeído e que são utilizadas como auxiliares quirais. Estas moléculas não
funcionam como pró-drogas de hidrólise química por serem demasiado estáveis em condições
fisiológicas. No entanto podem ser potenciais pró-drogas enzimáticas por possuírem grupos éster
ou amida.
19
As dioxolanonas são exemplos dessas moléculas. São obtidas por condensação de
aldeídos com ácidos α-hidróxi-carboxílicos e são auxiliares quirais na alquilação destes últimos.27
Neste trabalho estas e outras moléculas vão ser usadas para síntese de pró-drogas para
aldeídos. O aldeído usado será o pivaldeído.
20
2. Parte Experimental
2.1 Sínteses
Os reagentes usados nas sínteses foram comprados ás Empresas Sigma-Aldrich ou Merck.
Em algumas sínteses foi usada linha de vácuo e linha de azoto, os solventes foram
previamente secos:28 THF, com pré-secagem com KOH e secagem com fio de sódio usando
como indicador a benzofenona, Diclorometano, com pré-secagem e secagem em CaH2, e
clorofórmio com secagem em Na2SO4. Nalgumas purificações foi usado um aparelho de
destilação Kugelrohr 230 V da Aldrich, placas preparativas de Sílica Gel GF UV254, Uniplate
Techware Z513040 da Analtech ou realizou-se cromatografia em coluna com Sílica Gel 60 da
Fluka. Por vezes a evolução da reacção foi avaliada por Cromatografia em Camada Fina (TLC)
usando-se para isso placas de sílica Merck Kieselgel 60 F254. Após eluição as placas foram
reveladas com luz ultra violeta a 254 nm, e, se necessário com soluções indicadoras, como a
solução de ácido fosfomolibdémico em etanol ou a solução de ninidrina em acetona.
Os compostos sintetizados foram caracterizados por Ressonância Magnética Nuclear,
espectroscopia de Infravermelho, Análise elementar e/ou Espectrometria de massa. Alguns
aldeídos eram voláteis e não foi possível realizar análise elementar.
Os espectros de Ressonância Magnética Nuclear foram feitos num aparelho Bruker
AvanceII 400 Ultrashield Plus ou num aparelho Bruker AMX 300 (frequência de protão de 300
MHz). As análises elementares foram efectuadas num analisador elementar CHNS Carlo Erba,
modelo EA 1108, pela Eng. Conceição Almeida no Laboratório de Análise Elementar do ITQB.
Os espectros de Infravermelho foram feitos num espectrofotómetro Unican Mattson 7000 FTIR,
usando pastilhas de KBr para os compostos sólidos e pastilhas de NaCl para os compostos
líquidos. Os espectros de massa foram feitos num espectrómetro de massa API-ION
TRAP(PO03MS) pela técnica Catarina Coelho.
21
2.1.1 Aldeídos
2.1.1.1 Tentativas de preparação 1-Metil ciclo-hexanocarbaldeído29
Foram efectuadas 3 tentativas para sintetizar este composto, sendo que de nenhuma delas
resultou o composto desejado.
2.1.1.1.1 Primeira tentativa
O +
OCH3
CH3 It-BuOK
Figura 17: Esquema de reacção de síntese de 1-Metil ciclo-hexanocarbaldeído, usando a base t-BuOK.
Num balão previamente seco foi adicionado 110 mL de CH2Cl2 seco e ciclo-
hexanocarbaldeido (5,5 mL, 0.045 mol). Esta solução foi arrefecida a 0ºC e juntou-se t-BuOK
(6.52 g, 1,3 eq.) e a mistura ficou ligeiramente castanha observando-se a formação de gás.
Deixou-se a mistura a agitar até que o sólido se dissolvesse, adicionou-se depois mais 110mL de
CH2Cl2 seco e CH3I (8.2 mL, 3 eq). Seguiu-se a reacção por TLC.
Quando não havia evidências de evolução de reacção, a mistura foi lavada com solução
saturada de NaCl, removeu-se a fase aquosa, secou-se a fase orgânica com Na2SO4 e o solvente
foi removido sob vácuo obtendo-se um óleo castanho. Este óleo foi destilado originando fracções
de óleos incolores que foram analisados por TLC e verificou-se que nenhum era o produto
desejado - 1-Metil ciclo-hexanocarbaldeído, apenas materiais de partida e alguns produtos de
decomposição.
2.1.1.1.2 Segunda tentativa
O +
OCH3
CH3 INaH
Figura 18: Esquema de reacção de síntese de 1-Metil ciclo-hexanocarbaldeído, usando a base NaH.
22
A 200 mL de THF seco foi adicionado NaH (2.03 g, 1.1 eq). A mistura foi agitada num
banho de gelo durante 20 minutos e adicionou-se ciclo-hexanocarbaldeido (5,3 mL, 0.044 mol)
agitando-se durante 10 minutos. Juntou-se lentamente CH3I (4,15 mL, 1,5 eq) e deixou-se a
solução agitar durante a noite, protegendo a solução da luz. Seguiu-se a reacção por TLC.
Lavou-se a mistura com uma solução aquosa de NaCl. Removeu-se a fase aquosa, secou-
se a fase orgânica com Na2SO4 anidro e o solvente foi removido sob vácuo para formar um óleo
amarelo. Tentou-se purificar este óleo por cromatografia em coluna (SiO2, 5% AcOEt:95%
hexano), obtendo-se duas fracções semelhantes. Após evaporação do solvente analisou-se o óleo
obtido por 1H RMN e verificou-se que se tinham muitos produtos secundários.
2.1.1.1.3 Terceira tentativa
O +
OCH3
CH3 Itert-butylamine
∆, EtMgBr
Figura 19: Esquema de reacção de síntese de 1-Metil ciclo-hexanocarbaldeído, usando t-BuNH2/EtMgBr.
Num balão previamente seco foram misturados tert-butilamina (4.3 mL, 0.04 mol) e
ciclohexanocarbaldeído (5 mL, 1 eq.) sob atmosfera inerte e à temperatura ambiente observando-
se que a reacção é isotérmica. Após uma hora a água formada foi retirada com um pipeta de
Pasteur e um excesso de carbonato de potássio anidro foi adicionado. A mistura foi filtrada e
destilada a 22ºC sob vácuo.
Num outro balão previamente seco, adicionou-se 2-metil-N-[(1E)-2-
metilpropilidene]propan-2-amina (4,28 g, 0,026 mol) a uma solução 1 M de Brometo de
Etilmagnésio em THF (26 mL) e a mistura resultante refluxada durante 14 horas num banho de
óleo a 100ºC.
A mistura foi arrefecida e adicionou-se lentamente MeI (1.64 mL, 1 eq.). A mistura
resultante foi aquecida a refluxo durante 20 horas.
À solução branca com precipitado foi adicionada 25 mL duma solução aquosa de HCl a
10% e a mistura foi refluxada durante 2 horas. Arrefeceu-se a mistura, juntou-se um excesso de
NaCl e extraiu-se a solução 5 vezes com éter dietílico. A fase orgânica foi lavada com 25 mL
23
duma solução aquosa de HCl a 5% e várias vezes com solução aquosa saturada de NaCl até que
as águas de lavagem tivessem pH=5.
Finalmente a fase orgânica foi seca com MgSO4 anidro, filtrada e o solvente removido
sob vácuo. O óleo resultante foi destilado no aparelho de Kugelrohr e obtiveram-se 2 fracções: a
primeira é um líquido amarelo que solidifica a temperatura ambiente e a segunda um óleo
amarelo, restando um crude preto no balão de destilação. Após análise de 1H RMN verificou-se
que nenhuma das fracções continha o produto desejado - 1-Metil ciclo-hexanocarbaldeído.
2.1.1.2 Tentativa de preparação 3-(4-isopropil fenil)-2,2-dimetilpropanal30, 31, 32
H
O
ClH
O
+Aliquat, KOH
água, tolueno
Figura 20: Esquema de reacção de síntese de 3-(4-isopropil fenil)-2,2-dimetilpropanal.
Uma solução de KOH (5.05 g, 0.077 mol) e 2.55 g ALIQUAT 336 foi agitada em 15 mL
de água e 20 mL de tolueno e aquecida até à ebulição. A esta mistura juntou-se lentamente
cloreto de 4-isopropil benzilo (5 g, 0.029 mol) e isobutiraldeído (3,1 mL, 0.033 mol). Após 18
horas de agitação e refluxo a solução foi arrefecida à temperatura ambiente e diluída com 30 mL
de água. A fase orgânica foi removida e a fase aquosa extraída com éter dietílico. As fases
orgânicas foram lavadas, secas com Na2SO4 anidro e concentradas sob vácuo para formar um
óleo laranja.
Após destilação por coluna de fraccionamento a 140ºC o crude laranja originou 2 fracções
de um óleo cor de laranja que por 1H RMN parece ser constituído por uma mistura de compostos.
Tentou-se a sua separação por destilação no aparelho de Kugelrohr, mas não resultou
obtendo-se novamente a mistura.
24
2.1.1.3 2,2-dimetil-3-(4-metil-fenil)propanal33,34,35,36,37
O N N
MgBr
O
EtMgBr
THF, ∆
t-ButNH2
Na2CO3
1. p-CH3PhCH2Cl, ∆
2. 10% HCl, ∆
Figura 21: Esquema da reacção de síntese de 2,2-dimetil-3-(4-metil-fenil)propanal
Num balão, previamente seco, foram misturados tert-butilamina (10.5 mL, 0.11 mol) e
isobutiraldeído (10 mL, 0.11 mol) sob atmosfera inerte e à temperatura ambiente, e observou-se
que a reacção é isotérmica. Após uma hora a água formada foi retirada com um pipeta de Pasteur
e um excesso de carbonato de potássio anidro foi adicionado. A mistura foi filtrada e destilada a
20ºC para formar um óleo incolor: 2-metil-N-[(1E)-2-metilpropilidene]propan-2-amina.
Num outro balão previamente seco, adicionou-se 2-metil-N-[(1E)-2-
metilpropilidene]propan-2-amina (4,2 g, 0,033 mol) a uma solução 1 M de Brometo de
Etilmagnésio em THF (30 mL) e a mistura resultante foi refluxada durante 14 horas. A mistura
foi arrefecida e formaram-se alguns cristais. Agitou-se a mistura para dissolver os cristais e
juntou-se lentamente cloreto de 4-metilbenzilo (4,1 mL, 0.04 mol) sendo a mistura resultante
refluxada durante 20 horas.
Obteve-se uma solução branca com algum precipitado e adicionou-se 25 mL duma
solução aquosa de HCl a 10%. A mistura foi refluxada durante 2 horas e após arrefecimento,
juntou-se um excesso de NaCl e extraiu-se a solução 5 vezes com éter dietílico. A fase orgânica
foi lavada com 20 mL duma solução aquosa de HCl a 5% e repetidamente com solução aquosa
saturada de NaCl até que as águas de lavagem tivessem pH=5.
Finalmente a fase orgânica foi seca com MgSO4 anidro, filtrada e o solvente removido
sob vácuo. O óleo resultante foi destilado no aparelho de Kugelrohr. A 60ºC obteve-se um óleo
que não corresponde ao composto desejado. A 80ºC obteve-se um óleo incolor, o composto
pretendido - 2,2-dimetil-3-(4-metil-fenil)propanal. 1H-RMN (CDCl3, 400 MHz) δ: 9.61 (s, 1H, -(C=O)-H), 7.29-6.99 (m, 4H, Ar), 2.77 (s, 2H,
CH2-C(CH3)2), 2.34 (s, 3H, CH3-Ph) e 1.07 (s, 6H,C(CH3)2).
IV: ν (cm-1) =2977, 2933, 2727, 1729, 1515, 1463, 1201, 819;
25
2.1.1.4 2,2-dimetil-3-fenilpropanal38
CH3
CH3
O CH3
CH3
N
CH3
CH3
CH3 CH3
CH3
N
CH3
CH3
CH3
MgBr
CH3
CH3
O
EtMgBr
THF, ∆
1. PhCH2Cl, ∆
2. 10% HCl, ∆
t-ButNH2
Na2CO3
Figura 22: Esquema de reacção de síntese de 2,2-dimetil-3-fenilpropanal
Num balão, previamente seco, foram misturados tert-butilamina (10.5 mL, 0.11 mol) e
isobutiraldeído (10 mL, 0.11 mol) sob atmosfera inerte e à temperatura ambiente, e observou-se
que a reacção é exotérmica. Após uma hora a água formada foi retirada com um pipeta de Pasteur
e um excesso de carbonato de potássio anidro foi adicionado. A mistura foi filtrada e destilada a
20ºC para formar um óleo incolor: 2-metil-N-[(1E)-2-metilpropilidene]propan-2-amina.
Num outro balão previamente seco, adicionou-se 2-metil-N-[(1E)-2-
metilpropilidene]propan-2-amina (1,5 g, 0,012 mol) a uma solução 1 M de Brometo de
Etilmagnésio em THF (12 mL) e a mistura resultante foi refluxada (80ºC) durante 14 horas. A
mistura foi arrefecida e formaram-se alguns cristais. Agitou-se a mistura para dissolver os cristais
e juntou-se lentamente cloreto de 4-metilbenzilo (1.4 mL, 0.012 mol) sendo a mistura resultante
refluxada durante 20 horas.
Obteve-se uma solução amarela opaca com algum precipitado e adicionou-se 20 mL duma
solução aquosa de HCl a 10%. A mistura foi refluxada durante 2 horas e após arrefecimento,
juntou-se um excesso de NaCl e extraiu-se a solução 5 vezes com éter dietílico. A fase orgânica
foi lavada com 20 mL duma solução aquosa de HCl a 5% e repetidamente com solução aquosa
saturada de NaCl até que as águas de lavagem tivessem pH=6.
Finalmente a fase orgânica foi seca com MgSO4 anidro, filtrada e o solvente removido
sob vácuo. O óleo resultante foi destilado no aparelho de Kugelrohr. A 70ºC obteve-se um óleo
que não corresponde ao composto desejado. A 90ºC obteve-se um óleo incolor que é o composto
pretendido - 2,2-dimetil-3-fenilpropanal.
Análise Elementar: Exp (Calc) %C: 81.61 (81.44); %H: 8.76 (8.70);
IV: ν (cm-1) = 3031, 2940, 2860, 1728, 1603, 1498, 1455, 757, 702.
26
1H-RMN (CDCl3, 400 MHz) δ: 9.47 (s, 1H, -(C=O)-H), 7.26-6.97 (m, 5H, Ar), 2.81-2.66 (d,
2H, CH2-C(CH3)2), e 1,04 (s, 6H,C(CH3)2).
2.1.1.5 3-hidroxi-2,2-dimetilpropionaldeído38,39
HOH
O
H
O
H
O
H HOO
O
OH
0ºC+
r.t., 2 hrs
K2CO3
Figura 23: Esquema de reacção de síntese de 3-hidroxi-2,2-dimetilpropionaldeído
A uma mistura de isobutiraldeído (12.66mL, 0.136mol) e formaldeído (10,82 mL, 1.1
eq.) a 0ºC foi adicionado lentamente carbonato de potássio (7.90g, 0.44 eq.) de modo a manter a
temperatura abaixo de 20ºC. Antes da adição de K2CO3 a solução era incolor e após a adição a
solução ficou branca opaca.
Após 1:45 h de agitação à temperatura ambiente a mistura solidificou. Extraiu-se este
sólido com Et2O, secou-se com Na2SO4, evaporou-se o solvente sob vácuo para se obter um
sólido branco. Este sólido foi destilado a 100ºC originando o composto desejado - 3-hidroxi-2,2-
dimetilpropionaldeído - em equilíbrio com o seu dímero.
Análise Elementar: Exp (Calc) C: 58,33% (58.82%); H: 10.33% (9.80%);
IV: ν (cm-1) = 3434, 3316, 3222, 2979, 2886, 1475, 1365, 1234, 1118, 1051, 977, 892, 790, 701.
2.1.1.6 Tentativa de preparação ácido 4-(2,2-Dimetil-3-oxo-propil)-benzenosulfónico40
O
O
SHO
O
O
H2O
CHCl3, ClSO3H
Figura 24: Esquema de reacção de síntese de Ácido 4-(2,2-Dimetil-3-oxo-propil)-benzenosulfónico
27
Uma mistura de clorofórmio seco (2 mL) e 2,2-dimetil-3-fenilpropanal (0.85 g, 0.005mol)
foi arrefecida a -10ºC. A esta mistura foi adicionado ácido clorossulfónico (2 eq.) e a cor da
mistura mudou imediatamente de branco para preto. A solução foi agitada até que cessasse a
libertação de gás. Deixou-se a solução atingir a temperatura ambiente e deitou-se a mistura preta
viscosa sobre água gelada. A mistura dissolveu-se na água para formar uma solução laranja
A mistura laranja foi extraída com AcOEt originando um resíduo castanho. Removeu-se o
solvente sob vácuo. Fez-se o espectro de 1H RMN em MeOD e verificou-se que o composto
desejado – Ácido 4-(2,2-dimetil-3-oxo-propil)-benzenosulfónico - não se formou.
2.1.1.7 Tentativa de preparação 4-etil-4-formil-hexanoato de metilo41
OO
O
O
O
KOH cat.
O
Figura 25: Esquema de reacção de síntese de 4-Etil-4-formil-hexanoato de metilo
Ao 2-Etilbutiraldeido (10 mL, 0.075 mol) foi adicionada uma solução aquosa de KOH
(0.25ml, 2.2 mmol) e lentamente o metil-acrilato (7.5 mL, 1.1eq). A mistura foi agitada durante
60 minutos até que a reacção exotérmica acabasse e depois a mistura foi agitada a 55ºC. Seguiu-
se a reacção por TLC. Após duas horas de agitação a mistura estava ligeiramente amarela e muito
viscosa. Deixou-se a mistura a agitar durante a noite. Arrefeceu-se a solução, acidificou-se a
pH=2 com uma solução aquosa 0.1M HCl e a cor mudou de amarelo límpido para amarelo opaco.
Lavou-se a solução com água, adicionou-se metanol para ajudar a separar a fase orgânica da fase
aquosa. Removeu-se a fase aquosa, secou-se a fase orgânica com Na2SO4 anidro, removeu-se o
solvente sob vácuo e formaram-se novamente duas fases, removeu-se a fase aquosa e destilou-se
a o óleo amarelo e viscoso num aparelho de kugelrhor.
Após análise por 1H RMN verificou-se que não se obteve o composto desejado - 4-Etil-4-
formil-hexanoato de metilo - apenas uma fracção do material de partida, sobrando um crude
muito viscoso.
28
2.1.2 Pró-drogas
2.1.2.1 Anéis com S, N
2.1.2.1.1 Ácido 2-tert-butil-1,3-tiazolidina-4-carboxílico42, 43, 44, 45
O
S
NH
OH
O
+ OH2
SH
NH2
OHO +
Figura 26: Esquema da reacção de síntese de Ácido 2-tert-butil-1,3-tiazolidina-4-carboxílico
A uma solução de L-cisteína (3,22 g, 0.026 mol) em 40 mL de metanol adicionou-se
pivaldeído (3,6 mL, 1.2 eq.) e a solução aqueceu um pouco. Deixou-se a agitar durante a noite e
no dia seguinte a mistura tinha um aspecto opaco e branco. Evaporou-se o solvente e obteve-se
um sólido branco - Ácido 2-tert-butil-1,3-tiazolidina-4-carboxílico – que foi bem seco sob vácuo
até ficar um sólido solto.
Análise Elementar: Exp (Calc) %C: 50.89 (50.76); %H: 7.96 (7.99); %N 7.46 (7.40); %S 17.33
(16.94);
IV (cm-1): 3455, 3065, 2966, 1644, 1481, 1360, 1305, 1202, 859, 619;
1H-RMN (D2O, 300 MHz) δ: 4.71(d, J = 1.2 Hz, 0.4H, S-CH-NH), 4.64 (d, J =0.6 Hz, 0.6H, S-
CH-NH), 4.58-4.57 (m, 0.4H, CH2-CH-NH), 4.3-4.29 (m, 0.6H, CH2-CH-NH), 3.30 (m, 2H,
CH2), 1.0 (s, 0.6x(9H), (CH3)3), e 0.98 (s, 0.4x(9H), (CH3)3).
2.1.2.1.2 2-tert-Butil-tiazolidina46
O
H+
HS NH2
S NH
MeOH
r. t.
Figura 27: Esquema da reacção de síntese de 2-tert-Butil-tiazolidina
29
A uma solução de Cisteamina (2.02g, 0.025mol) em 20 mL de metanol adicionou-se
pivaldeído (2.1 ml, 1.1 eq.) à temperatura ambiente. Esta reacção é exotérmica e foi seguida por
TLC (20% AcOEt e 80% Hexano). Após 19 horas, como a reacção não estava completa,
adicionou-se mais 0.5 ml de pivaldeído. Após 24 horas de agitação removeu-se o metanol sob
vácuo para formar um óleo transparente. Verificou-se que este composto era muito instável,
decompondo-se rapidamente mesmo sob azoto e mantido a 4ºC. Este facto explica os desvios
elevados obtidos na análise elementar.
Análise Elementar Exp (Calc) %C 53.30 (57.88); %H 8.98 (10.41); %N 9.65 (9.64); %S 24.59
(22.07);
IV ν (cm-1): 3321, 2971, 1673, 1482, 1371, 1050, 927, 839;
1H-RMN (CDCl3, 300 MHz)δ: 4.36 (s, 1H, -S-CH-N-); 3.60-3.54, 3.00-2.81, 2.75-2.61 (m,
rotâmeros, 1H+2H+1H, -S-CH2-CH2-N-), 1.53 (s, 1H, -NH) e 1.02 (s, 9H, (CH3)3).
2.1.2.1.3 Ácido 2-tert-butil-1,3-tiazinano-4-carboxilico47
SH
NH2
O
OH
O
S
NH
OOH
+ OH2+
Figura 28: Esquema da reacção de síntese de Ácido 2-tert-butil-1,3-tiazinano-4-carboxilico
DL-Homocisteína (1 g, 0.007 mol ) foi dissolvida em 10 mL de MeOH e 2 mL de água e
adicionou-se pivaldeído (0.93 mL, 1.2 eq.). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante
16 horas, sendo depois os solventes removidos sob vácuo formando um sólido branco - Ácido 2-
tert-butil-1,3-tiazinano-4-carboxílico.
Análise Elementar Exp (Calc): %C: 52.67 (53.17); %H:7.93 (8.43); %N: 6.99 (6.89); %S:
16.26 (15.77);
IV ν (cm-1): 3461, 2936, 2858, 1725, 1455, 1263, 1190, 1023, 908, 828; 1H-RMN (D2O, 300 MHz) δ: 4.28, (s, 0.4x1H, S-CH-NH), 4.17 (s, 0.6x1H, S-CH-NH), 4.02-
4.03 (m, 0.4xH, CH2-CH-NH), 3.7-3.4 (m, 0.6x1H, CH2-CH-NH), 2.93-2.55 (m, 2H, S-CH2),
2.49-1.76 (m, 2H, CH2-CH-NH), 0.98 (s, 0.4x(9H), (CH3)3), e 0.96 (s,0.6x(9H), (CH3)3);
30
2.1.2.1.4 2-tert-butil-2,3-dihidro-1,3-benzotiazole
NH2
SH CH3
CH3
CH3
O NH
S
CH3
CH3
CH3
+
Figura 29: Esquema da reacção de síntese de 2-tert-butil-2,3-dihidro-1,3-benzotiazole
Uma solução de 2-aminotiofenol (0,9 mL, 0,008 mol) e pivaldeído (1,0 mL, 1,1 eq) em 10
mL de metanol foi agitada durante a noite à temperatura ambiente.
Seguiu-se a reacção por TLC (30% AcOEt, 70% Heptano) e após algumas horas de
reacção adicionou-se mais 0.3 mL de pivaldeído.
Quando por TLC não se observava o progresso da reacção o solvente foi removido sob
vácuo obtendo-se um sólido amarelo. Este sólido foi recristalizado com uma mistura de etanol e
água para formar cristais brancos em forma de agulhas - 2-tert-butil-2,3-dihidro-1,3-benzotiazole.
Análise Elementar Exp. (Calc.): %C 68.87 (68.35); %H 8.00 (7.82); %N 7.20 (7.25); %S 16.65
(16.59);
IV: ν (cm-1) = 3375, 3071, 2968, 2871, 2426, 1580, 1476, 1075, 806, 741, 485;
1H-RMN (MeOD, 300 MHz) δ: 6,65-6,25 (m, 4H, Ar), 4.90 (s, 1H, S-CH-NH), e 0.71 (s, 9H,
(CH3)3);
2.1.2.1.5 Ácido 2-tert-butil-5,5-dimetil-1,3-tiazolidina-4-carboxílico
O
S
NH
OH
O
+ OH2
SH
NH2
OHO
+
Figura 30: Esquema da reacção de síntese de Ácido 2-tert-butil-5,5-dimetil-1,3-tiazolidina-4-carboxilico
Uma solução de DL-Penicilamina (0,31 g, 0,002 mol) e pivaldeído (0,25 mL, 1,1 eq) em
10 mL de metanol foi agitada à temperatura ambiente durante a noite. Quando não havia
evidências de evolução de reacção por TLC (30% AcOEt : 70% n-pentano) o solvente foi
31
evaporado para formar um sólido branco - Ácido 2-tert-butil-5,5-dimetil-1,3-tiazolidina-4-
carboxilico.
Analise Elementar Exp (Calc.): %C 55.86 (55.27), %H 8.64 (8.81), %N 6.46 (6.44), %O
(14.72), %S 14.25 (14.75);
IV: ν (cm-1) = 3497, 3298, 2976, 2742, 2522, 2013, 1734, 1623, 1480, 1370, 1260; 1H-RMN (MeOD, 300 MHz)δ: 4,49 (s, 0,5x1H, N-CH-COOH), 4,33 (s, 0,5x1H, N-CH-COOH),
3,52 (s, 0,5x1H, S-CH-NH), 3,40 (s, 0,5x1H, S-CH-NH), 1,46 (s, 0,5x3H,CH3-C-S), 1,41 (s,
0,5x3H,CH3-C-S), 1,15 (s, 0,5x3H,CH3-C-S), 1,01 (s, 0,5x3H,CH3-C-S), e 0.81 (s, 0,5x9H,
(CH3)3), 0,79 (s,0,5x 9H, (CH3)3);
2.1.2.2 Anéis com N, O
2.1.2.2.1 2-tert-butil-1,4-dihidro-2H-3,1-benzoxazina48
NH2
OH
O
NH
O
+Tolueno
Refluxo
Figura 31: Esquema da reacção de Síntese de 2-tert-butil-1,4-dihidro-2H-3,1-benzoxazina
Uma solução de 2-aminofenil-metanol (2 g, 15,91 mmol) e pivaldeído (2,2 mL, 1,2 eq.)
em 150 mL de tolueno foi refluxada a 125ºC sob condições de Dean e Stark, durante 3 dias.
Seguiu-se a reacção por TLC (70% pentano e 30 % AcOEt). Após o segundo dia adicionou-se
mais aldeído (0.5 ml, 0.3 eq.). Removeu-se o solvente sob vácuo obtendo-se um sólido castanho
que foi recristalizado com uma mistura de água e metanol, formando-se cristais em forma de
agulhas.
Análise elementar Exp (Calc): %C: 75.39 (75.35); %H: 8.35 (8.96); %N 7.44 (7.32);
IV KBr ν (cm-1): 3387, 2963, 2873, 1590, 1483, 1366, 1100, 754; 1H-RMN (CDCl3, 300 MHz)δ: 1.034 (9H, s, C(CH3)3), 4.23 (1H, s, O-CH-NH), 4.96 - 4.80 (2H,
m, OCH2), 7.06 (1H, t, J = 7.2Hz, Ar), 6.90 (1H, d, J = 7.2Hz , Ar), 6.76 (1H, t, J = 7.5 , Ar), 6.66
(1H, d, J = 7.8, Ar);
32
2.1.2.2.2 2-tert-butil-3,4-dimetil-5-fenil-1,3-oxazolidina49,50
NH
OH O
N
O+
Figura 32: Esquema da reacção de síntese de 2-tert-butil-3,4-dimetil-5-fenil-1,3-oxazolidina
Dissolveu-se efedrina (2.05 g, 0.012 mol) em 20 ml de tolueno e adicionou-se pivaldeído
(1.63 ml, 1.2eq). Esta mistura foi refluxada a 90ºC sob condições de Dean e Stark. Após 2 dias de
reacção juntou-se mais pivaldeído (0.7 ml, 0.5 eq.). A reacção foi seguida por TLC (30% AcOEt :
70% n-pentano). Quando por TLC não havia mais evidências de evolução o solvente foi
removido sob vácuo originando um óleo amarelo. Este óleo foi purificado por cromatografia em
coluna (5% AcOEt : 95% de Heptano). Após esta tentativa de purificação verificou-se que o
composto ainda tinha algumas impurezas. Procedeu-se então à purificação por placa preparativa
com o mesmo eluente e ainda a uma destilação no aparelho de Kugelrohr. Após todos estes
procedimentos o composto ainda continha algumas impurezas.
Analise elementar: Exp. (Calc) % N 6.70, (6.00) % C 78.39, (77.21), % H 8.47, (9.93);
IV ν (cm-1): 3480.9, 2978.5, 2798.2, 2425.0, 1455.0, 1207.2, 1073.1, 711.6; 1H-RMN (CDCl3, 300 MHz) δ: 7.33-7.23 (m, 5H, Ar), 4.98 (d, 1H, O-CH-Ph), 3.82 (s, 1H, O-
CH-N), 3.01-2.97 (m, 1H, CH3-CH-N), 2.53 (s, 3H, CH3-N), 1.04 (s, 9H, (CH3)3), 0.68 (d,
3H,CH3-CH-N).
2.1.2.2.3 2-tert-Butil-oxazolidina-4-carboxilato de metilo51,52
O
H+
HO NH2.HCl
O NH
O
OMe
O
OMe
Et3N
Figura 33: Esquema da reacção de síntese de 2-tert-Butil-oxazolidina-4-carboxilato de metilo
33
O Éster metílico de DL-Serina (1.04g, 6.7 mmol) foi dissolvido em 40 mL de n-pentano.
Adicionou-se Pivaldeído (0.78, 1.1 eq.) e trietilamina (0.88ml, 1.0 eq.) e a solução foi refluxada
sob condições de Dean e Stark durante 5 dias. Após o segundo dia de reacção adicionou-se mais
pivaldeído (0.5eq.). A solução vai ficando mais branca. Seguiu-se a reacção por TLC (30%
AcOEt : 70%pentano). Quando não havia evidência de evolução de reacção, adicionou-se éter
etílico e água, separaram-se as duas fases e extraiu-se duas vezes a fase aquosa com éter dietílico.
As fases orgânicas foram secas com Na2SO4 anidro e o solvente foi removido sob vácuo para
obtendo-se um óleo transparente.
IV ν (cm-1): 3462, 3375, 2966, 1746, 1469, 1108, 103, 803, 671;
1H-RMN (CDCl3, 300 MHz) δ: 4.26-3.821 (m, 2H, O-CH-NH e NH-CH-COOMe), 3.69 (s, 0.5
x(3H), OCH3), 3.66 (s, 0.5x(3H), OCH3), 3.70-3.62 (m, 2H, -OCH2), 2.47 (s, 1H, NH), 0.93
(s,0.5x(9H), (CH3)3), 0.85 (s, 054x(9H), (CH3)3);
2.1.2.3 Anéis com N,N
2.1.2.3.1 1-(2-tert-butil-imidazolidin-5-ona) acetato de sódio53
NH2
NHOH
O
OO
NHNO
OO
Na+NaOH (aq.)
refluxo
Figura 34: Esquema da reacção de síntese de 1-(2-tert-butil-imidazolidin-5-ona) acetato de sódio
Dissolveu-se Glicil-glicina (2,0 g, 0,015 mol) em 10 mL de água e adicionou-se 10 mL de
uma solução aquosa de NaOH 1N. Agitou-se esta solução durante 30 minutos. Removeu-se o
solvente sob vácuo obtendo-se um óleo amarelo. Dissolveu-se este óleo em 30 mL de metanol e
adicionou-se pivaldeído (1,9 mL, 1,1 eq). A mistura foi refluxada durante 3 horas. Removeu-se o
solvente obtendo-se um sólido ligeiramente amarelo. O composto não foi isolado puro, mas, uma
vez que se observou que este não era estável, não se fez nenhuma tentativa de purificação.
IV: ν (cm-1) = 3454, 2970, 2212, 1655, 1421, 1303, 1047, 709;
34
1H-RMN (MeOD, 300 MHz) δ: 4.19- 4.14 (d, 0.5x2H, HN-CH2-CO), 3.78 (s, 0.33x1H, N-CH2-
COONa), 3.54 (s, 0.66x1H, N-CH2-COONa), 3.42-3.36 (d, 0.5x2H, HN-CH2-CO), 3.23 (s,
0.5x1H, N-CH-NH), 3.18 (s, 0.5x3H, N-CH-NH,), e 0.87 (s, 0.33x9H, (CH3)3), 0,73 (s, 0.66x9H,
(CH3)3).
2.1.2.3.2 2-tert-butil-6-oxohexahidropirimidina-4-carboxilato de potássio54,55
ONH2
NH2
O
OH
ONHNH
OO
O
K
+KOH (aq.)
refluxo
Figura 35: Esquema de reacção de síntese de 2-tert-butil-6-oxohexahidropirimidina-4-carboxilato de potássio.
L-asparagina monohidratada (2.00 g, 0.0134 mol) foi dissolvida em 5 mL de água e
adicionou-se 5 mL duma solução aquosa de KOH (0.96g, 0.0134 mol). Agitou-se durante alguns
minutos e o solvente foi depois evaporado sob vácuo a 60ºC. O sólido foi seco durante a noite
sob vácuo. Dissolveu-se este sólido em 20 mL de metanol, juntou-se o pivaldeído (1,6 mL, 1,1
eq.) e refluxou-se a mistura durante 6 horas. O solvente foi removido sob vácuo obtendo-se um
sólido branco. O espectro de RMN mostrava algumas impurezas. Tentou-se então recristalizar
este sólido com uma mistura de MeOH: AcOEt mas não resultou.
IV: ν (cm-1) = 3399, 2969, 2875, 2828, 1667, 1484, 1393, 797; 1H-RMN (MeOD, 400 MHz) δ: 4.02 (s, 0.33x1H, -CH-(CH3)3), 3.88 (s, 0.66x1H, -CH-(CH3)3),
3.35-3.31 (dd, J=4.2, 11.4 Hz, 1H, -CH2CHNH-), 2.52-2.46 (dd, J = 4.2, 17.1 Hz, 0.5x2H, -CH-
CH2-C=O), 2.19-2.11 (dd, J = 11.4, 17.1 Hz, 0.5x2H, -CH-CH2-C=O) e 0.90 (s, 9H, (CH3)3);
35
2.1.2.4 Anéis com O,O
2.1.2.4.1 2-tert-butil-5-fenil-1,3-dioxolan-4-ona56,57,58
OH
OH
O
OO
OO
+H+(cat.), refluxo
Figura 36: Esquema da reacção de Síntese de 2-tert-butil-5-fenil-1,3-dioxolan-4-ona
Ácido (R)-(-)-Mandélico (1 g , 0,0072 mol), pivaldeído (0,8 mL, 1,1 eq) e alguns cristais
de ácido p-toluenosulfónico foram misturados em 30 mL de n-pentano e refluxados sob
condições de Dean e Stark. Após 5,5 horas de refluxo verificou-se por TLC (30% AcOEt : 70%
Heptano) o consumo do material de partida. Arrefeceu-se a mistura e alguns cristais precipitaram
em forma de agulha. Adicionou-se uma solução aquosa de NaHCO3 a 8% e o sólido ficou na
interface das duas fases. Evaporou-se o pentano e o sólido foi filtrado e seco sob vácuo.
Formou-se preferencialmente um dos diastereómeros deste composto - (2S,5R)-2-tert-butil-5-
fenil-1,3-dioxolan-4-ona – mas por 1H RMN foram detectados alguns picos do outro
diastereómero - ((2R,5R)-2-tert-butil-5-fenil-1,3-dioxolan-4-ona.
Analise Elementar Exp (Calc.): % C 70.45 (70.89), % H 7.74 (7.32);
IV ν (cm-1): 3494, 3073, 3072, 2903, 1809, 1608, 1468, 1370, 1225, 1095, 984, 700;
1H-RMN (CDCl3, 300 MHz) δ: 7,45-7,26 (m, 5H, Ar), 5.33 (s, 1H, O-CH-C=O), 5,25 (s, 1H, O-
CH-O), e 1,09 (s, 9H, (CH3)3).
36
2.1.2.4.2 2-tert-butil-5-metil-1,3-dioxolan-4-ona58, 59, 60
O
OH
OH
O
O
OO
+H+
Refluxo
Figura 37: Esquema da reacção de síntese de 2-tert-butil-5-metil-1,3-dioxolan-4-ona
Ácido DL-Láctico (1 g, 0,01 mol), pivaldeido (1,2 mL, 1,1 eq) e algumas gotas de H2SO4
concentrado foram misturados em 20 mL de n-pentano e a solução foi refluxada sob condições de
Dean e Stark durante a noite. Seguiu-se a reacção por TLC (30% AcOEt, 70% n-pentano).
Arrefeceu-se a mistura ligeiramente amarela, lavou-se duas vezes com água, secou-se a fase
orgânica com Na2SO4, anidro e removeu-se o solvente sob vácuo obtendo-se um óleo amarelo
que foi purificado por destilação no aparelho de Kugelrohr a 30ºC. Este composto é muito volátil.
IV: ν (cm-1) = 3491, 2980, 1807, 1207, 1116, 974;
MS : m/z calculada para (M + Na)+: 181.2. experimental: 181.1;
1H-RMN (CDCl3, 400 MHz) δ: 5.25(d, J=1.24 Hz, 0.33x1H, O-CH-O), 5.09 (d, J= 1.12 Hz,
0.66x1H, O-CH-O), 4.43 (dq, J1=7.00 Hz, J2= 1.24 Hz, 0.33x1H, O-CH-C=O), 4.33 (dq, J1= 6.76
Hz , J2=1.12 Hz, 0.66x1H, O-CH-C=O), 1.43 (d, J=6.72 Hz, 0.66x3H, CH3-CH), 1.41 (d, J=6.92
Hz, 0.33x3H, CH3-CH), 0.93 (s, 0.66x9H, (CH3)3) e 0.91 (s, 0.33x9H, (CH3)3).
2.2 Medição da libertação de CO
A Quantificação de CO libertado (ver anexo) foi um dos principais objectivos deste
trabalho de forma a prever a adequação dos compostos como drogas ou pró-drogas e posterior
selecção para testes in vivo.
Para tal usou-se um Cromatógrafo para gases Thermofinnigan Trace GC com uma coluna
CTR1 de AlltechTM, com detector de condutividade térmica.
37
2.3 Estudos de Interacção de Pivaldeído com Aminoácidos
O Pivaldeído, aldeído comercial e o mais simples dos aldeídos terciários, foi também
estudado por Espectroscopia de Ultra Violeta ao nível das interacções com aminoácidos.
Usou-se nestes estudos um aparelho de Ultravioleta Shimadzu UV3100 controlado por
computador e células de quartzo de 1 cm de largura. Nestes estudos a linha de base foi feita com uma solução do meio usado, sendo depois feitos os
espectros após adição do aldeído.
Foram estudadas as interacções do pivaldeído com L-cisteína, L-arginina, L-lisina e L-
alanina. Na tabela seguinte estão indicadas as concentrações de aldeído e aminoácido usadas em
cada estudo.
Tabela 1: Valores de concentração referentes aos estudos de UV de interacções do Pivaldeído.
[Pivaldeído](M) Meio Concentração do meio (M) Linha de base
0.123 Sol. Aq. Cisteína 0.126 Sol. Aq. Cisteína 0,138 Sol. Aq. L-arginina 0,138 Sol. Aq. L-arginina 0,138 Sol. Aq. L-lisina 0,138 Sol. Aq. L-lisina 0.138 Sol. Aq. L-Alanina 0.138 Sol. Aq. L-Alanina
38
3. Resultados
3.1 Sínteses
3.1.1 Aldeídos
Neste trabalho o método mais usado para a preparação de alguns aldeídos terciários
consistiu na desprotonação do carbono α dum aldeído secundário originando um anião enolato.
Este anião é estabilizado por ressonância o que pode dar origem a alguns problemas durante o
ataque nucleófilo. Poderá haver competição no ataque nucleófilo entre os dois átomos com carga
negativa e, consoante os substituintes R, a velocidade de desprotonação e a reactividade do anião
poderão variar. Em alguns casos foi necessário usar grupos protectores sob atmosfera inerte. A
base usada também variava consoante os casos, tal como a reactividade dos electrófilos usados.
RR
O
H
H
R C-
R
OH
RR
O-
HB- E+R
R
O
E
H R
R
OE
H+
Figura 38: Mecanismo geral de síntese de aldeídos terciários.
Foram também efectuadas mais três sínteses para alterar a estrutura de alguns aldeídos terciários.
3.1.1.1 1-Metil ciclo-hexanocarbaldeído
As sínteses dos aldeídos terciários derivados do ciclohexanocarbaldeído não foram bem
sucedidas. Este comportamento poderá ser devido à formação do equilíbrio ceto-enólico e à
reacção de auto condensação.
Como já foi referido anteriormente o equilíbrio cetoenólico origina mais um centro
nucleófilo que provoca mais reacções secundárias.
39
O
H
H
C-
OH
O-
HB-OH
HE+
O
EH
OE
H+
Figura 39: Esquema da reacção de substituição nucleófila pelo ciclohexanocarbaldeido.
Uma dessas reacções secundárias poderá ser a auto condensação:
C-
OH
O-
HO
H
OHH
OH
H
Figura 40: Reacção de auto condensação do ciclohexanocarbaldeído.
3.1.1.2 3-(4-isopropil fenil)-2,2-dimetilpropanal; 2,2-dimetil-3-(4-metil-fenil)propanal e
2,2-dimetil-3-fenilpropanal
A síntese destes compostos envolvia a desprotonação do isobutiraldeído, funcionando este
depois como nucleófilo. Como já foi referido anteriormente para outros aldeídos secundários,
este tipo de anião é estabilizado por ressonância formando-se um isómero que vai competir na
substituição nucleófila, sendo este um dos motivos pelo qual na síntese de 3-(4-isopropil fenil)-
2,2-dimetilpropanal houve formação duma mistura de produtos (ver ponto 2.1.1.5). Uma outra
causa da mistura obtida poderá ser a auto-condensação do aldeído e o facto do electrófilo usado
não ser muito forte.
O
H
H
C-
OH
O-
HB- E+ O
E
HO
E
H+
Figura 41: Formação do anião do isobutiraldeído e possíveis reacções como nucleófilo.
40
O
H
O-
+O
OH Figura 42: Reacção de auto-condensação do isobutiraldeído41.
Utilizando outro método protegeu-se o grupo carbonilo com tert-butilamina, desprotonou-
se o carbono adjacente à imina com um reagente de Grignard, ocorrendo também a protecção do
azoto que poderia competir como nucleófilo, e por adição de um cloreto de benzilo ocorre o
ataque nucleófilo da dupla ligação, havendo a regeneração da imina e formação de sais de
magnésio. Ao se adicionar uma solução aquosa de ácido, dá-se a hidrólise da imina, regenerando
o aldeído.
O N
H
N
MgBr
N+
R
H
t-ButNH2H2O
EtMgBr
Etano
Cl
R
N
R
H2OO
R
H+
MgBrClNH2
Figura 43: Mecanismo geral de síntese de 2,2-dimetil-3-fenilpropanaldeidos.
3.1.1.3 3-hidroxi-2,2-dimetilpropionaldeído
A síntese deste composto é em tudo semelhante aos aldeídos já estudados. Primeiro,
ocorre a desprotonação do isobutiraldeído usando uma quantidade catalítica de base fraca, o
anião formado actua como nucleófilo atacando o formaldeído. Este passo é uma reacção muito
eficiente pois o formaldeído é um electrófilo muito forte.
Após a formação do aldeído terciário ocorre a dimerização deste produto que se torna
num sólido muito estável.
41
O
H
H
C-
OH
O-
H
O
H HOOH
OH
OO
OH
CO32-
H+ O OH
H+
Figura 44: Mecanismo de reacção de síntese de 3-hidroxi-2,2-dimetilpropionaldeído
3.1.1.4 Ácido 4-(2,2-Dimetil-3-oxo-propil)-benzenosulfónico
Nesta preparação pretendia-se a introdução de um grupo sulfónico no anel aromático por
substituição electrófila aromática (clorossulfonação). Este grupo iria aumentar a solubilidade em
água e seria interessante observar a reactividade na libertação de CO. No entanto a síntese não foi
bem sucedida.
O
S
O
O
OH
Cl
O
SO
O
OHClH
S
O
O
OH
Cl
O
SO
O
Cl
OH2O
SO
O
OH
SO
OOH
O
SO
O
O
Cl-
- HSO3-
Figura 45: Mecanismo de reacção de clorosulfonação prevista mas que não resultou.
3.1.1.5 4-Etil-4-formil-hexanoato de metilo
O mecanismo proposto para a reacção de síntese deste composto era semelhante ao
mecanismo geral já apresentado (ver fig. 45), no entanto a síntese deste composto não foi bem
sucedida. Este facto poder-se-á dever à pequena reactividade do metil-acrilato como electrófilo,
tendo ocorrido polimerização deste reagente.
42
O
H C-
O
OO
O
OOH
+
OH -
Figura 46: Mecanismo de reacção de síntese de 4-Etil-4-formil-hexanoato de metilo que não resultou.
OO
OH -
OO
O
O
CH-
O
O
OH O
O
OO
OH O
O
OO
H+ n
Figura 47: Mecanismo da reacção de polimerização de acrilato de metilo.
3.1.2 Pró-drogas
3.1.2.1 Sistemas de Anéis com S, N
Ácido 2-tert-butil-1,3-tiazolidina-4-carboxílico, 2-tert-Butil-tiazolidina, Ácido 2-tert-
butil-1,3-tiazinano-4-carboxilico, 2-tert-butil-2,3-dihidro-1,3-benzotiazole, Ácido 2-tert-
butil-5,5-dimetil-1,3-tiazolidina-4-carboxilico
A síntese destes compostos foi muito simples, sendo que alguns destes compostos não
precisaram de purificação já que o reagente em excesso tem baixo ponto de ebulição. A reacção
envolve o ataque nucleófilo da amina ao aldeído, formando-se um intermediário imina, ocorrendo
depois o ataque do tiol ao carbono da imina.
NH2SH
R2 R1
N SH
R2R1
O
NH S
R1 R2OH2H
+
H+
Figura 48: Mecanismo geral da reacção de formação de moléculas com sistemas de anéis com S, N.
Para formar estes compostos usaram-se vários aminotióis referidos na literatura – L-
cisteína, éster metílico de L-cisteína, cisteamina e D-penicilamina.
43
A L-Cisteína, éster metílico de L-cisteína e cisteamina são moléculas radioprotectoras e
são intermediários na síntese de L-Glutationa.
A D-Penicilamina é um metabolito de Penicilina. É vendida como fármaco e tem
actividade a nível do tratamento de artrite reumatóide, doença de Wilson e Cistinuria. A doença
de Wilson consiste numa desordem genética do metabolismo de cobre e a penicilamina funciona
como agente quelante deste metal. A Cistinuria é uma desordem hereditária que se caracteriza
pelo aumento de excreção de cistina.
O 2-aminotiofenol foi usado na síntese de tiazolidinas para perceber a influência dos
substituintes na libertação de CO.
Para investigar a influência do tamanho do anel na libertação de CO usou-se a
homocisteína que é um derivado da L-metionina.
3.1.2.2 Sistemas de Anéis com N, O
2-tert-butil-1,4-dihidro-2H-3,1-benzoxazina, 2-tert-butil-3,4-dimetil-5-fenil-1,3-
oxazolidina, 2-tert-Butil-oxazolidina-4-carboxilato de metilo
Para estas moléculas o método usado consiste na adição dos reagentes e refluxar com
remoção azeotrópica de água. Nesta reacção ocorre o ataque nucleófilo da parte amina para
formar um intermediário imina, havendo depois o ataque nucleófilo do grupo álcool para fechar o
anel.
NH2OH
R2 R1
N OH
R2R1
O
NH O
R1 R2OH2H
+
H+
Figura 49: Mecanismo da reacção de síntese de sistemas de anéis com N, O.
Para a síntese destes compostos usaram-se amino-álcoois já estudados para pró-drogas.
A efedrina é referida na literatura como um composto promissor para este método de pró-
drogas, uma vez que hidrolisaria rapidamente e libertaria o aldeído. No entanto no nosso caso
essa libertação não se verificou em 24 horas.
44
Usou-se também L-serina metil éster que quando condensada com pivaldeído dá origem a
uma oxazolidina que actua como auxiliar quiral de alquilação da serina.59 Em solução a
oxazolidina resultante encontra-se num estado de equilíbrio entre a forma anel e a forma cadeia,
sendo a forma cadeia preferida em solventes mais polares.60
Para avaliar a influência do tamanho de anel na libertação de CO usou-se também o 2-
aminofenil-metanol, que por condensação com o aldeído forma um anel de 6 membros.
3.1.2.3 Sistemas de Anéis com N, N
1-(2-tert-butil-imidazolidin-5-ona) acetato de sódio, 2-tert-butil-6-
oxohexahidropirimidina-4-carboxilato de potássio
Este tipo de sistemas de anéis reverte rapidamente aos reagentes por hidrólise química.
As moléculas deste tipo, sintetizadas, não foram obtidas puras. Uma delas, 1-(2-tert-butil-
imidazolidin-5-ona) acetato de sódio, era instável, tal como o análogo referido na literatura.53 No
caso de 2-tert-butil-6-oxohexahidropirimidina-4-carboxilato de potássio tentou-se a
recristalização mas não foi bem sucedida. Esta molécula é usada como auxiliar quiral.54,55
Nesta reacção a parte amina actua como nucleófilo atacando o aldeído e originando um
intermediário imina que é atacada pela amida, fechando o anel.
NH2NH
O R1
R2N
NH
O
R1 R2
O
NHN
R1
O
R2
OH2
H+
H+
Figura 50: Mecanismo geral da reacção de formação de moléculas com sistemas de anéis com N, N.
3.1.2.4 Sistemas de Anéis com O, O
Os compostos deste tipo consistem na condensação de α-hidroxi-ácidos com pivaldeído
com catálise ácida, formando assim um acetal. Ocorre um ataque nucleófilo do grupo álcool ao
aldeído, havendo depois o fecho do anel por ataque do grupo álcool formado ao carbonilo do
ácido com libertação duma molécula de água.
45
O
OH OH
R
O
O
O
OHR
OH
O
O
R
O
OH2
H+ H
+
Figura 51: Mecanismo geral da reacção de formação de moléculas com sistemas de anéis com O, O.
Na síntese deste tipo de moléculas foram usados o ácido láctico e o ácido mandélico.
3.2 Medição da libertação de CO
3.2.1 Aldeídos
Sintetizaram-se e estudaram-se vários aldeídos terciários como possíveis drogas para
libertação controlada de CO, tendo-se obtido o seguinte gráfico.
Perfil de libertação de CO de Aldeídos
0
10
20
30
40
50
60
0 5 10 15 20 25Tempo (horas)
% C
O li
bert
ado a
b
c
d
e
Gráfico 1: Perfil de libertação de CO de aldeídos
46
3.2.2 Pró-drogas
Neste trabalho, foram sintetizados vários tipos de pró-drogas para o pivaldeído. De todas
elas apenas as pró-drogas com anel de enxofre e azoto e a pró-droga 2-tert-Butil-oxazolidina-4-
carboxilato de metilo demonstraram libertação de CO e portanto mantém o comportamento
desejado do pivaldeído. De notar que apenas os compostos obtidos com uma pureza razoável
foram testados para libertação de CO.
O perfil de libertação de CO das pró-drogas de anel com enxofre e azoto tem o seguinte
aspecto:
CO release of prodrugs
0
5
10
15
20
25
30
35
0 5 10 15 20 25 30
Time (hrs)
% C
O
1
2
3
4
5
a
Gráfico 2: Cinética de libertação de CO dos vários compostos cíclicos
com enxofre e azoto.
Notam-se várias diferenças no comportamento de libertação de CO entre os vários
compostos testados.
• Observou-se que o pivaldeído possui uma menor libertação de CO que as pró-drogas
libertadoras. Conclui-se então que o aldeído protegido na forma de pró-droga é mais
eficiente para libertação de CO. Este facto poderá dever-se à protecção do aldeído que
assim deixa de ser tão susceptível a ataques nucleófilos por parte de biomoléculas.
47
• Verificou-se que os compostos com anel de 5 membros (exceptuando o 2-tert-butil-2,3-
dihidro-1,3-benzotiazole e 2-tert-butil-1,3-tiazolidin-4-carboxilato de metilo) são os que
mais libertam CO. Os compostos Ácido 2-tert-butil-1,3-tiazolidina-4-carboxílico e ácido
2-tert-butil-5,5-dimetil-1,3-tiazolidina-4-carboxilico têm um perfil de libertação muito
semelhante, tal como seria de esperar uma vez que estruturalmente diferem em apenas
dois grupos metilo. Esta diferença estrutural confere menor solubilidade em água
justificando isto a menor libertação de CO deste último composto.
NS
O
OH
H NS
O
OH
H
Figura 52: Ácido 2-tert-butil-1,3-tiazolidina-4-carboxílico e
Ácido 2-tert-butil-5,5-dimetil-1,3-tiazolidina-4-carboxilico
O composto 2-tert-butil-tiazolidina apresenta uma libertação inicial muito lenta,
possivelmente provocada pela menor solubilidade em água. No entanto após a hidrólise
inicial a solubilidade do composto aumenta e, como tal, a velocidade de libertação
também.
NHS OH2
NH
SH
OH
NH2SH
O+
Figura 53: Mecanismo de abertura do anel de 2-tert-Butil-tiazolidina.
• O composto ácido 2-tert-butil-1,3-tiazinano-4-carboxilico liberta cerca de 15% CO ás 24
horas. Este composto tem uma menor libertação de CO comparando com os compostos
análogos de 5 membros. O facto ser constituído por um anel de 6 membros pode explicar
uma maior estabilidade e daí poderá vir o comportamento de menor libertação de CO.
Segundo as regras de Baldwin o fecho do anel de seis membros corresponde a uma
48
ciclização 6-endo-trig, que é favorecida. Enquanto que a ciclização 5-endo-trig
correspondente aos anéis de 5 membros é desfavorecida.61
NS
OH
OH
Figura 54: Ácido 2-tert-butil-1,3-tiazinano-4-carboxilico
• A tiazolidina 2-tert-butil-1,3-tiazolidin-4-carboxilato de metilo é semelhante ao ácido 2-
tert-butil-1,3-tiazolidina-4-carboxílico (figura 54), diferindo apenas num grupo metilo
ligado ao grupo ácido. Este grupo metilo confere menor solubilidade ao composto,
adquirindo então, um comportamento de libertação de CO inferior.
NSO
O
H
Figura 55: 2-tert-butil-1,3-tiazolidin-4-carboxilato de metilo
Conclui-se então que os compostos com um grupo atractor no carbono α ao azoto no anel são
estabilizados. No entanto existem dois tipos diferentes de interacções que estabilizam diferentes
compostos:
1. Verificou-se que o composto 2-tert-butil-2,3-dihidro-1,3-benzotiazole é muito estável e
não apresenta libertação de CO. O anel de tiazolidina deste composto é estabilizado por
ressonância para o anel aromático:
NH+SC-
NH+S
CH-
NH+S
CH-
NHS
Figura 56: Estabilização do anel por ressonância do anel aromático.
Esta estabilização pode explicar o comportamento de libertação de CO apresentado.
49
2. O anel dos compostos: ácido 2-tert-butil-1,3-tiazolidina-4-carboxílico, 2-tert-butil-1,3-
tiazolidin-4-carboxilato de metilo, ácido 2-tert-butil-1,3-tiazinano-4-carboxilico e ácido 2-
tert-butil-5,5-dimetil-1,3-tiazolidina-4-carboxilico é estabilizado por ponte de hidrogénio
entre o oxigénio do grupo ácido e o hidrogénio do grupo amina secundária do anel:
NS
O
OH
H NS
O
O
H NS
O
OH
HNS
OH
OH
Figura 57: Estabilização do anel por pontes de hidrogénio.
3. O anel de tiazolidina do composto 2-tert-butil-tiazolidina não é estável, verificando-se
que este composto decompunha-se após algum tempo guardado sob azoto e a 4ºC. Este
comportamento pode ser justificado pelo facto de não possuir grupos atractores que
possam estabilizar a molécula ou por ressonância ou por pontes de hidrogénio:
NHS
Figura 58: Anel de tiazolidina não estabilizado,
nem por ressonância nem por pontes de hidrogénio.
Para além destes compostos, houve apenas um exemplo de um sistema de anel com azoto
e oxigénio que também libertou, 2-tert-butil-oxazolidina-4-carboxilato de metilo. O perfil de
libertação de CO obtido para esta pró-droga é o seguinte:
50
Perfil de libertação de 2-tert-Butil-oxazolidina-4-carboxilato de metilo
00,5
11,5
22,5
33,5
44,5
0 5 10 15 20 25Tempo (horas)
%C
O li
bert
ado
Gráfico 3: Perfil de libertação de CO de 2-tert-Butil-oxazolidina-4-carboxilato de metilo
O NH
O
OMe
Figura 59: 2-tert-Butil-oxazolidina-4-carboxilato de metilo.
Verifica-se que esta pró-droga tem uma libertação inicial muito lenta, e tem um máximo
de libertação, às 24 horas, de 4.2% de CO. Comparando esta pró-droga com o seu análogo 2-tert-
butil-1,3-tiazolidin-4-carboxilato de metilo denota-se uma menor libertação de CO. Isto deve-se à
diferente reactividade entre o oxigénio e o enxofre.
Por ser um átomo mais macio, o enxofre é melhor grupo de saída que o oxigénio. A carga
negativa formada após a abertura do anel é melhor estabilizada num átomo de enxofre que num
átomo de oxigénio.
As outras pró-drogas com sistema de anel com azoto e oxigénio também foram testadas
para libertação de CO e verificou-se que estas não libertam CO após 24 horas.
Os únicos compostos testados a pH=2 sem peróxidos foram as dioxolanonas e verificou-se
que estes não libertam CO neste meio.
51
3.3 Estudos de Interacção de Pivaldeído com Aminoácidos
Para perceber a viabilidade do pivaldeído como potencial droga estudaram-se as suas
interacções com vários aminoácidos e péptidos: L-Arginina, L-Lisina, L- Cisteína, L-Alanina,
dissolvidos em água a pH=7.4.
Interacção de Pivaldeído com L-Arginina
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
200 250 300 350 400Comprimento de onda (nm)
Abso
rvân
cia
tempo 01 hora2 horas24 horas
Gráfico 4: Interacção de Pivaldeído com L-Arginina
NH
O
NH
NH2
NH2
OH
Figura 60: L-Arginina
Pela observação do espectro obtido conclui-se que o pivaldeido não interage com a L-
Arginina. A banda correspondente ao aldeído ( λmax= 285 nm) não sofreu alterações significativas
ao longo do tempo.
52
Interação de Pivaldeído com L-Lisina
00,5
11,5
22,5
33,5
4
200 250 300 350 400 450 500Comprimento de onda (nm)
Abso
rvân
cia
tempo 0
30 minutos
1 hora
2 horas
24 horas
Gráfico 5: Interacção de Pivaldeído com L-Lisina
O
NH2
NH2 OH
Figura 61: L-Lisina
Pela observação do espectro obtido verifica-se que a banda correspondente ao aldeído
(λmax= 285nm) sofreu alterações significativas na presença se L-Lisina. Conclui-se então que o
pivaldeído interage com a L-Lisina. Esta interacção provavelmente será entre um dos grupos
amina e o aldeído.
53
Interacção de pivaldeído com L-Cisteína
0
0,5
1
1,5
2
230 250 270 290 310 330 350Comprimento de onda (nm)
Abs
orvâ
ncia
tempo 05 minutos10 minutos15 minutos20 minutos25 minutos30 minutos35 minutos40 minutos45 minutos1 hora1 h 25 min2 horas2 h 40 min3 h 40 min4 h 20 min5 h 20 min
Gráfico 6: Interacção de Pivaldeído com L-Cisteína
O
NH2
SH OH
Figura 62: L-Cisteína
Observando o espectro obtido verifica-se diminuição da banda correspondente ao aldeído
(λmax= 285 nm) e aumento da banda correspondente a formação da nova espécie, possivelmente o
intermediário imina (λmax= 242 nm). Conclui-se então que o pivaldeído interage com a L-
Cisteína, tal como já era sabido, provavelmente originando um produto semelhante ao composto
Ácido 2-tert-butil-1,3-tiazolidina-4-carboxílico.
54
Interacção de pivaldeído com L-Alanina
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
200 250 300 350 400Comprimento de onda (nm)
Abso
rvân
cia
tempo 010 minutos1 hora
2 horas24 horas
Gráfico 7: Interacção de Pivaldeído com L-Alanina
O
NH2
CH3 OH
Figura 63: L-Alanina
Mais uma vez se verificam alterações da banda do aldeído (λmax= 285 nm) e o aumento
duma banda (λmax= 218 nm), esta poderá ser devido á formação dum intermediário imina.
Conclui-se então que a L-Alanina interage com o pivaldeído.
Estas interacções são, no entanto, completamente reversíveis. Tal como se observou com
composto ácido 2-tert-butil-1,3-tiazolidina-4-carboxílico, que mantinha a capacidade de
libertação de CO, estas interacções não impedem a libertação de CO pelo aldeído. De notar
também que o carbonilo de aldeídos terciários é menos electrófilo que de aldeídos secundários e
primários. Sendo assim este tipo de aldeídos é menos susceptível a ataque nucleófilo por parte de
bio moléculas11.
Tendo em conta estes resultados do estudo das interacções do pivaldeído com
aminoácidos e recordando os resultados verificados nos testes de libertação de CO nas pró-drogas
(ponto 3.6.2), confirma-se o que já foi dito atrás nesse ponto, que o pivaldeído é mais eficiente
para libertação de CO quando protegido na forma de sistema de anel com N, S. Isto poderá dever-
se ao facto de estar protegido das interacções com muitas moléculas biológicas como
aminoácidos, péptidos, etc.
55
4. Anexos
Para quantificar o volume de CO libertado foi necessário fazer uma calibração prévia do
aparelho de modo a obter uma relação entre o volume e a área obtida pelo cromatógrafo. Para tal
efectuaram-se vários ensaios com diversos valores de volume de CO. Em frascos de 2 mL foram
colocados vários volumes de CO, e destes foram retiradas amostras de 250 µl e injectadas no
cromatógrafo.
Da relação entre as áreas obtidas e o volume em cada frasco resultou a seguinte recta:
Recta de Calibração do CO
A = 3,291E+06V + 5,986E+04R2 = 9,994E-01
0
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
3000000
3500000
4000000
4500000
5000000
0,00 0,50 1,00 1,50
Volume CO (mL)
Áre
a
Gráfico 8: Relação linear entre a área obtida e o volume de CO em cada frasco.
Da recta obtida pode-se então retirar a percentagem de CO libertado em cada amostra
injectada, para tal basta, a partir da área obtida, determinar o volume de CO libertado (V(mL)):
6
4
10291.310986.5)(
××−
=AmLV
Sabendo o número de moles de composto testado (n) e considerando as condições PTN
(volume molar do gás é 22,4 dm3 mol-1 = 22400 mL3 mol-1) pode-se então determinar a
percentagem de CO libertada no ensaio:
100)(22400
)()%( 13 ××
= −molmLnmLVCO
56
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