a utilização de bacteriófagos no controle de salmonelas em aves e suínos laurimar fiorentin...

A utilização de bacteriófagos no controle de Salmonelas em aves e

suínos

Laurimar FiorentinMéd. Vet., M. Sc., Ph.D.

Pesquisador da EMBRAPA Suínos e Aves

Cx. P. 21, 89700-000 Concórdia, SC.

Ministério da Agricultura,

Pecuária e Abastecimento

Bacteriófagos e o CBM

• Durante o CBM de 2003 (17 a 20 de novembro, Florianópolis, SC), professores e pesquisadores brasileiros criam informalmente um grupo interessados na pesquisa de bateriófagos.

• Em 2004 a Página Brasileira de Bacteriófagos é publicada na Rede Mundial de Computadores.

Esta apresentação

• Histórico.

• Utilização de bacteriófagos no controle de Salmonelas em suínos e aves.– Literatura.– Trabalhos da Embrapa Suínos e Aves.

• Perspectivas.

Bacteriófagos

• Vírus que atacam bactérias, em geral com estreito espectro de ação.– Com cabeça e cauda

ou filamentosos.– dsDNA, ssDNA,

RNA.– Líticos ou

lisogênicos.– Entre 20-200 nm.

Bacteriófagos líticos

Bacteriófagos lisogênicos

Histórico

Histórico• 1896: O bacteriologista

inglês Ernest Hankin relata que água de alguns rios podem inativar o agente do cólera.

Histórico

• 1915: Frederick W. Twort, do Brown Institution de Londres, observa que culturas de bactérias se tornam translúcidas e demonstra a transmissibilidade do fenômeno.

• 1914-1918: Primeira Guerra Mundial.

Histórico

• 1917: Félix d’Hérelle observa placas translúcidas em inoculações de agar com fezes de pacientes com disenteria, descreve os vírus de bactérias e propõe o termo“Bacteriófagos”.

• Revolução Bolchevique.

Histórico

• 1923: Após passar cinco anos com Félix d’Hérelle no Instituto Pasteur, Dr. Giorgi Eliava funda um instituto bacteriológico em T’bilisi, República da Geórgia, já sob o domínio soviético.

Histórico

• 1929: Alexander Fleming descobre a penicilina abre a era dos antibióticos.

"Cogito ergo sum”(“Penso logo existo”)

Renée Descartes

• 1934: Após resultados conflitantes em testes clínicos a “American Medical Association” recomenda o abandonar as pesquisa com bacteriófagos.– Bacteriófagos selecionados não eram de grande

virulência.

– Uso de apenas um bacteriófago no tratamento.

– Lisogenia.– Resíduos bacterianos no preparado.

Histórico

• 1920: Os soviéticos retomam a Geórgia.

Histórico -Eventos recentes-

• Nenhuma nova classe de antibióticos tem sido descoberta nos últimos 30 anos.

• O desenvolvimento de resistência múltipla aos antimicrobianos provocou uma revisitação aos bacteriófagos.

• O consumidor exige a inocuidade dos alimentos quanto a resíduos químicos.

Revisitação dos bacteriófagos

• Smith e Huggins, 1982.– 3 x 107 UFC de E. coli K1 no músculo gastrocnêmio (100 x vezes a

DL50).

– Um bacteriófago teve a mesma eficiência que múltiplas doses de estreptomicina e foi mais efetivo que a tetraciclina, a ampicilina, o cloranfenicol ou trimetoprim com sulfadialzole, tomando-se como comparação o número de camundongos mortos por grupo.

• Smith e Huggins, 1983.– Embora bacteriófagos para fimbrias adesivas K88 e K99 não puderam

ser selecionados, bezerros tratados tiveram menor número de células aderidas à membrana do intestino delgado, a severidade da infecção reduziu e os animais não tiveram tiveram perda de fluido.

– Bactérias resistentes aos bacteriófagos foram reisoladas de bezerros não curados.

Uma hipótese muito simples!!

Bacteriófagos líticos podem ser utilizados de forma racional na redução da carga bacteriana em animais vivos, resultando em menos contaminação dos produtos que chegam ao consumidor.

Bacteriófagos x Salmonelas-Aves-

• Berchieri, Lovell & Barrow 1991.– 72% dos animais em contato foram positivos para bacteriófagos 3 dias após

a inoculação.

– Redução na concentração de UFC de S. typhimurium no duodeno, ceco e fígado somente foi verificada com inoculações em doses > 1010 UFC/ave por via oral.

• Sklar e Joerger, 2001.– Tratamento com bacteriófagos em galinhas infectadas com S. Enteritidis

reduziu a eliminação comparado com os controles, porém os animais tratados ainda tiveram entre 105 e 107 UFC/g de conteúdo cecal .

– Foram reisoladas colônias resistentes ao bacteriófagos.

Bacteriófagos x Salmonelas-Aves-

• Goode et al., 2003.– Bacteriófagos líticos aplicados em MOI 100 e MOI 1000 reduziram 2

log de S. Enteritidis em pele de frangos.

– A redução foi total para UFC 102/cm2 e a MOI 105.

• Toro et al., 2005.– Um coquetel de bacteriófagos líticos inoculados pela via oral em

frangos reduziu de 81,8 para 1.1 UFC de S. typhimurium por mL de conteúdo do íleo.

Estudos da Embrapa Suínos e Aves

• Hipóteses: 1. Bacteriófagos podem reduzir concentração

de salmonelas em aves e suínos vivos e conseqüentemente em seus produtos.

2. É possível o uso de bacteriófagos na forma de uma tecnologia de controle de salmonelas em aves.

Salmonella Enteritidis• Salmonela de roedores que infecta galinhas sem

produzir sinais e lesões.• S. Enteritidis aparece como contaminante de

frangos em 60% dos casos (Santos et al., 2000).• O fago tipo 4 representa até 57,65% dos isolados

de SE (dos Santos et al., 2003). • Controle multifatorial

• HACCP

• BPP

• Probióticos/prebióticos

• vacinas

• Antibióticos


• Bacteriófagos líticos para S. Enteritidis fago tipo 4 e S. Typhimurium (ATCC 14028) foram pesquisados em fezes de:– 40 poedeiras coloniais– 45 reprodutoras comerciais

de corte– 13 emas– 9 “pools” de pássaros

diversos.


• Cinco bacteriófagos foram isolados e denominados CNPSA 1, CNPSA 2, CNPSA 3, CNPSA 4, e CNPSA 5, sendo 4 de galinhas coloniais enquanto o CNPSA 5 foi isolado de um “pool” de fezes de pássaros criados em cativeiro.

• CNPSA2 perdeu viabilidade.


• Bacteriófagos são “Lambda-like” em ultra estrutura.• São dsDNA.• Bacteriófagos CNPSA1, CNPSA3 e CNPSA4

apresentara-se diferenciáveis pelo RAPD e foram selecionados para estudos adicionais.

• Têm estreito espectro de sorovares.• Não se multiplicam em conteúdo do trato digestivo de

suínos e aves livres de salmonelas.


• RAPD diferenciou CNPSA1, CNPSA3, CNPSA4 e CNPSA4/CNPSA5, formando três grupos distintos.

• Todos os bacteriófagos isolados são do tipo cabeça e cauda.

Ag. Flagelares BacteriófagoNº Sorovar Grupo Ag. SomáticosFase 1 Fase 2 CNPSA1 CNPSA3 CNPSA4

1 S. Agona B 4,5 f,g,s - - -2 S. Anatum E 1 3, 10 e,h - - - -3 S. Cerro K [1, 5] 6,14,18,24 z23 - - -4 S. Choleraesuis C 1 6,7 - 1,5 - - -5 S. Cubana G 2 13,23 z29 - - -6 S. Derby B 4,5 f,g - - -7 S. Dublin D 1 1,9,12 [Vi] g,p - - + -8 S. Enteritidis D 1 1,9,12 g, m - + + +9 S. Gallinarum D 1 1,9,12 - - + + +10 S. Give E 1 3, 10 l,v 1,7 - - -11 S. Heidelberg B 1,4,[5],12 r 1,2 + + +12 S. Infantis C 1 6,7 r - - - -13 S. Kentucky C 3 O, 20 - z6 - - -14 S. Kuzendorf C 1 6,7 - - - - -15 S. London E 1 3,10, [15] l,v 1,6 - - -16 S. Manhattan C 2 6,8 d 1,5 - - -17 S. Meleagridis E 1 3, 10 - - + + +18 S. Montevideo C 1 6,7,14 g,m,[p], s [1,27] - + -19 S. Muenchen C 2 6,8 d 1,2 - - -20 S. Muenster E 1 3, 10 e,h 1,5 - - -21 S. Newington E 2 3,10,15 e,h 1,6 - - -22 S. Newport C 2 6,8 - 1,2 - - -23 S. Oranienburg C 1 6,7,14 m,t,[z57] - - -24 S. Panama D 1 1,9,12 l,v 1,5 - - -25 S. Pullorum D 1 1,9,12 - - - - -26 S. Sandiego B 4,[5],12 e,h,l,n,t - - -27 S. Saintpaul B 4,5 e,h 1,2 + + +28 S. Typhimurium B 4,5 1,2 + + +29 S. Worthington G 2 1,13,23 z lw - - -30 Salmonella sp. C1 ? ? ? - - -31 S. Typhimurium

ATCC 14028B ? ? ? + + +

Estudos da Embrapa Suínos e Aves - Espectro de ação

Estudos da Embrapa Suínos e Aves -

Espectro de ação em isolados de S. Typhimurium.

BacteriófagoIsoladoNº

Origem (UFRGS)CNPSA1 CNPSA3 CNPSA4

18B Fezes (F) + + +16B Linfonodos Mesentéricos (LM) + + +25E LM + + +26E F + + +4M LM + + +6M F - - -

28M F + + +27M LM + + +17L LM + + +19L F + + +36B F + + +39B LM + + +24H F + + +22B F + + +12L F + + +10L F + + +39L F + + +1D LM + + +

6SG Linfonodos Submandibulares (LS) + + +8SG Tonsila (T) + + +

51SG LS + + +37SG T + + +53SG T + + +52SG LS + + +11SG LS + + +12SG T + + +24SA F - - -10SI LS + + +9SG T + + +

14SG LS + + +49SG T + + +39SG LS + + +9SI LS + + +

18SD LM + + +8SB LM + + +

26SA LM + + +14028 ATCC + + +

Estudos da Embrapa Suínos e Aves - Dinâmica de lise-

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0 1 2 3 4 5 6 7

Hora

OD

540

Controle

CNPSA 1

CNPSA 3

CNPSA 4

00,20,40,60,8

11,21,4

0 1 2 3 4 5 6 7

Hora

OD

540

Controle

CNPSA 1

CNPSA 3

CNPSA 4

S. Typhimurium

S. Enteritidis

Estudos da Embrapa Suínos e Aves Dinâmica de bacteriófagos líticos em fezes suínas contaminadas Dinâmica de bacteriófagos líticos em fezes suínas contaminadas

experimentalmente com experimentalmente com SalmonellaSalmonella Typhimurium Typhimurium

00,7

25

102

0,51

49

210

50

100

150

Zero 1 2 3 4

Dias

UF

C x

10

6 /m

L

Trat 1 Trat 2

3,7

11,7

7,8

15,9

12,9

4,46,47

0

10

20

Zero 1 2 3 4

Dias

UF

C x

10

7 /m

L

Trat 2 Trat 3

S. Typhimurium Bacteriófagos

Trat 1: fezes suínas + BHI + S. typhimuriumTrat 2: fezes suínas + BHI + S. typhimurium + Bacteriófagos MOI 100Trat 3: fezes suínas + BHI+ Bacteriófagos


0

1

2

3

4

5

6

7

8

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Grupo 1: Não inoculados

Grupo 2: Bacteriófagos

Grupo 3: Salmonela

Grupo 4: Salmonela +Bacteriófagos

• Pintos SPF inoculados via oral com CNPSA1, CNPSA3 e CNPSA4.

16o dia3o dia 5o dia

Necropsia103 SE PT4 105 cada bacteriófago

Bacteriófagos nas fezes


• Pintos de corte inoculados via oral com CNPSA1, CNPSA3 e CNPSA4.

7o dia

Necropsias a cada 5 diasSE PT4 “seeders”

1011 cada bacteriófago

0

2

4

6

8

10

12

0 5 10 15 20 25

Days post-treatment

Log

10

Infected control Treated

1o dia 32o dia

Redução

de 3,5 logs.

UFC no conteúdo cecal


• Pintos de corte inoculados pela água de bebida com 109 UFP/mL de CNPSA1, CNPSA3 e CNPSA4.

6o a 11o dia

Necropsias a cada 3 dias6 x106 SE PT4 via oral

109 cada bacteriófago

1o dia 20o dia

UFC/g (log10) no conteúdo cecal

0

1

2

3

4

5

6

7

Nec 1 Nec 2 Nec 3 Nec 4 Nec 5

Controle Tratado

Estudos da Embrapa Suínos e Aves Excreção de bacteriófagos líticos para Excreção de bacteriófagos líticos para SalmonellaSalmonella Typhimurium em Typhimurium em

suínos infectados experimentalmentesuínos infectados experimentalmente

1. (gST+BL) foi infectado com uma cultura de ST contendo 107 UFC/mL e recebeu uma suspensão dos três BL no título de 1010 UFP/mL, dois dias após. 2. (gST) recebeu apenas a cultura de ST. 3. (gBL) recebeu somente a solução de BL.4. (gC) permaneceu como controle negativo .

Nenhum suabe foi positivo para bacteriófagos no dia zero em

todos os grupos e em todas as colheitas dos grupos gST e gC.

No segundo dia pós-tratamento (p.t.), 4/5 e 5/5 animais

dos grupos gST+BL e gBL eliminavam os vírus nas fezes. No

dia 4 p.t., a positividade foi 2/5 e 1/5 respectivamente.

No dia 6p.t., os fagos já não foram mais detectados

nas fezes de nenhum dos animais inoculados.

Delineamento Resultados


• Coxas e sobrecoxas imersas em 106 UFC/mL de SE PT4 e depois tratadas com 109 UFP/mL dos bacteriófagos CNPSA1, CNPSA3 e CNPSA4.

0

2

4

6

8

10

12

14

3 6 9 12 15

SE PT4 SE PT4 + Bacteriofagos

Log10 x dia pós -tratamento

Perspectivas na Embrapa Suínos e Aves

• Redução do impacto da infecção por SE PT4 em frangos.

• Redução da contaminação de carcaças de frangos infectados.

• Potencial aplicação em incubatórios e dejetos.• Utilização em diagnóstico.• Mais experimentação com S. Typhimurium em

suínos.

Perspectivas

• Bacteriófagos irão substituir os antibióticos?– Não. Provavelmente irão estabelecer um nicho

próprio (uso tópico, respiratório, gastro-intestinal).

• Antibióticos e bacteriófagos poderão ser utilizados conjuntamente?– Sim. Bacteriófagos como preventivo e

antibióticos como curativo.

Resumindo

• Bacteriófagos foram mais pesquisados e utilizados nos países da cortina de ferro.

• O mundo ocidental recentemente “descobriu” os bacteriófagos como agentes terapêuticos.

• Mais pesquisas são necessárias para definir melhor a utilização dos bacteriófagos em animais de criação.

• A Embrapa Suínos e Aves estabeleceu um programa para pesquisar o controle de Salmonelas com bacteriófagos.

• Resultados iniciais são encorajadores para perseguir no método como uma tecnologia.

• Os bacteriófagos devem se confirmar como uma alternativa aos antibióticos.

http://www.cnpsa.embrapa.br/bacteriophages/indexBazilianPageBacteriophages.html

Publicações

Silveira, R.H. 1, Fiorentin, L.2, Voss, D.2, Kich, J.D.2, Cerqueira, A.M.F.1 Host spectrum of indigenous Salmonella lytic bacteriophages. Submetido ao I3S 2006.

Silveira, R.H. 1, Fiorentin, L.2, Voss, D.2, Kich, J.D.2, Cerqueira, A.M.F. In vitro dynamic of lysis of indigenous bacteriophages to Salmonella Enteritidis and S. Typhimurium. Submetido ao I3S 2006.

FIORENTIN, L.; VIEIRA, N. D.; BARIONI JUNIOR, W. Oral treatment with bacteriophages reduces the concentration of Salmonella Enteritidis PT4 in caecal contents of broilers. Avian Pathology, 34(3): 258-263. 2005.

FIORENTIN, L.; VIEIRA, N. D.; BARIONI JUNIOR, W.; BARROS, S. “In vitro” characterization and “In vivo” properties of Salmonellae lytic bacteriophages isolated from free-range chickens. Braz. J. Poult. Sci., 6(2): 105-112. 2004.

FIORENTIN, L., VIEIRA, N.D.; BARIONI JUNIOR, W. Bacteriófagos reduzem a contaminação por Salmonela em coxas e sobrecoxas de frangos. In: Conferência APINCO 2005 de Ciência e Tecnologia Avícolas. Revista Brasileira de Ciência Avícola, 2, Suppl. 7, 185. 2005.

FIORENTIN, L., VIEIRA, N.D.; BARIONI JUNIOR, W. Reduction of Salmonella Enteritidis PT4 in caecal contends after treatment with bacteriophages. Annual Meeting of the American Association of Avian Pathologists, 2004. Philadelphia, PN, AAAP. CD-ROM.

FIORENTIN, L., Vieira, N.D.; Barioni Jr, W. “In vivo” properties of lytic bacteriophages isolates in Salmonella Enteritidis infected and uninfected SPF chickens. In: Congress of the World Veterinary Poultry Association, 13., 2003, Denver, Co., Anais. Denver: World Veterinary Poultry Association, 2003. p.161.

Excreção de bacteriófagos líticos para Excreção de bacteriófagos líticos para SalmonellaSalmonella Typhimurium em Typhimurium em suínos infectados experimentalmente.suínos infectados experimentalmente.

Dinâmica de bacteriófagos líticos em fezes suínas contaminadas Dinâmica de bacteriófagos líticos em fezes suínas contaminadas experimentalmente com experimentalmente com SalmonellaSalmonella Typhimurium Typhimurium

Obrigado!!

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