PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DE GOIÁS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOCIÊNCIAS FORENSES

A IMPORTÂNCIA DA ENTOMOLOGIA E DA ANÁLISE DE DNA

PARA A IDENTIFICAÇÃO FORENSE

Vanessa Daldegan Gomes de Lima1

Paulo Roberto Queiroz2

1Licenciada em Biologia pelo Centro Universitário de Brasília. Aluna da Pós-graduação em Biociências

Forenses pela Pontifícia Universidade Católica de Goiás/IFAR. 2Orientador: Biólogo; Doutor em Biologia Animal pela Universidade de Brasília – UnB. Professor de

especialização em Biociências Forenses IFAR/PUC-GO. E-mail: pqsilva@uol.com.br

RESUMO

Identificações criminais usando o material genético tiveram início em 1985. Técnicas como a amplificação, o

isolamento e a caracterização de material genético retirado do sistema digestório de artrópodes necrófagos e

hematófagos podem auxiliar na identificação da vítima e do suspeito. O objetivo desse trabalho foi descrever as

contribuições da entomologia e da genética para a análise e identificação de vestígios humanos de interesse

forense. Atualmente, os marcadores de maior relevância são o VNTR, STR e o DNA mitocondrial. Os

artrópodes que mais auxiliam no desenvolvimento da Entomologia Forense são os insetos das Ordens Diptera e

Coleoptera. As combinações das técnicas baseadas no DNA com a entomologia podem fornecer estratégias para

a obtenção de perfis de DNA que permitam ser aplicados na identificação humana visando suprir as mais

variadas finalidades forenses.

PALAVRA-CHAVE: Identificação humana; extração de ácidos nucleicos; amplificação de DNA.

ABSTRACT

Criminal identification using genetic material began in 1985. Techniques such as amplification, isolation and

characterization of genetic material taken from the digestive system of hematophagous and scavengers

arthropods may help identify the victim and the suspect. The aim of this study was to describe the contributions

of entomology and genetics for the analysis and identification of human remains of forensic interest. Currently,

the most relevant methods are VNTR, STR and mitochondrial DNA. The most helpful arthropods in the

development of forensic entomology are the insects of the Diptera and Coleoptera orders. The combination of

DNA-based techniques with entomology may provide strategies for obtaining DNA profiles that enable it to be

used for human identification objectives in order to meet several legal purposes.

KEY-WORD: Human identification, extraction of nucleic acids, DNA amplification.

1 INTRODUÇÃO

De acordo com Fachone; Velho (2007) a ciência forense é a classificação dada aos

esforços de geração e transferência de tecnologia e ciência com a finalidade de elucidar

questões relativas ao âmbito do sistema de segurança pública e justiça criminal. Já a perícia

criminal é a busca da verdade real das circunstâncias do crime a partir de evidências materiais

geradas pelo fato delituoso, em função de conhecimento tecnológico e científico comprovado,

com a finalidade de fundamentar os procedimentos legais até o julgamento.

Para qualificar um vestígio como admissível em um processo penal, as provas devem

estar livres de qualquer direito comum ou privilégio constitucional e, portanto, serem

confiáveis. Um perito em genética ou em entomologia, por não terem relação alguma com o

ocorrido, ajudam o julgador a compreender os fatos periciados (HALL, 2012).

Para suprir essa demanda, o serviço de segurança pública juntamente com a ciência,

procuram desenvolver técnicas cada vez mais eficientes e precisas para que o suspeito do

crime seja recolhido do meio social o mais rápido possível (MARIUZZO, 2007).

Com isso, o laudo pericial baseia-se nos conceitos científicos e tecnológicos. Estes são

produzidos por profissionais que trabalham com as técnicas já comentadas e se tornam

imprescindíveis para a justiça criminal e sistema público de segurança deste país

(FACHONE; VELHO, 2007).

Dessa forma, o trabalho colaborativo entre vários ramos das ciências podem ser

aplicados visando a obtenção de dados para a identificação de indivíduos para fins criminais.

Por exemplo, os processos de identificação de indivíduos para fins criminais usando o

material genético tiveram início em 1985 quando Alec Jeffreys, um geneticista britânico,

coletou o sêmen de um criminoso e obteve o perfil de DNA correspondente a partir dessa

amostra (DOLINSKY; PEREIRA, 2007). Essa análise foi feita por meio da metodologia de

RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism – Polimorfismo no Comprimento de

Fragmentos de Restrição) para a obtenção de perfis genéticos de minissatélites (DNA

fingerprinting). Nos EUA, em novembro de 1987, foram usados pela primeira vez, testes de

DNA para se determinar a culpabilidade criminal. A partir de então, desde o final do século

XX, os estudos na área de genética forense se desenvolveram em escala exponencial, com o

intuito de obter perfis genéticos como uma ferramenta complementar para investigações de

crimes sexuais e violentos (POLÍCIA CIVIL DO DISTRITO FEDERAL, 2011).

Visando complementar dados que possam ser usados na investigação, podem-se

empregar os conceitos da Entomologia Forense, que se amparam em aspectos ecológicos e

empregam informações coletadas de acordo com o estágio de desenvolvimento dos insetos

que colonizam os corpos em decomposição (THYSSEN, 2008). Uma das funções desse ramo

é determinar o intervalo pós-morte. Além disso, o exame de artrópodes recolhidos próximo ou

sobre os cadáveres também pode determinar se o mesmo foi deslocado entre localidades que

possuem entomofaunas diferentes, se o corpo esteve ou não enterrado por um período

determinado de tempo e, até mesmo, indicar traumatismos provocados por armas (GOMES,

2008).

Estudos recentes demonstram a possibilidade de se retirar e estabelecer o perfil de

DNA de origem humana a partir de material extraído do trato digestivo de larvas

decompositoras (GREDILHA; PARADELA; FIGUEIREDO, 2007). Thyssen (2008) descreve

que o uso de técnicas como a amplificação, o isolamento e a caracterização de material

genético retirado do sistema digestório de artrópodes necrófagos e hematófagos podem

auxiliar na identificação da vítima e do suspeito. Atualmente, os métodos de maior relevância

são o RFLP aplicado ao estudo de regiões repetitivas de DNA chamadas de minissatélites

(VNTR – Variable Number of Tandem Repeats – Número Variável de Repetições in Tandem)

e os microssatélites (STR – Short Tandem Repeats – Repetições Curtas in Tandem) revelados

pela reação em cadeia da polimerase (PCR – Polymerase Chain Reaction) (KOCH;

ANDRADE, 2008). Além destas, Thyssen (2008) afirma que o DNAmt (DNA mitocondrial)

revela-se um extraordinário marcador molecular.

Visando aumentar a dinâmica das atividades forenses que possam elucidar fatos

delituosos, faz-se necessária a complementação dos estudos a respeito da entomofauna

forense e a pesquisa de métodos de identificação por DNA a partir de vestígios biológicos

encontrados em cenas de crime para a identificação rápida de suspeitos. As combinações das

técnicas baseadas em DNA com a entomologia podem fornecer estratégias para a obtenção de

perfis de DNA que permitam ser aplicados na identificação humana visando suprir as

finalidades forenses.

O objetivo deste trabalho foi descrever as contribuições da entomologia e da genética

para a análise e identificação de vestígios humanos de interesse forense.

2 METODOLOGIA

Trata-se de uma revisão bibliográfica baseada em trabalhos científicos que descrevem

assuntos relacionados à Genética e Entomologia visando a sua aplicação forense. Grande

parte das fontes utilizadas foi retirada de bibliotecas virtuais da Ordem dos Advogados do

Brasil (OAB), Sociedade Brasileira de Análises Clínicas (SBAC), Empresa Brasileira de

Pesquisa Agropecuária (Embrapa), Instituição Nacional de Pesquisa da Amazônia (INPA),

Universidade de Campinas (Unicamp), Universidade de Trás-os-montes e Alto Douro,

Universidade Estadual de São Paulo (UNESP), Universidade do Grande Rio

(UNIGRANRIO), SUNY College of Environmental Science and Forestry, Universidade

Federal do Paraná (UFPR), Faculdades Integradas de Ourinhos (FIO), Universidade de

Coimbra (UC) e bases de dados científicas, tais como, Scielo (http://www.scielo.

org/php/index.php), Bireme (http://new.paho.org/bireme/), Google Acadêmico, bem como no

sítio PubMed (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/).

Outra parte das informações foi obtida por meio de periódicos, teses e monografias

disponíveis nas bibliotecas físicas da Universidade de Brasília (UnB) e do Centro

Universitário de Brasília (UniCEUB).

3 DESENVOLVIMENTO

3.1 Genética Forense

A análise de DNA apresenta elevada sensibilidade e poder de discriminação,

oferecendo uma poderosa ferramenta na identificação humana. Tecnicamente e do ponto de

vista da criminalística, o DNA pode ser coletado de praticamente todos os espécimes

biológicos, pois é uma molécula estável em locais frios e secos e se os vestígios são

armazenados nessas condições, as chances dos resultados obtidos serem confiáveis é bastante

razoável (KOCH; ANDRADE, 2008).

A confiabilidade dos exames de DNA é fundamentada nas várias fases de execução do

exame desta molécula, na aplicação rigorosa de procedimentos que garantem a qualidade da

perícia realizada (PARADELA; FIGUEIREDO; SMARRA, 2006) como, por exemplo, a

utilização de toucas, luvas e máscaras cirúrgicas descartáveis no momento da coleta,

manuseio e processamento de resultados; a devida proteção contra a ação de fungos e

bactérias mantendo a amostra protegida do calor e da umidade; a rígida documentação da

cadeia de custódia do material recolhido para evitar a contaminação por deposição de material

biológico (SMOKOVICZ, 2010).

As fontes de provas mais comuns que são coletadas para a prática de testes de DNA

forense são saliva, cabelos com ou sem raízes, sangue e sêmen, porém outros materiais como

urina, bolos fecais, ossos e peças dentárias também podem fornecer resultados para tipagem

de DNA (VAZ, 2008; GAERTNER; BINSFELD, 2011).

3.2.1 Métodos de extração de DNA aplicados na genética forense

Existem diferentes métodos de extração de DNA a partir de vestígios coletados em

cena de crime e que se constituem em material de interesse forense. De forma geral, cada

método de extração de DNA precisa eliminar diversos contaminantes, incluindo lipídios,

proteínas, carboidratos, pigmentos e partículas de solo (CHEMELLO, 2012).

Recentemente Hedman; Ansell; Nordgaard (2010) descreveram o índice de

classificação de perfil de DNA forense (FI - forensic DNA profile index), que tem a função da

avaliar quantitativamente e com imparcialidade os perfis traçados a partir das amostras

coletadas. Este índice é construído usando os dados gerados do PCA (Análise de

Componentes Principais) que combinam as análises da altura do pico total de alelos, o

equilíbrio dos picos alélicos dentro dos loci heterozigóticos (intra-locus ou equilíbrio local) e

o equilíbrio entre marcadores STR (inter-loci ou saldo global) (HEDMAN et al., 2009). Os

laudos periciais elaborados a partir da aplicação desse procedimento tornam-se de elevada

qualidade técnica (HEDMAN; ANSELL; NORDGAARD, 2010).

Soma-se a tudo isso a necessidade de coleta de amostras a partir do cadáver. Isso é

feito pela coleta de cortes histológicos diretamente do cadáver para a formação de um banco

de dados para posteriores análises e comparações com o conteúdo gástrico das larvas

encontradas junto à entomofauna correlacionada ao caso (CAINÉ, 2010).

Mas para o sucesso do emprego dos conceitos apresentados anteriormente é necessário

que se tenham disponíveis métodos de obtenção de DNA com qualidade e quantidade

suficientes para as técnicas moleculares que irão estabelecer os perfis de DNA para

comparação. Dessa forma, serão apresentadas metodologias de obtenção de DNA com a

finalidade de orientar os interessados no assunto na escolha e adoção do melhor método que

seja mais adequado à prática forense de DNA.

Por exemplo, na extração de DNA são empregados vários reagentes, tais como, o

Chelex. O Chelex 100 é um agente quelante usado para purificar compostos em uma amostra

pelo princípio da troca iônica. O seu mecanismo de ação é por meio da sua capacidade em se

ligar a íons derivados de metais de transição. O Chelex é um copolímero de estireno-

divinilbenzeno contendo grupos ácidos do tipo iminodiacético (CEO, 1993).

A resina Chelex é frequentemente usada para a extração de DNA visando utilização na

técnica de PCR. O mecanismo exato de ação do Chelex na preparação de DNA ainda é

incerto. O Chelex, provavelmente, protege o DNA dos efeitos do aquecimento usado para

liberar o DNA das células, por sequestrar íons de metais pesados divalentes das enzimas que

poderiam danificar a estrutura da molécula (WALSH, 1991).

A resina em forma de contas (beads) contendo grupos polares liga-se aos componentes

celulares polares após a lise das células, enquanto o DNA e o RNA permanecem em solução

na fase aquosa acima da fase contendo o Chelex, pois o mesmo é insolúvel em água. Isso

ocorre devido ao fato de que as moléculas de DNA liberadas de células lisadas são

susceptíveis a ação de DNAses. No entanto, as enzimas que degradam o DNA requerem o

cofator Mg+2

. Então, baseando-se nesse fato, o reagente Chelex liga-se firmemente a todos os

íons Mg+2

presentes em solução para evitar a degradação do DNA (MORETI, 2009).

Então, a partir dessa habilidade da resina Chelex 100, foram testados dois métodos de

extração de DNA utilizando-se o reagente Chelex 100 e o kit de purificação de DNA QIAamp

DNA minikit® (Qiagen) por Simonato et al. (2007).

Os autores prepararam os cortes de carcinoma epidermóide de assoalho bucal antes da

extração de DNA, fazendo a desparafinização do tecido coletado, pois para cada método de

extração faz-se necessário um preparo específico.

Segundo estes mesmos autores, nos tubos contendo os cortes para purificação com

Chelex 100 foram adicionados 100 µl de solução Tween 20 a 0,5%. Após ocorrer a

homogeneização, houve um aquecimento dos tubos a 90 °C por 10 minutos e, em seguida,

utilizando-se um termociclador, um resfriamento a 55 °C.

Adicionou-se então, 1 µl de proteinase K na concentração de 20 mg/ml.

Posteriormente, os cortes foram colocados a 55 ºC por 3 horas sendo levemente

homogeneizados a cada hora. Terminada esta fase, cada tubo recebeu 100 µl de Chelex 100®

diluído a 5% em solução de Tris 10 mM pH 8,0 e EDTA 1 mM, sendo os mesmos aquecidos

a 99 ºC durante 10 minutos e levemente agitados após o aquecimento.

Em seguida, realizou-se a centrifugação do material durante 15 minutos com uma

rotação de 10.600 rpm, aquecimento por 5 minutos a 45 ºC e adição de 100 µl de clorofórmio.

Novamente durante 15 minutos, colocou-se os tubos para centrifugar a 10.600 rpm. O DNA

presente no sobrenadante foi recuperado e armazenado em tubos limpos a - 20 ºC.

Já para o método de purificação com QIAamp DNA minikit os cortes de carcinoma

epidermóide de assoalho bucal foram preparados com a adição 1.200 µl de xilol e,

posteriormente, agitou-se por 15 segundos. Em seguida, os tubos foram centrifugados a

14.000 rpm durante cinco minutos.

O sobrenadante foi desprezado e adicionado ao sedimento 1.200 µl de etanol.

Novamente, durante 15 segundos os tubos foram agitados e centrifugados a 14.000 rpm por

mais cinco minutos. Realizou-se a repetição deste procedimento e, ao final, os tubos foram

colocados em centrífuga à vácuo com a temperatura mantida a 37 °C durante 15 minutos com

as tampas abertas, para que ocorresse a evaporação do etanol (SIMONATO et al., 2007).

Ainda, o emprego de kits de extração de DNA se mostra como uma alternativa para a

obtenção de DNA de relativa pureza. Por exemplo, Simonato et al. (2007) utilizaram o kit de

extração de DNA QIAamp DNA minikit® (Qiagen) para a obtenção de DNA de amostra

proveniente de carcinoma epidermóide de assoalho bucal.

Aos tubos contendo as amostras foram acrescentados de 180 µl de Buffer ATL (Tissue

Lysis Buffer), além de 20 µl de proteinase K (20 mg/ml). As amostras foram homogeneizadas

e incubadas a 55 ºC por 3 horas sendo levemente agitadas a cada hora. Após esse tempo,

adicionou-se ao tubo 200 µl de Buffer AL, sendo os mesmos aquecidos a 70 °C por 10

minutos para inativação da proteinase residual. A seguir, foram adicionados 200 µl de etanol e

agitados durante 15 segundos, centrifugando por período curto de 1 minuto.

A solução resultante foi movida para o dispositivo da coluna QIAamp DNA minikit® e

centrifugada a 8.000 rpm por um minuto e colocado em um tubo limpo. Adicionou-se então,

500 µl de Buffer AW1 (Wash Buffer 1) ao dispositivo com a coluna, que foram centrifugados

a 8.000 rpm por um minuto. O método de lavagem foi repetido com 500 µl de Buffer AW2

(Wash Buffer 2), acompanhado de centrifugação a 14.000 rpm durante 3 minutos.

O DNA foi eluído adicionando-se 50 µl de Buffer AE, incubando-se a temperatura

ambiente por um minuto e centrifugando-se a 8.000 rpm durante um minuto. Em seguida,

mais 50 µl de Buffer AE foram adicionados à coluna para completar a eluição, incubando-se

por 5 minutos e centrifugando-se a 8.000 rpm por mais 1 minuto. As amostras foram

armazenadas a -20 °C.

Estes autores relatam que a concentração de DNA obtida com o Chelex 100®

apresentou média de 120,62 ng/µl com quociente das leituras das absorbâncias 260/280 entre

0,8 e 1,41. Já com as amostras extraídas com QIAamp DNA minikit® o rendimento médio foi

de apenas 67,38 ng/µl, e quociente entre as leituras variou entre 1,11 e 2,53. Os autores ainda

demonstram que das 35 amostras processadas para a extração do DNA 82,85% foram

positivas quando extraídas com Chelex 100®

e 85,7% com QIAamp DNA minikit®.

Ambos os métodos, Chelex 100®

e QIAamp DNA minikit®, demonstraram possuir

potencial para uma boa extração de DNA total, sendo que o Chelex 100® apresenta custo mais

baixo que o QIAamp DNA minikit®

(SIMONATO et al., 2007).

Técnicas de biologia molecular tem se revelado eficazes para a identificação de

moléculas de DNA humano encontradas no trato digestivo de insetos. Maciel; Arantes (2010)

comentam que a técnica de PCR está associada à finalidade já citada. Liz (2005) relata o uso

do método orgânico com fenol/clorofómio para a extração e do uso de reagentes purificantes

como, por exemplo, o DNA-IQ para posterior amplificação com STR.

A extração de DNA do trato digestivo de insetos, por se tratar de amostras líquidas,

pode também ser efetivada com a utilização do aparelho DNA-IQ System ™, como divulgado

pela organização corporativa Promega Corporation em sua página eletrônica

(https://www.promega.com/products/pm/genetic-identity/dna-iq/dna-iq/), que consiste em um

sistema de isolamento de DNA que emprega partículas paramagnéticas e obtém amostras com

elevado grau de pureza para análises por STR (PROMEGA, 2012).

3.2.2 Principais marcadores moleculares usados na análise de DNA forense

Os marcadores mais usados na análise de DNA para finalidades forenses são os

minissatélites (VNTR) e microssatélites (STR) que são constituídos de sequências repetitivas

de DNA. As sequências de bases divergem entre si de acordo com o número de repetições que

podem ser de 1 a 4 bases no STR e de 10 a 100 no VNTR de acordo com o perfil de DNA de

cada indivíduo. Cada número de repetições que pode ser encontrado representa um alelo

diferente. Estes alelos podem ser analisados utilizando-se a reação em cadeia da polimerase

(PCR) no caso dos STR ou utilizando-se sondas de DNA quando se analisa os VNTR

(DOLINSKY; PEREIRA, 2007).

Especificamente para a identificação de indivíduos do sexo masculino, indica-se a

análise dos marcadores moleculares Y-STR. Esses marcadores permitem realizar a análise de

regiões específicas de microssatélites localizadas no cromossomo Y e que são repassadas de

geração em geração como herança paterna e com pouca ou nenhuma alteração. Esses

marcadores são muito úteis no comparativo de linhagens paternas e em estudos populacionais.

Outros marcadores são os mini-STRs que ajudam a revelar informações a partir de amostras

de DNA degradadas que tipicamente resultariam em perfis parciais e perda total de tipificação

a partir de amplificações STR regulares. E, por último, a utilização de regiões STR padrão

que são ideais para a comparação de resultados (MARJANOVIĆ et al., 2009).

Segundo Cainé (2010) os microssatélites representam uma pequena sequência de DNA

repetitiva de 2 a 7 pares de bases (pb) in tandem e que estão dispersas pelo genoma humano

com uma frequência de 1 STR por cada 300 a 500 kilobases. Este mesmo autor afirma que a

análise de um STR não permite a obtenção de resultados em amostras muito degradadas como

aquelas provenientes do trato digestivo larval. Com isso a pesquisa da região controle (D-

loop) da molécula do DNA mitocondrial (DNAmt) torna-se mais eficiente.

O DNAmt possui transmissão de origem materna e, assim, a observância da molécula

de DNA mitocondrial também permite a identificação de genes herdados pela mãe. O elevado

número de cópias de DNAmt por célula, torna a amplificação mais efetiva e a sua forma

circular reduz a tendência à degradação (CAINÉ, 2010; CRAVEN et al., 2012). Acumulam

mutações cerca de 10 vezes mais rapidamente que o DNA genômico, as regiões

hipervariáveis evoluem ainda mais rapidamente sendo úteis, portanto, no estudo de

acontecimentos recentes e nas investigações de marcadores espécie-específicos (TORRES;

KOSMANN; ARANTES, 2010).

A principal relevância forense da análise do DNAmt é o fato de existirem milhares de

mitocôndrias em cada célula, o que proporciona uma grande disponibilidade de matéria

disponível para extração e análise, mesmo que a amostra coletada seja pequena ou esteja

degrada (TIDBALL-BINZ, 2009).

Paradela; Figueiredo (2012) afirmam que na análise forense do DNA mitocondrial

rotineiramente são usadas sequências das regiões hipervariáveis (HV) I e II. Seguem relatando

que a investigação das regiões HV–I e II pode fornecer informações complementares para

relacionar o cadáver a determinados familiares, na maioria dos casos. Porém, outra aplicação

do DNAmt é a possibilidade de revelar um conjunto de polimorfismos que possibilita agrupar

amostras de um determinado haplogrupo.

A técnica de PCR (MULLIS; FALOONA, 1987) permite a obtenção in vitro de várias

cópias de uma dada região do DNA mitocondrial. A aquisição de novos segmentos

amplificados segue etapas como a extração do DNA molde, a escolha da região a ser

amplificada, a obtenção do iniciador específico para tal segmento a ser reconhecido, a

amplificação propriamente dita com o uso de um ciclador térmico e a leitura após a

eletroforese e coloração.

O uso da PCR possui vantagens como a identificação de alelos de forma simplificada e

alta sensibilidade que permite o exame partindo de quantidades mínimas de DNA, mesmo em

estágio avançado de degradação do material. Porém, as principais desvantagens desta

metodologia são a limitação de estudos de pequenas regiões nas quais são encontradas poucas

repetições de alelos e a alta suscetibilidade a contaminação (PENA, 2005).

Utilizando-se a eletroforese em gel de agarose os produtos das regiões do DNA

mitocondrial gerados pela técnica de PCR podem ser visualizados, pois esta é uma técnica

competente para separar moléculas de diferentes tamanhos quando se aplica uma diferença de

potencial através de um gel imerso em solução tampão, o que permite a migração das

moléculas de DNA negativamente carregadas em direção ao polo positivo (TORRES;

KOSMANN; ARANTES, 2010).

Fazendo uso de ferramentas da bioinformática, programas e equipamentos cada vez

mais sofisticados tornam possíveis a geração e análise de grandes números de sequências de

DNA e dessa maneira identificar SNPs e indels (inseções e deleções de nucleotídeos)

(SILVA, 2009).

Os SNPs e os indels são as bases genéticas da maior parte das variações alélicas e

podem ser abordados como marcadores bialélicos, havendo extensas aplicações no

mapeamento genético de alta resolução e em testes diagnósticos. Tais marcadores podem ser

identificados explorando os bancos de dados públicos e mais atualmente pelo

ressequenciamento de genomas completos (GUIMARÃES et al., 2009).

Estas técnicas podem ser usadas concomitantemente para analisar a simples variação

no tamanho dos alelos gerados por indels de sequências pequenas do DNA como, por

exemplo, fornecendo informações genotípicas sem a associação a outras técnicas (TORRES;

KOSMANN; ARANTES, 2010). Os indels podem ser identificados e analisados a partir de

adaptações de programas de bioinformática já existentes. Por exemplo, no trabalho de

Thiebaut et al. (2008) sequências de DNA associadas a expressão de genes foram analisadas

no programa Codon Code Aligner. Os resultados de tal sequenciamento foram comparados às

informações contidas em um banco de dados previamente estabelecido utilizando os

aplicativos Blast2sequences do NCBI e ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/

index.html) e verificou-se uma diferença de 269 pares de bases. A comparação indicou a

presença de uma mutação do tipo inserção/deleção (indel).

NISHIMAK et al (1999) utilizaram iniciadores de PCR (Direto: 5' CAT GGG GAA

GCA GAT TTG 3' e reverso: 5' TTA GCT ACC CCC AAG TGT 3') para a região HVI do

DNA mitocondrial humano (16030-16481) para a análise de polimorfismos gerados por

indels para a discriminação entre indivíduos chineses e japoneses. Foram investigados 150

indivíduos japoneses e 120 indivíduos chineses. Das análises realizadas foram identificados

108 tipos de sequências para o grupo japonês e 87 tipos de sequências para os indivíduos

chineses. Os autores observaram que alguns indels eram característicos para os indivíduos

asiáticos quando comparados com o grupo externo composto por caucasianos e que alguns

indels eram relacionados a indivíduos localizados em áreas específicas do leste asiático. Dessa

forma, os autores indicam a relevância do uso da análise de indels em DNA mitocondrial para

a identificação humana com finalidade forense.

3.3 Entomologia forense como fonte de DNA para a análise pela genética forense

A entomologia forense pode ser dividida em três áreas (urbana, produtos armazenados

e médico-legal) a entomologia forense torna-se responsável pelo esclarecimento da

responsabilidade e da sequência de fatos ocorridos em um fato delituoso (THYSSEN, 2008).

Fazendo relação com mortes violentas, a entomologia pode esclarecer a identidade da

vítima, a causa da morte, o local da morte e a cronotanatognose, que se refere ao intervalo

ocorrido entre a morte e o momento em que o corpo foi encontrado. Devido a alta

sensibilidade do sistema olfatório dos insetos estes animais são os primeiros a colonizar os

cadáveres nas cenas de crime (MIRANDA et al., 2006).

A entomofauna decompositora desempenha um importante papel ecológico com

envolvimento direto na entomologia forense com as questões médico-legais. Certos

conhecimentos relacionados com a entomologia forense médico-legal se correlacionam com

os estudos relacionados à taxonomia, biologia e ecologia dos táxons envolvidos nos processos

de decomposição cadavérica de animais e seres humanos (URURAHY, 2008).

A putrefação cadavérica é acelerada pela ação desses artrópodes (LOVE;

HAMILTON, 2011), sendo que cada estágio de decomposição do corpo atrai determinado

grupo de insetos. Fatores como temperatura e umidade do ar exercem influência e podem

modificar dados a respeito dos padrões de sucessão ecológica das espécies colonizadoras do

cadáver. Os registros referentes à distribuição geográfica destes táxons tonam-se então, de

fundamental importância para o IPM (CARVALHO; QUEIROZ, 2010).

De acordo com a distribuição geográfica de espécies específicas de insetos

encontrados junto ao corpo é possível determinar o local original onde o corpo foi depositado

(OLIVEIRA-COSTA, 2003).

Carvalho (2012) afirma que as espécies mais encontradas são Chrysomya albiceps,

espécie extremamente voraz que pode ser encontrada em áreas urbanas ou de mata, demonstra

canibalismo e predação da larva e o adulto desta espécie geralmente chega muito rápido ao

cadáver após a morte; Chrysomya putoria é uma espécie que tem preferência por regiões

úmidas; as larvas geralmente são saprófagas, podendo acarretar miíases, e os adultos são

extremamente ágeis e capazes de encontrar carcaças para oviposição logo após a exibição do

corpo (TORRES; KOSMANN; ARANTES, 2010); Chrysomya megacephala, esta espécie

não faz distinção por ambientes urbanos ou de mata, mas é predominante em cadáveres

encontrados em áreas urbanas, possui grande potencial forense para auxiliar na estimativa do

intervalo pós-morte; Lucilia eximia, prefere o estágio inicial da decomposição, porém seu

tempo de desenvolvimento é maior que o de outros indivíduos da família Calliphoridae;

Hemilucilia segmentaria, tem preferência por estágios avançados de decomposição e

demonstra predominância em ambientes de mata; Hemilucilia semidiaphana, importante

indicadora do local de morte e do IPM; Mesembrinella bellardiana e Cochlyomyia macellaria

quando associados ao cadáver somente são encontrados exemplares adultos; Sarconesia

chlorogaster, é utilizada como indicador de área urbana na região sul do Brasil e Pattonella

(Peckia) intermutans é um sarcofagídeo com comportamento de larviposição e de pioneirismo

nos processos decomposição dos cadáveres (CERIGATTO, 2009).

Sandoval (2011) afirma que é grande o número de espécies que se pode encontrar na

cena do crime. Entretanto é de fundamental importância que se faça a coreta identificação do

animal coletado, pois estes podem ser encontrados apenas por frações corporais, em estágios

imaturos ou pulpários. Para tal identificação tem-se utilizado marcadores moleculares como

alternativas aos estudos de caracteres morfológicos destas entomofaunas.

É muito importante, em determinados casos, provar a correlação das larvas com o

corpo relacionado na investigação pericial, ou seja, é necessário provar que a fauna

encontrada e coletada na cena do crime se alimentou daquele corpo ou, até mesmo, se havia

um corpo no local, se era animal ou humano, se era masculino ou feminino. Todas essas

indagações são comprovadas fazendo-se a análise do DNA coletado a partir da extração de

DNA utilizando-se o conteúdo retirado do trato digestivo das larvas coletadas sobre o cadáver

(CARVALHO, 2012).

3.4 Casos associados à entomologia e genética forense para a identificação de

cadáveres

Haskell (2009) cita o caso de um assassino que depositou sua vítima em um estuário

de maré que ficava a 240 km do centro da Bélgica. Foram coletados insetos a partir da grelha

e radiador do carro do suspeito para análise. Os insetos ali identificados eram encontrados

somente a 32 km de distância da costa, eram periódicos e possuíam vida curta como adultos,

em torno de 4 dias. O corpo da mulher havia desaparecido exatamente durante este período de

sobrevida da fase adulta dessa espécie, o que levou à condenação do suspeito.

Tidball-binz (2009) escreveu que foram desenvolvidas várias técnicas para analisar

moléculas de DNA a fim de identificar insetos e DNA humano. Os principais grupos de

insetos estudados para este fim são os mosquitos, piolhos, pulgas e percevejos.

Com o auxílio da genética forense os peritos também são capazes de elucidar a

identificação de suspeitos e/ou vítimas em casos de óbitos (CARVALHO; QUEIROZ, 2010).

Por exemplo, em um episódio de agressão e estupro de uma mulher o criminoso era portador

de piolhos pubianos e sem saber os transmitiu para sua vítima. Os piolhos foram coletados

como prova e deles foram gerados perfis de DNA do criminoso (HASKELL, 2009).

Li et al. (2011) relatam a relevância dos insetos como importante fonte de evidência

de DNA para a identificação de cadáveres em cenas de crime. Entretanto, os autores indicam

o cuidado que o perito deve ter em poder discriminar se o inseto estava colonizando o

cadáver, se é um contaminante presente no ambiente, ou se foi implantado em uma cena de

crime. Isso é crucial para se definir uma evidência por associação.

Dessa forma, os autores realizaram a identificação por DNA mitocondrial e

microssatélites de origem humana a partir do intestino de larvas de Aldrichina grahami

coletadas de várias partes de um cadáver. Após a dissecação das larvas para a remoção do

intestino e coleta do conteúdo gástrico, foi realizada a extração de DNA total e amplificação

por PCR com os iniciadores para a região HV-II do DNA mitocondrial (Direto: L48 5’ CTC

ACG GGA GCT CTC CAT GC 3’ e Reverso: H408 5’ CTG TTA AAA GTG CAT ACC

GCC A 3’). Utilizou-se, também, o kit de análise de STR denominado Applied Biosystems

Identifiler System.

Da análise de DNA mitocondrial foi obtido um produto de amplificação de 200 pb

correlacionado tanto com as amostras de DNA extraídas do cadáver quanto do conteúdo

gástrico do inseto. Além disso, houve congruência de perfis de STR para as regiões D8S1179,

D2S11, D7S820, CSF1PO, D3S1358, TH01, D13S37, D16S539, D2S1338, D19S433, vWA,

TPOX, D18S51, D5S818 e FGA entre o DNA do cadáver e o conteúdo gástrico das larvas.

Das análises obtidas os autores concluíram a possibilidade de se fazer uma associação entre as

evidências de DNA obtidas tanto do cadáver quanto dos insetos que colonizam esse cadáver.

4 CONSIDERAÇÕES FINAIS

É de grande importância o correto manejo das técnicas que evolvem a entomologia e a

genética forense. A concepção de protocolos de coleta, criação e preservação dos insetos traz

uniformidade e precisão às investigações de crimes sexuais e de mortes violentas.

O preparo do material deve ser adequado a cada técnica de amplificação e análise a ser

utilizada e a cadeia de custódia garante o rastreamento das formas de contaminação do

material genético, podendo assim, o pesquisador excluir de suas análises as discrepâncias que

inviabilizam os corretos e seguros resultados que exigem os laudos periciais relativos à

genética forense.

Todas as ciências de utilidades forenses, sozinhas se tornam inúteis, pois é a

interligação existente entre elas que é capaz de refazer os fatos e recontar o caso ocorrido. A

entomologia, com todas as suas peculiaridades, é capaz de afirmar o tempo transcorrido entre

a morte, o local da morte, se a morte foi violenta ou não ou, até mesmo, se realmente havia

um corpo em determinado local.

Contudo, sem a complementação com os dados gerados pelas análises genéticas, a

entomologia forense é incapaz de afirmar se o indivíduo periciado é a pessoa procurada, se há

vestígios de materiais orgânicos diferentes dos da vítima como nos casos, por exemplo, de

estupros seguidos de morte nos quais o agressor deixa seu sêmen no corpo da vítima e os

artrópodes decompositores que se alimentam desse material.

Diante das informações apresentadas nesse trabalho, ressalta-se a importância da

entomologia e da análise de DNA para a identificação forense, assim como, a atividade

multidisciplinar com as demais áreas científicas que atendem aos foros.

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