a doença de chagas na refião amazônica

5/22/2018 A Doena de Chagas Na Refio Amaznica

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O risco da doena de Chagas se tornar endmica na Regio

Amaznica (a maior floresta tropical do mundo, habitada por mais

de 30 milhes de pessoas) est relacionado intensa migrao de

pessoas de reas com incidncia significativa da doena, carregandoparasitos e vetores j adaptados ou pela adaptao de vetores e

animais silvestres (infectados com o Trypanosoma cruzi) ao domiclio

humano, em consequncia do desflorestamento incontrolado na

regio. A grande regio no Brasil e no conjunto dos pases amaznicos,

correspondendo a uma vasta rea de 7.702.264 km2 (Figura 1),

denominada Panamaznia.

Mais de 25 espcies de triatomneos silvestres de nove gneros edezenas de espcies de reservatrios j foram descritas na regio, a

maioria infectada pelo Trypanosoma cruzi.

A invaso das casas por triatomneos silvestres adultos (que vivem

em palmeiras prximas) atrados pela luz muito frequente na regio

amaznica (Figura 2).

Da mesma forma, a presena de animais silvestres, principalmente

Didelphis marsupialis, com elevadas taxas de infeco pelo T. cruzitem

sido encontrada no peridomiclio e intradomiclio naquela regio.

Um nmero crescente de casos agudos da doena de Chagas

tem sido descrito praticamente em todos os nove pases da regio

amaznica, alguns deles em surtos epidmicos atribudos a transmisso

oral atravs de alimentos contaminados (sucos de frutas, carne mal

cozida de animais silvestres e outros alimentos contaminados).

A DOENA DE CHAGASNA REGIO AMAZNICA

Jos Rodrigues Coura, Carlos Jos de Carvalho Moreira, Angela C.V. JunqueiraLaboratrio de Doenas Parasitrias, Instituto Oswaldo Cruz Fiocruz

Av. Brasil, 4365 Rio de Janeiro RJ 21040-360


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Casos crnicos da doena com cardiopatia grave tm sido

documentados, principalmente em coletores de fibra da piaava na

regio do Rio Negro, na Amaznia Brasileira.

Um programa de vigilncia que contemple os perfis de transmisso

na Panamaznia deve ser implementado de forma continuada

e uniforne nos prximos anos. consenso que em curto e mdio

prazo se evite a endemizao da doena de Chagas na regio.

Aes planejadas de controle e preveno devem ser inseridas para

Figura 1:Panamaznia. Seu territrio ocupado pelos seguintes pases: Bolvia,Brasil, Colmbia, Equador, Guiana, Peru, Suriname, Venezuela

e o territrio ultramarino da Frana, a Guiana Francesa.


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evitar que se reproduza o perfil das reas endmicas clssicas com

estabelecimento do triatomneo no intra e peridomiclio.

Em 2004 foi criada a Iniciativa Internacional para Vigilncia e

Preveno da Enfermidade de Chagas na Regio Amaznica (AMCHA),

j tendo sido realizada a 6 reunio e diversos cursos para treinamentode tcnicos, no reconhecimento do T. cruziem lminas na rotina do

diagnstico de malria.

Figura 2:Habitat de triatomneos silvestres e de Didelphis

marsupialisinfectados com T. cruzina regio amaznica.


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REFERNCIAS PARA CONSULTA

AGUILAR, M. M.; ABAD-FRANCH, F.; DIAS J.C.P.; JUNQUEIRA A.C.V.;COURA, J.R. Chagas disease in the Amazon Region. Memrias doInstituto Oswaldo Cruz, v. 102 (Suppl. I), p. 47-55, 2007.

ALBAJAR, P.V.; LAREDO, S.V.; TERRAZAS, M.B.; COURA, J.R. Miocardiopatiadilatada em pacientes com infeco chagsica crnica. Relato de doiscasos fatais autctones do Rio Negro, Estado do Amazonas. Revista daSociedade Brasileira de Medicina Tropical, v.38, p. 82-89, 2003.

BRENER, Z. ; ANDRADE, Z.A. ; BARRAL-NETTO, M. Trypanosoma cruzie Doena de Chagas. Editora Guanabara Koogan 2 Edio, Rio deJaneiro, 431 p. 2000. (Excelente livro para quem deseja especializar-

se no assunto).

COURA, J.R. Chagas disease: what is known and what is needed Abackground article. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz, (Suppl I),p.113-122, 2007.

COURA, J.R.; JUNQUEIRA, A.C.V., CARVALHO-MOREIRA, C.J.; BORGES-PEREIRA, J; ALBAJAR VIAS, P. Uma viso sistmica da endemiachagsica. In: Silveira AC, La Enfermedad de Chagas a la puerta delos 100 aos de uma endemia americana ancestral. OrganizacinPanamericana de la Salud y Fundacin Mundo Sano, Washington DC yRepblica Argentina. Publicacin Monogrfica 7, p. 25-35, 2007.

DIAS, J.C.P.; COURA, J.R. Clnica e Teraputica da Doena de Chagas.Uma abordagem prtica para o clnico geral. Rio de Janeiro: EditoraFiocruz, 1997. 486 p.

DIAS, J.C.P.; MACEDO, V.O. Doena de Chagas. In: JR Coura, Dinmicadas Doenas Infecciosas e Parasitrias, Rio de Janeiro: EditoraGuanabara Koogan, 2005. p. 555-593.

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JUNQUEIRA, A.C.V.; ALBAJAR, P.V.; COURA, J.R. Doena de Chagas naAmaznia Brasileira. In: JR Coura, Dinmica das Doenas Infecciosase Parasitrias, Rio de Janeiro: Editora Guanabara Koogan, 2005. p.595-603.

MOTA, J.; CHACON, J.C.; GUTIERREZ-CABRERA, A.E.; SANCHEZ-CORDERO, V.; WIRTZ, R.A. Identification of blood meal source andinfection with Trypanosoma cruziof Chagas disease vectors using amultiplex cytochrome b polymerase chain reaction assay. Vector BorneZoonotic Disease, v. 7, p. 617 27, 2007.

MUKABANA, W.R.; TAKKEN, W.; KNOLS, B.G. Analysis of arthropodbloodmeals using molecular genetic markers. Trends in Parasitology,v.18, p. 505 09, 2002.

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infestansfrom Chuquisaca, Bolivia. PLoS One. v. 3, p. 3585, 2008.STEUBER, S.; ABDEL-RADY, A.; CLAUSEN, P.H. PCR-RFLP analysis: apromising technique for host species identification of blood mealsfrom tsetse flies (Diptera: Glossinidae). Parasitology Research, v. 97,247 -54, 2005.

TOWNZEN, J. S.; BROWER, A. V.; JUDD, D. D. Identification of mosquitobloodmeals using mitochondrial cytochrome oxidase subunit I and

cytochrome b gene sequences.Medical and Veterinary Entomology, v.22, p. 386 - 93, 2008.

XAVIER, S.S.; SOUZA, A.S.; ALBAJAR, P.V.; JUNQUEIRA, A.C.V.; BIA, M.N.;COURA, J.R.Cardiopatia chagsica crnica no Rio Negro, Estado doAmazonas. Relato de trs novos casos autctones, comprovados porexames sorolgicos, clnicos radiogrficos do trax e ecocardiogrficos.Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v. 39, p.211-

216, 2006.


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1. O Trypanosoma cruzi

O Trypanosoma cruzi (Chagas 1909), um protozorio

pertencente ao filo Sarcomastigophora, subfilo Mastigophora,classe Zoomastigophora, ordem Kinetoplastida, subordemTrypanosomatina e famlia Trypanosomatidae.

Essa espcie de parasita desenvolve o seu ciclo de vida em

hospedeiros vertebrados (mamferos) e invertebrados (triatomneos),

onde assume estdios evolutivos diferentes (Hoare 1972). Assim como

outros Kinetoplastidas, o T. cruzicontm uma organela caracterstica,

chamada cinetoplasto. O DNA, ou KDNA, contido nessa organela

constitui-se de molculas organizadas em forma de maxicrculos eminicrculos.

Entre os hospedeiros mamferos do T. cruzi est o homem,

no qual se desenvolve uma infeco cuja resultante a doena de

Chagas. Essa infeco autctone nas Amricas, onde se estima uma

prevalncia entre 10 a 12 milhes de pessoas infectadas.

Entre as possveis formas de transmisso do T. cruzi ao homem,

as consideradas mais importantes so a vetorial ou contaminativa

(entre 70 e 90 % dos casos), a transfusional (1 a 20 %) e a congnita

(0.5 a 10 %).

Na vetorial a contaminao ocorre por solues de continuidade

na pele ou mucosas ntegras em contato com fezes infectadas

eliminadas durante ou aps o repasto sanguneo. At a presente

data j foram descritas 141 espcies de triatomneos, potencialmentetransmissoras do T. cruzi, classificadas em 5 tribos e 15 gneros. A

transmissotransfusional pode variar entre 12,5% e 25% para cada

500 ml de sangue total transfundido, especialmente na ausncia de

controle de qualidade em bancos de sangue.

Acredita-se que a transmisso congnita ocorra principalmenteaps o segundo trimestre de gestao. Outros modos de transmisso

so: por via digestiva (oral), tipicamente em forma de surtos; acidental


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e atravs de transplantes de rgos. Excepcionalmente, pode ocorrer

a transmisso por via sexual e por vetores no triatomneos (ex:

Cimicdeos).

O T. cruzipode ser encontrado infectando hospedeiros nos mais

diferentes ectopos: nos desertos norte-americanos, nos altiplanosandinos, nas florestas amaznica e atlntica e no complexo caatinga-

cerrado-pampa mido. Dentre esses ectopos, alguns albergam

outras espcies de tripanossomos (Figura 3), como o Trypanosoma

rangeli(Tejera 1920), que compartilha com oT. cruzia capacidade de

infectar mamferos e triatomneos (Tabela 1). O T. rangeli, porm, no

patognico para o homem apesar de ser encontrado infectando o

mesmo. Esses dados devem ser considerados nos estudos envolvendoambas as espcies, j que compartilham formas evolutivas semelhantes.

O esquema do ciclo evolutivo e a forma de transmisso vetorial de

ambas as espcies so expostos nas pginas seguintes.

Tabela 1:Exemplos de subgneros e espcies de tripanossomas,com a seco de desenvolvimento no vetor e tipo detransmisso e fluido infectado segundo Hoare (1972).

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(*) No existe consenso sobre a classificao taxonmica do T. rangeli.Alguns autores o classificam na seco Stercoraria e outros na Salivaria,apesar da transmisso ser principalmente inoculativa. Os autoressugerem como leitura complementar o captuloTripanossomase rangelidolivro Dinmica das Doenas Infecciosas e Parasitrias (COURA et al., 2005).

1.1 DIFERENTES ESTDIOS EVOLUTIVOS DO T. cruzi

O T. cruziapresenta formas evolutivas com aspectos morfolgicos

distintos, tanto no organismo vertebrado como no inseto vetor.

A superfcie celular dessas diferentes formas constituda por

macromolculas de composio varivel, o que reflete na interao

do parasita com a clula hospedeira. Alm das trs principais formas

abordadas nas pginas seguintes, uma srie de outras formas

intermedirias podem tambm ser observadas.

Figura 3:Origem geogrfica de 4 diferentes grupos de T. rangeli(A , B , C , D ) identificados no estudo filogentico

de Maia da Silva, F. et al. (2004).


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Fotografias de Snia Gumes Andrade - CPqGM/FIOCRUZ.

Figura 4:Forma amastigota de T. cruzi: B) amastigota em um macrfago;C) amastigota no corao; D, E) amastigotas no megaesfago.

A forma amastigotade multiplicao intracelular encontrada em

mamferos e tambm em cultivo celular (Figura 4).

Depois que os tripomastigotas invadem as clulas (por fagocitose,

endocitose ou penetrao ativa), para no serem destrudos

pelo sistema imune do hospedeiro, transformam-se nas formasamastigotas.

Estas se localizam nas fibras musculares esquelticas, cardacas

e lisas, clulas do sistema monoctico fagocitrio, sistema nervoso

central e sistema nervoso perifrico. Em pacientes imunodeprimidos

esse tropismo pode se modificar.


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Desenho de Bruno Eschenazi. Fotografia de Carlos Jos de C. Moreira - IOC/FIOCRUZ.

Figura 5:Forma epimastigota de T. cruzi: A) desenho;B) epimastigota em esfregao de fezes de triatomneo.

O epimastigota a forma de multiplicao no intestino do inseto

(Figura 5). A multiplicao ocorre por diviso binria longitudinal. Essa

forma, tambm encontrada nos meios axnicos (in vitro), est presente

na fase exponencial de crescimento. Os antgenos de superfcie de

epimastigota so tradicionalmente utilizados nas provas sorolgicasde diagnstico e como antgeno nas reaes de imunofluorescncia

indireta.

O tripomastigota uma forma do T .cruzique no se multiplica. encontrado no inseto vetor (tripomastigota metacclico), no sangue

e espao intercelular e tambm na cultura de clulas. As formas

encontradas no sangue podem apresentar-se com morfologias

distintas, podendo ser classificadas como forma delgada, larga e muito

larga (polimorfismo). Na figura 6 apresentam-se exemplos da forma

larga e delgada.

Desenho de Bruno Eschenazi. Fotografias de Carlos Jos de C. Moreira - IOC/FIOCRUZ.

Figura 6:Forma tripomastigota de T. cruzi. A) desenho;B, C) formas larga e delgada do T. cruzi, respectivamente.


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1.2 CICLO DOTrypanosoma cruziNO VERTEBRADOO triatomneo infectado, ao sugar o sangue, deposita suas fezes

contendo formas tripomastigotas metacclicas normalmente perto

do local da picada. Essas formas penetram por uma soluo de

continuidade na pele ou atravs das mucosas ntegras. Dentro doorganismo do vertebrado, os tripomastigotas invadem diferentes

tipos de clulas, transformando-se em amastigotas. O parasita tem

tropismo por clulas musculares estriadas e lisas, macrfagos e

tambm por clulas epiteliais e fibroblastos. As formas amastigotas

dividem-se por diviso binria, formando pseudocistos que se

rompem. Dentro destes pseudocistos, os amastigotas transformam-

se em tripomastigotas que so liberados, aps a ruptura da clula,atingindo a circulao sangunea, indo infectar novas clulas (Figura

7 A).

1.3 CICLO DOTrypanosoma rangeliNO VERTEBRADOAt hoje no conhecida a forma e o local da multiplicao

do parasita nos hospedeiros vertebrados. No homem a infeco

considerada benigna e pode persistir por at um ano e meio semmanifestaes clnicas. De forma excepcional, em 1951, o Dr. Torrealba

(apud Pessoa, S. B.), em seus estudos na Venezuela, relatou casos

agudos da infeco no homem, descrevendo sintomas equivalentes

infeco por T. cruzi,como febre, poliadenite, hepatoesplenomegalia

e anemia (Figura 7 B).

1.4 CICLO DOT. cruzi NO INVERTEBRADOO inseto vetor pica os hospedeiros vertebrados infectados,

sugando tripomastigotas presentes na corrente sangunea. As formas

tripomastigotas transformam-se em epimastigotas e esferomastigotas,

medida que migram pelas diferentes pores do intestino do inseto. As

formas epimastigotas colonizam preferencialmente o intestino mdio.

Neste local, as formas epimastigotas multiplicam-se intensamente

por diviso binria. Aps ocorrer a adeso do parasita ao epitlio,

atravs do flagelo, alguns desses epimastigotas transformam-se em


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tripomastigotas na poro final do tubo digestivo (ampola retal). As

formas resultantes dessa transformao, denominada metaciclognese,

so denominadas tripomastigotas metacclicas (formas infectantes),

que so encontradas principalmente no reto do inseto vetor. As formasesferomastigotas tambm podem transformar-se diretamente em

formas metacclicas. As formas infectantes so eliminadas com as fezes

ou com a urina, quando o inseto pica novamente um outro indivduo,

pois esses insetos tm o hbito frequente de defecar durante ou logo

aps o repasto sanguneo. O processo de metaciclognese ocorre

naturalmente no intestino do inseto vetor. Este fenmeno regulado

pela interao de produtos da secreo intestinal e por produtosderivados da digesto do sangue ingerido (Carvalho-Moreira et al.,

2003), assim como pela falta destes ltimos (reduo de nutrientes),

pois os triatomneos por vezes podem ficar privados de alimentao

por muito tempo na natureza. A metaciclognese pode tambm ser

conseguida in vitro, em condies qumicas definidas atravs do

estresse nutricional, atravs da incubao em um meio de diferenciao

artificial denominado TAU 3AAG, por exemplo.

Figura adaptada de REY, L. Parasitologia. 3 ed.: Guanabara Koogan, 2001, porBruno Eschenazi, Angela C. V. Junqueira e Carlos Jos de C. Moreira - IOC/FIOCRUZ.

Figura 7:Esquemas representativos dos ciclosde vida do T. cruzi(A) e do T. rangeli(B).


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1.5 CICLO DOT. rangeli NO INVERTEBRADOOT. rangeli foi descrito pela primeira vez na Venezuela, em 1920

(Tejera, 1920), como sendo uma espcie de parasita encontrada

exclusivamente na Amrica Central e na Amrica do Sul, onde

apresenta maior prevalncia na primeira e no Noroeste da Amrica doSul.Compartilha hospedeiros mamferos e vetores com o T. cruzi. A

primeira descrio de infeco humana comprovada no Brasil foi feita

por Coura et al., em 1996.Em condies naturais, o triatomneo ingere

o sangue de algum mamfero infectado com as formas tripomastigotas

sanguneas. Essas se transformam em epimastigotas na parte mdia

do trato digestivo do triatomneo. O T. rangeliconsegue atravessar o

epitlio do intestino do barbeiro, invadindo a hemolinfa. Uma vez nahemolinfa, ativa o sistema de defesa do inseto. Quando consegue

escapar deste sistema de defesa, o parasita atinge as glndulas

salivares, onde realiza a metaciclognese, transformando-se na

forma tripomastigota metacclica infectante, que ser transmitida a

outro mamfero pela picada. A seguir, so mostradas a anatomia do

tubo digestivo do triatomneo e a morfologia das principais formas

evolutivas do T. cruzie do T. rangelino inseto vetor (Figuras 8A, 8B e8C).


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Figuras desenhadas por Bruno Eschenazi, elaboradas porAngela C.V. Junqueira e Carlos Jos de C. Moreira.

Figura 8:Anatomia interna do triatomneo (A) e principais formasevolutivas do T. cruzi(B) e T. rangeli(C) no inseto vetor.

2.1Blastocrithidiasp

Alguns triatomneos capturados no campo podem albergar

naturalmente o tripanossomatdeo monogentico Blastocrithidia sp. A

forma de transmisso ocorre quando um inseto se alimenta das fezes

de outro inseto (coprofagismo-CO) ou quando ele se alimenta em outroinseto (canibalismo-CA), porm na natureza isso no frequente. As

possibilidades de contaminao aumentam quando os triatomneos

so mantidos em reas restritas, como ocorre nos insetrios, quando

o jejum prolongado. Nessas situaes eles tendem a praticar a

coprofagia e possivelmente o canibalismo, o que facilita o processo

de transmisso. As figuras 9 e 10 demonstram respectivamente o ciclo

evolutivo e formas epimastigotas de Blastocrithidia triatomae.

2. OUTRA ESPCIE DE TRIPANOSOMATDEO ENCONTRADA

NOS TRIATOMNEOS


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Foto de Angela C. V. Junqueira.

Figura 10: Formas epimastigotas de Blastocrithidia triatomae.

Figuras adaptadas por Bruno Eschenazi, Angela C.V. Junqueira e Carlos Jos de C. Moreirado site: http//:parasitology.informatik.uniwuerzburg.de/login/n/h/0163.html).

Figura 9: Ciclo da Blastocrithidia sp.


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3. CICLOS BIOLGICOS DE TRANSMISSO

Segundo Dias (1958) e Forattini (1980), o ciclo primitivo do T.cruzi de natureza enzotica, circulando o parasita entre vetores e

reservatrios silvestres (Figura 11). A doena de Chagas humana

uma situao recente, causada pelo crescimento e disperso da

populao humana com a consequente aproximao dos locais onde

existe esse ciclo.

Podemos dizer que a doena de Chagas foi e continua sendo

uma endemia basicamente rural, de populaes de baixa renda e de

pouca cultura, que vivem em condies precrias, onde ela no foi

erradicada, favorecendo a domiciliao de algumas espcies vetoras,dando origem ao chamado ciclo domstico do parasita. Entretanto,

esse quadro vem se modificando com o sucesso de alguns programas

de controle.

Ref: Pessoa, S. 1962. Domiciliao dos triatomneos e epidemiologia da doena de Chagas.Arq. Hig. Sade Pub. 27 (92): 161-171.

Figura 11: Ciclos biolgicos do Trypanosoma cruzi.


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Outros perfis tm sido descritos. Triatomneos silvestres podem

infectar o homem e os animais domsticos em seu habitat natural,

levando ao aparecimento de casos ocasionais da doena de Chagas,

denotando a no necessidade de triatomneos domiciliados para que

ocorra a transmisso vetorial.As pginas seguintes ilustram diferentes modelos de ciclos

biolgicos do T.cruzi e algumas das principais espcies de triatomneos

existentes na Regio Amaznica. Nos ltimos anos vem merecendo a

ateno o nmero crescente de casos agudos na regio onde no

tm sido descritas espcies domiciliadas com exceo doTriatoma

maculata.

3.1 CICLO DOMSTICO

Os triatomneos, que so insetos estritamente hematfagos,

podem encontrar em algumas habitaes humanas as condies

ideais de sobrevivncia, possuindo abrigo e oferta alimentar, tornando-

se insetos domiciliados (Figura 12A). Esse fenmeno (domiciliao)

tornou a transmisso vetorial o principal mecanismo primrio da

propagao da doena de Chagas. A domiciliao e a colonizaomostraram-se eficientes para certo nmero de espcies, como por

exemplo, o Triatoma infestansno Brasil.

3.2 CICLO PERIDOMSTICOAlgumas espcies de triatomneos podem assumir uma biologia

especial, adaptando-se a viver em reas em torno das habitaes

humanas, como telheiros, stos, chiqueiros, galinheiros etc, nutrindo-

se do sangue de animais domsticos, conforme o exemplo da Figura

12 B. No Brasil, entre as principais espcies de tritomneos encontradas

neste modelo de ciclo biolgico, podemos citar o Triatoma sordidae

T. pseudomaculata.

importante ressaltar que uma mesma espcie pode ser encontrada

tanto no domiclio como no peridomiclio.


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Desenho de Bruno Eschenazi e Angela C.V. Junqueira.

Figura 12: Ciclos biolgicos domstico (A) e peridomstico (B) do T. cruzi.

3.3 CICLO SILVESTRE

O aparecimento da doena de Chagas ocasional, como demonstrado

em algumas reas da Regio Amaznica, vem sendo verificado entre os

trabalhadores que extraem as fibras da palmeira Leopoldinia piassaba.

Esses trabalhadores ficam expostos ao contato com triatomneos da

espcie Rhodnius brethesi, denominados localmente de piolhos da

piaava, que habitam a referida palmeira. Esse contato contnuo,uma vez que o extrativista fixa sua moradia perto do local de extrao.

A Figura 13 demonstra possveis formas de infeco do homem

no ambiente silvestre pelo T. cruzi: por exposio ao vetor durante

o trabalho de extrao da fibra (Figura 13A) ou pela exposio

picada durante noite em colocaes, nos locais de acampamento

(Figura 13B).


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Fonte: JUNQUEIRA, A.C.V. Trypanosoma cruzi Chagas, 1909 em reas do Mdio e Alto Rio Negro-Amazonas, Brasil. 2005. 134 p. (tese de doutorado) Universidade de So Paulo, So Paulo.

Figura 13: Ciclo biolgico do T. cruzi, em reas de extrativismo daRegio do Mdio e Alto Rio Negro, Estado do Amazonas, Brasil (A, B).


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3.4 CICLO DE TRANSMISSO ORAL

A transmisso por via oral acontece pela ingesto de alimentos

contaminados com o parasito. Essa contaminao pode ser natural ou

externa. A natural ocorre pela ingesto de carne crua ou mal cozida

de animais infectados, ou pelo leite materno (situao espordicae rara); a contaminao externa ocorre pela deposio de fezes ou

urina de triatomneos sobre o alimento ou mesmo de secreo anal

de marsupiais infectados.

Segundo Barreto (1979), esse tipo de transmisso (oral) usual

entre os mamferos do ciclo silvestre da tripanossomase americana,

que ingerem triatomneos ou a carne de mamferos infectados. Com

relao ao homem no havia muitos relatos na literatura, porm apartir da ltima dcada vrios casos tm sido descritos na Amaznia

brasileira, grande parte deles atribudos ingesto de suco de frutos

de palmeiras contaminados com a forma infectante doT.cruzi, oriunda

de triatomneos infectados (Tabela 2). S na Amaznia brasileira j

foram descritas 25 espcies de triatomneos (Aguilar et al., 2007),

estando algumas delas representadas na pgina seguinte (Figura 14).

No ciclo biolgico a seguir, est representado o possvel modelo

de transmisso oral ocorrido no municpio de Mazago, no Estado

do Amap, onde foram registrados 17 casos de infeco aguda de

doena de Chagas. Valente et al.(2009) atriburam a provvel fonte de

infeco ao suco de aa preparado em mquina eltrica, possivelmente

contaminada com fezes ou tubo digestivo de triatomneos infectados

(Figura 15).Em maro de 2005, ocorreu um surto da doena em Santa Catarina,

onde os dados epidemiolgicos, levantados por tcnicos do Ministrioda Sade e da Secretaria Estadual de Sade, indicavam que a nicafonte de infeco comum seria a ingesto de caldo de cana contendoformas infectantes do T. cruzi.Os trabalhos de campo sugeriram quea contaminao tenha ocorrido durante a moagem da cana-de-acarjunto com inseto vetor infectado, vindo da mata prxima ao local deprocessamento do caldo.


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Fotos: Rodrigos Mxas e Marco Aurlio P. da Silva. Layout: Rodrigos Mxas.

Figura 14: Algumas espcies vetoras da Regio Amaznica.


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Fonte: boletim Informativo sobre vigilncia epidemiolgica da doena de ChagasFUNASA- Instituto Evandro Chagas.

Figura 15: Ciclo biolgico do T. cruziem outra rea da Regio Amaznica.

Fonte: SVS/MS. Dados sujeitos modificao. Dados atualizados at agosto de 2011.http://portal.saude.gov.br/portal/saude/profissional/visualizar_texto.cfm?idtxt=31454

Tabela 2: Casos de Doena de Chagas Aguda no Brasil de 2007 a 2010.


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4. DIAGNSTICO LABORATORIAL DA INFECO PELOTrypanosoma cruzi

Segundo Luquetti & Rassi (2000): ... o diagnstico da infeco

pelo T. cruzi deve ser apoiado pela epidemiologia, pela clnica e

confirmado quanto etiologia, pelo diagnstico laboratorial queoferece importantes subsdios, desde que realizados com tcnicas

apropriadas, reagentes adequados e seguindo as boas prticas de

laboratrio....Podemos tomar isso como uma norma a ser seguida.

Dentro do conhecimento geral do curso da infeco, imprescindvel

que fique consolidado o conceito de que a infeco pelo T. cruzi

no homem apresenta duas fases. A fase inicial ou fase aguda

caracterizada pela relativa facilidade com que se evidencia o parasitono sangue perifrico, com manifestaes clnicas gerais de porta de

entrada do parasito; tais manifestaes so caractersticas e conduzem

suspeita imediata de uma infeco aguda, e que se confirma com

a deteco do parasito no sangue. importante ressaltar que nem

sempre essas manifestaes se fazem presentes. Em contraste, na fase

seguinte, ou fase crnica, ocorre a diminuio do nmero de parasitos

na corrente sangunea, sendo por isso difcil seu encontro no exameparasitolgico direto. Neste caso, utilizam-se mtodos parasitolgicos

indiretos e de enriquecimento, que demonstram maior sensibilidade

que os diretos e que permitem o isolamento do parasita para estudos

de identificao e caracterizao. Na fase crnica ocorre um perodo

de latncia clnica, na maioria dos casos, cujas manifestaes podem

aparecer anos aps a infeco (Prata, 1968; Dias & Macedo, 2005).

O diagnstico laboratorial da infeco pelo T. cruzi pode ser

dividido, didaticamente, em 3 categorias: parasitolgicos, moleculares

e sorolgicos. Alguns autores dividem em apenas dois grupos:

parasitolgicos e sorolgicos.

Os mtodos parasitolgicos baseiam-se na demonstrao do

parasito sob a forma de tripanossoma no sangue e outros lquidos

orgnicos, ou ento sob a forma de leishmania (amastigotas) nos


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tecidos. Segundo o procedimento, esses mtodos so classificados

em diretos e indiretos, conforme mencionado anteriormente.

Recentemente, com o surgimento da tecnologia da PCR (Polymerase

Chain Reaction), um grande avano foi conseguido no diagnstico dos

agentes infecciosos. No final da dcada de 80, vrios ensaios surgiramutilizando a PCR na deteco do T. cruzi, ficando demonstrada a sua

maior sensibilidade em relao aos mtodos parasitolgicos clssicos.

A PCR consiste na sntese enzimtica,in vitro, de milhes de cpias de

uma sequncia especfica de DNA do patgeno.

A outra linha de procedimentos adotados a dos mtodos

sorolgicos, que tm como princpio a ligao antgeno (Ag)-anticorpo(Ac), cuja ligao pode ser revelada por protocolos com fundamentos

tcnicos distintos.

A grande maioria dos testes utilizados na rotina baseia-se na

pesquisa de Acs no soro ou plasma, sendo bem menos usual a deteco

de Ags. Seu emprego no diagnstico da infeco bem abrangente, o

que se deve em grande parte a sua elevada sensibilidade, otimizao

e custos relativamente baixos em relao aos outros mtodos, sendo

o mtodo laboratorial de escolha nas triagens de doadores de sangue

e inquritos epidemiolgicos.

fundamental que fique bem compreendido que A DCA corresponde

ao perodo inicial da infeco peloTrypanosoma cruziem mamferos,

podendo apresentar-se aparente ou inaparente. Define-se basicamente

pela alta parasitemia detectvel por exames parasitolgicos diretosdo sangue, tendo durao geralmente efmera no ser humano (entre

trs e oito semanas), podendo ser letal em crianas de baixa idade e

indivduos imuno-comprometidos ou evoluir para uma forma crnica

de longa durao que se caracteriza por baixssima parasitemia e

um elevado e consistente teor de anticorpos da classe IgG (Figura

16). Desta forma, o mtodo de escolha para o diagnstico estar

condicionado fase da infeco apresentada pelo indivduo.


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4.1 EXAMES PARASITOLGICOS DIRETOSDemonstram a presena da infeco atravs da visualizao dos

parasitos ao microscpio ptico. Tm alta especificidade e sensibilidade

na fase inicial da infeco (casos agudos) e muito baixa sensibilidadenos casos crnicos.

4.1.1 GOTA DE SANGUE EXAMINADA A FRESCOPesquisa direta do parasito na amostra biolgica, sem submet-

lo a processos de fixao e colorao. O sangue colocado entre

a lmina e a lamnula e examinado ao microscpio ptico com o

aumento de 400 vezes (400 x). Os parasitos so visualizados pelos

seus rpidos movimentos por entre as hemcias, que so por elesdeslocadas (Luquetti & Rassi, 2000).

4.1.2 DISTENSO FINA E GOTA ESPESSA

Como no mtodo anteriormente citado, a tcnica baseia-se na

pesquisa direta do parasita na amostra clnica, que submetida a

processos de fixao e colorao. O sangue pode ser coletado por

puno venosa ou digital, de preferncia sem o anticoagulante, que

Figura 16: Curva parasitmica nas fases aguda e crnica da doena de Chagas.Fonte: Manual Prtico de Subsdeo Notifio Obrigatria no SINAN, disponvel no

site http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/manual_chagas.pdf


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altera a fixao do material. As tcnicas que empregam colorao

permitem a caracterizao morfolgica do T. cruzie a sua diferenciao

do Trypanosoma rangeli, sendo importante sua utilizao onde as

duas espcies so encontradas coabitando. Nesse exame poderemos

encontrar diferentes formas de T. cruzi presentes no sangue perifrico(Figura 17).

Fonte: Brener Z., Chiari E. Variaes morfolgicas observadas em diferentes amostras deTrypanosoma cruzi. Revista do Instituto de Medicina Tropical de So Paulo, v. 5, p. 220-224, 1963.

Figura 17: Exemplo de diferentes formas tripomastigotas de T.cruzipresentes nosangue de camundongos infectados experimentalmente (polimorfismo):

A) formas finas; B) formas largas; C) formas muito largas.

4.1.3 MTODOS DE CONCENTRAO DE PARASITASSo mtodos que permitem a investigao direta do parasita

na amostra clnica concentrada por centrifugao. Entre os mais

empregados na rotina laboratorial esto o micro-hematcrito(Secretaria Nacional de Vigilncia em Sade, Ministrio da Sade.Doena de Chagas Aguda: Manual prtico de Subsdio Notificao

Obrigatria no Sinan- http://portal.saude.gov.br/saude/), o mtodode pesquisa do parasita no creme leucocitrio(Rey, L. Mtodos etcnicas usuais em parasitologia. In: Parasitologia. 3 Ed. Rio de Janeiro:

Guanabara Koogan, 2001. p.788) e o mtodo de concentrao de

Strout(Strout, 1962).


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No MTODO DE MICRO-HEMATRCRITOexamina-se o sangue dopaciente com anticoagulante, aps centrifugao, em um microtubo

capilar.

Para tal, o sangue pode ser coletado inicialmente em tubo coletor

com EDTA ou heparina e ento transferido, por capilaridade, paraum microtubo capilar seco. O sangue pode ser tambm coletado,

por puno digital, empregando o prprio microtubo capilar com

anticoagulante.

Deve-se preencher, aproximadamente, 2/3 do microtubo por

capilaridade. Para isso, inclinar com cuidado o tubo contendo o

sangue e introduzir uma das extremidades do microtubo no interior

do mesmo; o sangue entrar por capilaridade. Sugerimos encher pelo

menos dois microtubos por amostra suspeita.

Aps o preenchimento, limpar externamente, com papel

absorvente, o lado do microtubo que entrou em contato com o sangue.

Aps a limpeza, o lado do microtubo que ficar mais distante do

centro do rotor da centrfuga dever ser vedado/selado com massa

selante apropriada. Durante esse processo, fechar a extremidadeoposta do microtubo com o dedo; isso evitar que o sangue escorra na

massa durante o procedimento de vedao.A seguir, pressionar umadas extremidades do microtubo na massa selante em movimento de

rotao, preenchendo 0,3 - 0,5 cm do microtubo com massa.

Depois de vedado, o microtubo deve ser transferido para uma

microcentrifuga apropriada e centrifugado por 5 a 10 minutos a

160 g (Figuras 18A e B). Colocar o capilar na centrfuga de micro-hematcrito com a extremidade vedada para o lado externo. Os

microtubos devem estar balanceados, ou seja, um microtubo capilar

em posio oposta ao outro. Imediatamente aps a centrifugao,

o tubo deve ser levado ao microscpio onde examina-se o creme

leucocitrio (interface entre as camadas de plasma e hemcias),

empregando aumento de 100x (Figuras 18 C e D). Outra opo ,

com cuidado e utilizando equipamentos de proteo individual para


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evitar contaminao acidental, quebrar o microtubo na regio prxima

ao creme leucocitrio e retir-lo para exame entre lmina e lamnula

com aumento de 400x. Frente a casos suspeitos com exame inicial

negativo, o mtodo deve ser repetido em horrios diferentes durante

alguns dias (WHO Technical Report Series, 1991; Secretaria Nacional deVigilncia em Sade, Ministrio da Sade. Doena de Chagas Aguda:

Manual Prtico de Subsdio Notificao Obrigatria no Sinan).

Fotografias de Carlos Jos de Carvalho Moreira e desenhos de Bruno Eschenazi.

Figura 18: Centrfuga de microhematcrito (A, B), microcapilar aps acentrifugao (C), microcapilar montado em lmina para exame

ao microscpio e destaque da rea a ser examinada (D).

No MTODO DE STROUT, coleta-se 5 a 10 ml de sangue semanticoagulante e faz-se uma dupla centrifugao. Aps a primeira

centrifugao a 160 g por 3 minutos, o sobrenadante separado

sendo novamente centrifugado a 400 g por 20 min. O sedimento

resultante ento examinado entre lmina e lamnula com aumento

de 400x (WHO Technical Report Series, 1991; Secretaria Nacional de

Vigilncia em Sade, Ministrio da Sade. Doena de Chagas Aguda:

Manual prtico de Subsdio Notificao Obrigatria no Sinan).


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Na busca de um protocolo para exame do CREME LEUCOCITRIO,

utilizado na rotina de deteco de T.cruzino sangue, nos foi enviado

o empregado pelo Laboratrio Central de Sade Pblica (LACEN) do

estado do Par (Email: [email protected]). Nesse protocolo, o

sangue (10 ml) coletado em tubos com anticoagulante e centrifugadoa 1500 r.p.m. por 10 minutos (Rey, 2001). Logo aps a centrifugao,

retira-se, inicialmente, empregando-se uma pipeta, toda a camada

superior de plasma, mantendo no tubo a interface fina que contm

os glbulos brancos e a camada de clulas sanguneas vermelhas

inferior. Aps a retirada do plasma, com o auxlio de uma outra pipeta,

coleta-se a camada mais clara de glbulos brancos (creme leucitrio

ou buffy coat), tendo o cuidado para no pipetar junto a camadade clulas sanguneas vermelhas. Esse creme leucitrio poder ser

diretamente examinado entre lmina e lamnula com aumento de

400x ou utilizado para a confeco de um ou mais esfregaos que

sero desemoglobinizados e fixados. Neste caso, aps a fixao, cora-

se pelo Giemsa (1ml de gua tamponada + 2 gotas de corante) durante

25 minutos. Por ltimo, a lmina lavada com gua tamponada e

deixada para secar na temperatura ambiente. A(s) lmina(s) corada(s)dever(o) ser examinada(s) no microscpio ptico com aumentos

de 400x e 1000x (lente de imerso).

O LACEN do estado da Bahia (Email: [email protected].

br ou [email protected]) tambm utiliza a tcnica citada

anteriormente, porm, recomenda no caso de resultado negativo (e

de disponibilidade de material), transferir o creme e o sobrenadante

para outro tubo e centrifugar a 1800-2000 r.p.m. durante 5 minutos.Fazer um novo esfregao e seguir o mesmo procedimento em relao

colorao e exame microscpico.

Existem tambm outros mtodos, como o QBC (QuantitativeBuffy Coat)e o mtodo de concentrao em gradiente de Ficoll-

Hypaque.


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O MTODO DO QBCconsiste na concentrao dos parasitos pela

centrifugao do sangue, em tubos de micro-hematcrito, combinada

com a colorao dos cidos nucleicos do parasito pelo fluorocromo

denominado Laranja de Acridina. um teste de alto custo por envolver

microscopia fluorescente e tubos previamente preparados comanticoagulante e corantes especiais. Em estudo experimental usando

a tcnica do QBC, Amato Neto e colaboradores (1996) detectaram o

T. cruziem camundongos, na fase aguda da infeco, at uma diluio

do sangue de 1/10.000. Os equipamentos necessrios realizao do

exame esto representados a seguir (Figura 19).

O MTODO DE CONCENTRAO DE FICOLL-HYPAQUEse baseiana centrifugao de sangue heparinizado (6 ml) em gradiente de

Ficoll-Hypaque (3 ml) (Budzko & Kierszenbaum, 1974). Consiste na

centrifugao do sangue com anticoagulante a 400 g durante 20 min.

Como o Ficoll possui uma densidade maior que a dos linfcitos, porm

menor que os glbulos vermelhos e granulcitos, aps a centrifugao

os glbulos vermelhos e os polimorfonucleares passam pelo Ficoll

formando umpelletno fim do tubo. As clulas mononucleares ficam na

interface entre o plasma e o Ficoll, junto camada de mononucleares,

onde o parasito dever ser pesquisado (Figura 20).

Os mtodos de concentrao tm sido empregados com sucesso

na suspeita de casos agudos de reativao da infeco (Sartori et al.,

1995; Sartori et al., 1998; Galhardo et al., 1999; Santos et al., 2002 e

Oliveira et al., 2010).

Fonte: sites www.qbcdiagnostics.com e www.labessentials.com/Lumin_fluorescence_microscopy.htm

Figura 19: Equipamentos e materiais utilizados na Tcnica do QBC (A-D).


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Esquema de Carlos Jos de Carvalho Moreira.

Figura 20: Fundamento do mtodo de concentrao de Ficoll-Hypaque.

4.1.4 INFORMAES COMPLEMENTARES:

4.1.4.1 DETECO DIRETA DO T. cruzi NO LQUIDOCEFALORRAQUIDIANO

Em pacientes com co-infeco Chagas-HIV e pacientes chagsicos

imunocomprometidos por terapia supressiva, que apresentem sinais

e sintomas de reagudizao da infeco, a pesquisa parasitolgica

direta de T. cruzino deve se restringir apenas ao sangue perifrico,

mas ser tambm realizada no lquido cefalorraquidiano (Figura

21). importante alertar que, para se obter amostra de lquidocefalorraquidiano, necessrio um profissional qualificado e

experiente. Casos agudos, com envolvimento do Sistema Nervoso

Central (SNC), tambm requerem amostras biolgicas diferenciadas e

a realizao de exames complementares de diagnstico. Uma srie de

artigos na literatura tem relatado a presena de T. cruzipor mtodos

parasitolgicos diretos e indiretos realizados de amostras obtidas por

puno medular.


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4.1.4.2 CONSERVAO DAS AMOSTRAS AT O ENVIO

SORO:2 a 8C (geladeira), at 5 dias; -20C (freezer), at 15 dias.

EXAME PARASITOLGICO:as lminas devem ser enviadas apso esfregao ou a gota espessa estarem secos. Devero conter os

dados de identificao do paciente. As lminas no fixadas devem ser

enviadas at 24 horas; As fixadas devem ser enviadas at 7 dias aps a

confeco. Enviar temperatura ambiente. Para maiores informaes

consultar o Manual de coleta, acondicionamento e transporte de

material biolgico para exames laboratoriais da FUNED, no link:

.

4.1.4.3 CONVERSO DE g EM r.p.m.

Como as centrfugas mais antigas no permitem fazer a converso

de g em r.p.m. e vice-versa, no prprio equipamento, elaboramos um

exerccio para que o tcnico do laboratrio possa fazer essa converso

(Vide pginas 140-142 dos ANEXOS DOS MDULOS I E II).

Fonte:Oliveira, L R; Assis, L L T; Maltos, A L; Cali, M C F R; Moraes-Souza, H. Reativao da doena deChagas com envolvimento do sistema nervoso central durante tratamento de linfoma no Hodgkin.

Revista Brasileira de Hematologia e Hemoterapia. 32(3):269-272; 2010.

Figura 21: Formas tripomastigotas de T.cruzino fluido cerebroespinhal.


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4.2 EXAMES PARASITOLGICOS INDIRETOS

Os mtodos parasitolgicos indiretos, ou de enriquecimento,

costumam ser empregados na fase crnica da infeco, onde a

pobreza de formas tripomastigotas no sangue perifrico torna difcil a

demonstrao diretamente na amostra biolgica. Essa deteco podeser realizada por 4 mtodos indiretos: xenodiagnstico, hemocultura,

xenocultura e inoculao em animais de laboratrio.

4.2.1 XENODIAGNSTICO (Brumpt, 1914)Seu resultado depende diretamente da espcie de triatomneo

empregada e do nmero de ninfas utilizadas (Dias, 1940; Schenoneet al., 1969; Cerisola et al., 1974; Borges-Pereira et al., 1996).

Tem sensibilidade de 13% at 50% em indivduos sorologicamentepositivos, na fase crnica da infeco. empregado como mtodoconfirmatrio no acompanhamento laboratorial de pacienteschagsicos (Castro et al., 1983) e na avaliao teraputica na infeco

chagsica crnica (Canado et al., 1969).

O xenodiagnstico pode ser direto (tradicional -in vivo) ou indireto(artificial - in vitro). No xenodiagnstico direto, 40 exemplares de

triatomneos, de uma determinada espcie, so acondicionados emquatro pequenas caixas de madeira ou de plstico. As caixas so cobertascom fil ou morim (para permitir a alimentao dos insetos) e estestecidos so fixados com elsticos. Essas caixas devem ser devidamenteidentificadas com os dados do paciente. Na sequncia, as caixas socolocadas diretamente sobre a pele do paciente, para a alimentao

dos insetos, conforme a sequncia de fotografias a seguir (Figura 22).

No xenodiagnstico indireto, os triatomneos ingerem o sangue(coletado com anticoagulante) do hospedeiro vertebrado por meio de

uma mamadeira de vidro ou frascos de modelos diversos (Nicolle &

Woff, 1943; Rutledge et al., 1964). Os frascos so revestidos com uma

fina membrana natural ou artificial que permite o contato da pea bucal

do inseto com o sangue contido no mesmo (Figura 23). importante

que este sangue seja mantido aquecido a 37C para permitir a atrao

do triatomneo pelo calor (termotropismo). Como membrana artificial


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Fotografias de Rodrigo Mxas (A, B) e Carlos Jos de C. Moreira (C, D).

Figura 22: Montagem das caixas para o xenodiagnstico direto (A, B)e aplicao do xenodiagnstico direto (C, D).

utiliza-se normalmente um pedao de preservativo, sem lubrificante,

lavado previamente com gua destilada e seco. No xenodiagnstico

indireto evita-se a reao alrgica picada do inseto.

Fotografias cedidas pelo Dr. Rodolfo A. Devera.

Figura 23:Xenodiagnstico indireto (A, B).


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Aps a alimentao sangunea devemos verificar e selecionar

apenas as ninfas que se alimentaram (as que apresentam o abdmen

distendido, independente do grau de distenso), colocando-as em um

recipiente maior. O exame das ninfas dever ser realizado aos 45 ou

60 dias aps a alimentao, de acordo com o procedimento padroadotado no laboratrio. At a leitura, os insetos podero ser mantidos

a temperatura ambiente. Na metade do perodo de tempo entre a

alimentao e o exame, as ninfas devero receber uma alimentao

suplementar de sangue, que poder ser feita em galinha (Gallus

gallus). Esta alimentao importante para a manuteno do T.

cruzi no inseto.

A tcnica utilizada para o exame dos triatomneos est descrita naspginas 96/97 do mdulo II.

4.2.2 HEMOCULTURA (Chagas, 1909)

outro procedimento indicado na deteco do T. cruzi na fase

crnica da infeco. Ele se baseia no cultivo da amostra clnica coletada

(sangue, lquor, etc.) contendo o parasito, em meios de cultura

enriquecidos. So utilizados aproximadamente 30 ml de sanguecentrifugado a 4C, sendo o sedimento semeado em tubos com meio

LIT (Liver Infusion Tryptose). Os tubos semeados so incubados

temperatura de 28C, em estufa incubadora de BOD (Chiari & Dias,

1975; Luz et al., 1994). A leitura do exame feita aos 30, 60, 90

e 120 dias aps o cultivo. Aos 120 dias (ltimo exame) realizada

uma centrifugao para exame do sedimento (pellet). A sensibilidade

desse mtodo de cerca de 30% at 79% (varivel e nem sempre

reprodutvel). Este mtodo deve ser o escolhido quando se deseja

isolar o parasito para estudos bioqumicos, biolgicos e moleculares.

4.2.3 XENOCULTURA

A xenocultura (Bronfen et al., 1989) a semeadura do tubo

digestivo ou fezes do triatomneo em meio LIT. Esse procedimento

possibilita o isolamento de cepas de T. cruzi e controla a qualidade

dos xenodiagnsticos realizados.


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Como no representa um acrscimo significativo na positividade

dos exames, sugere-se seu uso apenas para controle de qualidade

na avaliao dos xenodiagnsticos. Inicialmente faz-se a esterilizao

externa do triatomneo em Soluo de White, por aproximadamente 1

hora. Posteriormente, retira-se o tubo digestivo do inseto (podendo-se fazer um pool de alguns insetos), macera-se o contedo e faz-se

a semeadura em meio LIT, contendo antibitico (tudo dentro de uma

capela de fluxo laminar). Incuba-se a 28C e examina-se, pela primeira

vez, aps 20 dias. O procedimento de retirada do tubo digestivo o

mesmo empregado no xenodiagnstico direto e indireto.

Soluo Esterilizante de White: 0,25 g de HgCl26,50 g de NaCl25 ml de HCl concetrado

250 ml de Etanol a 5%

750 ml de H2O

Fonte: Bronfen et al. Isolamento de amostras doTrypanosoma cruzipor xenodiagnstico e hemocultura depacientes na fase crnica da doena de Chagas. Memrias do Instituto Oswaldo Cruz,

v. 84, n. 2, p. 237-240, 1989.

4.2.4 INOCULAO EM ANIMAIS DE LABORATRIOA inoculao em animais, dos mtodos anteriormente relatados,

o procedimento menos usual, sendo mais utilizado nos estudos de

patogenicidade das populaes ou clones do T. cruzi. Isso se deve

baixa eficcia do mtodo como demonstrado por alguns autores

(Freitas, 1947). importante ressaltar que este tipo de procedimento

dever ser submetido s Comisses de tica de animais (Figura 24).

Fotografia de Carlos Jos de Carvalho Moreira.

Figura 24: Inoculao intraperitonealem camundongo.


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5. EMPREGO DOS MTODOS PARASITOLGICOS

OBS: Os procedimentos anteriormente descritos esto no Manual Prticode Subsdio Notificao Obrigatria no SINAN do Minstrio da Sade.

5.1 CASO SUSPEITO DE CHAGAS AGUDO

Realizar exame a fresco imediato, repetindo 3 a 4 vezes ao dia durantealguns dias;

Procurar enriquecer a pesquisa, realizando concomitantemente atcnica de micro-hematcrito;

Se no dispuser de microscpio no local, pode-se colher gota espessa

para exame em municpio vizinho, num esquema similar ao do examea fresco;

Colher sangue venoso (ou capilar, em papel de filtro) para realizarimediatamente a pesquisa usual de anticorpos da classe IgG portcnicas convencionais, repetindo este exame 3 semanas aps. Umaviragem do resultado indicar doena aguda;

Pesquisar anticorpo anti T. cruzida classe IgM (com restries).

5.2 CASO SUSPEITO DE CHAGAS CONGNITO

Efetuar a pesquisa direta (ou por micro-hematcrito) do parasito nocordo umbilical ou venoso (criana), repetindo como relatado noquadro anterior;

Realizar sorologia convencional para pesquisa de IgG anti T. cruzina criana. Repetir a sorologia aos seis ou sete meses de idade a

qual, sendo positiva, sugestiva de doena de Chagas congnita (ourecentemente transmitida por outra via).

Fonte: http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/manual_chagas.pdf

Esquema prtico do procedimento diagnstico frente a um caso

suspeito de Doena de Chagas (Ministrio da Sade do Brasil).


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6. DIAGNSTICO MOLECULAR

Tem como alvo a deteco do DNA (cido desoxirribonucleico) e o

RNA (cido ribonucleico) do patgeno. Esta estratgia de diagnstico

tem duas grandes vantagens: no depender da imunocompetncia

do organismo infectado e do tempo de infeco como nos testes

sorolgicos, bem como s detectar o DNA na presena do patgeno

no fluido biolgico, pois esta molcula no permanece livre por muito

tempo no organismo infectado.

6.1 REAO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)

um mtodo de sntese enzimtica, in vitro, que permite aobteno de milhes de cpias de sequncias de DNA. Baseia-se

na programao de ciclos repetitivos de desnaturao, hibridao e

extenso, conseguidos atravs de alteraes sucessivas de temperatura

(Figura 25). A sensibilidade do teste depende, em grande parte, do

nmero de repeties dos segmentos alvos da amplificao (stios),

enquanto que a especificidade depende dos iniciadores (primers)

empregados. um mtodo mais sensvel do que os mtodosparasitolgicos clssicos de deteco do T. cruzina fase crnica da

infeco.

O mtodo de PCR permite detectar DNA do parasita em diferentes

amostras biolgicas, tais como:

sangue total - Avila1) et al. (1991) utilizaram uma soluo

composta por 6 M Guanidina HCl - 0.2M EDTA, que permitiuestocar o sangue coletado, temperatura ambiente para

posterior anlise .

soro - Russomando2) et al.(1992) conseguiram amplificar o T.

cruziem amostras de soro;

lquor - Lages-Silva3) et al.(2002) comprovaram a existncia de

DNA de T. cruzino lquor de um paciente chagsico / HIV + ;


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contedo fecal/ tubo digestivo de triatomneos Valejo4) et al.

(1999) conseguiram amplificar T. cruzi em amostras de tubo

digestivo e hemolinfa de Rhodnius prolixus;

cortes de tecidos - Ghul5) et al. (1997) mostraram ser possvel

detectar DNA de T. cruzi em amostras extradas de tecidomumificado humano. Vago et al. (2000) verificaram, atravs

da tcnica de LSSP-PCR (low-string single primers-polymerase

chain reaction), a variabilidade gentica da populaco de T.

cruzi presente no tecido cardaco de 13 pacientes chagsicos

e em 5 com megaesfago. Elias et al.(2003) foram capazes,atravs de uma tcnica de micromanipulaco, de detectar DNA

de T. cruziem um nico macrfago dissecado diretamente deuma seco de tecido cardaco.

Figura 25: Reao em cadeia de polimerase (PCR).Figura modificada por Carlos Jos de C. Moreira e Bruno Eschenazi.

Fonte: www.sci.sdsu/.../in-vitro-genetics/PCR.gif


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6.2 PCR QUALITATIVA

A PCR Qualitativa tem como princpio a amplificao in vitro

de sequncias especficas do material gentico (DNA ou RNA) do

organismo alvo (Kleppe et al.,1971) e seu resultado baseia-se

na visualizao do produto amplificado em gel de agarose oupoliacrilamida (presena - PCR positiva ou ausncia - PCR negativa),

conforme mostra a Figura 26 (A e B). Neste tipo de teste, no se

admite resultado inconclusivo.

Fonte: JUNQUEIRA, A.C.V. Um estudo sobre o xenodiagnstico, a hemocultura e a reao em cadeia dapolimerase na deteco doTrypanosoma cruziChagas 1909 em indivduos na fase crnica da infeco

chagsica. 173 p. (tese de mestrado) Universidade Federal de Minas Gerais - Belo Horizonte, 1996.

Figura 26: A) Resultado padro em gel de agarose corado por brometo de etdio,depois da amplificao de DNA extrado das amostras de sangue. A banda

de 330 pb presente representativa da amplificao da sequncia especficado minicrculo de kDNA de T. cruzi; B) Resultado padro em gel de agarose

corado por brometo de etdio, depois da amplificao do DNA extradodas amostras de sangue. A banda de 110 representativa da amplificao

da seqncia especfica do gen de globina humana (Controle).

O avano nas tcnicas moleculares com o desenvolvimento da

PCR qualitativa aprimorou as condies de deteco de patgenos,

aliando especificidade e sensibilidade ao diagnstico (Erlich et al.,1991;

Brasileiro Filho & Pena, 1992; Silber et al., 1997). A multiplicao

de uma nica cpia de DNA em milhes de cpias filhas permite a

deteco de agentes etiolgicos antes no detectados pelos mtodos

parasitolgicos tradicionais (Breniere et al., 1995; Junqueira et

al.;1996; Gomes et al; 1999). Assim, o mtodo tem sido amplamente


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utilizado na identificao de agentes etiolgicos de diferentes doenas,

sendo de escolha quando a quantidade de parasita escassa. Como

exemplo, a identificao de Trypanosoma cruziem chagsicos crnicos

caracterizados pela baixa parasitemia, pode ser conseguida atrves da

PCR qualitativa (Batista et al., 2010).A realizao da PCR precedida por uma etapa de extrao do

DNA a partir da amostra a ser estudada, que deve ser muito bem

executada. J foi demonstrado que o protocolo de extrao de DNA

influencia o resultado da PCR. A extrao consiste de: a) lise celular

para a liberao do DNA da clula; b) remoo de protenas que

podem interferir no processo de amplificao ou que degradam o DNA

alvo (DNAses); c) precipitao e concentrao do DNA extrado. Estesprocedimentos podem ser feitos atravs do uso de mtodosin house,

kitscomerciais ou preparados comerciais (DNAzol, por exemplo).

Halos et al. (2004) publicaram um estudo com carrapatos, no

qual demonstraram que diferentes protocolos de extrao geram

diferentes resultados e que a combinao de mtodos fsicos e

qumicos mais eficiente do que o uso de apenas um deles. Em

outro estudo sobre extrao de DNA em artrpodes (caros), Desloire

et al. (2006) mostraram que podem ocorrer variaes na positividade

dos resultados de acordo com o estado alimentar do inseto. Em um

estudo-piloto experimental utilizando ninfas de 4 estgio de Rhodnius

brethesie Panstrongylus megistusinfectadas com 10, 100 e 1000 T.

cruzi, foram testados oito diferentes protocolos (Neves 2008, 2010).

Com a maioria dos mtodos no se obteve sucesso na extrao de

DNA, enquanto com dois, sim (surgimento de bandas de 330 pares

de base, que correspondem ao fragmento de DNA do cinetoplasto do

T. cruzi). Dos dois protocolos com os quais se conseguiu extrair DNA,

apenas um foi considerado o mais adequado por obter DNA a partir

de amostras com apenas 10 parasitas. Esses trabalhos so importantes

para demonstrar o quo importante a etapa de obteno de DNA,

para que a PCR seja confivel.


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42

6.3 PCR QUANTITATIVA uma variante da reao de PCR convencional, representando

grande avano nos mtodos moleculares de auxlio do diagnstico,particularmente por facilitar as tarefas de quantificao da expresso

gnica em determinado tecido ou amostra biolgica.O princpio do mtodo est baseado na deteco de fluorescncia

no tubo de reao medida que o DNA dupla fita sintetizado,determinando a quantidade de DNA de uma amostra que foiamplificada. Isso conseguido atravs de um sistema automatizado

que mede a intensidade de emisso fluorescente.

A PCR em Tempo Real torna possvel, por exemplo, avaliar a carga

parasitria de um paciente chagsico. E tem a grande vantagem depoder diminuir a contaminao da amostra, porm, apresenta um

custo mais alto do que a PCR qualitativa.

6.4 ESTUDO COMPARATIVO ENTRE A PCR E OUTROS MTODOSDE DETECO DO T. cruzi (xenodiagnstico, hemocultura epesquisa em lmina)

A tabela 3 apresenta os resultados de um estudo que vemsendo efetuado pelo Laboratrio de Doenas Parasitrias (antigoDepartamento de Medicina Tropical) do IOC-FIOCRUZ na Regio doMdio e Alto Rio Negro, Estado do Amazonas, Brasil, comparando oresultado de diferentes tcnicas de diagnstico parasitolgico e umatcnica de diagnstico molecular em animais silvestres capturados na

Regio. Vide tambm a Figura 38 (pgina 57).

Fonte: JUNQUEIRA, A.C.V. Trypanosoma cruzi Chagas, 1909 em reas do Mdio e Alto Rio Negro-

Amazonas, Brasil. 2005. 134 p. (tese de doutorado) Universidade de So Paulo, So Paulo.

Tabela 3: Comparao entre a PCR e outros Mtodos de Deteco do T. cruzi.


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6.5 VANTAGENS E DESVANTAGENS DO EMPREGO DA PCR NADETECO DO T. cruzi

Vantagens:

No depender diretamente da imunocompetncia do organismo1) infectado e do tempo* de infeco;

Possibilitar a avaliao quantitativa da parasitemia;2)

Maior sensibilidade em relao aos mtodos parasitolgicos3)

clssicos;

Somente detectar DNA na presena do parasita nos fluidos4)

biolgicos, visto que esta molcula no permanece muito

tempo livre no organismo (Barker,1990).

Obs.: * importante ressaltar que, apesar da alta sensibilidade, omtodo de PCR apresenta resultados melhores em maior parasitemia.

Desvantagens:

Alto custo - todo material importado e descartvel;1)

Contaminao com DNA exgeno, que pode ser evitada2)atravs de procedimento de Condies e Condutas Bsicas

Mnimas;

No reprodutibilidade de alguns protocolos;3)

Falta de otimizao em se tratando especificamente da deteco4)

de DNA do T. cruzi.


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7. DIAGNSTICO SOROLGICO

Baseia-se na deteco de antgenos, anticorpos ou imunocomplexos.

A sensibilidade mais acentuada em relao s provas parasitolgicas.

A grande maioria dos testes automatizada, o que determina um

baixo custo operacional, rapidez e simplicidade de execuo.

No caso da deteco de anticorpos, os nveis iro variar conforme

a fase da infeco (Figura 27).

Figuras adaptadas e elaboradas por Angela C. V. Junqueira e Carlos Jos de C. Moreira.

Figura 27: Perfis dos nveis de anticorpos na infeco chagsica (A-B).

A formao de anticorpos especficos da classe IgM relativamente

precoce, iniciando-se ao trmino da primeira semana de infeco

e mantendo nveis detectveis durante toda fase aguda. O inverso

verificado com IgG, que comea a ser detectado ao final da fase

aguda. Nessa fase difcil o encontro do parasita no sangue pelos

mtodos parasitolgicos diretos, como pode ser verificado nas curvas

de parasitemia feitas em camundongos infectados com diferentes

cepas (Figura 28).


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FASE AGUDA XFASE CRNICA

Figura adaptada por Angela C.V. Junqueira e Carlos Jos de C. Moreira.Fonte: DEVERA, R. A. 2002. Caracterizao Biolgica, Bioqumica e Molecular de Cepas doTrypanosoma

cruzi, Antes e Aps Passagens em Camundongos e em Cultura (Tese) Fundao Oswaldo Cruz,Instituto Oswaldo Cruz, Curso de Ps-Graduao em Medicina Tropical, Rio de Janeiro.

Figura 28: Parasitemia experimental em camundongos nas fases aguda e crnica (A, B).


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As provas sorolgicas podem ser realizadas e utilizadas para:

7.1 DIAGNSTICO INDIVIDUALElucidao de patologias cujos sintomas clnicos no sosuficientes para o diagnstico;

Diferenciao da fase da enfermidade (investigao de IgM/

IgG);

Diagnstico de infeces congnitas;

Seleo de doadores de sangue;

Seleo de doadores e receptores de rgo para transplante;

Avaliao de teraputica especfica.

7.2 INQURITOS SOROEPIDEMIOLGICOSEstabelecimento da prevalncia da infeco. Ex.: 1 inquritonacional nos anos 70 no Brasil;

Avaliao dos programas de controle atravs domonitoramento de novos casos. Ex.: 2 inqurito nacional

em menores de 5 anos de idade, em fase de publicao dos

dados/Brasil.7.3 AVALIAO DAS PROVAS SOROLGICAS

A avaliao das provas sorolgicas independe da prevalncia da

enfermidade. Devemos levar em considerao os seguintes fatores:

Sensibilidade da prova - a capacidade de um exame se1)

apresentar positivo quando o paciente realmente portador

da doena que se investiga (VP/VP+FN);

Especificidade - a capacidade de um exame dar negativo2)

quando o paciente no est doente (VN/VN+FP);

Eficincia - quando se tem concordncia dos resultados de3)

indivduos verdadeiros positivos e verdadeiros negativos

com indivduos com e sem infeco, na populao estudada

(VP+VN/VP+VN+FP+FN);


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Reprodutibilidade - a capacidade de obteno de resultados4)

com valores muito prximos entre si, quando se testa uma

mesma amostra em diferentes ensaios (R);

Valor preditivo positivo - a capacidade de um exame positivo5)

representar um paciente verdadeiramente portador da doenapesquisada (VP);

Valor preditivo negativo - a capacidade de um exame negativo6)

representar um paciente sadio (VN);

Ponto de corte (cut off) - o ponto de corte de um teste7)

sorolgico o valor que define o limite entre um teste positivo

e um negativo. A escolha deste limiar leva em considerao

as frequncias dos resultados observados nos testes de uma

populao em geral, bem como os de especificidade e de

sensibilidade de um teste (Figura 29).

Figura adaptada por Bruno Eschenazi.Fonte: FERREIRA, A.W.; VILA, S. L. M.

Diagnstico de Laboratrio das principaisdoenas infecciosas, parasitrias e auto-imunes. Correlao Clnico-Laboratorial.

2 ed. Rio de Janeiro: GuanabaraKoogan, 2001.

Figura 29: Cut-off (A, B).


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7.4 PROVAS/TESTES MAIS UTILIZADOS ATUALMENTE

7.4.1 IMUNOFLUORESCNCIA INDIRETA-IFI (Fife & Muschel,1959; Camargo, 1966)

Baseia-se na marcao de anticorpos com corantes fluorescentese visualizao ao microscpio de fluorescncia com luz ultravioleta

(Figura 30). A leitura visual (microscpio de fluorescncia). Tem alta

sensibilidade, sendo mais indicado para a fase aguda da infeco

(anticorpos da classe IgM aps a 1a semana). Pode apresentar

reatividade cruzada com outros antgenos, dando origem a resultados

falso-positivos. (Ex.: Leishmania spp).

Figura adaptada por Bruno Eschenazi. Fonte: FERREIRA, A.W.; VILA, S. L. M. Diagnstico deLaboratrio das principais doenas infecciosas, parasitrias e auto-imunes.Correlao Clnico-Laboratorial. 2 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan.

Fotos da IFI de Jlio Csar Miguel- Laboratrio de Doenas Parasitrias- IOC/FIOCRUZ.

Figura 30: Imunofluorescncia indireta: A) princpio do mtodo,B) exemplo de IFI positiva, C) exemplo de IFI negativa,

demonstrando, entretanto, autofluorescncia.


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7.4.2 HEMAGLUTINAO INDIRETA (Knierim,1970; Camargo,1971)

Baseia-se na sensibilizao de superfcie dos eritrcitos com a

adsoro de antgenos e na reao de anticorpos dirigidos contra

estes antgenos. A reao antgeno-anticorpo provoca a aglutinaodos eritrcitos (Figura 31). A leitura visual (Figura 32).

uma tcnica accessvel para qualquer laboratrio e de simples

execuo, porm dependendo do kit apresenta problemas de

reprodutibilidade.

A hemaglutinao indireta tambm pode apresentar resultado falso

positivo. Devido a isso, normalmente, so includos nos kits os seguintesreagentes extras: hemcias no sensibilizadas e 2-mercapto-etanol. O

primeiro empregado devido suspeita de anticorpos anti-hemcia;

neste caso os soros iro aglutinar hemcias no sensibilizadas. O

segundo (2-ME) tem como objetivo eliminar anticorpos IgM naturais,

que tambm podem produzir aglutinao das hemcias.

Figura adaptada por Bruno Eschenazi. Fonte: FERREIRA, A.W.; VILA, S. L. M. Diagnstico deLaboratrio das principais doenas infecciosas, parasitrias e auto-imunes.

Correlao Clnico-Laboratorial. 2. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2001.

Figura 31: Princpio do Teste de Hemaglutinao Indireta.


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7.4.3 ENSAIO IMUNOENZIMTICO - ELISA (Voller et al., 1976)Baseia-se na sensibilizao de microplacas (ou prolas) com

antgenos especficos e incubao com anticorpos frente a um

substrato. Um substrato especfico para um conjugado marcado

enzimaticamente com peroxidase (ou fosfatase alcalina), revela a reao.

A leitura feita com auxlio de um leitor de ELISA (espectrofotmetro

automatizado) que mede a intensidade da cor obtida em cada poo. A

intensidade de cor da reao diretamente proporcional quantidade

de anticorpos presentes na amostra (Figura 33).

Esta tcnica, que permite a realizao de vrias amostras de

maneira simultnea, em um curto perodo de tempo, pode ter sua

especificidade e sensibilidade aumentada ou diminuda, dependendo

do Ag que utilizado para sensibilizar a placa (Umezawa & Silveira,

1999). um dos mtodos mais empregados no diagnstico sorolgico

da infeco chagsica.

Foto: Jos Borges Pereira- Lab. Doenas Parasitrias- IOC/ FIOCRUZ

Figura 32: Exemplo de resultado de teste de Hemaglutinao Indireta.


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Figura adaptada por Angela C. V. Junqueira, Carlos Jos de C. Moreira e Bruno Eschenazi.Fonte: FERREIRA, A.W.; VILA, S. L. M. Diagnstico de Laboratriodas principais doenas infecciosas, parasitrias e auto-imunes.

Correlao Clnico-Laboratorial. 2. Ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2001.

Figura 33:Teste Imunoenzimtico-ELISA


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7.4.4 WESTERN BLOT

Um extrato de antgenos separado por eletroforese e transferido

para uma membrana de nitrocelulose. Aps a transferncia, a

membrana cortada em tiras pequenas e a seguir posta em contato

com o soro a ser testado. Aps a incubao, a reao revelada e avisualizao de banda (especfica) indica reao positiva (Figura 34).

A leitura visual.

O procedimento tcnico laborioso e de custo elevado, por

isso mais utilizado como teste confirmatrio, quando os testes

convencionais so divergentes (no caso da suspeita de infeco

chagsica).

Figura A - Adaptada por Bruno Eschenazi e Figura B - Tese doutorado de Junqueira ACV (2005).

Figura 34: Princpio da reao de Western-blot (A) e resultado de tesa blot(B): 1) soro de alta reatividade; 2) soro de mdia reatividade; 3) soro de baixareactividade (sorologia convencional positiva); 4) soro padro SAPA; 5) soro

sem reatividade; 6) soro de baixa reatividade (sorologia convencional negativa);7) soro com reactividade para banda de peso molecular superior a 160 kDa

(1 coleta); 8) soro com reatividade para banda de peso molecular superior a160 kDa (2 coleta, depois de 9 meses); 9) soro de paciente chagsico;

10) soro de baixssima reactividade; 11) soro de indivduo de regiocom infeco por T. rangeli; 12) soro de indivduo de regio com infeco

por T. rangeli; PM - marcadores de peso molecular (kDa) esto esquerda.


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7.4.5 TESTES DE EXECUO SIMPLIFICADA

Os testes rpidos para diagnstico existentes no mercado tm

como principais caractersticas a rapidez e a simplicidade na execuo,

pois normalmente no demandam equipamento ou conhecimento

qualificado para a realizao do teste ou mesmo interpretao doresultado permitindo a utilizao tanto de sangue total, como de

plasma ou soro. Seu emprego deve ser destinado a regies onde

o acesso ao diagnstico difcil. Alguns deles tm como princpio

a imunocromatografia de partculas impregnadas com extratos de

T. cruziem membrana de nitrocelulose, que em caso positivo concentra

a reao antgeno-anticorpo em uma nica fase slida. Exemplos: Stat

-Pak; Stick Chagas Teste(SCT).Entre os atualmente comercializados para doena de Chagas, para

ilustrar, podemos citar trs deles com fundamentos diferentes:

IDPaGIA um teste de aglutinao de partculas sensibilizadas

com trs peptdeos sintticos. Esses polmeros precipitam

na ausncia de anticorpos, aps centrifugao de suporte

apropriado, passando pelo gel e ficando no fundo do tubo(reao negativa). No caso da presena de anticorpos anti-T.

cruzi, os polmeros reagem e so retidos na superfcie do gel

(reao positiva). Os polmeros so visveis a olho nu. Apesar

da sua execuo ser relativamente simples, este teste pode no

ser considerado teste rpido, pois necessita de um equipamento

especial.

CHAGAS STAT PACK ASSAY um teste imunocromatogrfico,que emprega uma combinao de antgenos recombinantes com

alta especificidade contra anticorpos anti-T. cruzi(Figura 35).

IMMUNOCOMB II um teste imunoenzimtico, que emprega

protenas recombinantes do T. cruzi e anticorpos secundrios

contra imunoglobulina humana (Figuras 36 e 37).


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Figuras adaptadas por Bruno Eschenazi.

Figura adaptadas por Bruno Eschenazi.

Figura 35: Procedimento e leitura do CHAGAS STAT PACK ASSAY.

Figura 36: Procedimento do teste IMMUNOCOMBII


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Figura adaptada por Bruno Eschenazi.

Figura 37: Interpretao de resultado de IMMUNOCOMBII

Testes rpidos para deteco da infeco peloT. cruzi existentes no mercado

Fonte: Initial table: C Ponce 2007, updated by MSF and

WHO Programme on Control of Chagas disease, in 2011.


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7.5 APLICAO DOS MTODOS SOROLGICOS

7.5.1 NA TRIAGEM DE INDIVDUOS EM BANCO DE SANGUEAs provas sorolgicas tm grande importncia para evitarmos a

propagao da infeco chagsica atravs das transfuses de sangue.

A transmisso por essa via pode ser devido a alguns fatores como:

No realizao dos testes;1)

Testes realizados de forma inadequada;2)

Testes com baixa sensibilidade.3)

O risco de transmisso do parasita por transfuso de 500 ml

de sangue total oscila entre 12 e 20%. O T. cruzitambm pode sertransmitido pelo plasma e concentrado de hemcias. A transmisso

era mais comum nas transfuses de sangue coletado em doadores

pagos e nas transfuses de sangue total (Ref.: OMS, Srie de informes

tcnicos 950, Genebra, 2002).

As provas sorolgicas realizadas no Brasil de acordo com o RDC

153/06/2004 Ministrio da Sade so: a) HIV 1+2 (2 testes); b)

Doena de Chagas (ELISA 1 nica prova), c) HTLVI/II, d) Sfilis, e)Hepatite C e f) Hepatite B (AgHBs e Anti HBc).

As provas empregadas para deteco sorolgica da doena de

Chagas na Fundao Pr-Sangue de So Paulo (FPS) e no Hemocentro

de So Paulo (HSP) so: a) Imunofluorescncia (diluio 1/40) at

04/2003, b) Hemaglutinao (diluio 1/20) at 03/2002 e c) ELISA

antes de 19/11/93 (Portaria MS 1.376 de 19/11/93 - Obrigatrio

realizao de 2 testes de princpios diferentes at 12/2002).

No obstante, apesar das normas estabelecidas pelo Ministrio da

Sade do Brasil, para que no ocorra a transmisso transfusional, a

implementao de Polticas Nacionais de controle em bancos nem

sempre cumprida de maneira uniforme. Parte disso deve-se ao

fato de que, em todo o territrio nacional, nem sempre se faz uso

de mtodos sorolgicos automatizados com alta sensibilidade e


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especificidade, conforme preconizado (Ref. OMS, Srie de informes

tcnicos 905, Genebra 2002).

Como forma de uniformizar o padro idealizado, recomenda-se

que sejam feitos, de forma sistemtica, programas externos de controle

de qualidade dos testes sorolgicos utilizados na rotina.

7.5.2 NA TRIAGEM DE INDIVDUOS DE REGIES ENDMICASPARA REALIZAO DOS EXAMES PARASITOLGICOS

O grfico a seguir apresenta o resultado de um estudo, efetuado

pela equipe do Depto. de Medicina Tropical do IOC-FIOCRUZ, em uma

regio endmica do Estado do Piau, Brasil, onde foi comparada a

sensibilidade de deteco de T. cruziatravs da PCR, do xenodiagnsticoe da hemocultura, em pacientes sorologicamente positivo (Figura 38).

Fonte: JUNQUEIRA, A.C.V. Um estudo sobre o xenodiagnstico, a hemocultura e a reao em cadeia dapolimerase na deteco do Trypanosoma cruzi Chagas 1909 em indivduos na fase crnica da infecochagsica. 1996. 173 p. (tese de mestrado) Universidade Federal de Minas Gerais - Belo Horizonte, 1996.

Figura 38: Resultado comparativo de diferentestcnicas de diagnstico para doena de Chagas.


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7.5.3 MODELO DE INVESTIGAO EPIDEMIOLGICA

A maioria das investigaes epidemiolgicas clssicas de doena de

Chagas tem a sorologia como mtodo de triagem inicial. Isso se deve

a sua alta sensibilidade, especificidade e custo em relao aos outros

mtodos de diagnstico. Abaixo temos um organograma elaboradopara a conduta de deteco do T. cruziem humanos (Figura 39).

Fonte: JUNQUEIRA, A.C.V. Trypanosoma cruzi Chagas, 1909 em reas do Mdio e Alto RioNegro-Amazonas, Brasil. 2005. 134 p. (tese de doutorado) Universidade de So Paulo, So Paulo.

Figura 39: Modelo de organograma empregado em estudo efetuado peloDepto. de Medicina Tropical do IOC-FIOCRUZ.


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8. COMPLEXO Trypanosoma cruzi

Atravs de estudos efetuados com isolados de T. cruzi dediferentes hospedeiros e regies endmicas distintas foi verificado

que esta espcie de protozorio representada por uma populaoheterognea. Pode-se dizer que o T. cruzi um complexo formadopor populaes, muitas vezes bastante heterogneas, presentes nosdiferentes ciclos de transmisso que podem estar sobrepostos ouno (Coura JR et al., 1966). importante ter o conhecimento queempregamos o termo cepa para denominar o isolado obtido detriatomneos, mamferos naturalmente infectados ou pacientes. A cepausualmente consiste de uma populao heterognea de parasitas. Em1999 foram definidas 2 linhagens principais do T. cruzi, denominadasT. cruziI e T. cruziII, visando a padronizao da nomenclatura a seradotada pelos diferentes grupos de pesquisa (Anonymous,1999).Atualmente, atravs da utilizao de diferentes marcadoresmoleculares, foi aceita por consenso a subdiviso do txon T. cruzi emseis linhagens ou DTUs (Discret Taxonomic Units): T. cruziI a T. cruziVI

(Zingales et al., 2009).

A diversidade do T. cruzi tem sido verificada empregando-sedistintos parmetros, que vo desde os morfolgicos aos moleculares.Para fins didticos, podemos dividir as diferentes metodologiasutilizadas em caracterizao biolgica, caracterizao bioqumica emolecular. Os principais critrios, at a presente data, esto descritosa seguir:

8.1 CARACTERIZAO BIOLGICA - curva parasitmica,taxa de mortalidade, morfologia dos parasitas no sangueperifrico e estudo histopatolgico

No incio da dcada de 70, Andradeet al.(1970 a, b) e Andrade,S.G. (1974) iniciaram uma srie de estudos visando caracterizaobiolgica de cepas do T. cruzi e seus perfis histopatolgicos em animaisexperimentais. A partir desses estudos foi possvel classificar as cepas

em trs tipos ou biodemas:


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Biodema I (tipo I) - Cepas altamente virulentas, que se multiplicam

rapidamente, apresentando elevada parasitemia e mortalidade em

camundongos, que morrem entre o 7 e o 12 dias aps a inoculao.

Apresentam o predomnio de formas delgadas e macrofagotropismo

na fase inicial da infeco. Seu prottipo a cepa Y;Biodema II (tipo II)- Cepas com multiplicao relativamente lenta e

picos de parasitemia irregulares entre o 12 e 20 dias aps a infeco.

Apresentam a predominncia de formas largas e miocardiotropismo.

Possui como prottipo a cepa So Felipe;

Biodema III (tipo III)- Cepas que apresentam picos da parasitemiatardios, geralmente entre o 20 e 30 dias aps a infeco. Provocam

baixas taxas de mortalidade e apresentam o predomnio de formas

largas e de baixa multiplicao (~ 50 dias aps a infeco). Acometem

principalmente a musculatura esqueltica. Seu prottipo a cepa

Colombiana. Algumas taxas de parasitemia de cepas de biodema III

esto representadas na figura 40.

Fonte: DEVERA, R.; ILLARRAMENDI, X.; MONTOYA-ARAJO, R.; PIRMEZ, C.; FERNANDES, O.; COURA, J. R.Biodemes of Trypanosoma cruzi strains isolated from humans from three endemic areas in Minas Gerais

State. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. 2002, vol.35, n. 4, p. 323-330).

Figura 40:Taxas de parasitemia em camundongos suos infectadospor cepas do T. cruziclassificadas dentro do biodema III.


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8.2 CARACTERIZAO BIOQUMICA - Eletroforese deisoenzimas

A tcnica de eletroforese se isoenzimas para a classificao do

T. cruzi foi introduzida por Toy em 1974. Posteriormente, outros

pesquisadores iniciaram estudos de gentica populacional do T.cruzi com cepas oriundas da Bahia e de diferentes regies do Brasil,

quando caracterizaram trs grupos principais que foram denominadas

zimodemas (Miles et al. 1977, 1978, 1980). Podemos concluir que

zimodemas so grupos de cepas que apresentam perfis eletroforticos

isoenzimticos semelhantes. Enzimaticamente foram caracterizados

trs grupos do T. cruzi (Figura 41):

zimodema Ia) ,associado a isolados de marsupiais e triatomneossilvestres,

zimodema IIb) , associado a isolados domsticos,

zimodema IIIc) , associado ao ambiente silvestre.

Fonte: GOMES, Yara de Miranda et al . Caracterizao de uma cepa de Trypanosoma cruzi isoladade uma zona no endmica no Nordeste do Brasil. Rev. Inst. Med. trop. S. Paulo, So Paulo, v.

37, n. 1, 1995. Disponvel em: . Acesso em: 29 Jan 2008. doi: 10.1590/S0036-

46651995000100014

Figura 41:Perfis Eletroforticos de diferentescepas do Trypanosoma cruzi.

Enzimas: A) PGM; B) GPI e C) ALAT.

Cepas:PER - Peruana (tipo I); 21 SF - So Felipe eWSL - Wild So Loureno (tipos II) e

COL Colombiana (tipo III).


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8.3 CARACTERIZAO MOLECULAR UTILIZANDO DNA DOCINETOPLASTO(kDNA) - Anlise do Polimorfismo de Tamanhosdos Fragmentos de Restrio do kDNA (Restriction FragmentLenght Polymorphism - RFLP)

No final da dcada de 70, Mattei et al. (1977) introduziram atcnica de classificao de tripanossomos pela anlise do polimorfismo

dos tamanhos dos fragmentos de restrio do kDNA (Restriction

Fragment Lenght Polymorphism- RFLP). Nesta tcnica, normalmente

um segmento do genoma amplificado e clivado por endonucleases

de restrio. O produto da clivagem separado por eletroforese e

as variaes dos tamanhos das bandas, assim como as repeties,

constituem os chamados perfis de RFLP.

Posteriormente, Morel et al.(1980) empregaram a tcnica para a

caracterizao genotpica do T. cruzie propuseram o termo esquizodema

para denominar grupos com perfis semelhantes (Figura 42).

8.4 CARACTERIZAO MOLECULAR UTILIZANDO O DNANUCLEAR

8.4.1 TIPAGEM PELO GENE DE MINI-EXON

O gene que transcrito d origem ao mini-exon est presente no

genoma nuclear dos Kinetoplastida em aproximadamente 200 cpiasrepetitivas. Este gene constitudo por 3 regies: o exon, o intron e

Montagem de Carlos Jos de C. Moreira

Figura 42:Comparao entre diferentesisolados de T. cruzipelo mtodo de

Anlise do polimorfismo de tamanhosdos fragmentos de restrio do k DNA.


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a regio intergnica. O exon uma sequncia de 39 nucleotdeos

altamente conservada, sendo adicionado ps-transcricionalmente a

todos os RNAs mensageiros nucleares, atuando no processo de trans-

splicing da parasita. O intron moderadamente conservado entre as

espcies de um mesmo gnero ou subgnero. A regio intergnicado T. cruzi pode ser amplificada por PCR, possibilitando a classificao

em dois grupos principais T. cruziI e T. cruzi II (Figura 43).

Fonte: DEVERA, R. A. 2002. Caracterizao Biolgica, Bioqumica e Molecular de Cepas doTrypanosomacruzi, Antes e Aps Passagens em Camundongos e em Cultura (Tese), Fundao Oswaldo Cruz, Instituto

Oswaldo Cruz, Curso de Ps-Graduao em Medicina Tropical, Rio de Janeiro.

Figura 43B:Gel de agarose corado com brometo de etdio de produtos de PCR parao gene de mini-exon. As cepas so as seguintes: linhas 1 e 2, cepas de referncia Y

e F (T. cruziII e I, respectivamente); linhas 3-18, cepas testadas.

Figura adaptada por Carlos Jos de Carvalho Moreira.

Figura 43A:Representao esquemtica do ensaio de PCR para tipagem deT. cruziempregando o gene de mini-exon. A caixa preta representa o mini-exonde 39 bp, a caixa cinza representa a sequncia do intron (70 bp) e linha espessa

limitado pelos traos vermelhos representa a regio intergnica (484 bp).


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Esta tcnica uma ferramenta utilssima para estudos, tanto em

tripanossomatdeos, quanto para outros txons de protozorios

parasitas. Em relao ao T. cruzi o RAPD tem sido utilizado para

obter marcadores de DNA que permitem estabelecer relaes

genticas entre diferentes isolados. Apresenta algumas vantagens

como: a) como se trata de uma tcnica simples no necessita de

8.4.2 TIPAGEM PELO DNA POLIMRFICO AMPLIFICADOALEATORIAMENTE (Randomly Amplified polymorphic DNA - RAPD)

Esta tcnica tem sido utilizada para estudos taxonmicos e de

caracterizao de micro-organismos desde a sua introduo por

Welsh e McCleilland e Willians et al. em 1990. Basicamente umareao de PCR que utiliza pequenosprimers de sequncias aleatrias

capazes de amplificar regies annimas do DNA nuclear. O produto

da amplificao, quando analisado por eletroforese em gel de

poliacrilamida, demonstra padres de bandas especficas para cada

isolado de um determinado agente infeccioso (Figura 44).

Fonte: DEVERA, R. A. 2002. Caracterizao Biolgica, Bioqumica e Molecular de Cepas do Trypanosomacruzi, Antes e Aps Passagens em Camundongos e em Cultura (Tese) Fundao Oswaldo Cruz, Instituto

Oswaldo Cruz, Curso de Ps-graduao em Medicina Tropical, Rio de Janeiro.

Figura 44:Perfis de RAPD de cepas de T. cruzioriginais (O), apsmanuteno em camundongo (C) e meio LIT (L). A. Iniciador 2.

B. Iniciador 4. M, marcador de Peso Molecular, 100 bp.Cepas P23-1, Ig62, Ig523-2, Ig 520, Ig192-1, Ig539, BE-25 e B84.


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uma informao prvia sobre a sequncia do DNA a ser estudado;

b) requer pequenas quantidades de DNA para que possa ser realizada;

c) pode ser empregado um nmero limitado deprimers ou iniciadores.

As desvantagens so a baixa reprodutibilidade da tcnica e no refletir

geneticamente a variabilidade populacional.8.4.3 TIPAGEM ATRAVS DAS REGIES INTERGNICAS (IRTs)DOS GENES RIBOSSMICOS (RFLP- ITS- rDNA)

Os genes que codificam o RNA ribossmico so altamente

conservados tendo potencial para a anlise filogentica. So

encontrados como sequncias repetitivas que codificam para uma

subunidade maior e para outra menor separadas por regies que

no so transcritas, denominadas de espaadores no transcritos

(NTS - non transcribed spacers). Tambm apresentam regies

codificantes denominadas de espaadores internos transcritos (ITS -

internal transcribed spacers) que so pequenas sequncias de grande

variabilidade, flanqueados por segmentos altamente conservados, o

que torna possvel a confeco de iniciadores para PCR que anelam

nessas regies.

Cupolillo et al. (1995) padronizaram uma tcnica desenhando

ini

a doença de chagas na refião amazônica

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