Microbiologia GeneralTrimestre 16-P

8. Cinética microbiológica

CRECIMIENTO MICROBIANO Aumento ordenado de todos los constituyentes químicos de

los microorganismos en el número de células o en la masa celular

El crecimiento de una población se mide a través de:

Métodos indirectos

Consumo de sustratos Formación de productos Métodos cinéticos Componentes celulares Actividades enzimáticas

Métodos directos

Número de células

Masa celular Peso seco: filtración, centrifugación Turbidez: DO de una suspensión de células

Cuenta directa: microscopio Cuenta en placa: solo células viables

azúcares CH4, etanol Respirometría (O2/CO2) ác. nucleicos, proteínas, lípidos, ATP deshidrogenasa

Estimación de CRECIMIENTO

La selección de un método para cuantificar el crecimiento microbiano, depende de:

Propiedades de la biomasa (bacterias, hongos) Propiedades del medio de cultivo Sensibilidad requerida Confianza del método Velocidad necesaria

Métodos de crecimiento

Medida del número de células Cuenta directa al microscopio: conteo de células totales

cámaras especiales para conteo Cuenta en placa: conteo solo de células viables

Medida de la masa celular Peso seco: se recupera la biomasa del medio de cultivo, se

seca y se pesa (filtración, centrifugación) Turbidez: cuantificación de la DO de una suspensión de células curva patrón con número conocido de células

Masa celular número de células se puede estimar uno para

conocer el otro

Cámaras de recuento

Cálculo de no. de células/mL:X células x 25 cuadros x 104 x

FD [=] número/cm3

1 mm0.2 mm

Cámara de Neubauer

Cámaras de recuento

Ventajas: Conteo rápido de microorganismos

Limitaciones: No se distinguen las células muertas de las vivas Células pequeñas son difíciles de distinguir Se requiere tiempo y habilidad Se requiere un microscopio de contraste de fases si las

células no están teñidas No es buen método para suspensiones muy diluidas (< 106

células/mL)

Cuenta en placa

Fundamento: cada célula viable forma una colonia UFC: se cuantifica el número de células a través del conteo de colonias

Ventaja: solo se cuentan las células viables las que pueden reproducirse (dividirse)

Dos técnicas (medios sólidos): Siembra en superficie ≤ 0.1 mL de muestra sobre la superficie del

medio

Vertido en placa 0.1 - 1.0 mL de muestra en la caja, se vierte el medio fundido (~45°C) y se homogeneiza

Colonias superficiales

Colonias superficialesColonias sub-superficiales

Cuenta en placa: DILUCIONES SERIADAS

En los métodos de conteo en placa, el número de colonias: No debe ser muy alto para poder contarlas No debe ser muy bajo para que tenga significado

estadísticoNo. colonias 30 - 300

Muestra a contar

de caldo

10-2 10-3 10-4 10-5 10-6

Incontable

Normalmente no se conoce el número de microorganismos viables dilucionesusualmente seriadas

Cuenta en placa: DILUCIONES SERIADAS

Turbidimetría

Método más rápido (espectrofotómetro) Turbidez en una suspensión celular las células dispersan la luz

se cuantifica la luz transmitida No. de células DO (turbidez) número

de células turbidez (DO) Desventaja: problemas asociados al medio de

cultivo y a la presencia de partículasGRAVIMETRÍA

Se cuantifica el peso seco de una muestra Filtración (< 0.2 μm) de la suspensión de BM secado peso BM Centrifugación secado peso del precipitado Desventaja: incluye microorganismos muertos, materia orgánica,

polímeros extracelulares

8. Cinética microbiológica

CRECIMIENTO

Incremento ordenado de todos los constituyentes químicos de los microorganismos aumento en la

masa microbiana o en el número de células

FASES DE CRECIMIENTO

Fases de crecimientoExp Estacionaria Muerte

Tiempo

Crecim

iento

Cultivo en lote o “batch”

Lote (batch): el medio NO se renueva crecimiento en un volumen fijo que se altera continuamente por el crecimiento microbiano

Continuo: el medio se renueva constantemente número de células y estado metabólico constantes estado de equilibrio

CULTIVO EN LOTE (FASES DE CRECIMIENTO)

Adaptación o latencia: fase Lag Los microorg. adaptan su metabolismo a las nuevas condiciones

ambientales se prepararan para reproducirse Esta fase se puede reducir/evitar:

Inoculo lo más activo posible fase exponencial de crecimiento

Medio de crecimiento de inoculo parecido al medio de prod.

CULTIVO EN LOTE (FASES DE CRECIMIENTO)

Exponencial: fase Exp Condiciones óptimas para el

crecimiento los microorg. crecen y se multiplicanaumento logarítmico

La tasa de crecimiento es máxima y el tiempo de duplicación (td) es mínimo

La fase Exp no puede durar indefinidamente p. ej.: Si una bacteria con un td de 20 min crece a esa velocidad por 48 h

población equivalente a 4,000 veces el peso de la Tierra (peso de una bacteria: 10-12 g)

dx/dt = µx

CULTIVO EN LOTE (FASES DE CRECIMIENTO)

Fase de muerte Generalmente también es logarítmica, pero más lenta que el

crecimiento Exp Tasa de muerte > tasa de crecimiento

Fase estacionaria El cultivo está limitado por

nutrientes y/o por acumulación de productos

Tasa de crecimiento = Tasa de muertedx/dt = 0

dx/dt = -kx

CULTIVO CONTINUO Quimiostato*: tipo más común de cultivo continuo

control de la densidad de población y la tasa de crecimiento del cultivo

Elementos para su control: Tasa de dilución adición

de medio fresco a un flujo constante

Nutriente limitantenutriente esencial (C/N) en cantidad limitada

Medio frescoAire/gas estéril

Regulador de flujo

Espacio con aireReactor

Cultivo

Efluyente con células

*Permite mantener la población celular en fase Exp por largos periodos

CULTIVO CONTINUO Tasa de dilución controla la tasa de crecimiento el microorganismo no crece suficientemente rápido

para igualar la tasa de dilución: lavado una parte de la población muere por falta de nutrientes

[nutriente limitante] controla la densidad celular (células/mL) [Nutriente] limitante

densidad celular

Concentración de sustrato

Tiempo de duplicación

Densidad celular (biomasa)

Tasa de dilución

8. Cinética microbiológica

DEFINICIONES

Crecimiento: incremento ordenado de los constituyentes químicos de los microorganismos en el número de células o en la masa celular

Tasa de crecimiento: cambio en el número de células o masa celular por unidad de tiempo

Tiempo de duplicación (td): tiempo necesario para que a partir de una célula se formen dos (para que una célula se duplique)

Número de generaciones (n): número de divisiones celulares en un determinado tiempo = generaciones

8. Cinética microbiológica

Crecimiento exponencial

Durante la fase exponencial incremento de la población en el que el número de células se duplica cada cierto tiempo

Tiempo (h) No. células0

0.51.01.52.02.53.03.54.04.55.0

1248

1632 64

128256512

1,024

td = tiempo de duplicación

1 21 22 23 24 ... 2n

2

2x2x2td

td 2x2

td1

Crecimiento exponencial

Representando lo anterior en forma gráfica:

01000200030004000

0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5

x = x0 2n

x = número o masa de individuostd = tiempo de duplicaciónn = número de divisiones celulares en un

determinado tiempo = generaciones

Si td es constante el crecimiento es exponencial

td td td td1 2 2x2 23 ... 2n

Crecimiento exponencial

Obtener información sobre la tasa de crecimiento a partir de curvas aritméticas es difícil escala logarítmica (línea recta): Fácil uso podemos estimar tiempos de duplicación (td) a

partir de resultados experimentales

0300060009000

120001500018000

0 2 4 6 8Tiempo (h)

x (No

. de c

élulas

)

0.02.04.06.08.0

10.0

0 2 4 6 8Tiempo (h)

ln (x )

m = 0.693/td

TIEMPO DE DUPLICACIÓN

El número de veces que se duplica la biomasa en un cierto tiempo esta dado por:

Donde:n = número de generacionest = tiempo de la fase Exptd = tiempo de duplicación

La concentración de biomasa después de un tiempo de crecimiento exponencial puede cuantificarse, en función de la biomasa inicial, a través de:

n = t/td

x = x0 2n Donde:x = número final de célulasx0 = número inicial de células

x = x0 2t/td

t/td = n = ln x – ln x00.693

0.693 t + ln x0 ln x – ln x0 = 0.693td t td

TIEMPO DE DUPLICACIÓNCon base en la Ec. ❸, si conocemos las poblaciones inicial y final, podemos calcular el número de generaciones (n) y el tiempo de duplicación (td) para expresar la Ec. ❸ en términos de n:

x/x0 = 2t/td

ln (x/x0) = ln2 (t/td)ln (x/x0) = 0.693 (t/td)ln x =

Ec. de una línea recta

TIEMPO DE DUPLICACIÓN: EJEMPLO 1 Con n expresado en términos de parámetros cuantificables (x y x0), puede calcularse el tiempo de duplicación (td). P. ej.:Calcula el td de un cultivo, considerando que:

x0 = 5 x 107 células x = 5 x 108 células t = 6 h

t/td = n = ln x – ln x00.693

t/td = 20.0 – 17.70.693

t/td = 3.3 td = t/3.3 td = 6 h/3.3 = 1.8 h

TIEMPO DE DUPLICACIÓN: EJEMPLO 2A partir de una tabla de datos: número de células vs. tiempo Podemos calcular td de una gráfica semi-

logarítmica durante la fase Exp (crecimiento exponencial)

En donde la pendiente (m) = 0.693/td

t (h) x (células) ln x0 10 2.3

0.5 10 2.31.0 10 2.31.5 15 2.72.0 30 3.42.5 60 4.13.0 120 4.83.5 240 5.54.0 480 6.24.5 960 6.95.0 1920 7.65.5 3840 8.36.0 7680 8.96.5 15360 9.67.0 20200 9.97.5 21000 10.08.0 20800 9.98.5 20650 9.99.0 18400 9.89.5 14350 9.6

10.0 10250 9.2

ln x = 0.693 t + ln x0tdy = mx + b

05000

10000150002000025000

0 2 4 6 8 10

x (No. d

e célu

las)

Tiempo (h)

02468

1012

0 2 4 6 8 10

ln (x)

Tiempo (h)

TIEMPO DE DUPLICACIÓN: EJEMPLO 2

Pendiente = m = 1.386 Entonces, cómo

calculamos td?:

m = 0.693/td1.386 = 0.693/tdtd = 0.693/1.386td = 0.5 h

02468

1012

0 2 4 6 8 10ln (

x )Tiempo (h)

m = 0.693/td

TIEMPO DE DUPLICACIÓN: EJEMPLO 3

Se desea propagar un cultivo de Escherichia coli, cuyo tiempo de duplicación es de 20 min, estime: El número de generaciones de E. coli después de 10 h

de fase Exp El número de células producidas si el medio se inocula

con una célula, suponiendo que la fase Exp no termina

t/td = n = ln x – ln x00.693

n = t/td n = 10 h/0.33 h n = 30.3

td (h) = 20 min 1 h = 0.33 h60 min1. Convertir td a horas o t a minutos

2. Cálculo del número de generaciones (n)

TIEMPO DE DUPLICACIÓN: EJEMPLO 33. Cálculo del número de células producidas (x) si se inocula

con 1 célula (x0) Usando las ecs. (2) o (3):

x = 1 * 230.3x = x0 2n x = x0 2t/td

x = 1.3 x 109 células

t/td = n = ln x – ln x00.693 Usando la ec. (4):

30.3 = ln x – ln (1)0.693

ln x - 0 = 30.3(0.693) ln x = 20.9 x = exp(20.9)

x = 1.3 x 109 células

TIEMPO DE DUPLICACIÓN: ejemplos

Microorganismo Temperatura (°C)

Tiempo de duplicación (min)

Bacillus stearothermophilus 60 11Escherichia coli 37 20Bacillus subtillis 37 27

Streptococcus lactis 37 30Pseudomonas putida 30 45

Lactobacillus acidophilus 37 75Mycobacterium tuberculosis 37 360Bradyrhizobium japonicum 25 400

Anabaena cylindrica(cianobacteria) 25 840

Treponema pallidum(espiroqueta) 37 1980 (33 h)

8. Cinética microbiológica

µ

Tasa de crecimiento específica

Tasa específica de crecimiento = μ μ es la tasa (velocidad) a la cual una población microbiana se

duplica en un tiempo determinado (fase Exp) μ está definida por:

μ = Δx 1 = 1 dxΔt x x dt

Tasa de crecimiento específicaEn una gráfica aritmética de x vs. tiempo:

μ = pendiente entre 2 puntos el no. de células promedio en esos 2 puntos

m = y2 - y1x2 - x1

t (h) x (células)0 1

0.5 21.0 41.5 8

m = 4 - 2 (células) = 4 células1.0 - 0.5 (h) h

(2 + 4)/2 = 3 células

= 4 (células/h)3 células μ = 1.33 h-1

050

100150200250

0 1 2 3 4 5Tiempo (h)

x (No

. de c

élulas

)

Pendiente:

No. células promedio:

μFase Exp

Tasa de crecimiento específicaDe acuerdo con lo anterior:

dx = μ dtx

ln x - ln x0 = μ t

ln x = μ tx0

μ = 0.693td

dx = x0 xdt = t0 tsi integramos:

Despejando dx/x:

x = x0 eµt

OJO: t tiempo que dura la fase exponencial

Y, con base en el crecimiento Exp:

y = m x + b ln x = 0.693 t + ln x0td La pendiente (m) = μ

μ = Δx 1 = 1 dxΔt x x dt

Tasa de crecimiento específica

Para corroborar que µ en el ejemplo 1 sea correcta: Con la ec. (8)

Despejamos td:

µ = 0.693td

µ = 1.33 h-1

td = 0.5 htd (h) = 0.6931.33 h-1

8. Cinética microbiológica

PROBLEMA 1Si la concentración celular al inicio de la fase Exp en un cultivo es de 1 x 104 cel/mL y después de 4 h de crecimiento Exp hay 1 x 108 cel/mL. Calcular:

a) La tasa específica de crecimiento (m)b) El tiempo de duplicación (td)c) El número de generaciones (n)

Datos: x0 = 1 x 104 cel/mL x = 1 x 108 cel/mL t = 4 h

ln x - ln x0 = µt

Para calcular (a), podemos usar la ec. (6):

ln (1 x 104) = 9.2ln (1 x 108) = 18.4

(18.4 - 9.2)/4 [h] = µ

µ = 2.3 h-1

PROBLEMA 1

Para calcular (b), usamos la ec. (8): µ = 0.693td

td = 0.3 htd (h) = 0.6932.3 h-1

Para calcular (c), usamos la ec. (4):

n = 13.3n = 18.4 - 9.20.693

n = ln x – ln x00.693

PROBLEMA 2Un fermentador que se inocula con 2 x 106 cel/mL inicia su fase de crecimiento Exp después de 2 h. ¿Cuánta biomasa se produce después de 12 h si la bacteria tiene un td de 3.5 h y la fase Exp no termina? Datos:

td = 3.5 h x0 = 2 x 106 cel/mL t = 12 – 2 [h] = 10 h x = ?

Para calcular x, primero necesitamos calcular m ec. (8):

µ = 0.693td

µ = 0.2 h-1µ (h-1) = 0.6933.5 h

Calculamos x con las ecs. (6) o (7): x = x0 eµt

x = (2 x 106 cel/mL) e(0.2*10) x = (2 x 106 cel/mL) * (7.4)x = 1.5 x 107 cel/mL

PROBLEMA 3La bacteria Streptococcus lactis tiene un tiempo de duplicación de 0.5 h a 37°C. Si se inoculó un fermentador con 1 x 108 células/mL ¿Cuánta biomasa se producirá después de 300 min de crecimiento Exp? Datos:

td = 0.5 h x0 = 1 x 108 cel/mL t = 300 min x = ?

Primero tenemos que pasar TODO a las mismas unidades:

300 min 1 h = 5 h60 min

Podemos calcular x con la ec. (2), pero primero necesitamos calcular n x = x0 2n t/td = n

n = 5 h/0.5 h n = 10

PROBLEMA 3

Sustituimos n en la ec. (2)x = x0 2n n = 10 x0 = 1 x 108 cel/mL

x = (1 x 108) x 210 x = (1 x 108) x (1024)x = 1.02 x 1011 cel/mL

PROBLEMA 4¿Cuánto tiempo tarda un cultivo en alcanzar una concentración de biomasa de 17 g/L si se inoculó con una concentración de 0.4 g/L y la tasa específica de crecimiento fue de 0.8 h-1?

Datos: x0 = 0.4 g/L x = 17 g/L μ = 0.8 h-1

t = ?

Podemos calcular t con la ec. (5):ln x - ln x0 = µ t ln (17) = 2.83

ln (0.4) = -0.92

t = [2.83 - (-0.92)] / 0.8 h-1

t = (ln x - ln x0)/µ

t = 3.75 / 0.8 h-1

t = 4.7 h

En un experimento de laboratorio se obtuvieron los datos de crecimiento de Escherichia coli que se muestran en la tabla. Con base en ellos, calcula:

a) La tasa específica de crecimiento (µ) t (h) x (células)0 1.0E+041 1.1E+042 1.5E+043 1.5E+054 1.0E+065 1.9E+076 2.6E+087 4.2E+088 5.5E+089 5.3E+0810 4.5E+0811 1.5E+0812 2.0E+07

ln x9.29.39.611.913.816.719.419.920.120.119.918.816.8

0.E+001.E+082.E+083.E+084.E+085.E+086.E+08

0 2 4 6 8 10 12Tiempo (h)

X

b) El tiempo que tarda en duplicarse la población de E. coli y el número de generaciones

58

1114172023

0 2 4 6 8 10 12Tiempo (h)

ln X

Identificamos la fase Exp

PROBLEMA 5

La pendiente de la recta es μ: μ = 2.4 h-1

μ = 0.693/td, entonces: td = 0.3 h

n = t/td, entonces: td = 0.3 h t = ??? t = tiempo que dura la fase exp

t = 6 - 2 [h] = 4 hn = 14n = 4 h / 0.3 h