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PONTIFCIA UNIVERSIDADE CATLICA DO PARAN CENTRO DE CINCIAS BIOLGICAS E DA SADE CURSO DE FARMCIA TOXICOLOGIA

TOXICOLOGIA AULAS PRTICAS

2011 2 Semestre

Curitiba 2011

Toxicologia Prtica

Prof. Srgio Fontoura

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NDICE Pg. Normas de Segurana no Laboratrio de Toxicologia 03 Anlises Toxicolgicas 04 Percia Toxicolgica 05 Ensaios Preliminares 05 Determinao da Creatinina Urinria 12 Curva de Calibrao 13 Mineralizao 14 Controle da Exposio Ocupacional ao Monxido de Carbono IBE: Carboxiemoglobina 15 Controle da Exposio Ocupacional a Agentes Metemoglobinizantes IBE: Metemoglobina

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Controle da Exposio Ocupacional ao Fenol e Benzeno. IBE: Fenol Urinrio 19 Controle da Exposio Ocupacional ao Tolueno IBE: cido Hiprico Urinrio 22 Controle da Exposio Ocupacional ao Chumbo IBE: Aminolevulnico Urinrio (ALA-U) 24 Controle da Exposio Ocupacional a Inseticidas Organofosforados e Carbamatos IBE: Atividade da Butirilcolinesterase (BChE)

27 Dosagem Alcolica 30 Pesquisa Toxicolgica do Diazepam 32 Pesquisa Toxicolgica do Fenobarbital 34 Monitoramento Teraputico 35 Pesquisa Toxicolgica de Nitratos e Nitritos 38 Pesquisa de Metanol em Bebidas Alcolicas 40 Tratamento Bsico do Intoxicado 42 Cromatografia Gasosa 44 Modelo de Relatrio 47 REFERNCIAS 48

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NORMAS DE SEGURANA NO LABORATRIO DE TOXICOLOGIA 1. Indumentria Apropriada

Avental de mangas compridas, longos at os joelhos, com fios de algodo na composio do tecido. No usar avental de nylon ou 100% de polister.

Cala comprida de tecido no inteiramente sinttico, preferencialmente de algodo, grossa como um jeans. O uso de saia ou vestido, bermuda ou short so proibidos

Sapato fechado, de couro ou assemelhado. Portanto, o uso de sandlia, chinelo, sapato aberto no sero permitidos.

culos de segurana. Por medidas de segurana o uso de lentes de contato, braceletes, correntes ou outros

adereos tambm no sero permitidos. Luvas

2. Como se comportar no laboratrio Certifique-se da localizao do chuveiro de emergncia, lava-olhos, e suas

operacionalizaes. Conhea a localizao e os tipos de extintores de incndio no laboratrio. No laboratrio terminantemente proibido fumar, beber, comer Brincadeiras que podem comprometer a segurana do aluno ou de seus colegas no sero

toleradas. As pessoas que usarem cabelos compridos, devem trabalhar com os mesmos presos. proibido trabalhar ou permanecer sozinho no laboratrio. Na ausncia do professor, os

alunos no devem permanecer no interior do laboratrio. Quando precisar descartar alguma soluo verifique a existncia de um local apropriado

para tal, NUNCA DESPREZE QUALQUER MATERIAL NA PIA.

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ANLISES TOXICOLGICAS

1. INTRODUO Estas anlises so requeridas sempre que se torna necessrio esclarecer, confirmar ou prevenir uma intoxicao. So realizadas tambm no controle da terapia do intoxicado, fornecendo ao clnico o perfil de depurao em andamento.

2. CARACTERSTICA FUNDAMENTAL O agente txico se encontra ligado a uma matriz biolgica na ordem de traos.

3. FINALIDADE A finalidade orienta o planejamento analtico. Anlise toxicolgica de urgncia; controle da exposio ocupacional, monitoramento teraputico, controle do uso de drogas; esclarecimento de intoxicao letal; dosagem alcolica, exame anti-dopagem.

4. AGENTE TXICO OU TOXICANTE preciso saber, antes de se iniciar a anlise, se esta deve ser direcionada apenas ao agente txico e/ou algum de seus produtos de biotransformao, ou ainda avaliar algum indicador bioqumico ou hematolgico que aponte o efeito do toxicante no organismo. Assim, trs classes configuram-se para a anlise ou avaliao:

substncia qumica in natura: paration produtos da biotransformao: p-nitrofenol parmetros bioqumicos ou hematolgicos: atividade da BChE ou AChE

Tambm se devem conhecer as caractersticas fsico-qumicas do agente txico: gases, compostos volteis e fixos, substncias orgnicas e inorgnicas.

5. AMOSTRA Uma vez definida a finalidade da anlise e a natureza da substncia ou indicador que se pretende reconhecer ou quantificar, necessrio selecionar a amostra que melhor represente a biodisponibilidade, a excreo ou o efeito do toxicante no organismo.

esclarecimento de intoxicao letal vsceras, sangue, urina, etc anlise toxicolgica de urgncia sangue, urina, lquido de dilise, lquido de lavado gstrico, vmito, restos alimentares e de medicamentos controle da exposio ocupacional sangue, urina, cabelo* controle do uso de drogas urina, cabelo* monitoramento teraputico sangue, urina, saliva** controle de dopagem urina, cabelo* * futuro; **algumas drogas so bem excretadas pela saliva Amostras alternativas ar expirado unha, cabelo tecido adiposo leite materno (animal no seria amostra alternativa)

6. MTODO O mtodo dever ser exato, preciso e sensvel. A anlise toxicolgica, qualquer que seja a finalidade, apresenta as fases: separao extrao identificao/quantificao Os mtodos de extrao/separao dependem da natureza da substncia qumica a ser analisada: voltil, orgnica ou inorgnica.

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PERCIA TOXICOLGICA

1. INTRODUO Anlises toxicolgicas realizadas para fins legais: esclarecimento de intoxicaes letais, controle de dopagem e dosagem alcolica. Portanto, as anlises podem ser realizadas em indivduos vivos e/ou mortos.

2. ESCLARECIMENTO DE INTOXICAO LETAL a) Necrpsia

Coleta de material: o legista colhe o material de necrpsia: vsceras, sangue e urina. Em caso de exumao: ossos, unhas, cabelo

ENSAIOS PRELIMINARES

Quando a substncia txica envolvida com uma intoxicao for desconhecida, h a necessidade de realizar alguns ensaios para orientar a marcha analtica.

1. PESQUISA DE METAIS

a) Lminas metlicas Fundamento: baseia-se no intercmbio de cargas inicas entre o material suspeito e a lmina usada, de acordo com a srie de potenciais eltricos dos diversos metais. ESCALA DE ELETRONEGATIVIDADE (DECRESCENTE): F(4,0) O(3,5) Cl N(3) Br(2,8) I S C(2,5) Au Pt Hg Cu P H(2,1) B As(2) Sb(1,9) Si Sn Pb Fe(1,8) Cr Zn (1,6) Mn Al Be(1,5) Mg(1,2) Ca Sr Li(1) Ba Na(0,9) K Rb(0,8) Cs(0,7)

Tcnica: sero usadas lminas de Zn, Fe, Cu e Al bem polidas que so colocadas no material suspeito acidificado com HCl a 10%. Depois de um aquecimento moderado por at 60 minutos, retirar a lmina e verificar a reao sofrida:

Lmina Alterao Sofrida Interpretao Zn Escurecimento Ag, Cu, Hg, Sb, Sn ou outro

metal menos eletropositivo que o Zn

Fe Avermelhamento Cu Cu Cobre-se por uma camada branco-acinzentada Ag ou Hg Cu Escurecimento As, Bi ou Sb Al Eflorescncias brancas Hg

Se a lamina de Cu apresentar um escurecimento, deve-se fazer o ensaio de Gutzeit para o reconhecimento do As: Transferir 2 a 5 ml do material suspeito para um tubo de ensaio e acidificar com gotas (2 gotas/ml de amostra) de HCl concentrado. Cobrir o tubo com um pedao de papel de filtro. Umedecer a cpsula de papel, bem no centro, com uma gota de soluo de AgNO3 a 10%. Levantar a cpsula o suficiente para introduzir rapidamente 2 a 3 pastilhas de Zn. Observar o escurecimento do papel de filtro. Pergunta: Quais reaes devem ter ocorrido para que haja o escurecimento do papel ?

2. PESQUISA DE GASES OU VAPORES

a) Papis Reativos

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A pesquisa de diversos compostos gasosos ou volteis pode ser realizada atravs de papis reativos. Os quais so preparados no prprio laboratrio, tratando os papis com solues previamente preparadas.

Exemplos de papis reativos: Papel Reativo Cor aps exposio Indicao

Picrossdico* Vermelha HCN Cobre-guaiaco Azul (instantnea) HCN Acetato de chumbo Preta H2S Nitrato de prata Preta H2S, H3As Sulfato de cdmio Preta H2S Fluorescena Vermelha Br2 Hematoxilina violeta NH4OH

*cido pcrico a 1% (secar ao abrigo da luz) + carbonato de sdio a 10%

Confirmao da presena de cianeto: ensaios colorimtricos para a demonstrao da presena de cianeto numa amostra biolgica: quando da suspeita de uma intoxicao por este tipo de composto.

Observaes: A) O CN- biotransformado no organismo pela rodonase gerando SCN-. B) Aps o bito o CN- pode ser transformado em SCN- devido a putrefao. Assim, deve-se pensar que na amostra proveniente de uma intoxicao letal por cianeto o on j no exista.

3. PESQUISA DE COMPOSTOS VOLTEIS

a) Amostra: sangue, vsceras, leite, lavado e contedo gstricos. Se a anlise no for realizada de imediato, conservar a amostra em frasco hermeticamente fechado, sob refrigerao, sem o uso de conservantes qumicos.

b) Separao Destilao: 1. Meio cido verificar o pH da amostra, se cido alcalinizar com soluo de

NaOH a 10% e depois acidificar com cido tartrico a 10%, se alcalina ou neutra, acidificar com cido tartrico. Destilar aproximadamente 2/3 do volume inicial da amostra D1.

2. Meio alcalino alcalinizar o material remanescente no balo com MgO at pH 8,0. Destilado D2.

c) Extrao Extrair os destilados D1 e D2 com ter etlico, 2 ou 3 vezes. Evaporar o solvente. Retomar o resduo com pequena quantidade de gua e proceder aos ensaios de identificao.

d) Identificao 1. Destilado D1: verificar a presena de substncias oxidveis, hidrocarbonetos halogenados, benzeno, fenol e sulfeto de carbono. 2. Destilado D2: pesquisar substncias como a anilina e o paration.

e) Tcnica Substncias oxidveis (lcoois, aldedos, hidrocarbonetos no saturados e outras facilmente oxidveis) Juntar em tubo de ensaio a 1 ml de D1 1 ml de H2SO4 conc., gotas de soluo de K2Cr2O7 0,05 N; aquecer em banho de gua. Aparecimento de cor verde indica reao positiva.

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Qual o fundamento desta prova ? Apresente uma reao qumica que poderia explicar este fundamento (por exemplo, supondo que a substncia oxidvel em questo seja o metanol).

lcoois (metanol e lcool etlico) a) Metanol A 1 ml de D1 juntar, em tubo de ensaio, 1 gota de KmnO4 a 5% e 1

gota de soluo de H3PO4 a 10%, aguardar 1 minuto e adicionar soluo saturada de NaHSO3 gota a gota, at descorar o excesso de permanganato. Juntar, em seguida, 4 ml de soluo de H2SO4 a 75%, uma pequena poro de cido cromotrpico, aquecer em banho de gua fervente por at 10 minutos. Observar o aparecimento de cor violeta. Este ensaio tambm d positivo para o aldedo frmico, Como voc faria para diferenciar o metanol do aldedo frmico usando esta reao ?

b) Etanol (reao de Lieben) A 1 ml de D1 juntar gotas de KOH a 10% e de soluo iodo-iodetada, at cor amarela persistente. Aquecer e verificar o aparecimento de ppdo amarelo e/ou odor caracterstico de iodofrmio. Este ensaio d positivo tambm para a acetona. Para diferenciar, repetir a operao com soluo de NH4OH em substituio ao KOH, neste caso a reao positiva somente para a acetona. Qual a estrutura do iodofrmio ?

4. SPOT TESTS PARA PESQUISA DE DROGAS E FRMACOS

Fritz Feigl (1891 1971) foi o criador da Anlise de Toque Tpfelreaktionen, em alemo; Spot Tests, em ingls procedimento analtico para fins qualitativos, executado com tcnica muito simples com o emprego de uma ou poucas gotas de amostra e reagentes, em geral sobre papel de filtro, em que se desenvolve uma colorao caracterstica para a identificao da substncia ou grupo qumico . O resultado, para que possa indicar a sensibilidade da prova, ou seja, o valor mnimo detectvel na menor concentrao expresso mediante o limite de identificao, em microgramas, acoplado ao limite de diluio. O teste tanto mais sensvel quanto menor o limite de identificao e maior o de diluio. Determinar a sensibilidade do mtodo para barbitricos (fenobarbital), benzodiazepnicos (diazepam) e salicilatos (cido saliclico) Fundamento: Salicilato + Fe+++ complexo Fenobarbital + NaOH p-hidrxi fenobarbital + KMnO4 colorao verde Diazepam formao de benzofenona por hidrlise cida dando colorao amarela ao meio Tcnica:

b) Transferir para um funil de separao 5 ml de plasma (ou 20 ml de urina) c) Ajustar o pH entre 4,0 e 5,0 com soluo de H2SO4 0,1 N d) Extrair duas vezes com o dobro do volume de clorofrmio-isopropanol (95:5),

agitando por 2 minutos, esperar separar as fases e) Transferir a camada orgnica para um bquer, filtrando-a sobre Na2SO4 anidro f) Evaporar em banho de gua (60C) at a secura e reservar R1 g) Transferir para um funil de separao 5 ml de plasma (ou 20 ml de urina) h) Ajustar o pH entre 9,0 e 10,0 com a soluo de NaOH 1 N e extrair duas vezes com

a mistura clorofrmio-ter (3:1) agitando por 2 minutos, esperar separar as fases i) Transferir a fase orgnica para um copo de bquer, filtrando-a sobre Na2SO4 anidro j) Adicionar 1 a 2 gotas de H2SO4 0,1 N e evaporar o solvente em banho de gua

(60C) at a secura e reservar R2 k) Ressuspender os resduos com ter-clorofrmio (1:3) e executar as provas a seguir

Numa placa de toque contra um fundo branco, depositar 0,2 ml da amostra com 0,2 ml do reativo e observar aparecimento de cor caracterstica.

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1) Pesquisa de Fenobarbital Em um tubo de ensaio misturar 1 ml de NaOH 0,5 N com 1 ml da soluo 0,5 N de KMnO4. Sobre a amostra depositar 0,2 ml deste reativo. Observar o aparecimento de colorao verde amarelo-marrom

2) Pesquisa de Benzodiazepnicos (Diazepam) Sobre a amostra depositar 0,2 ml do reativo de Marquis* e observar colorao amarela, esta reao no especfica, dando resultado positivo para qualquer benzodiazepnico

3) Pesquisa de salicilatos (cido saliclico) Depositar 0,2 ml da amostra e sobre esta 0,2 ml de cloreto frrico a 5% e observar o aparecimento de colorao violeta, compostos fenlicos do a mesma reao. Faa um teste com o reativo de Marquis*.

* Reativo de Marquis: Formaldedo a 40% ........................ 1 ml H2SO4 concentrado ........................20 ml Validade 30 dias

Determinar a sensibilidade do mtodo: Solues padro: 10 mg/ml Preparar diluies de 10 a 0,1 mg/ml Testar as diluies e determinar a sensibilidade do mtodo Compare os seus resultados com os de MAREK e cols. (2004):

Substncia Concentrao mg/ml 2 1 0,5 0,3 0,2 0,1 0,05 Diazepam +++ +++ ++ ++ + + - Fenobarbital +++ +++ ++ ++ + + - cido saliclico ++ + + + - - -

Outros resultados com o Reativo de Marquis Salicilatos colorao avermelhada que desaparece com a adio de gua Herona, monoacetilmorfina, codena e dionina vermelho-cereja violeta azul Clorpromazina e prometazina prpura Levomepromazina azul-avermelhado Anfetamina laranja marrom-esverdeado Desoxiefedrina vermelho-alaranjado marrom

QUESTES: 1) Levando em considerao a concentrao txica de cada um dos frmacos e

considerando uma amostra como sangue, o mtodo tem uma boa sensibilidade ? Justifique a sua resposta.

2) Levando em considerao a concentrao letal de cada um dos frmacos e considerando uma amostra como sangue, o mtodo tem uma boa sensibilidade ? Justifique a sua resposta.

3) Levando em considerao a concentrao teraputica de cada um dos frmacos e considerando uma amostra como sangue, o mtodo tem uma boa sensibilidade ? Justifique a sua resposta.

4) Levando em considerao agora uma amostra como urina, o mtodo tem uma boa sensibilidade ? Justifique a sua resposta.

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5. RECONHECIMENTO DE FRMACOS POR CCD - TRIAGEM

Tambm seria um ensaio preliminar, para a identificao de substncias txicas desconhecidas. O resultado da CCD orientar a configurao do cromatgrafo a gs. A triagem tambm pode ser feita por ensaios imunolgicos (imunofluorescncia e ELISA)

1. AMOSTRAS a) Sangue soro, plasma, total b) Urina c) Outras

2. ESQUEMA DA ANLISE SANGUE URINA

EXTRAO

EXTRATO EXTRATO CIDO ALCALINO

1/3 2/3 2/3 1/3

IDENTIFICAO

CROMATOGRAFIA CROMATOGRAFIA CROMATOGRAFIA GASOSA EM CAMADA GASOSA DELGADA

3. TCNICA

3.1 Extrao Sangue 10 ml urina 40 ml

Meio cido do volume pH entre 4 e 5 com H2SO4 0,1 N solvente: clorofrmio isopropanol (95:5) resduo R1

Meio alcalino do volume pH entre 9 e 10 com NaOH 1 M solvente: clorofrmio ter (3:1) resduo R2

4. RECONHECIMENTO POR CCD

a) Retomar R1 com gotas de ter clorofrmio (1:3) e transferir para duas placas C1 e C2 b) Retomar R2 com gotas de ter clorofrmio (1:3) e transferir para outras duas placas

C3 e C4 c) Aplicar em cada placa 5 padres ( 10 g/ml)

d) Fases mveis

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Placas Fases Mveis C1 Clorofrmio propanona (4:1) C2 Clorofrmio propanona (9:1) C3 Metanol NH4OH 25% (100:1,5) C4 Clorofrmio metanol (9:1)

e) Corrida: 10 cm f) Reveladores

Placas Reveladores C1 FeCl3 a 5%(A) Dragendorff(B) C2 HgSO4 (C) Difenilcarbazona a 0,1% (D) C3 Bromocresol verde (E) p-nitroanilina diazotada(F) C4 Dragendorff(B) NaNO2 (G) Dragendorff(B)

Preparo dos Reveladores a) Cloreto frrico a 5% em soluo aquosa (FeCl3) b) Reativo de Dragendorff (DI)

1) iodeto de potssio .................................. 12,0 g gua destilada ........................................ 30,0 ml

2) nitrato de bismuto ................................... 0,51 g cido actico glacial ............................... 30 ml Misturar as solues 1) e 2); completar o volume at 300 ml com cido sulfrico a 10%. Juntar mistura 6g de iodo e agitar durante 30 minutos.

c) Soluo de sulfato de mercrio (HgSO4) 1) HgO soluo a 5% ................................... 100 ml 2) H2SO4 conc. ............................................. 20 ml

Juntar cuidadosamente 2) em 1); resfriar e completar o volume para 250 ml com gua destilada.

d) Soluo de difenilcarbazona a 0,1% em clorofrmio (DFC) Soluo recente

e) Soluo de bromocresol verde (BCV) 1) soluo etanlica de BCV a 0,1% 2) soluo tampo-fosfato de potssio (pH 5,5) 3) gua destilada

Misturar 1,2 e 3 na proporo 2:1:1

f) p-nitroanilina diazotada (DC) 1) p-nitroanilina a 1% em HCl 1N 2) etanol 3) soluo de NaNO2 a 5% (conservar em geladeira)

Misturar 1 e 2 (1:1); a soluo estvel a 4C durante alguns meses; diazotar com 3 na proporo de 5:1. Depois de aproximadamente 3 min, nebulizar a cromatoplaca com o reativo, esperar cerca de 3 minutos e aplicar a soluo de NaOH a 50%, que deve ser diluda (1:10) com etanol no momento do uso

g) soluo de NaNO2 a 1% em gua (conservar em geladeira) (NaNO2)

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1. Comportamento de algumas drogas de carter cido e neutro frente a duas sequncias de reveladores: Droga Reveladores

FeCl3 DI HgSO4 DFC cido saliclico ++(vi) - - - Cafena - ++(cs) - - Diazepam - +++(cs) - - Fenobarbital - - +++(br) +++(vi)

2. Comportamento de algumas drogas de carter bsico e neutro frente a duas sequncias de reveladores:

Droga Reveladores BCV DC DI NaNO2 DI Cafena - - ++++(cs) ++++(pr) ++++(cs) Diazepam - - ++++(cs) ++++(cn) ++++(al) Haloperidol ++(vi) ++(am) ++(cs) ++(cn) ++(al) Imipramina ++(vi) +++(cs) ++(al) +(cn) +(cs)

3. Valores de hRf de algumas drogas de carter cido e neutro em duas fases mveis:

Droga CLOROFRMIO - ACETONA 4 : 1 9 : 1 cido saliclico 07 02 Cafena 34 24 Diazepam 80 68 Fenobarbital 56 41

4. Valores de hRf de algumas drogas de carter bsico e neutro em duas fases mveis:

Droga Reveladores MetOH NH4OH (100:1,5) HCCl3 MetOH (9:1) Cafena 75 88 Diazepam 80 99 Haloperidol 80 67 Imipramina 50 35

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CREATININA URINRIA PARA AS PRTICAS DO FENOL URINRIO, CIDO DELTA AMINOLEVOLNICO URINRIO E DO CIDO HIPRICO

1) Princpio A creatinina reage com o cido pcrico em meio alcalino, formando o picrato de creatinina que tem uma colorao amarelo avermelhada..

2) Reagentes a) cido pcrico : 28 mmol/l b) Hidrxido de sdio: 6 M c) Soluo padro: 50 mg/dl

3) Tcnica a) Procedimento

Reagentes Tubos (ml) Branco Padro Teste H2O 2 ml 2 ml 2 ml Urina - - 20 L Soluo padro - 20 L - cido pcrico 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml Hidrxido de sdio 2 gts 2 gts 2 gts Misturar e deixar em repouso a temperatura ambiente por 10 minutos, ler as absorbncias em 520 nm

4. Clculos Aa

Onde: Cp = concentrao do padro Creatinina (mg/dl) = x Cp AP = absorbncia do padro Ap Aa = absorbncia da amostra

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CURVA DE CALIBRAO A maioria dos mtodos analticos est baseado em uma curva de calibrao na qual uma

quantidade medida y representada em um grfico como uma funo de uma concentrao x conhecida, de uma srie de padres. Quando se constri a curva de calibrao, nem sempre todos os pontos caem sobre a reta devido aos erros aleatrios no processo de medida. Ento se deve ajustar a melhor reta que passa por esses pontos. Uma maneira comum de encontrar esta reta atravs do mtodo dos mnimos quadrados. Assume-se que uma reta um bom modelo para representar a relao entre a absorbncia de uma amostra y e sua concentrao x. A reta que procuramos dada pela equao: y = mx + b onde m a inclinao da reta e b o intercepto. A inclinao e o intercepto so chamados de parmetros do modelo que nesse caso uma reta. Assume-se tambm que qualquer desvio dos pontos individuais da reta resulta de erros na medida (da rea do pico ou de leitura da absorbncia) e que no h erros nos valores de x, isto , as concentraes das solues-padro so conhecidas exatamente. A linha gerada pelo mtodo dos mnimos quadrados aquela que minimiza a soma dos quadrados dos resduos para todos os pontos. xi e yi so as coordenadas dos dados individuais, N o nmero de pares de dados usados na preparao da curva de calibrao e x e y so os valores mdios para as variveis. Inclinao da Reta m: xi. yi - xi. yi N m = (xi - x)2

O intercepto b: b = y - mx Para o clculo de qualquer concentrao a partir de absorbncias determinadas experimentalmente: C = A b/m C = concentrao A = absorbncia b = intercepto m = inclinao da reta

Para facilitar os clculos preencher a tabela abaixo com os dados necessrios i Xi

(concentrao) Yi

(absorbncia) xi - x (xi - x)2 xiyi

01 02 03 04 05 06

Obs.: Esta tabela ser til nas prticas onde a curva de calibrao for necessria

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MINERALIZAO

1. INTRODUO Processo de separao de metais pesados do material biolgico atravs da destruio da matria orgnica. Aps a absoro os metais se depositam nos tecidos ligados a protenas (em geral em radicais sulfidrilas livres encontrados nos resduos de cistena), e deste modo no podem ser identificados.

2. MTODOS a) Mineralizao por via seca Calcinao: destruio da matria orgnica atravs do calor (400 a 450 C) 1. Calcinao Simples colocar a amostra (15 g de vsceras, 100 ml de urina ou 20 ml de sangue) numa cpsula de porcelana e secar a 110 C em estufa. transferir a amostra seca para mufla e aquecer gradualmente at 550 C, at a obteno de cinzas brancas, plmbeas ou avermelhadas. resfriar e suspender as cinzas com soluo de HNO3 a 10%, filtrar 2. Calcinao Alcalina Indicada para uma maior concentrao de amostra (vsceras). adicionado um composto alcalino oxidante que agir como catalisador (KNO3, por exemplo). Pelos processos de calcinao, simples ou alcalina, h perda total de As e Hg e parcial de Cd, Pb, Sn, Zn, Be, Sb e Tl Por qu ? b) Mineralizao por via mida As tcnicas de mineralizao por via mida esto baseadas nas aes oxidante do HNO3 e desingraxante do H2SO4, podendo ser empregados catalisadores. colocar a amostra (5 ml de sangue, 10 ml de urina ou 2 g de vsceras) em um erlenmeyer e juntar 10 ml de HNO3 e 2 ml de H2SO4. aquecer em chapa eltrica adicionando novas pores de HNO3 sempre que haja escurecimento ou que apaream vapores brancos (SO3). continuar o aquecimento at a obteno de um lquido amarelado, que no escurea aps resfriamento (observar por 15 a 20 min.). juntar 20 ml de gua e aquecer ebulio at reduzir o volume a aproximadamente 4 ml. Por este mtodo h perda de Pb, Ca, Sr, Ba, Mg, Bi e Sb. Por qu ?

c) Mineralizao por cloro nascente Baseia-se na ao oxidante do Cl2: direta: Hg2Cl2 + Cl2 2HgCl2 indireta: Cl2 + H2O 2HCl + [O] Mtodo de Brouardel-Ogier colocar em um balo 5g de vsceras previamente homogeneizadas e adicionar 20% desta massa de KclO3 fazer passar uma corrente de Cl2 nascente at a obteno de um lquido amarelo que no mais escurea aps resfriamento. Por este mtodo h perda de Ag, por qu ?. d) Extrao Aps a separao, qualquer que seja o mtodo usado, os metais podero ser extrados com agentes quelantes ou solventes orgnicos. O Tl pode ser extrado com ter dietlico e o Pb e Hg, aps a complexao, so bem extrados com ditizona.

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CONTROLE DA EXPOSIO AO MONXIDO DE CARBONO INDICADOR BIOLGICO DE EXPOSIO: CARBOXIEMOGLOBINA

1. INTRODUO O monxido de carbono um gs incolor, inodoro e inspido gerado a partir da combusto incompleta do carbono, como ocorre em diversas indstrias, como as siderrgicas. H tambm exposio ocupacional em garagens e indstrias qumicas. Ns tambm estamos expostos ao gs atravs da poluio atmosfrica nas grandes cidades. O gs est presente na fumaa dos incndios, a maior causa de morte nestes sinistros a anxia tecidual causada pelo excesso de carboxihemoglobina. O IBE do gs a carboxihemoglobina (HbCO), uma vez que o CO muito mais afim pela hemoglobina (Hb) do que o prprio oxignio. (VER DEFINIES NAS NR-7 E NR-15)*

2. TCNICA DE BEUTLER e WEST 2.1 Fundamento

Este mtodo se baseia na capacidade do diotinito de sdio em reduzir a oxiemoglobina e a metemoglobina e a carboxiemoglobina ser resistente a esta reduo, de modo que no sistema existir uma mistura de dois pigmentos:a hemoglobina reduzida e a carboxiemoglobina, as absorbncias sero determinadas a 420 e 432 nm

2.2 Reagentes a) Tampo: KH2PO4/K2HPO4, 0,1 M, pH 6,85. Este tampo estvel

indefenidamente se estocado sob refrigerao. b) Soluo hemolizante (SH): tampo diludo 1:10 com gua destilada ou

deionizada, estvel por 1 semana c) Soluo de ditionito de sdio (SD): Ditionito de sdio 1,25 mg/ml em tampo,

preparar imediatamente antes do uso.

2.3 Procedimento a) Coleta da amostra: colete sangue venoso usando EDTA (1,5 mg/ml de sangue

vide pgina 14) ou heparina (15 unidades USP/ml de sangue). O sangue pode ser coletado em seringa ou atravs de vacuumtainner

b) Hemlise: Em um tubo contendo 3ml da SH adicione 25 L de sangue, cubra o tubo com parafilm e misture 2 ou 3 vezes por inverso

c) Determinao da HbCO: aps 5 minutos, pipete 0,2 ml do hemolisado passando para um tubo contendo 2,3 ml da soluo SD, cubra o tubo com parafilm e misture gentilmente vrias vezes por inverso. Deixe em repouso a temperatura ambiente por 10 minutos. Leia as absorbncias a 420 e 432 nm contra um tubo contendo apenas a soluo SD.

2.4 Clculos 1 (AR x F1)

%HbCO = AR(F2 F1) F3 + 1 Onde: AR = razo A420/A432 F1, F2 e F3 so as absortividades molares da Hb e da HbCO. A absortividade molar de uma substncia a um dado comprimento de onda igual a absorbncia (A) dividida pela concentrao (C) em mol/L, i.e W = A/C. Na realidade estas constantes so as taxas de duas absortividades molares (da hemoglobina reduzida e da HbCO), a concentrao destas hemoglobinas no precisam ser levadas em considerao quando a Hb completamente convertida na Hb reduzida ou na HbCO, estes fatores so ento definidos pela razo entre dois valores de absorbncia: F1 = AHb432/AHb420; F2 = AHbCO432/AHb420 e F3 = AHbCO420/AHb420, estes valores podem ser determinados experimentalmente ou compilados da literatura: F1 = 1,3330; F2 = 0,4787 e F3 = 1,9939.

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Determinao experimental das absortividades molares: hemolise 50L de sangue uma pessoa no fumante com 6 ml de SH. Com uma pipeta volumtrica adicione 2 mL deste hemolisado em 2 frascos volumtricos de 25 mL. Sature o contedo do frasco 1 com CO por 30 minutos, e borbulhe ar comprimido no segundo por 2 horas expondo este frasco a luz de uma lmpada de 60W (ajuda a dissociar a HbCO). Complete o volume dos frascos e leia as absorbncias em 420 nm e em 432 nm. Calcule as absortividades como explicado acima.

3. GERAO DE CO EM LABORATRIO Gotejar 340 ml de H2SO4 sobre 100g de formiato de sdio ou de clcio ou cido frmico conc. com aquecimento. Purificar o gs pela passagem atravs de duas solues: 1= KOH + Na2S2O4 (1:2) 2= CaCl2 (soluo saturada) Preparo da soluo de hidrossulfito de sdio Hidrossulfito de sdio anidro 8,28 g Sol. aquosa de NaOH a 5% 60 ml Relao entre o CO (ppm) ambiental e a taxa de HbCO (%)

CO (ppm) HbCO (%)

CO (ppm) HbCO (%)

CO (ppm) HbCO (%)

CO (ppm) HbCO (%)

0 1 40 8 80 15 160 28 5 1 45 9 90 17 170 29

10 2 50 9 100 18 180 31 15 3 55 10 110 20 190 33 20 4 60 11 120 21 200 34 25 5 65 12 130 23 210 36 30 6 70 13 140 25 220 37 35 7 75 13 150 26 250 41

4. PERGUNTAS 1. Que reaes qumicas ocorrem na gerao do monxido de carbono em laboratrio ? 2. Para que servem as solues (1) e (2) descritas acima ? (no vale dizer para purificar

o gs, o que elas retiram ? ) 3. Em um ambiente a concentrao de CO de 0,01% e a do oxignio de 21%,

sabendo-se que o CO cerca de 210 vezes mais afim pela hemoglobina que o O2, aps 1 hora de exposio qual a quantidade de HbCO esperada (em %) ?

4. Considere o resultado da questo anterior como sendo a HbCO medida em um trabalhador exposto ao CO. Pergunta-se: trata-se de uma exposio muito grave ?

5. Que volume de uma soluo 0,33 M de EDTA tetrassdico voc deve colocar em um frasco para a coleta de 5 ml de sangue ? Dados: H = 1 g/mol; C = 12 g/mol; N = 14 g/mol; O = 16 g/mol e Na = 23 g/mol

*As normas regulamentadoras NRs 7 e 15 podem ser encontradas na integra em http://www3.dataprev.gov.br/SISLEX/paginas/05/mtb/7.htm e http://www.normaslegais.com.br/legislacao/trabalhista/nr/nr15.htm respectivamente

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CONTROLE DA EXPOSIO OCUPACIONAL A AGENTES METEMOGLOBINIZANTES INDICADOR BIOLGICO DE EXPOSIO: METEMOGLOBINA

1. INTRODUO um indicador biolgico inespecfico de exposio a uma variedade de agentes qumicos que a induzem e para as quais h variaes de natureza toxicocintica e toxicodinmica Substncias metemoglobinizantes e alguns usos industriais:

Substncias Produo de Anilina* Corantes, frmacos, praguicidas, borracha Dimetilanilina Fibras de vidro, quimioterpicos antimicrobianos, vanilina,

corantes Dinitrobenzenos Corantes, celulides, explosivos Dinitrotolueno Munio, explosivos n-Metilamina Aceptor de cidos em sntese Nitroanilinas Corantes, antioxidantes, medicamentos veterinrios Nitrobenzeno Derivados da celulose, acetoaminofenol, essncia Nitroclorobenzenos Corantes, borracha, praguicidas Nitrotolueno Borracha, corantes txteis, praguicidas xido ntrico cido ntrico, presente em gases de solda Propilenoglicol-dinitrato Propelente de torpedos Toluidinas Borracha, praguicidas, frmacos, corantes Xilidinas Frmacos e corantes Anisidina Azocorantes e guaiacol Cicloexilamina Anticorrosivo em caldeiras, borracha, praguicidas 2-nitropropano Tintas vinlicas, nitrocelulsicas, borracha clorada, adesivos Perclorilfluoreto Agente fluoretador em sntese Tetranitrometano Explosivo, aditivo do diesel Trinitrotolueno Explosivos

*Cite ao menos dois frmacos que podem ser obtidos a partir da anilina

2. METEMOGLOBINEMIAS a) Metemoglobinemia hereditria: relacionada a deficincias enzimticas como por exemplo a

NADH-cit b5-redutase; ou a defeitos na estrutura proteica da hemoglobina com substituies de aminocidos resultando em hemoglobinas anormais, como por exemplo a Hb M

b) Metemoglobinemia adquirida: a forma mais frequente de metemoglobinemia na espcie humana, surgindo aps a exposio a compostos qumicos, frequentemente usados na indstria ou como agentes teraputicos. Muitos destes compostos so capazes tambm de reduzir substncias como o glutation e o cido ascrbico, que normalmente protegem a hemoglobina contra a oxidao. Frmacos relacionados com metemoglobinemia

Principal Indicao Frmaco Antimalricos Anestsicos locais

Primaquina Bupivacana, Lidocana, Prilocana (crianas)

A utilizao de vegetais ricos em nitratos (espinafre, beterraba, rabanete e outras) no preparo de alimentos infantis, pode ser, tambm, responsvel pela ocorrncia de metemoglobinemia em crianas nos primeiros meses de vida.

3. TCNICA 3.1 Mtodo de Hegesh et al (1970)

a) Amostra A amostra sangue heparinizado (ver prtica HbCO). Quando a anlise no for realizada dentro de 30 minutos, resfriar rapidamente (2 C) e conservar sob refrigerao no mximo at 24 horas.

b) Preparo da amostra

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Hemolisar o sangue (4,4 ml de gua destilada para 1,6 ml de sangue); aps 2 minutos, adicionar 2,0 ml de tampo fosfato pH 7,2. c) Tcnica transferir a amostra de sangue j hemolisado e tamponado para um tubo de centrfuga; centrifugar a 2.000 rpm por 15 minutos transferir o sobrenadante, com auxlio de pipeta de Pasteur, para um tubo de ensaio . Deste tubo, transferir de novo 2,4 ml para uma cubeta (I) e 0,2 ml para outra (II) contendo 2,2 ml do reativo ferricianeto-fosfato. aps um minuto efetuar a leitura das absorbncias (AI e AII) em 632 nm, contra ar. adicionar 80 L de soluo de cianeto neutralizada s duas cubetas; misturar e, aps 1 minuto, efetuar novamente a leitura das absorbncias (AIII e AIV) calcular a metemoglobina, expressando-a em porcentagem de hemoglobina total, a partir da frmula seguinte: AI AIII x 100

%MeteHb = (AII AIV) x 12

12 fator de diluio Soluo tampo fosfato 0,5 M - pH=7,2 misturar 7,0 mL de fosfato de sdio bi bsico (Na2HPO4) 0,5 M e 3,0 mL de fosfato monobsico de potssio (KH2PO4) 0,5 M, Soluo de cianeto neutralizada: misturar 1 ml da soluo de NaCN a 10% recentemente preparada com 0,9 ml da soluo de cido actico a 12% , esta soluo estvel por at 6 horas. Soluo de ferricianeto-fosfato: Misturar 0,2 ml de ferricianeto de potssio a 5% e 2,5 ml da soluo tampo fosfato e completar com gua destilada at 10 ml, esta soluo estvel por at 24 horas. Obs. A soluo de ferricianeto de potssio deve ser guardada em frasco mbar

3.2 Mtodo de Naoum et al (2004) a) Amostra

A amostra sangue coletado com EDTA (0,33 M). Colocar 1 gota da soluo de EDTA em um tubo de ensaio com tampa de rosca e colocar 5 ml de sangue, homogeneizar bem por inverso (pelo menos 10 vezes) DELICADAMENTE. b) Reagentes Soluo estoque de Tampo Fosfato M/15 Na2HPO4.12H2O .............................. 9 g KH2PO4 ............................................ 5,7 g

Soluo trabalho de Tampo Fosfato , diluir o tampo estoque de modo a obter o tampo fosfato M/60

Saponina 1%

c) Tcnica Identificar dois tubos A e B. No tubo A colocar 50 L de sangue total e adicionar 50 L de saponina a 1%, agitar para ocorrer hemlise Adicionar 3 mL do tampo fosfato M/60 e homogeneizar No tubo B colocar 150 L da mistura do tubo A e completar o volume para 1,5 mL com a soluo tampo de trabalho Calibrando o espectrofotmetro com a soluo tampo de trabalho, determinar a absorbncia do tubo A em 630 nm e do tubo B em 540 nm Calcular a metemoglobina usando a frmula abaixo:

A630 x 100 % Hb = A630 +(A540 x 10) 4. INTERPRETAO

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Procure na legislao o limite de tolerncia e o IBMP do IBE usado para avaliao desta exposio Mtodo de Hegesh et al (1970): valor de referncia at 2 % Mtodo de Naoum et al (2004): valor de referncia 1,9 a 3,8%

5. PERGUNTAS 1. Numa indstria qumica, onde os trabalhadores expostos a compostos metemoglobinizantes, a

taxa de metemoglobinemia mdia foi de 6%. Esta empresa sofrer alguma sano por parte da Delegacia Regional do Trabalho ?

2. Por que as crianas de at 2 anos esto mais sujeitas a ao destes compostos ? 3. Como feito o tratamento de uma hipermetemoglobinemia, que substncias so empregadas

e como elas agem ? 4. No caso de uma taxa letal de metemoglobinemia, qual a causa da morte ? Por qu ?

CONTROLE DA EXPOSIO OCUPACIONAL AO FENOL E BENZENO INDICADOR BIOLGICO DE EXPOSIO: FENOL URINRIO

1. INTRODUO FONTES DE EXPOSIO

Indstria qumica lcool anidro, estireno, poliestireno, nitrobenzeno, etc. Indstria petroqumica Siderrgicas que utilizam carvo mineral A exposio crnica ao benzeno est relacionada com anemia aplstica

BIOTRANSFORMAO DO BENZENO 1 2 3 BENZENO BENZENO EPXIDO FENOL CATECOL

6 4 7 5 1,2,4 TRI OH BENZENO

QUINOL 9

8 CONJUGAO COM C. BENZENO GLICURNICO OU DIIDRODIOL SULFATO

10 p- BENZOQUINONA

TRANS,TRANS MUCONICALDEDO C. TRANS,TRANS MUCNICO (AttM) (para maiores detalhes sobre este bioindicador consultar a PORTARIA N.34, DE 20 DE DEZEMBRO DE 2001

Para se fazer as correlaes dos resultados das anlises de AttM-U com a concentrao de benzeno no ar, devero ser utilizados os valores de correlao abaixo, estabelecidos pelo DFG

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(1996), com alterao dos resultados em mg/l para mg/g de creatinina, que foram feitas admitindo-se uma concentrao mdia de 1,2 grama de creatinina por litro de urina.

Correlao das concentraes de AttM-U com benzeno no ar, obtidas a partir dos valores estabelecidos pelo DFG (1996), corrigidos para grama/grama de creatinina (admitida concentrao mdia de 1,2 grama de creatinina por litro de urina)

Benzeno no Ar (ppm)

Benzeno no Ar

(mg/m3) Ac. t,t

mucnico (urina) (mg/l)

Ac. t,t mucnico

(urina) (mg/grama creatinina)

0,3 1,0 - - 0,6 2,0 1,6 1,3 0,9 3,0 - - 1,0 3,3 2 1,6 2 6,5 3 2,5 4 13 5 4,2 6 19,5 7 5,8

DETERMINAO DO FENOL URINRIO Separao extrao destilao cida por arraste de vapor Solventes orgnicos Amostra urina Excreo do fenol forma de glicurondeo T1/2 do fenol 12 horas

QUANTIFICAO a) Cromatografia Gasosa

Extrao separao solventes orgnicos (ter dietlico) em meio cido a quente

b) Espectrofotometria

2. AMOSTRA A amostra deve ser coletada ao trmino da jornada de trabalho, a densidade deve ser medida e a conservao em geladeira (2 a 10C).

3. TCNICA a) Transferir 10 ml da amostra de urina para o balo de destilao. Adicionar 4 ml da soluo de

H2SO4 a 50% (v/v) e lavar as paredes do balo com aproximadamente 5 ml de gua destilada. Destilar at recolher um volume de 100 ml em proveta graduada (aparelho para destilao por arraste de vapor).

b) No momento de continuar a anlise, homogeneizar o destilado. Identificar 3 tubos e proceder de acordo com a tabela abaixo

Reagente B (ml) P (ml) T (ml) H2O 2,0 - - Soluo padro de trabalho - 2,0 - Destilado - - 2,0 Acetato de sdio a 50% 0,2 0,2 0,2 p-nitroanilina diazotada 0,2 0,2 0,2

APS EXATAMENTE 1 MINUTO Soluo de carbonato de sdio a 20% 0,4 0,4 0,4 H2O 1,2 1,2 1,2 c) Aps 3 minutos efetuar a leitura em 525 nm, usando como referncia um branco de reativos.

OBSERVAES: Leituras no espectrofotmetro:

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1) Usar sempre 2 cubetas apenas, uma para leitura do branco e amostra e outra para as solues-padro (partindo-se da soluo de menor para a de maior concentrao). 2) Em casos especiais, quando for necessrio, utilizar uma terceira cubeta para a leitura do branco 3) Utilizar um pedao de papel absorvente para limpar o lado externo da cubeta antes das leituras e outro para retirar o excesso de lquido de dentro da cubeta, entre uma leitura e outra. 4) A curva de calibrao ser feita por uma das bancadas a partir de uma soluo padro estoque na concentrao de 1 g/L (ver Curva de Calibrao pgina 13) 5) Expressar o resultado em mg de fenol por g de creatinina (ver na pgina 12 o procedimento para a determinao da creatinina urinria).

4. PERGUNTAS 1. Qual a concentrao normal de fenol urinrio que pode ser encontrada nas pessoas no

expostas ocupacionalmente ? 2. Explique como as pessoas no ocupacionalmente expostas podem apresentar fenol na urina. 3. Qual o IBMP considerando a exposio ao fenol ? 4. Por que o fenol deve ser expresso em mg/g creatinina ao invs de mg/L de urina ? 5. Antes do ensaio a densidade de urina deve ser medida, que fatores podem alterar a densidade

urinria ? Qual a faixa normal da densidade urinria ? 6. Qual a funo do cido sulfrico neste ensaio ? 7. Observe a biotransformao do benzeno e identifique as reaes 1 a 10,determinando em que

fraes hepticas elas ocorrem e quais as enzimas as envolvidas.

CONTROLE DA EXPOSIO OCUPACIONAL AO TOLUENO INDICADOR BIOLGICO DE EXPOSIO: CIDO HIPRICO URINRIO

1. INTRODUO

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O tolueno um lquido incolor, voltil (presso de vapor a 25C = 28 mmHg e ponto de ebulio igual a 110,6C) muito pouco solvel na gua, solvel em acetona e miscvel com etanol, ter etlico, benzeno, etc. As principais fontes de exposio ocupacional ao tolueno decorrem do seu uso como solvente para leos, borracha natural e sinttica, resinas, carvo, piche, betume e acetilcelulose. usado tambm como diluente para tintas e vernizes. Na indstria qumica matria prima para a sntese orgnica do cloreto de benzeno, sacarina, TNT, etc e largamente empregado na indstria grfica. O tolueno puro apresenta traos de benzeno como impureza (< 0,01%) e o comercial, pode conter at 25% de benzeno. BIOTRANSFORMAO DO TOLUENO 1 2 3 4 Tolueno lcool benzlico benzaldedo cido benzico cido hiprico

6 7 8 5 o-cresol m-cresol

p-cresol benzoilglicurondeo 2. AMOSTRA A amostra urina, coletada aps o final do segundo dia de exposio, em frasco de polietileno de 125 ml, o volume da amostra deve ser de 50 a 100 ml, pode ser empregado como conservante o timol (alguns cristais por frasco). Para fins de controle de qualidade, amostras de pr-exposio e de indivduos no expostos podem ser analisadas. Se a amostra no for imediatamente analisada esta deve ser refrigerada durante algumas horas e em seguida congelada (- 20C). Os trabalhadores devero ser instrudos a no consumir no dia da realizao do exame alimentos que possam conter benzoato de sdio como conservante ou de medicamentos como a aspirina, pois podem produzir um falso positivo.

3. TCNICA b) Preparar as cromatoplacas (slica gel G ativadas a 110C por 60 min) de acordo

com a padronizao:

Bancada A P1 P2

c) Transferir para a cromatoplaca 10 L de urina e alquotas de 10 L da soluo padro de cido hiprico em diferentes diluies (0,5 a 10 g ). A soluo padro estoque de cido hiprico preparada com metanol na concentrao de 1 g/L. (qual a massa de cido hiprico em 10 L da soluo estoque ?)

d) Desenvolver 10 cm com o sistema solvente (clorofrmio-acetona-cido actico: 40:10:5, que ser preparado por uma das bancadas antes do incio da aula), retirar a placa da cuba e sec-la por 10 minutos a 120C.

e) Revelar com a soluo de p-dimetilaminobenzaldedo a 5% em anidrido actico e aquecer novamente a placa a 120C por 10 minutos.

f) Esfriar a placa, raspar as zonas reveladas e transferir, com cuidado, uma a uma para tubos de centrfuga.

g) Adicionar a cada um dos tubos, 3ml de acetato de etila, agitar e centrifugar. h) Retirar o sobrenadante passando para tubos de ensaio devidamente identificados,

efetuar as absorbncias no espectrofotmetro em 468 nm.

10 cm

2 cm

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i) Determinar a concentrao do cido hiprico (Ch) atravs da curva de calibrao (absorbncia x concentrao g/L), ver pgina 13: Curva de Calibrao.

j) Uma das bancadas dever determinar a creatinina urinria (Cr) de acordo com a tcnica descrita na pgina 12.

k) CLCULOS: Ch cido hiprico (g/g de creatinina) = ________ Cr

4. QUESTES 1) Na biotransformao do cido hiprico vista acima, quanto a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8 quais as reaes, as enzimas envolvidas e as fraes hepticas onde elas ocorrem. 2) Na urina de pessoas no expostas ao tolueno possvel encontrarmos o cido hiprico ? 3) Na urina de um trabalhador exposto ao hidrocarboneto foi encontrado o cido hiprico numa concentrao de 3 g/g de creatinina. O indivduo em questo estava muito exposto a substncia ? Justifique a sua resposta. 4) Por que a aspirina pode interferir com esta determinao ? 5) Qual a funo do acetato de etila nesta prtica ? 6) Existe outro mtodo que no sofre interferncia da aspirina, qual este mtodo ? 7) Explique como o cido hiprico foi separado da matriz biolgica nesta prtica.

CONTROLE DA EXPOSIO OCUPACIONAL AO CHUMBO - INDICADOR BIOLGICO DE EXPOSIO: CIDO - AMINOLEVULNICO URINRIO (ALA-U) 1. INTRODUO

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Mecanismo de Ao Txica do Chumbo sobre a Sntese de Hemoglobina

2. AMOSTRA O ALA estvel em urina cida (pH 1,0 a 5,0). Assim, se a anlise no for realizada dentro de poucas horas, adicionar a amostra HCl ou cido actico glacial, a fim de manter o pH adequado. Para urina de 24 horas, adicionar cido em quantidade suficiente para se obter uma concentrao final de 0,001 a 0,1 N. O ALA permanece estvel por muitos meses quando a amostra acidificada e conservada sob refrigerao ao abrigo da luz. Recomenda-se que logo aps a coleta, o frasco seja envolto em papel alumnio.

3. TCNICA (TOMOKUNI & OGATA)

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3.1 Fundamento O ALA condensado pelo acetoacetato de etila e o produto desta condensao extrado com o acetato de etila. Este produto colorimetricamente determinado tratando o extrato orgnico com o reativo de Ehrlich modificado.

a) Colocar em cada um de 2 tubos (identificados como B e A) 1,0 ml de urina e 1,0 ml de tampo acetato (pH 4,6). Adicionar 0,2 ml de acetoacetato de etila somente ao tubo A e agitar por 5 segundos.

b) Manter os tubos em banho de gua fervente durante 10 minutos. c) Esfriar e adicionar 3,0 ml de acetato de etila aos dois tubos; agitar manualmente, 50 vezes. d) Se necessrio centrifugar a 2.000 rpm e transferir a camada orgnica (superior) para outros

dois tubos de ensaio. e) Adicionar 2,0 ml do reativo de Ehrlich* modificado a cada tubo, e misturar. f) Aps 10 minutos, determinar a absorbncia (553 nm) do produto colorido formado, usando

como referncia o tubo sem acetoacetato de etila g) Calcular a concentrao de ALA com auxlio de uma curva de calibrao constituda a partir de

diluies de 1 a 30 mg/l da soluo estoque, tratados da mesma forma que a amostra de urina (ver Curva de Calibrao na pgina 13).

*Reativo de Ehrlich: dissolver 1 g de p-dimetilaminobenzaldedo em 30 ml de cido actico glacial, adicionar 5 ml de cido perclrico a 60%, 5 ml de gua destilada e completar o volume at 50 ml com o cido actico. Preparar o reativo no dia da utilizao.

4. CLCULOS A soluo estoque de ALA preparada dissolvendo-se 6,4 mg de cloridrato de ALA em gua (50 mg ALA/l) e completar o volume at 100 ml. Esta soluo estvel por mais de 2 meses, quando

COOH

CH2

CH2

C O

CH2

NH2

ALA

+ CH3 CH2 CH2 CH3O

C

O O

C

acetoacetato de etila

N

(CH 2 COOH

R3

CH2 )(2HOOC

R2

+NCH3

CH3

CO

H

Ehrlich composto cclico

H

CH3

CH

CH NCN

R R

3HC

composto colorido

)

H

3

3

2

2

3

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guardada sob refrigerao. Faa uma curva de calibrao fazendo diluies da soluo padro (concentraes entre 5 e 30 mg/L). CREATININA URINRIA TRANSFORMAR CONCENTRAO DO ALA-U DE mg/L para mg/g CREATININA (vide tcnica para determinao da creatinina urinria na pgina 12)

5. PERGUNTAS 1. Medindo-se a concentrao de ALA-U voc est avaliando uma exposio recente ou mais

antiga ? 2. Que parmetro voc poderia usar para avaliar uma exposio mais recente (avaliar a

exposio de hoje por exemplo) ? Por qu ? 3. Este parmetro que voc escolheu na questo anterior seria pesquisado na urina ou no

sangue ? Por qu ? 4. Que mtodo (no descreva a tcnica) ou equipamento voc usaria para pesquisar este

parmetro (o mesmo da questo 2) ? 5. Se voc usar como amostra o cabelo para fazer o controle da exposio ocupacional ao Pb,

como voc poderia fazer para avaliar exposies em diferentes momentos (mais recentes e mais antigas) ? Justifique a sua resposta.

6. Que volume de uma soluo a 10% de HCl voc dever colocar no frasco para coleta de urina de 24 horas para que a concentrao final do cido esteja naquela faixa tima (vide amostra) Dados: H= 1 g/mol e Cl= 35,5 g/mol

7. A mesma questo anterior, se for usada uma soluo de cido actico a 5% ? Dados: H= 1 g/mol; C = 12 g/mol; O = 16 g/mol

8. Cite algumas indstrias existentes em Curitiba ou no Paran onde os trabalhadores estejam expostos ao metal.

9. Considerando uma intoxicao letal e que a amostra provenha de material de exumao, os ossos seriam uma boa amostra ? Justifique a sua resposta.

CONTROLE DA EXPOSIO OCUPACIONAL A INSETICIDAS ORGANOFOSFORADOS E CARBAMATOS INDICADOR BIOLGICO DE EXPOSIO:

ATIVIDADE DA BUTIRILCOLINESTERASE (BChE)

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1. INTRODUO A BChE (anteriormente conhecida como colinesterase do soro [ChE] ou pseudocolinesterase) uma enzima produzida no fgado, cuja funo fisiolgica no foi ainda totalmente esclarecida. Ela capaz de hidrolisar diversos steres, tais como: acetilcolina (ACh), butirilcolina (BCh), propionilcolina, cido acetilsaliclico, succinilcolina, cocana e outros compostos. A enzima inibida por compostos organofosforados (OrgPO4) e carbamatos, assim a sua atividade pode servir de IBE para estes compostos Causas de atividade diminuda da BChE: Tipo Condio Deficincias hereditrias

Variantes da BChE: alelos A (atpico), F (resistente ao fluoreto), S (silencioso) e outros

Variao fisiolgica Aps a 10 semana de gestao Recm natos e crianas

Causas adquiridas Hepatopatias Infarto do miocrdio Doenas do colgeno (distrofia muscular, miotonia congnita e dermatomiosite) Hiperpirexia Tuberculose (Tb) Doenas infecciosas agudas Hipocalcemia Uremia Doenas renais crnicas

Causas iatrognicas

INSETICIDAS ORGANOFOSFORADOS E CARBAMATOS Inibidores da MAO Terapia com estrognios Propranolol Neostigmina Cloridrato de clorpromazina Circulao extracorprea

Por outro lado, a atividade aumentada observada em situaes associadas com o metabolismo anormal de lipdeos, tais como: hiperlipoproteinemias, obesidade, diabetes, sndrome nefrtica. Foi demonstrada correlao positiva entre a atividade enzimtica e as concentraes de colesterol total e fraes (LDL e VLDL) e de triglicerdeos.

2. DETERMINAO DA ATIVIDADE ENZIMTICA 2.1 Mtodo 1 Mtodo de Dietz e cols. (1973)

2.1.1 Princpio do mtodo A BChE hidrolisa o substrato (propioniltiocolina), com a liberao de grupo sulfidrila livre ao nvel

da tiocolina: O grupo SH livre reage com o reativo de cor (DTNB = cido 5,5-ditiobis [2-nitrobenzico]), levando a formao de um derivado de cor amarela, de absoro mxima em torno de 410 nm. Veja figura abaixo.

2.1.2 Reagentes a) Substrato: propioniltiocolina (na forma de iodeto) 45 mol (liofilizado) b) Reagente de cor: DTNB 0,423 M em tampo fosfato pH 7,6 c) Soluo inibidora: sulfato de quinidina a 0,5% d) Soluo padro: 20 L que corresponde a 7 UI/ml

2.1.3 Tcnica Preparo da soluo de substrato: Adicionar 4,5 ml de gua destilada ao frasco que contm o

liofilizado.

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Preparo da soluo padro: reconstituir a soluo padro com 3 ml de gua destilada.

Determinao da atividade da BChE

REATIVO TUBO BRANCO (ml) TUBO TESTE (ml) Substrato 0,5 0,5

Reativo de Cor 1,5 1,5 Colocar em BM. por 3 minutos a 37 C

Amostra - 0,01 Incubar a 37 C por exatamente 2 minutos e 30 segundos

Soluo inibidora 1,5 1,5 Amostra 0,01 -

Homogeneizar e ler as absorbncias do teste contra o branco a 410 nm. *A cor estvel por 15 minutos temperatura entre 20 a 30 C.

Determinao do Fator

Reagente Branco Padro 1 Padro 2 Padro 3 gua destilada 2,0 ml 2,0 ml 2,0 ml 2,0 ml Soluo padro - 10 L 10 L 10 L Reagente de cor 1,5 ml 1,5 ml 1,5 ml 1,5 ml

Homogeneizar e ler as absorbncias dos Pn em espectrofotmetro em 410 nm contra o B.

Clculos 7 Fator = Absorbncia mdia

Atividade U.I./ml = Abs da amostra x fator

2.1.4 Interpretao

Valores de referncia: 6,0 a 12,0 U.I./ml 5,0 a 10,5 U.I./ml

2.2 Mtodo 2 Mtodo Wiener Lab (2000) 2.2.1 Princpio Butiriltiocolina + H2O tiocolina + butirato Tiocolina + DTNB 2-nitro-5-mercaptobenzoato

2.2.2 Reagentes Soluo tampo fosfato pH 7,7 (K2HPO4 + KH2PO4) 50 mM Substrato: iodeto de butiriltiocolina 7 mM DTNB 0,25 mM O substrato e o DTNB esto no mesmo frasco Amostra: soro ou plasma. Anticoagulantes que contm citrato, fluoreto ou oxalato produzem inibio leve. A amostra deve ser preferencialmente fresca, pode ser conservada at uma semana sob refrigerao (2 a 10C) sem conservantes.

2.2.3 Tcnica 1) Reconstituir o substrato com 3 ml do tampo fosfato, incubar por alguns minutos a 37C

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29

2) Adicionar 20L da amostra, e imediatamente ler a absorbncia (tempo 0), disparando simultaneamente o cronmetro 3) Ler as absorbncias a cada 30 s at 90s 4) Determinar a diferena mdia da absorbncia a cada 30 s (A), subtraindo cada leitura da anterior e fazendo a mdia dos valores, utilizar a mdia para os clculos. 5) Clculos: UI/L = A x 22.710 OBS: Se a temperatura empregada for de 37C, a amostra dever ser diluda (1:5)

2.2.4 Interpretao Valores de referncia Crianas, homens e mulheres com mais de 40 anos de idade: 5,5 a 13,4 UI/ml Mulheres entre 16 e 39 anos de idade, que no estejam grvidas nem tomando contraceptivos orais: 4,4 a 11,7 UI/ml Mulheres entre 18 a 41 anos de idade, grvidas ou tomando contraceptivos orais: 3,8 a 9,5 UI/ml

3. PERGUNTAS

1. Para preparar 4,5 ml do substrato (mtodo 1) ou 3 ml do substrato (mtodo 2), qual a massa necessria do mesmo ?

2. Partindo-se do princpio que voc dever usar, para cumprir o que pede a questo 1, um sal do referido substrato, qual a massa do mesmo para que seja possvel preparar a referida soluo ?

3. Para preparar 100 ml de DTNB na concentrao prescrita no mtodo 1, qual a massa necessria ?. E para o mtodo 2 ?

4. Qual o IBMP para este IBE, quando do controle a exposio ocupacional por anticolinestersicos ?

5. Voc determinou a atividade de pr-exposio de um agricultor de 50 anos, cuja atividade foi inferior ao normal, voc descobriu que o mesmo era hipertenso. Qual causa iatrognica poderia estar envolvida com esta atividade mais baixa ? Justifique.

6. Considere a mesma pergunta da questo anterior, mas desta vez considere que a pessoa envolvida seria uma mulher, 25 anos, casada. Quais as possveis causas de atividade diminuda ?

Dados: C= 12 g/mol; N= 14 g/mol; O= 16 g/mol; S= 32 g/mol; H= 1 g/mol, Iodo = 127 g/mol

DOSAGEM ALCOLICA

1. INTRODUO

Toxicologia Prtica


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Exame realizado, para fins legais, pelo IML. Pode ser realizado: a) em vivos acidentes automobilsticos em geral com vtimas ou quando o Detran acionado,

ou a pedido da Justia. b) em mortos esclarecimento da causa mortis ou dependendo das circunstncias da morte,

para esclarecer a influncia do lcool nestes casos. Pode ser realizado por laboratrios de anlises clnicas para fins de diagnstico de intoxicaes agudas, principalmente aquelas onde haja risco de morte. 2. AMOSTRA a) Vivos sangue, urina, saliva e ar expirado. A urina empregada quando do exame anti-

doping, onde o lcool pode tambm ser pesquisado. A saliva uma das vias de excreo e pode ser empregada para estudos toxicocinticos.

b) Mortos estmago e contedo, crebro, fgado, sangue e urina.

3. SEPARAO Depositar em balo 5 ml da amostra (sangue com EDTA ou heparina vide pgina 11). Para cada parte de sangue adicionar 2 partes de soluo saturada de cido pcrico (13:1.000) e 4 partes de gua destilada. Destilar um volume igual a 4 vezes o volume inicial de sangue.

4. DOSEAMENTO Tcnica: xido-reduo Tomar 5 ml do destilado e juntar em erlenmeyer 5 ml de H2SO4 concentrado (com muito cuidado!!) Titular com uma soluo de K2Cr2O7 a 19:1.000. Reao Negativa: com uma gota de bicromato de potssio a soluo ficar amarela, adicionar 2 a 3 gotas e observar cuidadosamente. Reao Positiva: com uma gota de bicromato de potssio a soluo ficar azulada (azul bem claro, d a impresso, quando a concentrao de lcool bem pequena, que a soluo est incolor), deve-se titular, gota a gota, at a soluo adquirir uma tonalidade verde. Anotar o volume gasto, deixar cair mais uma gota, se a soluo tornar-se amarelada ( ou verde amarelada) h um excesso de bicromato. Se a colorao no mudar h ainda lcool para ser oxidado.

5. CLCULOS 1 ml de K2Cr2O7 19:1.000 oxida 0,005 ml de lcool 20 ml de destilado correspondem a 5 ml de sangue 5 ml de destilado correspondem a x ml de sangue 3C2H5OH + 2K2Cr2O7 + 8H2SO4 3CH3COOH + 2Cr2(S04)3 + 2K2SO4 + 11 H20 Ento, se for gasto 1 ml de bicromato: x ml deve conter 0,005 ml de etanol 1.0 ml de sangue y ml de etanol Ento y= ml/l de sangue 6. INTERPRETAO At 2008 o CNT (Cdigo Nacional de Trnsito) definia 6 dg/L como alcoolemia mxima permitida de ser encontrada em um condutor de veiculo automotor.

7. CONCENTRAO DE LCOOL ETLICO EM ALGUMAS BEBIDAS Bebida %

Aguardente 46 a 60 Cerveja 5 a 7 Conhaque 40 a 60 Usque 45 a 58 Vinho 12 a 16 Vinho do Porto 18 a 22 Vodca 45 a 65

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8. PERGUNTAS 1. Qual a quantidade mxima de lcool pode ser encontrada no sangue de um motorista, de

acordo com a legislao em vigor ? 2. Qual a quantidade mxima de cada uma das bebidas acima poderia ser ingerida por um

indivduo antes de dirigir ? (ao menos para no sofrer as sanes da lei) [Dica: a alcoolemia corresponde a da quantidade de lcool presente no organismo, os restantes devem estar no fgado, no crebro e em outros tecidos, para facilitar imagine um homem de 70kg que tem 5 L de sangue, e a concentrao de lcool nas bebidas % (v/v)]

3. Hoje se faz a dosagem alcolica fazendo cromatografia gasosa e a separao feita atravs de um processo chamado head space. O que vem a ser este processo ?

4. Se voc beber a mesma quantidade de lcool na forma de cerveja, em duas situaes diferentes: uma com o estmago vazio e a outra com estmago cheio, em qual situao a alcoolemia dever ser maior ? Por qu?

5. Considere agora outras duas situaes onde voc ingere a mesma quantidade de lcool com estmago cheio. Na primeira voc ingere vodca e na segunda cerveja, em qual situao a alcoolemia dever ser maior ? Por qu ?

PESQUISA TOXICOLGICA DO DIAZEPAM

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1. INTRODUO O diazepam uma droga que age sobre o SNC, dependendo da dose ela pode agir como ansioltico, sedativo ou hipntico. Ao contrrio dos barbitricos, os benzodiazepnicos so drogas seguras, so raros os casos de morte devido a intoxicao aguda por estes compostos. Os acidentes envolvem principalmente crianas. A dose letal para um adulto de aproximadamente 1.000x a sua dose hipntica, a do fenobarbital (barbitrico) a dose letal algo em torno de 100x a sua dose hipntica. Quando do emprego de lcool a dose letal pode ser menor.

2. AMOSTRA Sangue seringa heparinizada (ver prtica HbCO pgina 10 ) Leite bomba de vidro manual

3. SEPARAO/EXTRAO a) Transferir 2 ml da amostra para funil de separao contendo 10 ml da soluo tampo (1 M

de H3BO3 KCl Na2CO3 pH 9,0) e extrair com duas pores de ter etlico (agitar vigorosamente por 2 minutos)

b) Reunir os extratos em erlenmeyer com tampa esmerilhada e adicionar 5 ml de HCl 2 N, passar para funil de separao e agitar por 2 minutos e desprezar a camada etrea.

c) Adicionar 5 ml da soluo de NaOH 2 N fase aquosa e extrair duas vezes (agitar por 2 minutos) com 2,5 ml de ter etlico. Filtrar o extrato etreo atravs de sulfato de sdio anidro para copo de bquer e evaporar o solvente at a secura, em B.M. a 50 C.

d) Retomar o resduo com 0,4 ml de n-hexano-acetona (8:2) e aplicar na cromatoplaca j devidamente preparada e identificada.

e) Fazer a mesma coisa para o padro (20 mg/ml) f) Correr 10 cm usando a fase mvel existente na bancada, a cuba j deve ter sido saturada

por pelo menos 30 minutos. g) Revelar com o reativo de Draggendorff: aparecimento de manchas castanhas

OBS.: 1) Monitoramento teraputico tcnica de separao/extrao a mesma, porm a tcnica de

identificao e quantificao a da cromatografia gasosa, neste caso usado um padro interno, o qual dever ser um benzodiazepnico.

2) O diazepan liga-se a protenas plasmticas, 98% se encontra na frao ligada.

4. PERGUNTAS

Biotransformao do diazepam 1 2 DIAZEPAM TEMAZEPAM OXAZEPAM

3 4 5

NORDIAZEPAM GLICURONDEO

REABSORO

BILE

HIDRLISE INTESTINO

1. O diazepam seria um composto de carter cido, bsico ou neutro ? 2. O diazepam seria bem excretado pela via mamria ? Justifique a sua resposta.

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3. Quais as funes do tampo pH 9,0, do HCl e do NaOH nesta prtica ? 4. Na biotransformao do diazepam acima, quais so as reaes 1, 2, 3, 4 e 5 ? Que

enzimas esto envolvidas e em que fraes hepticas elas ocorrem ? 5. Qual o mecanismo de ao de um frmaco como o diazepam ? E do fenobarbital ? E do

lcool ?

5. CONCENTRAES PLASMTICAS E SIGNIFICADO

Concentrao Plasmtica (mg/L) Significado 0,5 a 2,25 Concentrao teraputica 5,0 a 20,0 Concentrao txica > 50 Concentrao letal

PESQUISA TOXICOLGICA DO FENOBARBITAL 1. INTRODUO

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Os barbitricos so substncias muito txicas em altas doses e podem causar vasodilatao perifrica, hipotenso, hipotermia, coma, convulses e insuficincia renal aguda. A morte normalmente ocorre aps complicaes cardiorrespiratrias ou respiratrias. Concentraes plasmticas de barbitricos maiores que 10 mg/l (50 mg/l para o fenobarbital) pode estar associada com intoxicaes graves. Doses repetidas de carvo ativado e/ou diurese alcalina pode ser til na terapia de intoxicaes por estes compostos. Hemoperfuso com carvo ativado tambm pode ser usada na terapia de intoxicaes por barbitricos de ao curta e intermediria. As tentativas de suicido em geral h o envolvimento tambm do etanol.

2. AMOSTRAS Para o monitoramento teraputico a amostra empregada soro ou plasma. Para anlise toxicolgica de urgncia a mesma amostra pode ser empregada, alm do uso de lavado gstrico. No caso de intoxicaes letais as amostras usadas so: vsceras, sangue, urina e contedo gstrico.

3. TCNICA a) Transferir 5 ml da amostra para um funil de separao e ajustar o pH entre 6 a 7,5

com soluo de HCl 0,5N ou de NaOH 0,45N. b) Adicionar 25 ml de clorofrmio, agitar vigorosamente por 3 minutos e deixar o

sistema em repouso at decantar bem a fase clorofrmica. c) Separar a camada clorofrmica, filtrar atravs de papel-filtro e receber numa

proveta graduada, anotar o volume para posterior correo. d) Transferir o extrato clorofrmico para o funil (limpo) e adicionar 5 ml da soluo de

NaOH 0,45N. Agitar por 3 minutos e decantar . Tomar cuidado para recuperar o mximo possvel da camada aquosa.

e) Transferir 2 ml da fase alcalina para duas cubetas (A e B). Adicionar em seguida 1 ml da soluo de NaOH 0,45N a uma das cubetas (A) e 1 ml da soluo de NH4Cl a 16% outra (B).

f) Efetuar a leitura da absorbncia, em 260 nm, usando a cubeta A contra a B, para obter a densidade tica da amostra (Aa).

g) Tratar da mesma maneira que a amostra, volume igual da soluo padro de fenobarbital (50 g/ml) e efetuar a leitura da absorbncia do padro (Ap).

4. QUESTES 1. Que clculos voc dever fazer para calcular a concentrao da droga na amostra ? 2. Se a leitura da Aa fosse 0,75 e da Ap fosse 0,25, qual seria a concentrao da droga

na amostra analisada ? Seria um caso de intoxicao ? Por qu ? 3. O leite materno poderia ser empregado como amostra para a pesquisa do

fenobarbital ? 4. Qual o mecanismo de ao txica do fenobarbital ? 5. Que tipo de interao medicamentosa ocorre entre o fenobarbital e o lcool etlico ?

Justifique a sua resposta em termos farmacodinmicos.

. CONCENTRAES PLASMTICAS E SIGNIFICADO

Concentrao Plasmtica (mg/L) Significado 15 a 30 Concentrao teraputica 65 a 135 Concentrao txica > 100 Concentrao letal

MONITORAMENTO TERAPUTICO Associao clnico x laboratrio Concentrao plasmtica deduo da vida biolgica

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Estudo farmacocintico curva de excreo Anlise dos fatores que alteram a relao dose/resposta: Como o exame feito separao/extrao concentrao cromatografia gasosa concentrao plasmtica 1. Regimes posolgicos inadequados: dose/frequncia

Ajuste individual da dose em funo da vida biolgica da droga Ex.: fenitona

vida Frequncia Consequncia 24 horas 1/24 horas - 6 horas 1/24 horas Efeito subteraputico 48 horas 1/24 horas Intoxicao

2. Alteraes Farmacocinticas a) Absoro

biodisponibilidade farmacocintica na formulao (forma farmacutica interaes medicamentosas anti-cidos, metoclopramida fatores genticos falta de um transportador ativo

b) Distribuio 1. Protenas plasmticas

Bsicas 1 glicoprotena cida cidas albumina

1.1 Concentrao da Droga

Ex. A.A.S Uso [ ] Plasmtica (mg%) % Ligada

Analgsico 5 a 20 80 a 95 Anti-inflamatrio 15 a 30 50

1.2 Concentrao de Protena Plasmtica

Albumina (g/dl) Digitoxina Ligada (%) Fenitona Ligada (%) 4,0 97 90 3,0 75 85 2,0 50 80 1,0 25 82 0,5 15 50 0,1 10 15

1.3 Condies Fisiopatolgicas

Hiperurecemia drogas cidas tero um competidor endgeno Sndrome nefrtica albuminria Drogas cidas concentrao livre _____________________ concentrao total _____________________

1.4 Interaes Medicamentosas Competio pelos mesmos stios na protena plasmtica

FENITONA + AAS DESLOCA AUMENTO DA A FRAO LIVRE

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FENITONA OU

AUMENTO DA EFEITO BIOTRANSFORMAO TXICO E EXCREO

EFEITO SUBTERAPUTICO

1.5 Efeito do pH Sanguneo Ex. Teofilina Ligao a protena plasmtica independente da [ ] relao direta com o pH: pH ligao

1.6 Idade RN [ ] plasmtica livre 1,2 a 2,4 vezes > adulto

ALBUMINA BILIRRUBINA C. GLICURNICO

EXCREO NA FORMA DA [ ] LIVRE CONJUGA

c) Biotransformao 1. Fatores genticos

Ex. Acetilases

2. Cintica dose dependente

3. Interaes medicamentosas Indutoras fenobarbital Inibidoras imipramina, codena, etc

Cintica Dose Dependente

00,20,40,60,8

11,21,41,61,8

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25Dose

mm

ol/s

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4. Produtos da biotransformao farmacologicamente ativos Primidona fenobarbital Carbamazepina carbamazepina epxido Codena morfina Diazepan oxazepan

5. Idade

IDADE VELOCIDADE DE BIOTRANSFORMAO RECM NATO CRIANA ADULTO IDOSO

6. Condies Fisiopatolgicas Hepatopatias, cardiopatias

d) Excreo Nefropatias Hepatopatias Cardiopatias

DROGAS MONITORADAS

Drogas com baixo ndice teraputico ou que possam, durante a terapia, modificar o regime posolgico: Ltio, digitlicos; barbitricos, benzodiazepnicos, anticonvulsivantes

PESQUISA TOXICOLGICA DE NITRATOS E NITRITOS

1. INTRODUO

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A adio de nitratos e nitritos em alguns produtos alimentcios uma prtica comum em muitos pases. Sua utilizao em embutidos, alm de produzir a cor e o aroma caractersticos evita o crescimento do Clostridium botulinum. No Brasil amplo o uso de nitrito como conservante antibacteriano em linguias a despeito da possibilidade de o nitrito reagir com aminas e formar compostos N-nitrosos carcinognicos. Os nitratos, no alimento podem ser convertidos a nitritos, alm disso, crianas menores de 2 anos so mais susceptveis a ao metemoglobinizante destes compostos. A legislao brasileira permite o uso de nitratos e nitritos, aceitando como limite mximo para NO3-, associado ou no ao nitrito, 500 ppm. Quando o nitrito usado isoladamente o limite mximo de 200 ppm. A OMS recomenda o mximo de 150 ppm. Os nitratos tal como o de sdio, alm de serem usados como conservantes alimentares, so encontrados em fertilizantes inorgnicos, so empregados como antisspticos, alm de serem empregados na indstria de explosivos. A morte de um adulto pode ser possvel com a ingesto de aproximadamente 15 g do sal sdico ou potssico. Os nitratos no trato gastrointestinal so convertidos em nitritos. Os nitritos, como o de sdio, j foram empregados na terapia da HAS e angina, atualmente, so usados para a preveno da ferrugem, na indstria de explosivos e claro, como conservantes alimentares. A dose letal do sal sdico de aproximadamente 10 g (j foram relatados casos fatais com a ingesto de 2 g ou menos). A pesquisa toxicolgica destes compostos pode ser realizada em alimentos (controle de qualidade ou fiscalizao) ou em material biolgico (contedo gstrico, resduos alimentares, urina, etc.).

.

2. TESTE QUALITATIVO Este teste pode ser utilizado para a identificao tanto de nitratos, nitritos, bromatos, cloratos,

hipocloritos e iodatos. aplicvel para o contedo gstrico e resduos alimentares, mas no serve para o controle de qualidade ou fiscalizao. a) Filtrar, se necessrio, 5 ml do contedo gstrico em um tubo de ensaio b) Tomar 0,5 ml deste filtrado e passar para outro tubo c) Adicionar com cuidado, pelas laterais do tubo, 0,5 ml da soluo de difenilamina (10 g/L)

em cido sulfrico concentrado. d) H a formao de uma camada sobre a amostra, se esta adquirir uma tonalidade azul, a

prova positiva.

3. TESTE CONFIRMATRIO 3.1 Reativos

a) cido sulfmico 1 ml de sulfamato de amnio (150g/L) e 1 ml de uma soluo de HCl 2 N recm preparada

b) Imipramina 20 g/L 3.2 Nitratos

a) Misture 0,5 ml da amostra com 0,5 ml de cido sulfmico b) Adicione 0,5 ml da soluo de imipramina , e cuidadosamente adicione 1 ml de cido

sulfrico concentrado c) O aparecimento de uma cor azul intensa, confirma a presena do nitrato.

3.3 Nitritos a) a 0,5 ml da soluo de imipramina (20 g/L), adicione 0,5 ml da amostra e 1 ml de HCl

concentrado b) o aparecimento de uma cor azul indica prova positiva

4. ENSAIO QUANTITATIVO NITRITOS Este ensaio pode ser aplicado a uma amostra como a urina.

4.1 Reagentes

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l) Acetato de sdio em soluo aquosa 164 g/L m) cido sulfanlico 6 g/L em 1 parte de HCl concentrado e 4 partes de gua n) 1-aminonaftaleno 4,8 g/L em 1 parte de HCl concentrado e 4 partes de metanol

4.2 Tcnica a) Em um frasco volumtrico de 50 ml misture 1 ml da amostra (ou do padro) com igual

volume de cido sulfanlico . Deixe em repouso por 10 minutos. b) Em seguida, adicionar 1 ml da soluo de 1-aminonaftaleno e 1 ml da soluo de acetato

de sdio e complete o volume at 50 ml com gua destilada c) Deixe em repouso por 10 minutos e mea a absorbncia a 510 nm contra um branco de

reativos (substitua a amostra por gua destilada) d) A concentrao do padro de 10 mg/l de nitrito preparada com nitrito de sdio

5. PERGUNTAS

1. Chegando ao laboratrio uma amostra para a pesquisa de nitrato, por que o ensaio deve ser prontamente realizado ?

2. Que massa de nitrito de sdio voc dever medir para preparar 50 ml de uma soluo padro na concentrao de 10 mg/l de nitrito (on) ?

3. Que clculos voc deve fazer para determinar a concentrao do on na amostra testada pela sua bancada ?

4. Se um adulto ingerir a dose txica de NaNO2, qual a causa do bito ? Justifique a sua resposta.

5. Considere uma intoxicao simultnea com NaNO2 e NaCN, neste caso haver potencializao, sinergismo, efeito aditivo ou algum tipo de antagonismo ? Justifique a sua resposta.

6. Haver alguma diferena na terapia se a intoxicao for por nitrato ou nitrito ? Justifique a sua resposta.

PESQUISA DE METANOL EM BEBIDAS ALCOLICAS

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1. Introduo O metanol um lcool txico para mamferos e extensivamente usado como solvente, na sntese de cido e do aldedo frmico, como combustvel, como aditivo de combustvel para aviao e outros empregos. A ingesto acidental resulta em grave intoxicao devido ao acmulo dos seus produtos txicos de biotransformao: o formaldedo e o cido frmico. A intoxicao aguda usualmente causa cefalia, vertigem, fadiga, nusea, vmito, viso borrada, cegueira e mesmo morte. A dose letal de metanol para o homem este entre 340 g a 1 mg/kg de peso corporal. Como este lcool muito barato e acessvel ele tem sido usado na produo de bebidas falsificadas (destiladas e vinhos), e ocorreram mortes e/ou cegueira em muitas pessoas na China, Brasil, San Salvador, ndia e Taiwan. O metanol formado tambm pelo metabolismo da pectina (polissacardeo ramificado constitudo principalmente de cido galacturnico, um dos principais constituintes da parede celular vegetal, como a cana-de-acar).

A produo de alguns medicamentos fitoterpicos usa o metanol como solvente e podem existir resduos deste lcool nestes produtos

2. Mtodo Mtodo do colorimtrico do cido cromotrpico 2.1 Fundamento

O metanol oxidado a metanal no destilado da amostra diluda a 5% (v/v) em etanol, atravs do KMnO4 em meio fosfrico. O metanal dosado espectrofotometricamente (570 nm) devido a colorao violeta que adquire na presena do cido cromotrpico ( cido 4,5-di-hidrxinaftaleno-2,7 dissulfnico) em meio sulfrico.

2.2 Procedimento Medir com proveta, 100 ml da amostra e colocar no balo para destilao, aquecer at que a temperatura esteja em torno de 78 1oC.Destilar um volume de 10 ml medidos numa proveta de 50 ou 25 ml. Determinar o teor alcolico com o densmetro digital e diluir o destilado at um teor alcolico de 5%, anotar o ttulo da diluio.

Toxicologia Prtica


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2.3 Reagentes a) cido cromotrpico Dissolver 25 mg do cido cromotrpico (ou de seu sal

sdico) em 17,5 ml de gua destilada. Colocar esta soluo em banho de gelo e adicionar com cuidado, em pequenas pores sob agitao, 37,5 ml de H2SO4 concentrado. Esta soluo deve ser preparada no dia do uso.

b) Soluo padro estoque de metanol 0,5 g/L em lcool etlico absoluto a 5%: 0,05 g de metanol puro e 5 ml de lcool absoluto em balo volumtrico de 100 ml e completar o volume com H2O

c) Soluo de diluio Em balo volumtrico de 500 ml colocar 25 ml de lcool etlico absoluto e completar com gua destilada

d) Soluo de cido fosfrico a 50% 50 ml e) Permanganato de potssio a 5% 50 ml f) Sulfito neutro de sdio a 2% 50 ml

Preparo da curva de calibrao: Em bales volumtricos de 50 ml colocar 2,5; 5; 10; 15; 20 e 25 ml da soluo padro

de metanol estoque (0,5 g/L). Completar com a soluo de diluio

Reagentes Tubos (mL)

B P1 P2 P3 P4 P5 P6 T Amostra diluda - - - - - - - 0,5 Soluo padro - 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 - Soluo de diluio 0,5 - - - - - - H3PO4 a 50% 1 gt 1 gt 1 gt 1 gt 1 gt 1 gt 1 gt 1 gt KMnO4 a 5% 2 gts 2 gts 2 gts 2 gts 2 gts 2 gts 2 gts 2 gts AGITAR E REPOUSO T am bi en te por 10 min Na2SO3 a 2% go tas para des co r a r (HO)2C10H4(SO3H)2 a 0,05% 5 5 5 5 5 5 5 5

Deixar em BM 70C por 20 minutos. Resfriar e ler as absorbncias em 570 nm. Calcular o teor alcolico pela curva de calibrao e considerar o ttulo da diluio do destilado

Interpretao De acordo com a legislao brasileira o teor mximo permitido de metanol de 20 mg/dl em bebidas alcolicas

3. Questes 1. Qual o mecanismo de ao txica do metanol, que explica o

surgimento da acidose metablica quando de uma intoxicao aguda ? 2. E o aparecimento da cegueira, como pode ser explicada ? 3. Por que a ingesto crnica de bebidas alcolicas est relacionada com

alguns tipos de cncer ? 4. Por que a cachaa deve ser diluda e as bebidas fermentadas devem ser

destiladas e em seguida diludas ? 5. Quanto ao controle da exposio ocupacional ao metanol: qual o IBE

usado ? Em que amostra o IBE pesquisado ? Qual o IBMP aceito pela legislao brasileira ?

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TRATAMENTO BSICO DO INTOXICADO

1. INTRODUO Princpio bsico: interromper a exposio ao agente txico Cuidados: identificao do agente txico verificao da via de absoro retirar roupas contaminadas e lavagem da pele cuidados com as vias respiratrias guardar material para anlise posterior posio correta da cabea etiologia da intoxicao

2. INGESTO gua para diluir o agente txico: contra indicada por aumentar a rea da superfcie gstrica Leite MENOS AINDA !!!!!!! Neutralizao qumica 76 C 76 + 37 C = 113 C Esvaziamento gstrico: eficaz at uma hora aps a ingesto. Emese: menos eficaz que a lavagem gstrica em at 50%. Para proceder a emese: o paciente deve estar consciente; desaconselhada para agentes txicos corrosivos ou volteis emtico de escolha: xarope de ipeca, na falta deste: detergente, xampu evitar a emese mecnica Carvo ativado: considerado o nico tratamento universal, til no tratamento tardio (aps 1 hora da ingesto) tima capacidade absortiva: 300 a 2.000 m2/g Dose: 100 g/200 ml de gua adultos: 50 a 100 g; crianas 1 a 1,5 g Para drogas de ciclo enteroheptico lavagem intestinal Exemplos: Carbamazepina Fenilbutazona Dapsona Fenobarbital Digitoxina Nadolol Feniciclidina Teofilina Laxantes e catrticos: so contra indicados.

3. INALAO DE GASES OU VAPORES Retirar o indivduo do local desapertar roupas verificar sinais de asfixia respirao artificial

4. OLHOS gua corrente 5 minutos no esfreg-los evitar usar neutralizantes qumicos

5. PELE gua fria retirar as roupas e continuar a lavagem com gua fria

6. ANTDOTOS a) Diminuem a absoro por ao fsica carvo ativado adsoro do agente txico Exceo: lcoois, lcalis e cidos fortes e cianetos

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b) Diminuem a absoro por reao qumica NaCl na intoxicao pela Ag KMnO4 na intoxicao por alcalides Hipossulfito de sdio na intoxicao por metais pesados c) Deslocam o agente txico do local de ao Nitrito de amila na intoxicao por cianetos

d) Diminuem a biotransformao lcool etlico na intoxicao pelo metanol

e) Aumentam a excreo NaCl a 0,9% EV na intoxicao por Br Diurese forada: abandonada Diurese cida ou alcalina: est contra indicada, h risco de acidose ou alcalose metablica

f) Cessam a ao farmacolgica cido ascrbico e azul de metileno na intoxicao pela anilina

g) Agem diretamente sobre o agente txico Vitamina B12 como quelante de ons cianeto Ededato clcico dissdico na intoxicao por metais pesados Dimercaptossuccnico (PMSA: cido dimercaptopropano sulfnico) melhor que o EDTA nas intoxicaes por Pb, Hg e As

h) Antagonismo farmacolgico Atropina + NaHCO3 na intoxicao por compostos organofosforados. O bicarbonato em excesso instabiliza a ligao do organofosforado pela esterase. Nalorfina nas intoxicaes por opiides (morfina, por exemplo) Vitamina K nas intoxicaes por compostos cumarnicos

7. NOVIDADES NO TRATAMENTO DAS INTOXICAES Imunotoxicologia: uso de anticorpos no tratamento de intoxicaes. Imunoterapia passiva: soro total. A IgG pode levar a doena do soro, as manifestaes txicas alrgicas so mais graves. O uso de fragmentos Fab tem a vantagem de trazer menos efeitos colaterais, porm o custo elevado. Este tipo de tratamento indicado quando: a intoxicao no deve se instalar de imediato o risco de morte do paciente sem tratamento deve ser alto O anti-paraquat no funcionou pois a intoxicao se instala muito rpido. Esperanas: Ac antidepressivos tricclicos: trabalhos em animais Ac anticocana: populaes inteiras poderiam ser tratadas.

Futuro Anticorpos monoclonais.

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CROMATOGRAFIA GASOSA

Toxicologia separao, identificao e quantificao lcoois, frmacos, solventes, pesticidas, drogas de abuso, etc Amostras biolgicas separao/extrao cromatografia Maior preciso, sensibilidade Cromatografia em fase gasosa Separao, identificao e quantificao Substncias volatilizveis, gases, vapores Distribuio das substncias entre uma fase estacionria e uma mvel

O CROMATGRAFO A GS

FASE MVEL Gs de arraste Inerte Puro impurezas podem danificar a fase estacionria H2O, O2 oxidao, hidrlise de algumas fases estacionrias Maior pureza maior custo Escolha do gs detector H2; N2

Gs de Arraste Puro

1 2

3

4

6

5

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Fase Estacionria Compactada em uma coluna Cromatografia gs-slido fase estacionria slida, grande rea superficial

anlise de gases e compostos apolares de baixo peso molecular. Separao adsoro

Cromatografia gs-lquido fase estacionria um lquido pouco voltil, cobre um suporte slido. Separao partio

Condies Cromatogrficas Separao e identificao depende da afinidade da substncia pelas fases mvel e

estacionria Condies podem alterar a afinidade resultado Padronizao das condies cromatogrficas

Condies Cromatogrficas - Temperatura Temperatura da coluna Temperatura do vaporizador Temperatura do detector

Analito elui mais rapidamente, ( Menor tempo de reteno)

Condies Cromatogrficas - Temperatura

Temperatura da

coluna

Presso de

vapor

Velocidade de

migrao

CUSTO

PUREZA

A

B

C

A = 99,995 % (4.5) B = 99,999 % (5.0) C = 99,9999 % (6.0)

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Condies Cromatogrficas Gs de Arraste Gs inerte, puro H2, N2, Ar, Fluxo constante

Condies Cromatogrficas Fase Estacionria Fase estacionria polaridade varia consideravelmente Escolha da fase estacionria substncia a ser pesquisada conhecer as

propriedades fsico-qumicas Detectores

Seletivos ou Universais Seletivos uso mais restrito, maior sensibilidade Seletivos Detector de Captura de Eltrons (DCE) identifica substncias com

grupos eletroflicos Neste detector gerada uma corrente de eltrons por uma fonte radioativa (chamada

corrente de fundo). Esta corrente ser diminuda pela captura dos eltrons quando as substncias eltron-afins alcanarem o detector

Universais de Condutividade Trmica (DCT) e de Ionizao de Chama (DIC) Mais universal DIC DIC identifica todo o composto que, ao ser queimado, produza uma corrente elevada

de ons. Esta ionizao determina uma queda de voltagem no interior do DIC que representa o sinal eletrnico enviado ao registrador

Anlise Qualitativa Tempo de reteno

TEMPERATURA DA COLUNA

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MODELO DE RELATRIO O RELATRIO o relato por escrito, de forma ordenada e minuciosa daquilo que se observou no laboratrio durante o experimento. Desta forma, o relatrio o conjunto da descrio da realizao experimental, dos resultados obtidos, assim como das ideias associadas, de modo a constituir uma compilao completa e coerente de tudo o que diga respeito ao trabalho relatado. O relatrio deve em primeiro lugar, retratar o que foi realmente realizado no experimento, sendo de fundamental importncia a apresentao de um documento bem ordenado e de fcil manuseio. Alm disso, deve ser o mais sucinto possvel e descrever as atividades experimentais realizadas, a base terica dessas atividades, os resultados obtidos e sua discusso, alm da citao da bibliografia consultada. O relatrio deve ser redigido de uma forma clara, precisa e logica, sempre de forma impessoal, utilizando-se a voz passiva no tempo passado. E bastante recomendvel efetuar uma reviso do relatrio para retirar termos redundantes, clarificar pontos obscuros e retificar erros no original. Uma ateno especial deve ser dada aos termos tcnicos, resultados, formulas e expresses matemticas. As ilustraes (tabelas, formulas, grficos) devero vir na sequencia mais adequada ao entendimento do texto. Seus ttulos devem ser em negrito, e a legenda, quando houver, deve estar imediatamente abaixo da tabela, figura ou grfico. Identificar os mesmos, uma sequencia lgica: Tabela 1: ; Tabela 2: ; assim como Figura 1: e Grfico 1:. O relatrio deve conter: 1. Identificao: Relatrio N.: Ttulo do Relatrio: Nome dos Autores Local e ano 2. Resumo Inicialmente, deve ser feito um resumo dos principais aspectos a serem abordados no relatrio, tomando por base, as etapas constantes do procedimento experimental desenvolvido e dos resultados obtidos. Este item deve ser elaborado de forma clara e sucinta para proporcionar ao leitor os tipos de informaes fornecidas no documento. No deve ultr

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controle da terapia

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