21-metodos+ fenotipicos deteccao mecanismoss rodrigo mendes

Métodos Fenotípicos para Detecção dos Mecanismos de Resistência Antimicrobiana em Bacilos Gram-Negativos

Prof. Dr. Rodrigo Elisandro MendesPós-doutorando da Disciplina de Infectologia

Universidade Federal de São Paulo - EPM

http://www.unifesp.br/servicos/sobre.htm

Índice

Principais ProblemasParede celular bacterianaResistência Bacteriana a AntimicrobianosPrincipais Problemas em EnterobactériasPrincipais Problemas em Bacilos Gram-Negativos Não-Fermentadores-lactamasesLocalização dos genes laDetecção de -lactamases-lactamases de espectro ampliadoESBL no BrasilInfecções por amostras produtoras de ESBL SURTOMétodos fenotípicos para detecção das amostras produtoras de ESBLDetecção de amostras produtoras de ESBLTestes para Detecção de Cepas Produtoras de ESBL-lactamases do Grupo 1 (AmpC)Resistência aos carbapenens EnterobactériasDetecção de Metalo- -lactamases Detecção de amostras produtoras de MBL Dissemination of an Epidemic Carbapenem-Resistant Metalo--lactamases emEnteroactérias no Brasil

Principais Problemas

Enterobactérias

• Resistência às cefalosporinas de amplo espectro

• Resistência aos carbapenens (rara)

Bacilos Gram-negativos não fermentadores

• Resistência aos carbapenens

• Resistência às polimixinas (rara)

Parede celular bacteriana

Bactéria Gram-positiva Bactéria Gram-negativa

Pelcza, Microbiology, 1999.

Bactéria Gram-positiva

Bactéria Gram-negativa

Resistência Bacteriana a Antimicrobianos

Principais Problemas em Enterobactérias

Resistência às cefalosporinas de amplo espectro e monobactâmicos

Produção de -lactamases de espectro ampliado (ESBL)Produção de -lactamases AmpC

Resistência aos carbapenens (rara)

Falsa resistênciaProdução de ESBL/AmpC + alt. da membrana externaProdução de Metalo- -lactamases (MBL)

Principais Problemas em Bacilos Gram-Negativos Não-Fermentadores

Resistência aos carbapenens

Produção de AmpC + alt. da membrana externa

Produção de Metalo- -lactamases (MBL)

Efluxo ativo

Resistência às polimixinas (rara)

Alteração da composição lípidica do LPS e/ou

Hiperexpressão da porina OmprH

-lactamases

São enzimas que catalisam a hidrólise do anel beta-lactâmico

Principal mecanismo de resistência entre gram-negativos

Grande diversidade

Produção mediada pelo DNA cromossômico ou extra-cromossômico (plasmídios e transposons)

Localização dos genes bla

Conjugação entre bactérias da mesma espécie

Conjugação entre bactérias de espécies diferentes

Transmissão e disseminação

DNA Cromossomal

DNA Extra-Cromossomal

Divisão binária

Cél. Mãe para cél. filha

Disco de Nitrocefin

Detecção de -lactamases

+ -

-lactamases de espectro ampliado(extended-spectrum beta-lactamase)Enterobactérias: E. coli e K. pneumoniae

Mediadas por genes plasmidiais não induzíveis

Vários genes: tem, shv, per, ges, ctx, oxa

Degradam todos os monobactâmicos e beta-lactâmicos com exceção dos carbapenens e das cefamicinas

Geralmente, inibidas pelos inibidores de -lactamases (ácido

clavulânico, sulbactam e tazobactam)

Bush et al., AAC 39:1211, 1995

-lactamases de espectro ampliado(extended-spectrum beta-lactamase)

-lactamases de espectro ampliado Importância Clínica

Posso utilizar cefalosporinas de amplo espectro para o

tratamento de Infecções causadas por bactérias

produtoras de ESBL?

Paterson et al., J Clin Microbiol 39:2206, 2001.

-lactamases de espectro ampliado Importância Clínica

MIC ( µg /ml) Falência terapêutica

% (N)

Morte até 14 dias após bacteremia

N(%)

8 100 (6/6) 33 (2/6)

4 67 (2/3) 0 (0/3)

2 33 (1/3) 0 (0/3)

£1 27 (3/11) 18 (2/11)

Total 54 (15/28)

CTX-M-8 - Rio de Janeiro - C. amalonaticus e E. cloacae Bonnet et al., J Clin Microbiol 44:1936, 2000.

BES-1 - Rio de Janeiro - Serratia marcescens

Bonnet et al., Antimicrob Agents Chemother 44:3061, 2000.

CTX-9 e -16 - Rio de Janeiro - E. coli e E. cloacae

Bonnet et al., Antimicrob Agents Chemother. 45:2269, 2001.

SHV-27 - Aracajú - Klebsiella pneumoniae

Corkill et al., J Antimicrob Chemother 47:463, 2001.

CTX-M - São Paulo - Klebsiella pneumoniae

Carmo Filho. Doutorado UNIFESP/EPM, 2003.

ESBL no Brasil

Infecções por amostras produtoras de ESBLSURTO

No. Ribogrupo PFGE pI

1 1019-4 W2 5.4, 7.6, 7.9

2 1019-4 W3 5.4, 7.6, 7.9

3 637-8 Z1 5.4, 7.6, 7.9

4 637-8 Z3 5.4, 7.6, 7.9

5 637-8 Z2 5.4, 7.6, 7.9

6 637-8 C 5.4, 7.6, 7.9

7 637-8 C 5.4, 7.6, 7.9

l 1 2 l 3 4 5 l 6 7

Amostras de P. mirabilis produtoras de ESBL isoladas pelo Programa SENTRY 1997 -1998

Todos os métodos fenotípicos se baseiam na

inibição da atividade da enzima pelos

inibidores de -lactamases (IBL)

Métodos fenotípicos para detecção das amostras produtoras de ESBL

Limites de triagem do CLSI (antigo NCCLS)

Teste de Adição de IBL aos discos de cefalosp.

Discos combinados

Teste de dupla-difusão em disco

Etest

Métodos automatizados

Métodos fenotípicos para detecção das amostras produtoras de ESBL

Detecção de amostras produtoras de ESBLLimites de Triagem do CLSI

E. coli, K. pneumoniae, K. oxytoca, P. mirabilis*

CLSI, 2005

Disco Difusão MIC

Aztreonam < 27 mm > 2 µ g/mL

Ceftazidima* < 22 mm > 2 µ g/mL

Ceftriaxona < 25 mm > 2 µ g/mL

Cefotaxima* < 27 mm > 2 µ g/mL

Cefpodoxima* < 17 mm > 2 * /> 8 µ g/mL

Disco difusão

• Meio de Müller-Hinton

• Utilizar discos de ceftazidima e cefotaxima sozinhos e os associados ao ácido clavulânico

POSITIVO

Aumento do halo 5 mm da associação

CAZ/AC ou CTX/AC vs. halo de CAZ ou CTX

Detecção de amostras produtoras de ESBLTeste confirmatório recomendado pelo CLSI

E. coli, K. pneumoniae, K. oxytoca, P. mirabilis

Disco difusão

Ácido Clavulânico

• Preparar solução estoque 1000 ml fresca ou congelada a –

70°C

• Adicionar 10 ml desta solução sobre os discos de CAZ e

CTX uma hora antes do teste

Controle de Qualidade

• - Positivo: K. pneumoniae ATCC 700603

• - Negativo: E. coli ATCC 25922


Teste de adição de IBL

Jacoby & Han, 1996

Carter et al., J Clin Microbiol. 38:4228, 2000.

Detecção de amostras produtoras de ESBLTeste de adição de IBL

Métodos dilucionais

• Meio de Müller-Hinton com a concentração de cátions

ajustada

• Concentrações dos antimicrobianos:

•ceftazidima: 0.25-128 mg/ml

•ceftazidima/ácido clav.: 0.25/4-128/4mg/ml E

•cefotaxima: 0.25-64 mg/ml

•cefotaxima/ácido clav.: 0.25/4-128/4mg/ml

POSITIVO

Redução 3.0 diluições


E. coli, K. pneumoniae, K. oxytoca, P. mirabilis

CLSI, 2005

Métodos dilucionais

Controle de Qualidade

• Positivo: K. pneumoniae ATCC 700603

• Negativo: E. coli ATCC 25922


Teste de adição de IBL

CLSI, 2005

Vantagens• Teste simples;• Fácil interpretação;• Custo

Limitações• Preparo e armazenamento da

solução estoque de ácido clavulânico;

• Caracterização errônea

Detecção de amostras produtoras de ESBLTeste de adição de IBL

1

23

4

56

1.Cefpodoxima,

2. Cefpodoxina + Ác. Clavulânico,

3. Ceftazidima,

4. Ceftazidima + Ác. Clavulânico,

5. Cefotaxima

6. Cefotaxima + Ác. Clavulânico

Detecção de amostras produtoras de ESBLDiscos combinados

1

23

4

5

6

1. Cefpodoxima, 2. Cefpodoxina + Ác. Clavulânico,3. Ceftazidima, 4. Ceftazidima + Ác. Clavulânico, 5. Cefotaxima 6. Cefotaxima + Ác. Clavulânico

Vantagens• Teste simples;• Fácil interpretação;• Custo

Limitações• Substrato (novo disco com

cefpiroma);• Não detecção de amostras

produtoras de SHV-6


Sensibilidade• Ceftazidima = 86% Cefotaxima = 65.5%• Combinados = 93%

100% das amostras produtoras de ESBL apresentaram aumento no halo > 5 mm, enquanto as produtoras de AmpC e K1 apresentaram aumento < 1 mm.

M'Zali et al. J Antimicrob Chemother45:881-5 , 2000. Carter et al. J Clin Microbiol 38:4228-32, 2000.


De Gheldre et al. J Antimicrob Chemother. 52:591-7, 2003

Sensibilidade/Especificidade (%)

Escherichia coli e Klebsiella spp.• CAZ/clav: 88% e 92%• CTX/clav: 90% e 92%• CPR/clav: 95% e 84%• CAZ/clav + CPR/Clav: 100% e 82%

Enterobacter aerogenes• CAZ/clav: 94% e 100%• CTX/clav: 94% e 100%• CPR/clav: 94% e 100%• CAZ/clav + CPR/Clav: 100% e 100%


Pereira et al. J Bras Patol Med Lab 39:301-308, 2003.

134 amostras de K. pneumoniae do Hospital Säo Paulo – 1996/2001

Discos da Oxoid

Cefotaxima e cefpodoxima: S e E = 100%

Etest ESBL

S = 96% e E = 100%


Jarlier, 1988

Distância de 30 mm

CAZ

ATM

CRO/CTX

CPM

AMX/AC

Detecção de amostras produtoras de ESBLDisco-difusão dupla ou teste de aproximação

Jarlier, 1988

Teste Positivo


Teste Positivo

Vantagens• Teste simples;• Não necessita de reagentes

especiais

Limitações• Distância entre os discos;• Armazenamento dos discos

com ácido clavulânico;• Interpretação


Fitas disponíveis

Ceftazidima, cefotaxima e cefepima

Critério de positividade

Redução 3.0 diluições

Razão TZ/TZL > 8

Razão CT/CTL > 8

TZ = 32 TZL =2

32 16 8 4 2

Cormican & Jones, 1996

Detecção de amostras produtoras de ESBLEtest®


Zona Fantasma


Vantagens• Teste simples;

Limitações• Substrato específico;• Não detecção de amostras,

cuja as MICs situem acima das diluições testadas;

• Custo


MicroScan – Painéis de Gram-negativos

Triagem para ESßL

Poços que contêm cefpodoxima 4 mg/mL e ceftazidima 1 mg/mL associados ao clavulanato

ESßL plus Confirmation PanelAntimicrobiano (conecntação testada em mg/ml)

Aztreonam 0.5 – 64 Cefpodoxima 0.5 – 64Cefepima 1 – 32 Ceftazidima 0.5 – 128Cefoxitina 2 – 32 Ceftazidima/Clav4 0.12/4 – 16/4Cefotaxima 0.5 – 128 Ceftriaxona 1 – 64Cefotaxima/Clav4 0.12/4 – 16/4 Meropenem 0.5 – 16Cefotetan 1 – 32 Piperacillina 16 – 64

Imipenem 0.5 – 16

Detecção de amostras produtoras de ESBLMétodos Automatizados

Vitek – Painéis de Gram-negativos

Triagem para ESßL

Poços que contêm cefotaxima e ceftazidima 0,5 mg/mL associados ao clavulanato


Vantagens• Padronização intra- e inter-

laboratorial;

Limitações• Substrato específico;• Não detecção de amostras,

cuja as MICs situem acima das diluições testadas;

• Custo


CLSI, 2005

Detecção de amostras produtoras de ESBLK. pneumoniae ATCC 700603 – CQ ESBL +

Avaliação da Sensibilidade e Especificidade de Diferentes Testes para Detecção de

Cepas Produtoras de ESBL

Reis et al., J Bras Patol Clin 37:43, 2001.

Teste Sens. Espec.

Disco difusão (bkpts ESBL -NCCLS) 89 62

Dupla Difusão 41 100

ESBL Etest® 89 98

Disco difusão (CTX + AZT - NCCLS) 88 83

Adição de clavulanato 97 47

MICs para 5 substratos (Etest) 100 100

Detecção de amostras produtoras de ESBL

Sugestão

• Limites de triagem estabelecidos pelo CLSI;

+

• Teste de dupla-difusão em disco, ou

• Discos combinados

-lactamases do Grupo 1 (AmpC)

Livermore. Scand J Inf Dis 79(Suppl):7-16, 1991

• Antimicrobianos hidrolisados: aztreonam, cefalosporinas de amplo espectro e penicilinas de amplo espectro

• Enterobacter spp., Citrobacter freundii, Morganella morganii, Providencia stuartii, Providencia rettgeri, Serratia spp., Pseudomonas aeruginosa - cromossomal

• Não são inibidas por inibidores de β-lactamases

• Produzidas em pequena quantidade a menos que sejam induzidas

• Agente retirado produção volta a níveis basais ou pode ocorrer mutação e desrepressão

CAZCFOCRO

D

Distância em mm = raio do beta-lactâmico - 3 2

-lactamases do Grupo 1 (AmpC)Teste de indução de -lactamases AmpC

Resistência aos carbapenensEnterobactérias

Checar resultados das cepas ATCCs

Verificar a validade e a estocagem dos discos;

Verificar a identificação;

Repetir o teste de sensibilidade técnica

Confirmada Lab. de referência

Resistência aos carbapenensMetalo--lactamases

• Hidrolisam penicilinas, cefalosporinas e carbapenens

• Genes cromossômicos e plasmidiais (transposons, integrons)

• Zn++ como cofatores enzimáticos

• Inibidas por EDTA e compostos derivados do thiol

• Família IMP-1 a -16 (Japão, China, Europa, Canadá, Portugal, Taiwan, Brasil)

• Família VIM-1 a -11 (Argentina, Colômbia, Europa, Coréia, Taiwan, EUA)

• GIM-1 (Alemanha)

• SPM-1 (São Paulo Metalo- -lactamase)

(Page 2002, Rossolini et al 2001; Nordmann & Poirel 2002, Toleman et al 2002)

Detecção de Metalo- -lactamases Importância Clínica

A maior parte da produção destas enzimas é mediada por genes plasmidiais, que podem se disseminar entre espécies distintas

Medidas de Controle

Detecção do mecanismos – opções terapêuticas – Novas drogas como IMBL.

Detecção de amostras produtoras de MBL Disco- aproximação IMBL

Distância de 15-25

mm

CAZ IMP

IMBL

Arakawa J Clin Microbiol 38:40-43, 2000.

Distância de 4-5 cm

IMBLEDTA – 5 ml 100 mM2-MPCA puro – 2 a 3 ml

Disco- aproximação com ácido 2-mercaptopropiônico

NEGATIVA POSITIVA

Arakawa J Clin Microbiol 38:40-43, 2000.

Detecção de amostras produtoras de Metalo--lactamases

IMP

IMP/EDTA

Critério de positividade: 5 mm?

Detecção de amostras produtoras de Metalo- -lactamases - Adição de EDTA

Detecção de amostras produtoras de Metalo- -lactamases - Etest

Walsh et al., J Clin Microbiol 40:2755-9, 2002.

Critério de positividade : Redução 3.0 diluições

Detecção de amostras produtoras de Metalo- -lactamases

Controles de Qualidade

• CQ -: P. aeruginosa ATCC 27853

• CQ +: P. aeruginosa 48-1997A (produtora de SPM) P. putida 48 – 1234 (produtora de IMP -1)

Dissemination of an Epidemic Carbapenem-Resistant Pseudomonas aeruginosa Producer of SPM Metallo--

Lactamase in Distinct Brazilian Regions

Gales et al. J Antimicrob Chemother 52:699, 2003.

First Isolation of a Metallo--lactamase-Producing-multiresistant Klebsiella pneumoniae from a Patient in Brazil

Lincopan et al. J Clin Microbiol

43:516, 2005.

Outbreak caused by a Carbapenem-Resistant Klebsiella pneumoniae Producer of IMP-1 Metallo--Lactamase in a Brazilian Teaching Hospital

Grimbaun et al. 44th ICAAC, Washington, DC. 2004.

Metalo--lactamases em Enterobactérias no Brasil

21-metodos+ fenotipicos deteccao mecanismoss rodrigo mendes

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