1_introdução ao dna

1

GENÉTICA MOLECULAR

Química

Biologia

Física

Biomol

Biologia Molecular?

Fusão de três áreas da CIÊNCIA BÁSICA

2

Biologia Molecular?

Características Biológicas e Mecanismos defuncionamento das moléculas

Estuda os aspectos físicos, químicos e biológicos das

moléculas principalmente macromoléculas os ácidos

nucléicos e seus produtos, as proteínas

Ciência recente com o início (aproximado) na décadade 50

Uma ciência básica que permitiu grandes avanços emciência aplicada como a Engenharia Genética eBiotecnologia

Parte das metodologias utilizadas em biologiamolecular subsídios para outras áreas comofisiologia, medicina, física, botânica, zoologia dentreoutros

Biologia Molecular?

3

1) Ácidos Nucléicos: Características principais

2) O código genético e controle do fluxo informação genética

3) Introdução ao DNA recombinante

CONTEÚDO PROGRAMÁTICO

1) Ácidos Nucléicos: características principais

•DNA e a informação genética

•A dupla hélice do DNA e o dogma central da

biologia molecular

•Estrutura do DNA

•Topologia do DNA

•Cromossomos, cromatina e Nucleossomo

•Replicação do DNA

•Mutabilidade e reparo de DNA


4

•Mecanismos de transcrição em procariotos

•Mecanismos de transcrição em eucariotos

•Processamento de RNA

•Mecanismos de tradução

•Código genético

2) O código genético e o fluxo informação genética


3) O controle da informação genética


•Regulação gênica em eucariotos

•Regulação gênica em procariotos

•Regulação gênica durante o desenvolvimento

5


•Aplicações da biologia molecular

•Técnicas de análise

4) Introdução ao DNA recombinante

• 3 provas teóricas parciais, não cumulativas

• Apresentação de seminário

• Será considerado aprovado o aluno que obtiver a média das

notas maior ou igual a 6.0 e frequência maior ou igual a 75%.

• A disciplina não oferecerá prova substitutiva e sim a possibilidade

de uma avaliação complementar (recuperação). Esta avaliação

englobará toda a disciplina ministrada no período a que se refere.

•Para participar do processo de recuperação o aluno deverá ter

obtido nota final igual ou superior a 5,0 e frequência maior ou igual

a 75%.

•Alternativamente, poderão ser solicitados a realização de

trabalhos de pesquisa extra-classe que contribuirão na média de

avaliação.

AVALIAÇÃO

6

• Prova I – 09/11• Prova II – 07/12• Prova III – 18/01

•Alterações nas datas de prova só serãofeitas mediante situações excepcionais

AVALIAÇÃO

Bibliografia Básica:1. WATSON, J. D.; BAKER, T. A.; BELL S. P.; GANN A.; LEVINE

M.; LOSICK R. Biologia Molecular do Gene, 5ª.edição, Editora Artmed, 2006

2. WATSON, J. D. ; MYERS, R. M.; CAUDY, A. A.; WITKOWSKI, J. A. DNA recombinante, genes e genomas, 3ª edição, Editora Artmed, 2008

3. LEWIN, B. Genes IX , Editora Artmed, 2008

Bibliografia Complementar1. ALBERTS, B. LEWIS, J.; BRAY, D. Biologia Molecular da

célula, 4ª Edição, Editora Artmed 2004

2. LODISH, H., BERK, A.; MATSUDAIRA P. e colaboradores. Biologia Celular e Molecular -– 5ª Edição, Editora Artmed

BIOLOGIA MOLECULAR - CBNC 22 BIBLIOGRAFIA BÁSICA

7

BIOLOGIA MOLECULAR

O DNA COMO MATERIAL

GENÉTICO

DNA e RNA forma descritos pelaprimeira vez em 1869 por F.Miescher (biólogo suíço)

Isolou um material contendofósforo do núcleo das células nopus descartado de bandagenscirúrgicas nucleína

Relatou que o conteúdo donúcleo era constituído de umaporção acídica (DNA) e umaalcalina (histonas)

Friedrich Miescher

Bases Bioquímicas e Estruturais dos Ácidos Nucléicos

8

A composição química do DNA foi

determinada em 1909 pelo médico russo

Phoebus Levene no Instituto Rockefeller

(bases nitrogenadas, açúcar e fosfato) e

demonstra que estes são polímeros, ou

seja, formados por muitas repetições de uma

mesma subunidade.

Em 1929 Levene também estabeleceu que

existia uma diferença química entre os dois

ácidos nucléicos, o DNA e o RNA, termos que

começaram a ser largamente utilizados.

No entanto, Levene morreu em1940, antes

que o significado dessas moléculas fosse

esclarecido.

Phoebus Aaron Theodor Levene


Durante muito tempo se acreditou que era impossívelque as características genéticas fossem codificadaspor uma molécula linear simples formado por somente4 nucleotídeos como o DNA

Acreditava-se que ele formava um arcabouço para asmoléculas o qual seria o verdadeiro material genético

Proteínas eram consideradas pela maioria grande maioria da comunidade científica como o provável constituinte genético.

O DNA Como Material Genético

9

Em 1928, Frederick Griffith fez uma sériede experimentos com ratos infectadoscom a bactéria Streptococcus

Griffith tinha duas linhagens da bactériaStreptococcus.

A linhagem S (smooth) – possuia umenvelope de polissacarídeo que tornava aaparência das colônias lisas e brilhantes.

A linhagem R (rough) – as colônias nãopossuíam este envelope e as colôniastinham uma aparência opaca e masrugosa.

Frederick Griffith



10

Princípio Transformante -DNA

Frederick Griffith - 1928

Em 1931 Oswald Avery,Collin MacLeod e MaclynMacCarty deramprosseguimento aosexperimentos de F.Griffith O. Avery C. Macleod M. MacCarthy


Os resultados de seus esforços foram publicadosem 1941

Romperam células S mortas e removeram os lipídeos ecarboidratos

Dividiram o extrato purificado em três frações:

Fração 1 + Protease

Fração 2 + RNAse

Fração 3 + DNAse

11

Qual o componente celular responsável pela “informação”?

Princípio transformante - Griffiths


Avery, MacLeod e MacCarty demonstraram que o DNAé o material genético???

Parte do meio científico ainda não ficou convencida...

Acreditavam que o DNA era um catalisador para aativação de genes constituídos de proteínas...

No início dos anos 50 muitos cientistas testavam osbacteriófagos

Sabiam que o vírus injetava “algo” na bactéria quecausava sua propagação

O que era injetado DNA ou proteína?

12


Bacteriófagos vírus que infectam bactérias

Compostos unicamente por DNA e proteína!

Cabeça

Cauda

Fibras da

Cauda

Célula

bacteriana

Fagos

DNA, Proteína ouDNA

+ Proteína?

Cabeça

Cauda

Fibras da

Cauda

DNA, Proteína ouDNA

+ Proteína?

Microscopia eletrônica de transmissão do

fago T2 infectando E. coli. O fago T2

utiliza parte da cauda para injetar seu

material genético na bactéria

Bacteriófago T2

Infectando uma

célula de E. coli

Bacteriófago T2

Injeção do

material genético

Propagação

Lise


Ciclo lítico de um bacteriófago

*Existe também um ciclo denominado delisogênico o material genético do vírus éincorporado ao do hospedeiro

13


Após o fim da segunda guerramundial (08/05/1945), diversosfísicos que haviam trabalhadoanteriormente com energianuclear estavam migrando paraa biologia

Martha Hershey e Alfred Chase

Eles começaram a trabalhar com bactérias ebacteriófagos (ou fagos), o que posteriormenteajudou a fundar a BIOLOGIA MOLECULAR!

Em 1952 Hershey e Chasedemonstraram o papelessencial do DNA através deexperimentos utilizandoisótopos radiativos

Proteínas do

fago marcadas

com 35S

1.Cultura de bactérias e

infecção por fagos

crescidos previamente

na presença de 35S

2. Agitação da

cultura em um

liquidificador

capsídio se

desprende

3.Radioatividade

encontrada nas

proteínas

5. Radioatividade é

encontrada no

meio líquido

4.Separação

capsídios no meio

líquido bactérias

fundo (sólido)


O experimento de Hershey e Chase

Centrifugação

Material genético injetado pelo fago é o DNA

14

DNA do

fago

marcado

com 32P

1.Cultura de bactérias e

infecção por fagoscrescidos previamentena presença de 32P

2. Agitação da

cultura em um

liquidi.

capsídio se

desprende

3.Radioatividad

e encontrada

no DNA

5. Radioat. é

encontrada

no meio

sólido

4. Separação

capsídios no

meio líquido

bactérias

fundo (sólido)


O experimento de Hershey e Chase

Radiação encontrada no interior das bactériasMaterial genético injetado pelo fago DNA

Centrifugação

15

PROVA DEFINITIVA

DNA É O MATERIAL GENÉTICO

Em 1952 quando foi provada que a molécula deDNA era realmente a detentora da informaçãogenética começou-se a dar importância às suascaracterísticas químicas e estruturais

Muitos trabalhos que haviam sido negligenciadoscomeçaram a mostrar sua importância

Em 1938, o físico britânico William

Thomas Astbury (1898-1961),

discípulo de Lawrence Bragg, é o

primeiro a estudar o DNA pela

cristalografia por raio X e a

estabelecer que sua estrutura

apresenta a forma de um longo

filamento

William T. Atsbury

Características Bioquímicas e Estruturais dos Ácidos Nucléicos

16

Início da década de 1950 Alexander

Robertus Todd, químico orgânico

(Cambridge), determinou como eram

constituídos os nucleotídeos

Alexander Robertus Todd

Nobel 1957


Os nucleotídeos que compõe o

DNA tem como arcabouço um

acúcar: A RIBOSE é constituída

de cinco carbonos que são

numerados, por convenção no

sentido anti-horário da molécula

de O presente em seu anel

Pentose açúcar que possui

um anel com 5 átomos.

Ligado ao anel há um

grupo fosfato, composto de

um átomo de fósforo ligado

covalentemente a 4

átomos de oxigênio


17

Os nucleotídeos possuem:

ligada quimicamente

a um açúcar (pentose) e este a um grupo fosfato.

Uma base nitrogenada



As bases nitrogenadas que compõe os nucleotídeospossuem anéis formados por C-N. Entretanto tamanhosdistintos. Pirimidinas possuem um anel enquanto aspurinas ocorre um anel fusionado à outro.

18


Uma diferença entre DNA e RNA ...

OH

Desoxiibose

HOH

Ribose

OH

DNARNA

C1’ - Se liga a base

nitrogenada

ERRADO!!!!!

C5’ - Se liga o grupamento

fosfato

C3’ – OH deste carbono é

utilizado na ligação

fosfodiester

Os carbonos com maior

importância estrutural são:


Outra diferença entre DNA e RNA ...

19

A.Todd também

concluiu que estes

estavam unidos a

grupos fosfatos nas

posições 3`e 5` das

moléculas de

desoxirribose, o

açúcar do DNA. Essas

ligações recebiam a

denominação de

ligações fosfodiéster.


Totalmente

diferente

do modelo

anterior ...


A ligação

fosfodiester

também

ocasiona uma

polarização da

molécula de

DNA.

Em umaextremidadeela terminacom o grupoP ligado aocarbono 5’

Na outraextremidadetermina comOH (ligado docarbono 3’ )

20

Em 1949 Erwin Chargaff fez uma

descoberta espetacular

Trabalhando hidrólise de DNA com

cromatografia em papel ele determinou

que existia uma relação na proporção

de purinas e pirimidinasErwin Chargaff

DNA

Hidrólise

Nucleotídeos

Cromatografia


1) Os nucleotídeos não estão presentes

em quantidades equivalentes (ex: 25%

A, 25% C,...)

A

C

G

T

2) A proporções relativas não são

aleatórias....

Feita a cromatografia e possível

quantificar a quantidade de cada base

Ex: em humanos 31% A, 20%C, 20%G e 29T%

Qual a importância destes dados?


21

1) A quantidade de bases púricas e pirimídicas são

equivalentes:

Ex: em humanos 31% A, 20%C, 20%G e 29T%.

Portanto existia uma razão 1 entre purinas e pirimidinas

Como também razão 1 entre A/T e G/C

A (31%)

T (29%)

C (20%)

G (20%)~ 1 = 1

A (31%) + G (20%) ~ 50%

T (29%) + C (20%) ~ 50%

2) Existem uma razão entre determinadas purinas e

pirimidinas:


A proporções eram verdadeiras somente para espécie

humana?

Chargaff investigou a proporção para diversas espécies….

A razão 1 entre purinas e pirimidinas Como também razão

1 entre A/T e G/C ficaram conhecidas como Regras de

Chargaff


22

Uma vez que sua importância foi reconhecida, além davalorização e reconhecimento dos trabalhos mencionados,começou uma corrida para se a investigar como a moléculade DNA é estruturada.

L. Pauling e Robert Corey CalTech

M. Wilkins e R. Franklin KingsCollege

J. Watson e F. Crick Cambrige

A corrida teve envolvimento devários grupos extremamenterespeitados

Nobel 1954 e 1962

Linus Carl Pauling

Química 1954 -Pesquisa

sobre a natureza da ligação

química e sua aplicação à

elucidação da estrutura das

substâncias complexas.

Paz 1962 - por tentar proibir

o uso das armas nucleares


Em 1953 Paulingpublicou um artigo emque proponha aestrutura do DNA combase em dadoscristalográficos

Pauling... Duas vezesprêmio Nobel, descobriua ordenação de orbitaisquímicos, a alfa hélicede proteínas...

Até os gênios erram ...

No artigo o DNA possuíauma tripla hélice!!!!!


23

Enquanto isso no Kings College…

Gerador

de raios X

Feixe deraios X

Cristal deDNA

(fibras)

Padrão dedifração

Maurice Wilkins e R. Franklin

R. Franklin, sob orientação de M.Wilkins, obtinha o padrão dedifração de cristais de DNA

Difração de raios X de fibras de DNA


Equipamentos dotamanho deprédios

Geradores de raios-X…

Ou maiores…


24

Voltando a Rosalind Franklin e ao padrão de difração obtido

Difração de raios X de fibras de DNAR. Franklin

Padrão sugeria uma molécula helicoidal

Mas nem R. Franklin nem seu orientador M. Wilkinssouberam interpretar os resultados...


Neste mesmo ano (1953) JamesWatson e Francis Crick visitaram olaboratório de M. Wilkins e R.Franklin...

E proporam uma teoria utilizando os dados de Franklin....

Analisaram os difratogramas…

James Dewey Watson e Francis Crick


25

A interpretação

James Dewey Watson e Francis Crick


26


Micro () = 10-6

Nano (n)= 10-9

Angstrons (Å) = 10-10

Pico (p)= 10-12

Femto (f)= 10-15

Atto (a)= 10-18

Zepto (z)= 10-21

Algumas unidades de medida utilizadas em

trabalhos de biologia molecular


A dupla hélice apresenta raio de1nm.

Distância entre as bases de 0.34nm.

Pares de bases em posiçõesequivalentes ocorrem a cada 34nm.

A conformação helicoidal típicaproduz dois tipos cavidades: menor(12 Å) e maior (22 Å)

As bases nitrogenadas pareadas no

centro da molécula e unidas por pontes

de H. Sendo que o pareamento A/T

possui 2 pontes H e G/C três.

Grupamentos fosfato-açúcar do

esqueleto estão posicionados para o

exterior da dupla hélice

27


Outro observação de Watson e Crick é que as fitas

são antiparalelas

3’

5’

5’

3’

A extremidades 3’ (hidroxila-OH) 5’ (fosfato-P) sãoinvertidas nas duas fitas

O modelo propõe o pareamento entre purinas epirimidinas (A/T e C/G)

Pareamento A/T e C/G): explica as regras de Chargaff!!!!

O pareamento de nucleotídeos semelhantes não se adequaao diâmetro uniforme da hélice de DNA indicado pelosdados de difração Diâmetro da mol.

de DNA (2nm/20 A)

Purina + Purina: muito grandes

Pirimidina + Pirimidina: muito pequenas

Purina + Pirimidina: distância consistente

com os dados de difração de raios-X


28


Space Filling Model=Leva em conta o raioatômico= mais próximodo real

Principais característicasdo DNA descritas porWatson e Crick.

"We wish to suggest a

structure for the salt of

deoxyribose nucleic acid

(D.N.A.). This structure

has novel features which

are of considerable

biological interest...

...It has not escaped our

notice that the specific

pairing we have postulated

immediately suggests a

possible copying

mechanism for the genetic

material."

-James Watson Francis

Crick


29

... Now our model for deoxyribonucleic acid is, in

effect, a pair of templates, each of which is

complementary to other . We imagine that prior to

duplication the hydrogen bonds are broken, and the

two chains unwind and separated. Each chain hen

acts as a template for the formation on to itself of a

new companion chain, so that eventually have two

pairs of chains, where we only have one before.

Moreover, the sequence of the pairs of bases will have

been duplicated exactly.....

Um mês depois...

Implicações sem precedentes na história da genética!!!!

Explicaria como a informação genética é perpetuada



Neste trabalho Watson e Crick propõe que a replicaçãoSEMICONSERVATIVA do DNA

Replicação = construçào de réplicas de uma molécula

Na dupla fita de DNA, uma fita é o exato complemento da

outra

Replicação semiconservativa?

30


No momento da divisão celular as fita mãe serviria demolde para a síntese de uma nova fita dupla

A nova dupla fita conteria uma fita recém formada(“filha”) e uma fita velha (“mãe”)

Metade dupla fita = velha/Metade dupla fita = nova semiconservativa (sempre é conservada uma das fitasmãe a cada divisão celular)

Fita

Mãe

MOLÉCULA

FILHA

Fita

Filha

Fita

Mãe

Fita

Filha

Região do DNA parental

Região de replicação doDNA: parental. Novosnucleotídeos são pareadoscom os das fitas parentais

Regiãoreplicada doDNA


A genética passaria a tratar as “entitades genéticas” (A/a) como constituintes físicos

Explica como a informação genética é mantida de geração para geração

MOLÉCULA

FILHA

31


1) Seria realmente necessária uma fita molde para a síntesede uma nova molécula de DNA?

Arthur Kornberg começou a trabalhar com extratosbacterianos (E. coli) livres de células foi capaz deresponder a primeira pergunta

Arthur Kornberg

Apesar das teorias existiam céticos que questionavam doispontos básicos:

2) A replicação do DNA é semiconservativa?

Em 1954 conseguiu isolar uma novaproteína que era capaz de replicar oDNA na presença de precursores dealta energia. A esta enzima se deu onome de DNA polimerase


A enzima só conseguia sintetizar novasfitas de DNA na presença de fitas velhas...

Demonstra a necessidade de fitas mãecomo molde para a síntese de novas fitas

Desoxinucleotídeostri-fosfatados (dATP,dCTP, dTTP e dCTP)

+

DNA polimerase I

+

Fita Molde

Incubação emtubo de ensaio(replicação “invitro”)

Replicas damolécula deDNA

O experimento de A. Kornberg

Arthur Kornberg

Nobel Medicina 1959

32



E a replicação semiconservativa???

Muitos não acreditavam que a replicaçãopudesse acontecer como descrito por Watson eCrick.

Célula Parental

Segunda

Replicação

Primeira

Replicação

As fitas parentais seseparam e cada uma servecomo molde para umanova fita complementar

Modelo Conservativo Modelo DispersivoModelo Semi-conservativo

Cada dupla fita novacontém uma mistura departes “velhas”e “novas”

As fitas parentaispermanecem inalteradas eambas as duplas fitas filhassão novas

Três modelos tentavam explicar a replicaçãodo DNA

33


Em 1958 Matthew Meselson e

Franklin Stahl descobriram como o

DNA se replicava utilizando E. coli.

Como todas as bactérias E. coli

possui um único cromossomo

(principal) circular

Matthew Meselson e Franklin Stahl

Em condições ótimas E. coli se

divide a cada 20 minutos

34


Centrifugação do

DNA em CsCl

50.000g por 2-3 dias

Cultura em meio

contendo 15N

Cultura em meio

contendo 14N

-Denso

+ Denso

DNA pesado

(contendo 15N)

DNA leve

(contendo 14N)


Cultura em meio

contendo 15N

Transferência para

meio contendo 14N

Extração do DNA

Centrifugação

20 min. de cultura 40 min. de cultura

20 min. de cultura

apresentava um

DNA de massa

intermediária, uma

mistura de 14N e 15N

40 min. de cultura

apresentava um DNA de

massa intermediária

, uma mistura de 14N e15N e outro com somente14N

35


Célula Parental

Segunda

Replicação

Primeira

Replicação

Modelo Conservativo Modelo DispersivoModelo Semi-conservativo

Resultado da centrifugação de DNA após 20min de cultura em 14N

Resultado da centrifugação de DNA após 40min de cultura em 14N

X

X

OK!OK!

OK! X

Os resultados de Meselson e Stahl comprovam que a

replicação do DNA é semi-conservativa

36


Rosalind Franklin

Graças descobertas efetudas peladescoberta da estrutura do DNA esuas implicações o pêmio Nobelde fisiologia e medicina de 1962foi para…

Maurice WilkinsFrancis CrickJames Watson

XObtenção dos cristais e padrão de

difraçãoInterprertação da estrutura do DNA e

suas implicações biológicas

DESCRIMINAÇÃO SEXUAL!!!!!!

Características Bioquímicas e Estruturais dos Ácidos NucléicosE R. Franklin?

Morreu em 1958 vítima da radiação-X que utilizava emseus trabalhos...

Prêmio Nobel não é póstumo…

Afirmou nunca ter entregue seus dados para Watson e Crick...

Entretanto o trabalho deles se baseou em seus difratogramas..

Wilkins ou Bragg passaram os dados…

37

Fluxo da Informação Genética Contida no DNA

Após todos os estudos a comunidade ainda não havia

compreendido como a informação genética poderia estar

contida em um alfabeto de apenas quatro letras:

Mesmo com apenas quatro letras, as posições possíveis

vão depender do tamanho do genoma (4N)- onde N é o

número de letras da seqüência)

Apesar do DNA conter as informações para a construção

de uma proteína estava claro que não era o DNA que

construía


Diversos trabalhos mostravam a síntese de proteínas em

locais onde não ocorria o DNA

Síntese protéica de eucariotos ocorre no citoplasma*

enquanto o DNA se encontra isolado no núcleo

Deveria haver alguma molécula capaz de transferir a

informação existente no DNA para o citoplasma...

38

As atenções foram concentradas para uma segunda

molécula de ácido nucléico ainda pouco estudada... O

RNA


Célula de Tetrahimena cultivada

com Citidina radioativa, todo o RNA

sintetizado se encontra no núcleo

(partículas negras)

Célula após doze minutos de

transferência para meio contendo

citidina não radioativa, o RNA se

encontra no citoplasma

Demonstra que o RNA é sintetizado no núcleo e migra

para o citoplasma

Torbjörn Casperson e Jean Brachet, demonstraram que o

RNA esta presente em altas quantidades no citoplasma

DNA RNA


O RNA é uma molécula linear, não ramificada, também com

quatro tipos de nucleotídeos unidos por ligações

fosfodiéster 3’ 5’

Possui duas diferenças quanto a molécula de DNA

1) O açúcar é uma ribose que difere unicamente por

possuir uma hidroxila no C 2’

39


2) Enquanto o DNA

possui a pirmidina

Timina no RNA existe a

substituição desta base

por uma Uracila, a qual

tem ausência de um

grupo metila no carbono

5 da base nitrogenada.

Os polirribonucleotídeos assim como os

desoxipolirribonucleotídeos podem formar moléculas

dupla fita

Não são usuais, normalmente ocorrem entre duas

partes da mesma molécula de RNA fita simples*

(muitas vezes possuem caráter regulatório)


Fácil imaginar uma molécula de RNA como a detentora da

mensagem genética para o citoplasma

Em 1958 era de credo geral que a informação presente no

DNA cromossômico, servia de molde para a síntese do

RNA que se deslocavam para o citoplasma e serviam de

informação para a síntese de proteína

F. Crick se referiu a este processo como o DOGMA

CENTRAL DA BIOLOGIA MOLECULAR

40

DNA

REPLICAÇÃO

Tradução

Transcrição

RNA

Proteína

REPLICAÇÃO

Transcrição

reversa

DOGMA CENTRAL DA BIOLOGIA MOLECULAR


Filme


Como a informação era passada do RNA Proteína?

Havia uma teoria simplista que de alguma maneira a

molécula de RNA formava invaginações que reconheceria

o aminoácido e, de maneira também inexplicável, ligaria

uma aminoácido à outro até formar a proteína...

F. Crick de início concordou, mas…

Como uma molécula muito hidrofílica como o RNA poderia

interagir com aminoácidos altamente hidrofóbicos (Gli, Ala,

Val, etc..)

41

Como distinguiria amino ácidos que diferiam por somente

uma grupo metila (Gli/Ala, Val/Leu, e Leu/Iso)


Gly LeuAla Val

Iso Leu


F. Crick propôs que deveria existir uma molécula

adaptadora que era capaz de se ligar ao aminoácido e

também reconhecer as bases no molde de RNA

Anos mais tarde trabalhando com extratos proteicos livres

foi identificada uma molécula que era capaz de se ligar aos

aminoácidos antes que estes fossem incorporados a

proteína

A molécula também era composta por RNA e foi

denominada de RNA Transportador (tRNA ou RNAt)

AMINOÁCIDOTransferido para tRNA por uma classe de

enzimas aminoacil sintetase

Representa cerca de 10% de todo o RNA da célula

42


RNA transportadores são pequenas moléculas de RNA, em

a própria seqüência dos nucleotídeos são capazes de

formar pontes de hidrogênio intramoleculares resultando

em um arranjo espacial complexo com estrutura

secundária Braço

aceptor

de AA

Representação linear de um

RNA transportador. As pontes de

H estão em vermelho

Estrtutura tridimensional do RNA

transportados de Phe


Se o RNA é somente um transportador de AA onde estava

a informção vinda do núcleo que especificava a síntese de

proteínas?

Neste momento as suspeitas da molécula que carregam a

informação recaíram em outra classe de RNA o RNA

ribossomal (rRNA ou RNAr)

Constitui aproximadamente 85 % de todo o RNA presnte

na célula

Entretanto a análise de ribossomos de E. coli e dados de

outros organismos sugeriam que não era o caso

43


As moléculas de RNA ribossomomal também formam

estruturas secundárias através de pontes H

Entretanto muito mais complicadas ...

rRNA16S (E. coli) rRNA23S de (E. coli)


Formando estruturas

tridimensionais de

grande

complexidade ....

Subunidade 16S e 23S do ribossomo de E. coli

44


1) Os rRNA de E. coli e diversos organismos são

compostos por duas subunidades diferentes que podem

estar juntas ou separadas no citoplasma. Todas as cadeias

de rRNA das subunidades menores apresentam tamanho

~de 1500bases

2) As subunidades maiores cerca de 3000 bases

3) As cadeias de rRNA apresentam conteúdo de G + C

muito alto

Se sabia que no genoma existia grandes variações na

quantidade de AT/GC o que não se refletia nos rRNAs

Muito uniformes – sabendo que proteínas variam muito

em tamanho era de se esperar ≠s tamanhos de RNA

Muito uniformes

Entretanto a análise de ribossomos de E. coli e dados de

outros organismos sugeriam que não era o caso


Finalmente células de E. coli

infectadas com o fago T4 forneceram

o sistema para a descoberta da

molécula que continha a informação

para síntese de proteínas

Ao infectar as células o T4 as células

de E. coli cessam a síntese de RNA

endógeno

Sintetizam somente o RNA do T4

Foi constatado que os RNAs de T4 se ligavam a

ribossomos e se posicionavam para se ligar aos tRNAs

O RNA do fago então se desloca na superfície do

ribossomo posicionando suas bases para ligação de

tRNAs

45


Após demonstrado que este RNA dirigia a síntese de

proteínas foi detectado representantes da molécula em

diversos organismos

Por conta de trazer a informação genética contida no DNA

ele foi denominado de RNA mensageiro (mRNA ou RNAm)

mRNA reponde por somente 4-5% de todo o RNA presente

na célula

Apresenta grandes variações de tamanho o que é

condizente com a variação de tamanho existente entre

proteínas


Foi negligenciado por sua baixa

abundância. Entretanto um RNA

pode ser lido por diversos

ribossomos

Forma estruturas helicoidais, mas

raramente estruturas secundárias

46

Fluxo da Informação Genética Contida no DNADesta forma os papeis do diversos tipos de RNA foram

elucidados

A informação da molécula de DNA segue o seguinte fluxo:

A transferência da

informação RNA

proteína ocorre no

ribossomo


Ainda restavam perguntas: como a informação genética

presente no DNA e passada para o mRNA é traduzida?

Deveria haver colinearidade entres as moléculas de mRNA

e as proteínas codificadas por estas

Francis Crick, Sidney Brenner e Charles Yanosfsky fizeram

as primeiras teorias

Grupos de nucleotídeos sucessivos ao longo de uma

cadeia de DNA codificavam AA sucessivos na proteína

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Caso dois nucleotídeos = 4 X 4 = 16 possíveis

combinações =16 aminoácidos ?

Caso três nucleotídeos = 4 X 4 X 4 = 64 possíveis

combinações =64 aminoácidos ?

Como apenas quatro nucleotídeos especificam 20

aminoácidos ?

Através de combinações específicas

Quatro nucleotídeos = 4 X 4 X 4 X 4 = 256 possíveis

combinações =254 aminoácidos /

O consenso foi que o mais provável seria uma trinca de

nucleotídeos.

64 aminoácidos?

Algumas trincas deveriam especificar para o mesmo

aminoácido...


Marshal Niremberg e Heinrich

Matthei trabalhando com

transcrição “in vitro” começaram

a responder as perguntas

rRNA (16 e 23S) + tRNAs + poli Uracila (5’

UUUUUUUU....3’)

Sintetizava peptídeo Phe-Phe-Phe-...

Heinrich Matthei e Marshal Niremberg

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Logo após este experimento o

químico orgânico, Har Gobin

Kohrana sintetizou o mRNA 5’

AGUAGUAGUAGU 3’

O poli mRNA AGU resultava em um

peptídeo poliCys

Kohrana fez diversos mRNAs

sintéticos com todas as

possibilidades existentes para as

trincas

Har Gobin Kohrana

Provou que a trinca de nucleotídeos levava a informação

para os 20 AA constituintes da proteína

61 dos 64 grupos de trincas possíveis codificam AA sendo

que a maioria é codificada por mais de uma trinca


Nobel Medicina 1968

Três trincas não produziam

polipeptídeos

Se adicionadas em alguma

combinação que gerava

polipeptídios fim da cadeia C

As trincas ficaram

denomidas de códons

Códons que

determinavam o fim da

cadeia = códons de

terminação

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Quem responde pela

transcrição DNA RNA

Hurwitiz e Samuel B. Weiss

isolaram uma enzima que era

capaz de sinetizar “in vitro”

fitas de DNA utilizando um

molde de DNA e nucleotídeos

trifosfatados

(ATP, CTPG, GTP e UTP)

como precursores

Samuel B. Weiss e Jerard Hurwitiz

Após a síntese a razão AU/GC da fita de RNA era

~igual à razão AT/GC ao trecho de DNA utilizado


Enzimas capazes de sintetizar moléculas de RNA a

partir de moléculas de DNA são denominadas de RNA

polimerases

A síntese de RNA ocorre sempre em uma direção

fixa iniciando na extremidade 5’ com término em

um nucleotídeo 3’ (5’ 3’)

Em bactérias somente uma RNApol sintetiza as três

classe de RNA. Em eucariotos.... Mais complicado!!!!!

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Existe uma polaridade 5’ 3’ na síntese de

moléculas do RNA (e também na replicação do DNA)

Existe polaridade na síntese de proteína ???

Carboxi terminal (C-terminal) Amino terminal (N-

terminal) ou vice versa?

Esta pergunta foi respondida utilizando uma técnica

de marcação radioativa denominada de pulso ou

marcação pulsada


Cultura de reticulócitos de coelho (eritrócitos imaturos)

produzindo grande quantidade de e - globina

Tratados com Cys (35S) por alguns segundos

Somente Globinas com cadeias completas foram

isoladas e digeridas com Tripsina (K-R)

Deteção de radiação dos fragmentos tripticos

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Região C-

terminal alto

teor de

radiotividade

Região N-

terminal

baixo teor de

radiotividade

Vermelhosem radição

Azulr adioativo

Setas= sítios de tripsina

Síntese proteíca N-terminal Carboxi terminal

1_introdução ao dna

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