Seqüenciamento de DNA

Profa. Dra. Aline Maria da Silva

Instituto de Química- USP

Bibliografia:

Recombinant DNA – James Watson & Michael Gilman

Guia de Rotas na Tecnologia do Gene – Matthew Walker & Ralph Rapley

Biologia Molecular Básica-Arnaldo Zaha

Seqüenciamento de DNA

Clivagem química ou Método de Maxam-Gilbert (utilizado apenas em situações especiais)

Método de Sanger: Terminação controlada da replicação

Manual

Automatizado

Método de Sanger

Reação da DNA Polimerase I

2´, 3´didesoxirribonucleotídeo trifosfato (ddNTP)

2, 3´didesoxirribonucleotídeo trifosfato (ddNTP) interrompe a reação de polimerização da cadeia de DNA

Sequenciamento método de SangerObtenção do molde: DNA dupla fita desnaturadoAnelamento do “primer” (iniciador) ao molde

Primer pode estar radioativamente marcado com 32P

Extensão do “primer”: dCTP, dGTP, dTTP e dATP + DNA polimerase

Terminação da síntese: adição dos ddNTPsNo sequenciamento automatizado cada um dos ddNTPs está

acoplado a um cromóforo fluorescente distinto

Separação dos fragmentos de DNA com 1base de diferença em eletroforese

Gel de poliacrilamida ou Capilar

Detecção dos fragmentos após eletroforeseAutorradiografia (sequenciamento manualLaser (sequenciamento automatizado)

Sequenciamento método de Sanger

Anelamento do “primer”

Extensão do “primer”

Terminação da síntese: adição dos ddNTPs

Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante

Autorradiografia

Eletroforese em gel de poliacrilamida separando fragmentos de DNA com 1 base de diferença

Autorradiograma de um gel de sequenciamento de DNA

Sequenciamento automatizado

Imagem de um gel de sequenciamento com detecção por fluorescência

Cromatograma: Sequenciamento automatizado com “dye terminators” (método da interrupção controlada

da replicação com ddNTPs)

Programa para montagem (PhredPhrapConsed)

Estratégia de sequenciamento do genoma humano

Nature 15 Feb 2001 409(6822)

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Análise de Sequências de genes e de genomas

Comparação da sequência obtida com sequências depositadas em Bancos de Dados de Sequências de DNA e Proteínas (www.ncbi.nlm.nih.gov)

Programa BLASTIdentificação de fases abertas de leitura (ORFs) na seqüência

de bases no caso de seqüências codificadorasAnálise de domínios proteicos na seqüência de aminoácidos

deduzida a partir da seqüência de basesIdentificação de regiões regulatórias (promotores, enhancers,

etc)Estabelecimento de relações filogenéticas entre a sequência de

interesse e sequencias similares de outros organismosEtc, Etc, Etc......

Bioinformática

Busca por comparação no GenBank com programa BLAST>geneXGGCACGAGGGAGAAGTTTGTGGTAGTAATAATAATAGTAATGAACAACCAATAAACGAAAATTTAAATATATAAAATATATTTAAAATAAAAATAAAAAATAAAACAAAACAAAACAAAACAAAAACAAAAAAAAATAAAAAGAGAAAGAAAATAAATAAAAATAAAATAATATAAATAAAAAAGAATGGAAATTGATTTAGATTCAATCATTACAAGATTATTGGAACCAAGAACTACAAAACCAGGTAAATTAGTTGATTTAGCAGAGGAGGAAATTAGATATTTAACAGTTCAAGCCACTGAAATCTTTATAAATCAACCAATTTTATTGGAATTAGAAGCACCAATCAAGATCTGTGGTGATATTCATGGACAATACTACGATTTACTTCGTCTCTTTGAGTACGGAGGATTCCCACCACAAAGTAATTATCTTTTTTTAGGTGATTATGTCGATCGTGGTAAGCAATCCTTAGAGACCATTTGTTTATTGTTGGCCTATAAAATCAAATATCCAGAGAACTTTTTCATTCTTCGTGGAAATCACGAATGTGCATCCATCAATCGTATCTATGGTTTTTACGATGAATGCAAGAGAAGATACAACAGCAAATTATGGAAAGCATTTACAGATTGCTTCAACTGTCTCCCAGTTGCAGCCATCATTGACGAGAAAATCTTTTGTATGCATGGTGGTCTCTCACCAGATCTCAAGAATATGGATCAAATTCGTAGAATCACTAGACCAACCGTTGTTCCAGATTTTGGTCTTTTATGTGATCTCTTGTGGGCTGATCCTGATAAAAACATTCAAGGTTGGGAAGATAATGACCGTGGTGTCTCCTATACTTTTGGTGCCGACGTTGTCGAATCATTCTTAAAGAAACACGATCTCGATTTAGTTTGTAGAGCTCATCAAGTTGTAGAAGATGGTTATGAATTCTTTGCTAAACGTCAATTGGTAACCCTCTTTTCCGCTCCAAATTACTTTGGTGAATTTGATAACGCTGGTGCTATGATGGGTGTCGATGAAACTTTAATGTGTTCATTCCAAATTTTAAAACCTGCCGATAAAAAAAAACTTACAAACGATAGTAATGGTAGACCATTAACTCCTCCAAGAAATAAACAACAAAAACCAAAAAAATAAATTAAAATAACTACTTTTTTAAAAAAAAAG

BLASTx no GenBank

Tradução em todas as 6 fases de leitura e busca contra banco de sequência de proteínas