FIGURA 4.1 Síntese semiconservativa do DNA. As duas fitas parentais se separam e cada uma é molde para a síntese de uma fita filha complementar. Portanto, os dois duplex filhos têm cada um uma fita parental e uma fita recém-sintetizada.

FIGURA 4.5Separação das fitas parentais em uma forquilha de replicação. Síntese de DNA ocorre em uma estrutura chamada forquilha de replicação, na qual as fitas parentais são separadas. Uma helicase é necessária para separar fitas parentais e permitir que a forquilha progrida. Proteínas que se ligam a DNA de fita simples (single-stranded DNA-binding proteins – SSB) são necessárias para manter as fitas separadas. As fitas parentais enrolam-se uma em torno da outra mais ou menos uma vez a cada 10,5 pb, e devemse desenrolar para se separarem; isso gera problemas topológicos. Note que uma das fitas em crescimento está orientada com sua extremidade 3’ voltada para a forquilha, enquanto a outra está orientada com sua extremidade 5’ voltada para a forquilha.

FIGURA 4.6 Resolvendo o problema de polaridade: síntese semidescontínua de DNA. Ambas as fitas são elongadas em suas extremidades 3’. A que tem sua extremidade 3’ voltada para a forquilha pode crescer continuamente; é chamada fita contínua ou líder. Como nenhuma DNA polimerase pode adicionar nucleotídeos à extremidade 5’ de uma cadeia em crescimento, a fita com sua extremidade 5’ voltada para a forquilha é feita como uma série de pequenos pedaços chamados fragmentos de Okazaki, cada um sintetizado na direção de 5’ para 3’, e depois unidos. Esta é chamada de fita descontínua, retrógrada ou tardia.

FIGURA 4.7Síntese de DNA em uma forquilha de replicação. (a) A fita contínua é elongada em sua extremidade 3’ por adições repetidas de nucleotídeos, como mostra a Figura 4.2. Um fragmento de Okazaki feito previamente, com um pequeno primer de RNA, é mostrado do outro lado. (b) Usando a fita parental como molde, primase sintetiza um primerde RNA (preto). (c) DNA polimerase estende covalentemente a extremidade 3’ do primerde RNA, incorporando desoxirribonucleotídeos (cinza médio), como mostra a Figura 4.2. (d) Quando o fragmento de Okazaki aproxima-se do fragmento sintetizado anteriormente, o primer de RNA do fragmento mais antigo é removido e a falha é preenchida por uma DNA polimerase que elonga o fragmento de Okazaki mais novo. Enquanto isso, a forquilha abre mais e primase sintetizou um novo primer. (e) Quando a falha foi preenchida e apenas uma quebra permanece, uma DNA ligase sela os dois fragmentos (dentro do círculo). Esse processo será repetido com o novo primer elongado, o primer antigo removido, a falha preenchida e a quebra selada.

FIGURA 4.10Braçadeiras corrediças. (a) Uma proteína de instalação da braçadeira (clamp-loading) se liga ao DNA. (b) O instalador de braçadeira organiza a braçadeira corrediça a partir de suas subunidades. (c) DNA polimerase associa-se com a braçadeira organizada e torna-se processiva. (d) Estrutura da braçadeira corrediça em células de mamíferos, um trímero de subunidades PCNA. O DNA passa livremente pelo grande buraco no centro do complexo.

FIGURA 4.12 Enzimas da replicação em E.coli. A fita contínua (acima) é elongada por pol III associada a uma braçadeira corrediça. O complexo DNA helicase/primase (DnaB/DnaG) move-se ao longo do molde para a fita tardia (abaixo); faz uma pausa para permitir que a DnaG sintetize um primer de RNA a cada 1000 a 2000 nt. Pol III elonga o primer até que ele alcance o primer do fragmento de Okazaki sintetizado anteriormente. Nesse momento, pol III libera o DNA e pol I se liga à extremidade do fragmento de Okazaki. Pol I remove o primer de RNA, um nucleotídeo de cada vez, usando sua atividade 5’-endonuclease e simultaneamente preenche a falha em um processo chamado “nick translation”. Quando há uma quebra remanescente com desoxirribonucleotídeos em ambos os lados, a DNA ligase pode selar a quebra.

FIGURA 4.11 Replicação de ambas as fitas num replissomo. Pela ligação de duas DNA polimerases juntas e a fita descontínua criando uma alça para que possa passar através do complexo, ambas as fitas podem ser feitas em um só lugar. O DNA passa pelo complexo, girando à medida que passa; o grande complexo protéico não precisa girar ao redor do DNA.

FIGURA 4.13 Enzimas replicando a fita tardia em eucariotos (a fita líder não é mostrada). (a) RPA, uma SSB, liga-se ao molde de fita simples que foi aberto pela progressão da forquilha de replicação. Um fragmento de Okazaki anterior é mostrado à direita, com o primer de RNA em cinza escuro. (b) A atividade da primase no complexo pol α/primase inicia a síntese de um primer de RNA. (c) Depois de o primer de RNA atingir 10 nucleotídeos, a atividade polimerase do complexo pol α/primase assume e elonga o primer com cerca de 15-30 desoxinucleotídeos. Então, pol α/primase dissocia-se. (d) RFC se liga à extremidade deste fragmento de Okazaki parcialmente completo e catalisa a montagem de uma braçadeira corrediça a partir de três moléculas de PCNA. (e) Pol δ se liga à braçadeira corrediça e elonga o fragmento de Okazaki. (f) À medida que o complexo de replicação aproxima-se do primer de RNA anterior, esse primer é degradado pela ação combinada de RNase H e FEN1. (g) A falha é preenchida pela continuação da elongação do fragmento de Okazaki. (h) A quebra remanescente é selada pela DNA ligase.

FIGURA 4.14 Replicons em seqüência e replicação bidirecional em eucariotos. (a) Há múltiplas origens de replicação (ori) organizadas em seqüência ao longo de cada cromossomo eucariótico. No homem, são espaçadas em intervalos de aproximadamente 50.000-100.000 pb. (b) Início ocorre em todas as origens (ori). Grupos adjacentes de oristendem a funcionar juntos. (c) Duas forquilhas de replicação divergentes são estabelecidas em cada ori, de modo que a replicação é bidirecional. As estruturas formadas são chamadas bolhas de replicação. (d) Bolhas de replicação aumentam, à medida que a replicação continua, até que fiquem bem próximas. Nesse estágio, o término da replicação une bolhas adjacentes e separa o DNA parental. Topoisomerase II é essencial para término e segregação dos cromossomos. (e) Os cromossomos duplicados resultantes podem, então, segregar em duas células filhas.

FIGURA 4.18 Telomerase. Telomerase é um complexo ribonucleoprotéico com uma fita curta de RNA, como parte integral; catalisa a adição de novas repetições teloméricas de 6-nt à extremidade 3’ de uma cadeia de DNA. O RNA da telomerase pareia parcialmente pelas bases com a repetição telomérica e serve de molde para a reação, enquanto o componente protéico funciona como uma transcriptase reversa, sintetizando DNA usando o RNA como molde. Depois da adição de uma repetição de seis nucleotídeos, a enzima pode se dissociar e se ligar novamente e adicionar novas repetições de 6-nt.

FIGURA 4.16 Ciclo celular. Em células eucarióticas, a replicação do DNA (fase S) e a mitose (fase M) são separadas por dois intervalos, G1 e G2. O tamanho dos segmentos representa a fração típica do tempo ciclo de divisão celular.

FIGURA 4.23 Lesão no DNA. (a) Deaminação oxidativa converte C em U. (b) Sítio AP. Despurinação (ou, menos freqüentemente, despirimidinação) é a clivagem de uma ligação glicosídica entre a posição 1´ do açúcar e a base. Isso deixa um sítio abásico ou AP, mas não quebra o esqueleto açúcar-fosfato. (c) O6-metil guanosina é uma lesão altamente mutagênica. (d) Luz ultravioleta leva à ligação entre piridinas adjacentes ao longo de uma das fitas do DNA. Um dímero de timina cis-syn ciclobutano é mostrado no esquema. (e) Um dímero ciclobutano é mostrado na dupla fita do DNA; o esqueleto é mostrado como um bastão para revelar a distorção das bases em ligação cruzada (circulado em preto) e bases complementares na outra fita.

FIGURA 4.25 Reparo por excisão de base. (a) O ponto danificado (bolinha colocada na fita (a)) é reconhecido por uma DNA glicosilase. (b) A base é removida por clivagem da ligação glicosídica que a conecta com o açúcar desoxiribose; o esqueleto açúcar-fosfato não é quebrado. Isso deixa um sítio AP. (c) O esqueleto açúcar-fosfato é clivado no lado 5’ do sítio abásico por uma AP endonuclease. Há também clivagem no lado 3’ desse sítio para remover o resíduo de açúcar; isso pode ser feito por algumas AP endonucleases ou por uma atividade de AP liase. (d) A falha de um único nucleotídeo é preenchida por uma DNA polimerase. (e) A quebra remanescente é selada por uma DNA ligase.

FIGURA 4.26Reparo por excisão do nucleotídeo. (a) A base danificada (pequena bolinha nas fitas (a) e (b)) é reconhecida por um complexo de reparo do DNA. (b) O segmento ao redor da base lesada é removido por um complexo enzimático que faz duas quebras na fita danificada, uma de cada lado da lesão. (c) Um oligonucleotídeo (27-29 nt no homem, 12-13 nt em E.coli) é liberado. (d) Ressíntese: uma DNA polimerase preenche a falha, usando a fita oposta como molde. (e) A DNA ligase sela a quebra remanescente.

FIGURA 4.28 Reparo de pareamento errado em E.coli. (a) Um par errado no DNA recém -replicado. A fita parental está metilada, mas nos primeiros minutos após sua síntese, a nova fita ainda não foi metilada; tal sítio, com apenas uma das fitas metilada, é chamada hemimetilado. (b) MutS e MutL ligam-se ao par errado. ATP é hidrolisado quando desloca uma pequena alça do DNA. (c, f) MutH se liga a um sítio hemimetilado (que poderia estar no lado esquerdo ou direito do par errado). (d, g) A fita não-metilada é quebrada e depois removida, estendendo-se para além do ponto do par errado. Isso pode ocorrer em qualquer direção (d e g). (e, h) A longa falha resultante é preenchida por uma DNA polimerase, adicionando nucleotídeos à extremidade 3’ da fita (preta). (i) A quebra remanescente é selada por uma DNA ligase (fita de (e) é mostrada). (j) Os sítios hemimetilados são metilados (fita de (h) é mostrada).

FIGURA 4.30Fotorreativação. (a) Fotoliase liga-se a um ciclobutano dímero de pirimidina; luz não é necessária para essa etapa. (b) O complexo absorve luz, o que resulta na clivagem das ligações unindo pirimidinas adjacentes. (c) A enzima então se dissocia do DNA

FIGURA 4.31Síntese bypass (translesão). (a) Lesão no molde geralmente faz parar DNA polimerases replicativas, uma vez que não podem adicionar nucleotídeo oposto a uma lesão não-codificadora ou com distorção na fita. (b) DNA polimerases especializadas, com especificidade relaxada (ver Tabela 4.2) podem inserir nucleotídeos opostos a lesões no molde permitindo, assim, ultrapassar (bypass) a lesão e sintetizar fitas filhas sem falhas. A especificidade relaxada e a falta de revisão dessas polimerases significam que erros (mutações em potencial) são freqüentemente introduzidos. Essas polimerases se dissociam facilmente do DNA, de modo que o comprimento do DNA que sintetizam é geralmente pequeno.

FIGURA 4.32Reparo de falha na fita filha. (a) Falhas ficam no DNA recém-replicado, onde forquilhas de replicação param devido a lesões. Como a lesão não tem DNA intacto oposto, não é substrato para reparo por excisão. (b) Recombinação permite que a fita parental isopolar (cinza-escuro) preencha a falha na fita filha (cinza-claro). Isso deixa uma falha na fita parental. (c) A falha na fita parental pode ser preenchida (preto) por uma DNA polimerase, porque há um molde intacto oposto. O resultado é reparo da falha na fita filha, mas a lesão permanece. Note que a lesão agora pode ser reparada por reparo de excisão, porque agora está oposta a uma fita intacta.

FIGURA 4.33 Regulação do reparo do DNA e recuperação em E. coli : a respos-ta SOS. (a) Em células não danificadas, um grupo de operons que constituem o regulon SOS é regulado por um repressor comum, LexA. Esse regulon inclui o próprio gene lexA (auto-regulação) e o gene recA, juntamente com muitos genes que codificam enzimas que agem reparando lesões. Há uma transcrição baixa, constitutiva de muitos desses genes, incluindo lexA e recA, mesmo quando a proteína LexA está presente. (b) Lesões bloqueiam forquilhas de replicação e, assim, deixam DNA fita-simples. RecA se liga a DNA fita-simples e é “ativada”. Nessa forma, ajuda na clivagem de LexA. Os fragmentos clivados de LexA não podem se ligar aos operado-res, de modo que todo o conjunto de operons é induzido. Muito mais RecA é feita, juntamente com outras proteínas, incluindo LexA. Enquanto existirem lesões, RecA permanecerá ativada, LexA continuará a ser clivada para que os operons permaneçam ligados. Quando as lesões são reparadas, RecA é “desativada” e não mais ajuda a clivar LexA, de modo que LexA ativa se acumula e desliga os genes desse regulon.