genética e melhoramento de plantas -...
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Genética e Melhoramento de
Plantas
Marcadores moleculares e sua utilização no melhoramento
Por: Augusto Peixe
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5 Introdução ao uso de Marcadores moleculares
Definição
Marcador molecular é todo e qualquer fenótipo molecular.
Exemplo: Fragmento de DNA (correspondente a regiões expressas ou não do genoma)
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5 As Técnicas Mais Comuns – Utilidade e Limitações
Marcador RFLP RAPD Microsatélites
Baseado em... Hibridação PCR PCR
Grau de polimorfismo Elevado Elevado Muito Elevado
Heritabilidade Codominante Dominante Codominante
Preço Elevado Baixo Elevado
Reprodutibilidade Elevado Baixo Elevado
Obtenção de dados Fácil Fácil Muito Fácil
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5 Algumas aplicações das Técnicas no Melhoramento Genético de Plantas
Mapeamento genético (RFLP, RAPD, AFLP, Microsatélite).Identificação da origem parental (Minisatélites ,
Microsátelite) Identificação e diferenciação de culturas de arroz, soja,
cevada, clones de cacau (RAPD). Na área florestal, por exemplo Eucalyptus, a identificação de
clones superiores a nível de DNA, é muito importante para resolver suspeitas ou dúvidas de identificação dos clones para a instalação correcta de campos de sementes clonais (RAPD).
Controle da eficiência da polinização, neste caso, a aplicação de marcadores está baseada na capacidade de discriminar o parentesco masculino (RAPD , Microsatélites).
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5 Algumas aplicações das Técnicas no Melhoramento Genético de Plantas (Cont…)
Verificar a diversidade genética de populações (por exemplo fungos e bactérias) em determinado ambiente (RFLP, RAPD, Isoenzimas, Minisatélites).
Identificação de genótipo de porta-enxertos de cítrus que apresentavam um comportamento fora do esperado em termos de produtividade ou tolerância ao stress (Marcadores isoenzimáticos)
Verificação do grau de parentesco: RFLP e Microsatélites (marcadores co-dominantes) são mais indicados por serem marcadores co-dominantesdisponibilizando maior informação genética, porém, o seu alto custo muitas vezes não justifica.
Empresas produtoras de híbridos têm utilizado os marcadores para identificação de suas variedades com a finalidade de proteger suas patentes(RAPD, Microsatélite).
Determinação da distância genética de linhagens homozigóticos para prever o comportamento de híbridos em arroz e melão (RAPD e Microsatélites).
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5 Material de Base (DNA)
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CTAB (Cetyltrimethylammonium bromide)-Detergente catiónico age solubilizando as membranas celulares.
NaCL(Cloreto de Sódio)-Ajuda a solubilização do CTAB e a acção deste.É necessário também para ajudar o álcool a precipitar o DNA.
Reagentes protectores da molécula de DNAEDTA(Ethylenediaminetetraacetate)-As enzimas que degradam o DNA necessitam de Mg2+ e Ca2+ para o fazerem ,assim o EDTA forma quelatoscom estes metais ficando assim indisponíveis para as enzimas degradarem o DNA.
PVP (Polyvinylpyrrolidone)-É um antioxidante.Ele evita a oxidação de compostos fenólicos tais como o tanino, quinona e polifenóis.
β-mercaptoetanol-Protege o DNA das actividades das enzimas(peroxidases,polifenoloxidases) que o degradariam ,desnaturando-as.
Função dos componentes do tampão de extracção de DNA
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5 Técnica de Base (PCR)PCR (Reacção em cadeia da polimerase)-Esta tecnologia foi
concebida por Kary Mullis em meados da década de 80.
Esta técnica poderosa envolve a síntese em vitro de milhões de cópiasde um segmento específico de DNA na presença da enzima DNA polimerase utilizando um par de primer específico.
O passo decisivo para a expansão do PCR ocorreu quando Saiki et al.(1988) isolaram uma DNA polimerase (taq polimerase)de uma bactéria (Thermus aquaticus) que vive em fontes térmicas, polimerisa a 72ºC,mantendo assim a actividade por algumas horas a 95ºC.
Um ciclo de PCR envolve 3 etapas num aparelho chamado Termociclador:
-Desnaturação- abertura da fita dupla de DNA devido a temperatura de 92ºC a 95ºC.
-Emparelhamento temperatura é reduzida rapidamente para 35ºC a 60ºC,permitindo a hibridação do primer a fita de DNA.
-Extensão-a temperatura é elevada para 72ºC para que a enzima DNA polimerase realize a extensão adicionando nucleotídos.
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pcr
PCR Animação
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5 RAPD
RAPD(Polimorfismo de DNA amplificado ao acaso)é uma técnica baseada em PCR elaborada e patenteada por Williams et al(1990) nos Estados Unidos.
A técnica possui 2 características distintas do protocolo de PCR :-1ª-Utiliza um único primer-2ª-O primer único tem sequência arbitrária , portanto sua sequência
alvo é desconhecida.
O produto da reacção de RAPD realizada no termociclador éaplicado em gel de eletroforese.
Cada primer utilizado dirige a síntese de vários segmentos de DNA simultâneamente em diversos pontos do genoma, resultando assim de várias bandas no gel
A grande quantidade de DNA é visualizada com brometo de etídioem luz ultra violeta
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5 Etapas da técnica de RAPD
1. Extracção de DNA
2. Quantificação de DNA extraído
3. Padronização da concentração de DNA para PCR
4. Reacção de PCR
5. Electroforese
6. Coloração com brometo de etídio e visulização das bandas
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5 RAPD
Dominância dos marcadores RAPDUma característica fundamental dos marcadores RAPD é o facto deles se comportarem como marcadores dominantes,ou seja,as bandas que se vêm no gel só aparecem devido a presença de pelo menos um alelo dominante no loco.Quando se têm 2 alelos recessivos no loco a banda não aparece no gel porque não foi amplificada,isto porque, a técnica só amplifica locos com alelos dominantes.Este facto constitui uma desvantagem desta técnica .
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5 Microsatélites (SSR)
Microsatélite é uma técnica que foi desenvolvida no início dos anos 80. É uma variação da técnica de PCR, por isso utiliza 1 par de primersespecíficos.Esta técnica amplifica segmentos curtos (1 a 4 nucleotídeos)de DNA que se encontram repetidosao longo do genoma .
Estes segmentos curtos repetitivos do genoma não são expressos em proteínas porém são úteis porque como estão dispersos no genomaapresentam nos géis um alto grau de polimorfismo .
Esta técnica diferencia um indivíduo heterozigotico de um homozigotico, portanto os marcadores são codominates.
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5 Etapas da técnica de SSR
1. Extracção de DNA
2. Quantificação de DNA extraído
3. Padronização da concentração de DNA para PCR
4. Reacção de PCR
5. Electroforese
6. Coloração com brometo de etídio e visualização das bandas
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5 RFLP(Polimorfismo no Comprimento de Fragmento de Restricção)
Esta técnica detecta polimorfismo através de cortes na fita dupla de DNA gerando uma grande quantidade de fragmentos.A base genética do polimorfismo observado resulta assim de mutações nos sítios de restrição ou de inserções , deleções ou rearranjos entre estes sítios.RFLP são marcadores de expressão co-dominante por isso pode-se distinguir genótipo heterozigoto de um homozigoto.
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5 Etapas da técnica de RFLP1. Extracção de DNA
2. Corte da fita dupla de DNA com enzimas de Restrição
3. Gel agarose (neste gel não se pode ver as bandas separadamente,por serem muitas)
4. Passagem das bandas para membrana de nitrocelulose por capilaridade
5. Fixação das bandas de DNA na membrana
6. Hibridização da sonda aos fragmentos complementares de DNA
7. Exposição das sondas a um filme de raio X num processo chamado autoradiografia ,revelando as bandas de DNA.
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5 Formas de obtenção de sondas para Técnica de RFLP
Transcrição reversa de RNA mensageiro produzindo cDNA(DNA complementar)
Amplificação via PCR de sequências conhecidas utilizando primers específicos
Através de bandas RAPD seleccionadas e obtidas de gel de electroforese e amplificadas e amplificadas via PCR
Nota: As sondas são marcadas com fósforo radioactivo que emitirão particulas β ou fotóns de luz que permitirão visualizar as bandas ,no processo de autoradiografia.
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5 Limitações dos Marcadores Moleculares
Métodos de extracção de DNAAusência de polimorfismoEscolha da técnicaPoucos Linkage mapsCusto das técnicas