virologia ano lectivo 2010/11 técnicas diagnóstico virologia – parte i

VirologiaAno Lectivo 2010/11

Técnicas Diagnóstico Virologia – Parte I

Testes imunológicos Baseiam-se em reacções antígeno-anticorpo:

Anticorpos – molécula solúvel produzida por plasmócitos durante

a reposta imune humoral, com capacidade de se ligar

especificamente a um epítopo de um antígeno.

Antigénio – qualquer substância ou molécula estranha capaz de

induzir uma resposta imune no hospedeiro e/ou capaz de se ligar

através do(s) seu(s) epítopo(s) a um anticorpo.

Aula 3 - Técnicas Diagnóstico Virologia - Parte I 2

Anticorpo Cadeias de glicoproteícas :

Cadeias leves Cadeias pesadas

Região constante – local de activação de outros elementos dos S. Imune;

Região variável – local de ligação ao antigénio


AnticorpoTipos de anticorpos

PoliclonaisObtidos a partir de diferentes clones de células;

MonoclonaisObtidos a partir de um único clone de plasmócitos


Classes de anticorpos no Homem


Imunoglobulinas Características

IgG Principal Ig sérica Envolvida na activação do complemento e na opsonisação

IgM Primeiro Ac a ser produzido (fase aguda)Confinada aos vasos sanguíneos e tecidos inflamados

IgA Presente no soro, secreções e mucosasTem funções de opsonização.

IgD Encontra-se na membrana de linfócitos B, funcionando como receptor de antigénios.Funções pouco definidas.

IgE Desencadeia a liberação de histaminas dos mastócitos, basófilos e eosinófilos.Responsável pelas alergias. Confere protecção contra parasitas.

http://saber.sapo.ao/wiki/Imagem:Mono-und-Polymere.svg





Antígeno

Epítopo

Região do antígeno que reage com o anticorpo

Possibilidade de reacções cruzadas

Pequenas alterações na estrutura do antígeno,

entre outras factores, podem afetar

profundamente a ligação com o anticorpo


Aplicabilidade

Papel importante:

Tipo de amostra varia conforme o

que queremos pesquisar


Diagnóstico

Monitorização

Tratamento

http://images.google.pt/imgres?imgurl=http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/5/52/Urinbecher.jpg/180px-Urinbecher.jpg&imgrefurl=http://www.encyclopaedia.es/pt/wiki/Urina.html&usg=__VHEeTsDbQ8EzFiob_OPgaY9scG0=&h=224&w=180&sz=6&hl=pt-BR&start=2&um=1&tbnid=5rGehgDoGxhixM:&tbnh=108&tbnw=87&prev=/images?q=urina&um=1&hl=pt-BR&rlz=1T4ADBF_pt-BRPT304PT304&sa=N

Técnicas de Imunologia

Reacções Imunoenzimáticas

ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent assay)

ELFA (Enzyme Linked Fluorescent Assay)

Imunofluorescência

Imunocromatografia

ImunoHisto/Citoquímica

Análise Proteínas: Western Blot


Reacções Imunoenzimáticas


ELISA

Permite determinar a concentração do analito

Calcular curva de calibração – interpolar a concentração da molécula a quantificar


Baseia-se numa reação imunoenzimática com detecção final por espectrofotometria

Tipos de ELISA

Sandwich


1. Poços revestidos com anticorpo especifico

2. Formação de complexos

3. Ac Secundário (conjugado com a enzima)

4. Adição do substrato

5. Medição por espectrofotometria

Tipos de ELISA

Indireto


1. Poços revestidos com antígeno específico

2. Formação de complexos

3. Ac conjugado com enzima



Tipos de ELISA

Competitivo


1. Ac específicos incubados com a amostra

2. Adição dos complexos formados a placa revestida com Ag

3. Ac secundário



Quanto maior a concentração de analito menor a absorbância

ELISA

Método automatizado


ELFA

Permite fazer um análise quantitativa Curva de calibração


Reação imunoenzimática com detecção final por fluorescência.

ELFA

Teste, geralmente, automatizado onde é

necessário:

Um cone sensibilizado com Ag, serve,

tanto de fase sólida como sistema de

pipetagem

Uma barrete que contem os

reagentes necessários para a

realização da técnica


Imunofluorescência


Imunoflurescência


Os Ac ou Ag especificos estão marcados com fluorocromos

O resultado é visualizado ao microscópio de fluorescência A luz UV excita os fluorocromos havem emissão de fluorescência

Fluorocromos mais usados Fluoresceína (isotiocianato de fluoresceína – FITC) Rodamina

Imunoflurescência


Dependendo da técnica pode-se fazer uma análise qualitativa ou semi-

quantitativa

Alta sensibilidade(fluorescência é mais intensa) e especificidade.

Tipos de Imunoflourecênca

Directa

Indirecta

Anti-complemento

Imunofluorescência Indireta


Etapas

▫ Fixação (quando queremos

pesquisar Ac as laminas vêm

revestidas com o respectivo Ag);

▫ Ac primário

▫ Ac Secundário (marcado com um

fluorocromo);

▫ Reagente de contraste

Imunofluorescência anti-complemento


Etapas

▫ Inactivação do complemento endógeno

▫ Formação do complexo antigénio-anticorpo

▫ Adição do complemento que se liga ao complexo formado

▫ Ac conjugado que se liga ao complemento

▫ Detecção por microscopia de fluorescência

Imunofluorescência


Resultados

Permite localizar o analito

EX: Membrana celular

Análise com o corante de contraste

Imunofluorescência


Resultados

Pesquisa de anticorpos: resultado positivo

(fluorescência verde)

Pesquisa de anticorpos: resultado negativo

http://www.anemia-infecciosa-aviaria.com/disease/cav-pos.asp

Imunocromatografia


Imunocromatografia


Teste qualitativo

Detecção antigénios virais ou anticorpos

Rápido e simples

Fase móvel: amostra diluida

Fase sólida: membrana revestida

Imunocromatografia


Dispositivo com membrana revestida com Ag ou Ac nas zonas T e C

Utilização de Ac específicos marcados com partículas de látex

Ac secundários ligados à membrana – formação de complexos visíveis devido às partículas de látex



Imunologia e citologia ou histologia

Estudar a presença ou ausência antigénios (partículas virais, proteínas)

Diferenças de expressão de proteínas

Localização celular do antigénio

Método qualitativo (maior parte dos casos)

Quantificação relativa



Método directo Ac primário marcado enzimaticamente reage directamente

com o antigénio

Método Indirecto Ac primário que se liga ao antigénio Ac secundário marcado enzimaticamente

Enzima (mais utilizada): peroxidase (PO)



Principio do método

PO+ H2O2+ Dador de electrões PO+ H2O2+ precipitado



Passos importantes

Fixação (sol. Alcoólica)

Permeabilizar (detergente)

Ac primário

Ac secundário conjugado

Substrato com agente cromogénio

Corante de contraste

Imunohistoquímica


Imunohistoquímica

http://cancerres.aacrjournals.org/content/69/22/8718/F5.large.jpg

Imunocitoquímica


Imunocitoquímica

Análise Proteínas


Western Blot


SDS-PAGE (PolyAcrylamide Gel Electrophoresis)

Western Blot


Blotting

Western Blot


Detecção

1. Bloqueio da

membrana

2. Ac primário

3. Ac secundário

conjugado

4. Detecção

Western Blot


Aplicação

VirologiaFonte: slideshare: aula02-tecnicas-diagnostico-virologia-parte-1&user_login=HugoSousa1

Técnicas Diagnóstico Virologia – Parte I

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