Apresentao do PowerPoint

Mestrado Integrado em Cincias FarmacuticasVirologia - 29 de Maio de 2015Carina Maia Turma L2| Jeane Cristine Meneses | Joana Pedroso Turma L8 Journal Club

Journal of Clinical Virology 42 (2008) 6569

1Objetivos2

Comparar os resultados obtidos quando se usam dois tipos de amostras para a deteo do vrus Influenza A e B e do RSV: aspirado nasofarngeo (NPA) e flocked swabs nasofarngeas (NPFS).

Verificar qual das amostras permite um diagnstico mais exato

A qualidade da amostra um passo essencial para fazer a deteo de vrus e o subsequente diagnstico de uma infeo vrica.

NPFS - nasopharyngeal flocked swabe uma zaragatoa especialeles recolhem celulas da faringe com essa zaragatoae NPA - nasopharyngeal aspirate um aspirado nasofaringeo e eles estao a comparar os dois metodospara ver com qual dos dois se obtem as melhores amostras para depois se poder fazer analises

2Importncia3Deteo de antignios virais e mtodos baseados em tcnicas de PCR Tcnicas de diagnstico mais usadas atualmenteA qualidade da amostra importante pois influencia a sensibilidade da tcnica e consequentemente a deteo dos vrus.

Deteco de antgeno um mtodos que tm sido frequetemente utilizado para rpida deteco viral ou seja diagnostico , mas os mtodos baseados em PCR esto agora a ser mais utilizado. Em todos estes mtodos, o tipo e qualidade do amostra clnica de extrema importncia. Nasopharyngealaspirados (NPA) so geralmente considerados os melhores exemplares para a deteco rpida de vrus respiratrios . No entanto, obteno NPA desagradveis para o paciente, requer equipamentos especializado e um operador qualificado para a colheita da amostra e tambm dificil de obter em out-paciente (ambulatorio) a zaragatoa nasofaringeal (NPS)tem sido demostrados melhores resultados comparativamente ao NPA contudo estes resultados tem sido controversos. Normalmente o NPS tem menos celulas epiteliais (do que o NPA) para detecao directa de antigenio por IF assay34So os melhores exemplares para a deteco rpida de vrus respiratrios. A obteno desagradvel para o paciente, requer equipamentos especializados; Operador qualificado para a colheita da amostra; difcil de obter em pacientes em ambulatrioAspirados Nasofarngeos (NPA)

Mtodos de Obteno das AmostrasMtodos de Obteno das AmostrasA comparao entre zaragatoas nasofarngeas e aspirados nasofarngeos ainda controversa: Alguns estudos indicam que com um swab nasofarngeo se conseguem obter resultados comparveis aos obtidos pelo NPA; As amostras obtidas por NPS tm menos celulas epiteliais do que o NPA (importante para detecao directa de antigenio por ensaio de imunofluorescncia) Zaragatoas (swabs) Nasofarngeos (NPS)5

Deteco de antgeno um mtodos que tm sido frequetemente utilizado para rpida deteco viral ou seja diagnostico , mas os mtodos baseados em PCR esto agora a ser mais utilizado. Em todos estes mtodos, o tipo e qualidade do amostra clnica de extrema importncia. Nasopharyngealaspirados (NPA) so geralmente considerados os melhores exemplares para a deteco rpida de vrus respiratrios . No entanto, obteno NPA desagradveis para o paciente, requer equipamentos especializado e um operador qualificado para a colheita da amostra e tambm dificil de obter em out-paciente (ambulatorio) a zaragatoa nasofaringeal (NPS)tem sido demostrados melhores resultados comparativamente ao NPA contudo estes resultados tem sido controversos. Normalmente o NPS tem menos celulas epiteliais (do que o NPA) para detecao directa de antigenio por IF assay56Zaragatoas modificadas com objetivo de aumentar o n de clulas epiteliais colhidas e consequentemente proporcionar um melhor diagnstico. Proporcionam amostras clnicas melhores quando comparados com zaragatoas convencionais. Ainda no h comparaes em relao ao aspirado nasofarngeo Flocked-nasopharyngeal swab (NPFS)

Mtodos de Obteno das Amostras

Protocolo do estudo aprovado pelo comit de tica do hospital Queen Mary. Consentimento informado obtido antes dos indivduos serem recrutadosRecolha das Amostras7PACIENTES: 196 crianas de idade inferior a 18 anos que foram hospitalizadas com infeces agudas do trato respiratrio no hospital Queen Mary no perodo entre Fevereiro a Maio de 2007 Para cada paciente colheu-se um aspirado nasofarngeo (NPA) de uma narina e uma flocked swab (NPFS) da outra

Cento e noventa e seis crianascom menos de 18 anos foram hospitalizadas com infeces agudas do trato respiratrio em Queen Mary hospitalar no perodo de fevereiro a maio de 2007 . O protocolo do estudo foi aprovado pelo comit de tica de Queen Mary Hospital e consentimento informado por escrito antes do inicio do estudo. NPA e NPFS foram recolhidos em paralelo de cada paciente. O amostra NPA foi recolhida de uma narina e os NPS de outra. Inicialmente, as crianas foram distribuidas aleatoriamente de modo que o NPA(seja recolhido em 1 em 50% das crianas) e o NPS (em 1 nas outras 50%). No entanto, a anlise intercalar antecipado revelou que houve uma diferena minima em ser o NPA 1 ou NPS 1. Assim, posteriormente, oordem de amostragem foi deixada preferncia do enfermeiro. O NPFS foi recolhido da seguinte maneira. Mediu-se s distncia entrenarinas do paciente e o lbulo da orelha para calcular comprimento de insero. A zaragatoa foi gentilmente inserido na narina no sentido da faringe ate se sentir resistencia, em seguida, foi rodado trs vezes para se obter as clulas epiteliais. A zaragatoa foi ento retirado e colocado em 2,5 ml de transporte viral mdio. NPA foi recolhido recorrendo a 1 kit aspirador de suco em vacuo. As amostras foram mantidos frescas (AINDA NO FORAM ALTERADAS FRIO??) foram entregue ao laboratrio dentro de 3 h depois da colheita. No laboratrio, tanto NPA e NPFS foram divididos em duas alquotas e tratadas de um modo idntico. Uma aliquota foi usada para o teste IFD e o outro foi usado para ensaios de PCR e, no caso de NPA,alem dos 2 metodos tambm para a cultura. O volume original de NPA foi registado e este foi utilizado para clculo da quantidade absoluta de vrus presente na amostra quando analise quantitativa PCR foi feito em tempo real.

Interim analysis - Inclinical trialsand other scientific studies, aninterim analysisis an analysis of data that is conducted before data collection has been completed7Recolha das Amostras8

Recurso a um aparelho de suco em vcuo. Colheita para frasco com 2,5ml de meio de transporte Colheita do aspirado nasofarngeo:Clculo da distncia entre as narinas e o lbulo da orelha do paciente para saber a profundidade da inseroInsero da zaragatoa na narina em direo faringe at se sentir resistncia. Zaragatoa foi rodada 3x para se obterem clulas epiteliaisZaragatoa mergulhada em 2,5ml de meio de transporteColheita da flocked swab

Cento e noventa e seis crianascom menos de 18 anos foram hospitalizadas com infeces agudas do trato respiratrio em Queen Mary hospitalar no perodo de fevereiro a maio de 2007 . O protocolo do estudo foi aprovado pelo comit de tica de Queen Mary Hospital e consentimento informado por escrito antes do inicio do estudo. NPA e NPFS foram recolhidos em paralelo de cada paciente. O amostra NPA foi recolhida de uma narina e os NPS de outra. Inicialmente, as crianas foram distribuidas aleatoriamente de modo que o NPA(seja recolhido em 1 em 50% das crianas) e o NPS (em 1 nas outras 50%). No entanto, a anlise intercalar antecipado revelou que houve uma diferena minima em ser o NPA 1 ou NPS 1. Assim, posteriormente, oordem de amostragem foi deixada preferncia do enfermeiro. O NPFS foi recolhido da seguinte maneira. Mediu-se s distncia entrenarinas do paciente e o lbulo da orelha para calcular comprimento de insero. A zaragatoa foi gentilmente inserido na narina no sentido da faringe ate se sentir resistencia, em seguida, foi rodado trs vezes para se obter as clulas epiteliais. A zaragatoa foi ento retirado e colocado em 2,5 ml de transporte viral mdio. NPA foi recolhido recorrendo a 1 kit aspirador de suco em vacuo. As amostras foram mantidos frescas (AINDA NO FORAM ALTERADAS FRIO??) foram entregue ao laboratrio dentro de 3 h depois da colheita. No laboratrio, tanto NPA e NPFS foram divididos em duas alquotas e tratadas de um modo idntico. Uma aliquota foi usada para o teste IFD e o outro foi usado para ensaios de PCR e, no caso de NPA,alem dos 2 metodos tambm para a cultura. O volume original de NPA foi registado e este foi utilizado para clculo da quantidade absoluta de vrus presente na amostra quando analise quantitativa PCR foi feito em tempo real.8Recolha das Amostras9

Cento e noventa e seis crianascom menos de 18 anos foram hospitalizadas com infeces agudas do trato respiratrio em Queen Mary hospitalar no perodo de fevereiro a maio de 2007 . O protocolo do estudo foi aprovado pelo comit de tica de Queen Mary Hospital e consentimento informado por escrito antes do inicio do estudo. NPA e NPFS foram recolhidos em paralelo de cada paciente. O amostra NPA foi recolhida de uma narina e os NPS de outra. Inicialmente, as crianas foram distribuidas aleatoriamente de modo que o NPA(seja recolhido em 1 em 50% das crianas) e o NPS (em 1 nas outras 50%). No entanto, a anlise intercalar antecipado revelou que houve uma diferena minima em ser o NPA 1 ou NPS 1. Assim, posteriormente, oordem de amostragem foi deixada preferncia do enfermeiro. O NPFS foi recolhido da seguinte maneira. Mediu-se s distncia entrenarinas do paciente e o lbulo da orelha para calcular comprimento de insero. A zaragatoa foi gentilmente inserido na narina no sentido da faringe ate se sentir resistencia, em seguida, foi rodado trs vezes para se obter as clulas epiteliais. A zaragatoa foi ento retirado e colocado em 2,5 ml de transporte viral mdio. NPA foi recolhido recorrendo a 1 kit aspirador de suco em vacuo. As amostras foram mantidos frescas (AINDA NO FORAM ALTERADAS FRIO??) foram entregue ao laboratrio dentro de 3 h depois da colheita. No laboratrio, tanto NPA e NPFS foram divididos em duas alquotas e tratadas de um modo idntico. Uma aliquota foi usada para o teste IFD e o outro foi usado para ensaios de PCR e, no caso de NPA,alem dos 2 metodos tambm para a cultura. O volume original de NPA foi registado e este foi utilizado para clculo da quantidade absoluta de vrus presente na amostra quando analise quantitativa PCR foi feito em tempo real.

No caso das amostras de aspirado nasofarngeo anotou-se o volume para fazer quantificao absoluta da carga viral por qPCR. Uma das alquotas do aspirado nasofarngeo foi posteriormente usada em culturas celulares.

9Imunofluorescncia Direta (IFD)

10Amostra: 196 aspirados nasofarngeos (NPA) e 196 zaragatoas da nasofaringe (NPFS)

Kit utilizado: IMAGEN Respiratory Screen (Oxoid Ely Ltd., UK)

http://www.oxoid.com/UK/blue/prod_detail/prod_detail.asp?pr=K612011&c=UK&lang=EN (22-05-2015)http://www.thermoscientific.com/content/tfs/en/product/oxoid-imagen-respiratory-virus-screen.html (22-05-2015)10Imunofluorescncia Direta (IFD)11

The nasopharyngeal aspirate was resuspended in virus transport medium and centrifuged, and the cell pellet was resuspended in phosphate-buffered saline and washed by repeated cycles of centrifugation until free of visible mucus. The cell pellet was then spotted on 6-mm wells of Teflon-coated slides, air dried, and fixed in ice-cold acetone for 10 min. The smears were stained with Imagen respiratory screen influenza virus type A and B reagents (Dako, Glostrup, Denmark) and viewed at a magnification of 400 under epifluorescent illumination using the fluorescein isothiocyanate (FITC) filter of a Nikon fluorescent microscope. If a specimen with 20 columnar epithelial cells in the nasopharyngeal aspirate smear was negative by immunofluorescence, the specimen was considered to have insufficient respiratory epithelial cells, and such specimens were reported as indeterminate FROM: K. H. Chan, N. Maldeis, W. Pope, A. Yup, A. Ozinskas, J. Gill, W. H. Seto,K. F. Shortridge, and J. S. M. Peiris. Evaluation of the Directigen FluAB Test for Rapid Diagnosis of Influenza Virus Type A and B Infections

1. The collection and preparation of specimens is of fundamental importance in the diagnosis of respiratory virus infection by direct immunofluorescence and cell culture methods. Specimens must be collected from the site of infection during the time of peak viral shedding so that they contain as much infected material as possible and prepared in such a way as to preserve either intact cells which are free from adherent mucus etc for direct microscopy of specimens or the viability of viruses in specimens to be cultured.11Imunofluorescncia Direta (IFD)12Controlo positivo (clulas infetadas com uma estirpe de controlo de cada um dos vrus)Controlo negativo (clulas no infetadas)

Imagem retirada de: http://www.thermoscientific.com/en/product/oxoid-imagen-respiratory-screen-positive-negative-control-slide.html (26-05-2015)Reagente de Screening:

Reagente de controlo negativoInformao retirada de. http://www.thermoscientific.com/content/dam/tfs/SDG/MBD/MBD%20Documents/Instructions%20For%20Use/IMAGEN/Respiratory%20Screen/X7852.pdf (Acesso a 24-05-2015)The nasopharyngeal aspirate was resuspended in virus transport medium and centrifuged, and the cell pellet was resuspended in phosphate-buffered saline and washed by repeated cycles of centrifugation until free of visible mucus. The cell pellet was then spotted on 6-mm wells of Teflon-coated slides, air dried, and fixed in ice-cold acetone for 10 min. The smears were stained with Imagen respiratory screen influenza virus type A and B reagents (Dako, Glostrup, Denmark) and viewed at a magnification of 400 under epifluorescent illumination using the fluorescein isothiocyanate (FITC) filter of a Nikon fluorescent microscope. If a specimen with 20 columnar epithelial cells in the nasopharyngeal aspirate smear was negative by immunofluorescence, the specimen was considered to have insufficient respiratory epithelial cells, and such specimens were reported as indeterminate FROM: K. H. Chan, N. Maldeis, W. Pope, A. Yup, A. Ozinskas, J. Gill, W. H. Seto,K. F. Shortridge, and J. S. M. Peiris. Evaluation of the Directigen FluAB Test for Rapid Diagnosis of Influenza Virus Type A and B Infections

1. The collection and preparation of specimens is of fundamental importance in the diagnosis of respiratory virus infection by direct immunofluorescence and cell culture methods. Specimens must be collected from the site of infection during the time of peak viral shedding so that they contain as much infected material as possible and prepared in such a way as to preserve either intact cells which are free from adherent mucus etc for direct microscopy of specimens or the viability of viruses in specimens to be cultured.12Imunofluorescncia Direta (IFD)13Reagentes consistindo em anticorpos monoclonais purificados direcionados contra protenas especficas dos diferentes vrus.

http://www.thermoscientific.com/content/dam/tfs/SDG/MBD/MBD%20Documents/Instructions%20For%20Use/IMAGEN/Parainfluenza%20virus%20Types%201,%202%20and%203/X7849.pdf 13Reverse Transcriptase quantitative PCR14Amostras: 196 aspirados nasofarngeos (NPA) e 196 zaragatoas da nasofaringe (NPFS)Pesquisa de Influenza A e B e de RSV por RT-qPCR. Deteo da carga viral.

Two step Reverse Transcriptase PCR combinado com um real time PCR (qPCR)Imagem retirada de http://en.wikipedia.org/wiki/Reverse_transcription_polymerase_chain_reaction#Two-step_RT-PCR (24-05-2015) 14

15

Extrao de cidos nucleicos totais

Retirado de: http://www.biomerieux-usa.com/clinical/nuclisens-easymag (Acesso a 23-05-2015)Reverse Transcriptase quantitative PCR

NicliSENS esay MAG is na IVD-labeled automated system for total nucleic acid extraction from a variety of sample types and volumes. The NucliSENS easy MAG is a breakthrough platform specifically optimized for total nuclei acid extraction from biological samples. The system automates na enhanced magnetic silica versoon of bioMrieuxs proprietary BOOM technoloy a gold standard for the universal extraction of RNA and DNA.

Introduo do tampo de buffer amostra. Introduo de slica magntica. Um sistema patenteado que usa magnetes consegue manipular eficazmente a slica. Posteriormente h uma lavagem de forma a purificar o acido nucleico ligado silica. A ponta do equipamente esta especialmente desenhada para ficar alinhada com o poo que recolhe a amostra de forma a evitar contaminao. Posteriormente h uma eluio (mistura-se a silica magntica no tampo, faz-se aquecimento e h um laser que detecta o liquido que passa ao longo do processo para garantir a qualidade). Posteriormente h remoo da silica magntica e obtem-se um produto de eluio purificado apenas com cidos nucleicos. 1516Reverse Transcriptase quantitative PCR

16Reverse Transcriptase quantitative PCR17

12L RNAPrimers aleatrios

Imagem retirada de: https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/18064014 (Acesso a 23-05-2015)cDNA

SuperScript II reverse transcriptase5 is a point mutant of Moloney murine leukemia virus RT (M-MLV RT) engineered to be RNase H-. Like M-MLV, it is a DNA polymerase that synthesizes a complementary DNA strand from singlestranded DNA, RNA, or a RNA:DNA hybrid. But compared with wild type RTs, SuperScript II delivers higher yields of full-length cDNAsuperior performance that enhances results in all your experimentsIn wild type RTs such as M-MLV and AMV, RNase H activity competes with 53 DNA polymerase activity for the hybrid formed between the RNA template andthe DNA primer. This competition inhibits the elongation of template-primer complex, resulting in lower yields of cDNA. RNase H activity also acts to diminish the yield and reduce the size of the cDNA by hydrolyzing the RNA template as chain growth occurs. The elimination of RNase H activity allows higher yields and significantly greater full-length cDNA. Youll typically achieve >50% more full-length cDNA synthesis and substantially greater yields of first-strand synthesis than obtained with AMV RT or M-MLV RT.

The point mutations leading to inactivity of the RNase H domain in SuperScript II RT also improve the temperature stability, allowing first-strand synthesis at temperatures as high as 50CReverse transcription at higher temperatures improves cDNA synthesis from RNA that has high GC content or secondary structure, or both. With higher thermostability than wild type RTs, SuperScript II lets you meet these challengeswhile giving you the high yield and full length you need.

RNase H (Ribonuclease H ) is an endoribonuclease that specifically hydrolyzes the phosphodiester bonds of RNA which is hybridized to DNA. This enzyme does not digest single or double-stranded DNA17Reverse Transcriptase quantitative PCR18

F forward primerR reverse primer

Os tempos para cada fase foram retirados das respectivas referncias que esto indicadas no artigo.

Influenza A: The virus has segmented RNA genome and 7th segment, M gene, encodes 2 proteins. M1 is a matrix protein and M2 is a membrane protein. The M gene may be involved in determining host tropism. Besides, novel vaccines targeting M1 or M2 protein to confer cross subtype protection have been under development

Influenza B: Nonstructure protein gene 8 Os virus influenza tem um genoma segmentado constitudo por 8 cadeias de RNA singe stranded e linear. A protena no estrutural NS1 codificada por influenza A, B e C.

Adenovirus tem um genoma constitudo por uma molecula de DNA linear, de dupla cadeia e no segmentada. O hexon gene codifica para a protena da cpside II (protena estrutural).

RSV: single strand RNA negative polarity. L gene codifica para a RNA polimerase do RSV.

NOTA: no quer dizer que os autores amplificaram o gene todo podem ter amplificado uma pequena sequencia desse gene.

1819

2L cDNA (Influenza A, B e RSV) ou 5L de (ds)DNA para Adenovrus FastStart DNA Master SYBR Green I Mix reagent kit (Roche Diagnostics GmbH, Germany)0,5M de cada primerMgCl2Fluorescence was monitored once at each cycle at the end of the annealing phase.

Imagem retirada de: http://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/sybr-green-qpcr.html (Acesso a 24-05-2015)Reverse Transcriptase quantitative PCR

Imagem retirada de: http://www.bio-rad.com/en-us/applications-technologies/qpcr-real-time-pcr (acesso a 27-05-2015)Reverse Transcriptase quantitative PCR20Curva de Calibrao

Imagem retirada de: http://www.sabiosciences.com/pathwaymagazine/pathways7/designing-validating-real-time-pcr-primers.php (Acesso a 26-05-2015)

Imagem retirada de: https://www.lifetechnologies.com/pt/en/home/life-science/cloning/topo/topo-ta-cloning/topo-ta-for-invitro-transcription.html (Acesso a 27-05-2015)https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/vectors/pcriitopo_map.pdf https://www.lifetechnologies.com/pt/en/home/life-science/cloning/topo/topo-ta-cloning/topo-ta-for-invitro-transcription.html

Os autores sintetizaram cada sequencia viral de interesse e introduziram-na num vector TOPO. Esta tecnologia permite a insero de produtos genticos dentro de vectores recorrendo enzima topoisomerase I (consegue quebrar a dupla cadeia de DNA e estabelecer nova ligao). Posteriormente o vector inserido dentro de celulas bacterianas competentes e isso permite obter um elevado numero de copias do material genetico mais do que se obteria com um PCR. Posteriormente esse material gentico quantificado por uma determinada tcnica, por exemplo espectrofotometria UV (os autores no referiram que tecnica usaram nem que kit) e obtem-se a quantidade em unidades de massa (ex: ng) de material gentico. Posteriormente essa quantidade convertida atraves de formulas matemticas no equivalente de n de cpias. Os autores tinham entao um tubo com x ng de cada sequencia gentica e a esses x ng corresponde y n de cpias. Diluiram a soluo de forma a terem uma quantidade que corresponde-se a 1x10^1, 1x10^2, 1x10^3, 1x10^4, 1x10^5 e 1x10^6 n de cpias. Para cada uma dessas 6 diluies foram fazer qPCR e obtiveram um determinado valor de Ct. Construiram uma curva de calibrao do Ct em funo do n de copias.Posteriormente no PCR de cada amostra analisada basta retirar o valor de Ct e fazer interpolao nessa curva de calibrao de forma a ter o N de copias que a amostra possui. 20

Reverse Transcriptase quantitative PCR21Retirado de: http://mededu.cau.ac.kr/micro/research_pds/LC_FastStart_DNA_Master_SYBR_Green_I.pdf (Acesso a 24-05-2015)

Para verificar a especificidade dos produtos obtidos, no final faz-se aumentar a temperatura. A Syber green so se liga a cadeias duplas de DNA, por isso para determinadas temperaturas vai haver o melting com separao de cadeias e h uma quebra na fluorescencia. Se fizermos um grafico da fluorescencia em funao da temperatura podemos verificar o pico em que essa quebra ocorre para a sequencia padro. Quando vamos a fazer um PCR a cada amostra no sabemos o que vamos ter no fim, por isso no fim de todos ciclos de PCR vamos fazer uma anlise de melting e vemos se o pico do produto coincide com o pico da sequencia padro. Na experiencia de melting, a temperatura foi aumentada 0,1C por segundo no intervalo entre 65-95C. 21Culturas Celulares22MDCK LLC-MK2HEp-2CRDLinhas celulares usadasAmostras 196 aspirados nasofarngeosCulturas celulares em monocamada Inoculao com 200L de aspirado nasofarngeo suspenso no meio de transporte Isolamento dos vrus atravs da observao do efeito citoptico.

MDCK: madin-darby canine kidneyRD: rhabdomyosarcoma,LLC-MK2: Rhesus Monkey Kidney Epithelial Cells Hep-2C: clulas epiteliais derivadas de crvix humano com carcinoma.

which could support the growth of various viruses including influenza, parainfluenza, respiratory syncytial virus (RSV), and adenovirus. On detection of specific cytopathic effects, theviruses are identified with standard protocols.

NOTA:Cultura de celulas em monocamada o mais usado em virologia para diagnstico de infeces viricas. A cultura em monocamada consiste numa camada nica de clulas crescendo numa superfcie. o sistema celular mais usado.preparao da amostra para inoculao depende da natureza da amostra. Uma vez que a maioria das amostras biolgicas, submetidas a exame virolgico, esto contaminadas com bactrias ou fungos torna-se necessrio tratar essas amostras com antibiticos. Amostras tais como fezes ou lavados da garganta, so tratadas com antibiticos antes da inoculao.Algumas culturas celulares so sensveis a vrios tipos de vrus enquanto que outras culturas so sensveis apenas a certos tipos de vrus. O meio de cultura das clulas removido antes da inoculao da amostra clnica, de modo a permitir maior contacto da amostra com as clulas em cultura. Procede-se depois inoculao da amostra nas culturas celulares, por adio de um determinado volume da amostra s clulas em cultura. Aps aproximadamente 1 hora repe-se o meio de cultura e as clulas so incubadas na estufa, normalmente a 35-37C (embora algumas culturas de vrus respiratrios sejam incubadas a 33C, uma vez que essa temperatura ptima para alguns vrus da gripe e rinovrus).

Ou seja vamos ter uma cultura de clulas em monocamada e a amostra do aspirado nasofaringeo. Vamos remover o meio de cultura e transferir um determinado volume de amostra para contactar com as celulas. Incubamos 1h a 37C e depois adicionamos o meio de cultura. Incubamos e observamos de tempo a tempo ate termos efeito citopatico. 22Resumindo2323Resultados24

Total= 80 positivosThe prole of test results from the NPA and NPFS speci-mens by RT-PCR and DIF for inuenza A and RSV is shown.

A true positive for inuenza A or RSV was denedas a patient with two independent tests (different tests onsame or different specimens or same test on two differentspecimens) positive for the same virus.

A true positive for inuenza A or RSV was denedas a patient with two independent tests (different tests onsame or different specimens or same test on two differentspecimens) positive for the same virus. Both NPA and NPFShad excellent sensitivity (100%) for detecting inuenza Aby RT-PCR. However, NPA was slightly more sensitive thanNPFS for detecting RSV by RT-PCR (100% vs. 92.3%) andDIF (87.2% vs. 84.6%) and for detecting inuenza A by DIF(90.2% vs. 82.9%) (Tables 2 and 3).2425

Aspirado nasofarngeo (NPA) e flocked swab (NPFS): excelente sensibilidade (100%) na deteo de influenza A por RT-PCR NPA permite obter uma maior sensibilidade do que NPFS:Na deteo de RSV por RT-PCR (100% NPA vs. 92,3% NPFS) e por DIF (87,2% NPA vs. 84,6% NPFS). Na deteo de influenza A por DIF (90,2% NPA vs. 82,9% NPFS)Resultados

O que esto a comparar? A sensibilidade do mtodo de PCR e de deteo directa de antignios em cada uma das amostras (aspirado nasofaringeo ou zaragatoa flocolada). 25Resultados26

The mean of viral load of RSV RNA was signi-cantly higher in NPA compared to NPFS specimens (mean 4.2 10.9 and 4.52 10.8; p = 0.002). For inuenza A virus,the mean viral loads for NPA and NPFS was 2.25 10.11 and 6.82 10.9 but these differences were not statistically signif-icant (p = 0.31) (Table 4).

As cargas virais de RSV em cada tipo amostra quantificadas por real time PCR foram superior para o aspirado nasofaringeo em comparao com as amostras obtidas com a zaragatoa flocolada. No caso do virus influenza as diferenas de carga viral obtida em cada tipo de amostra no so estatisticamente significantes. Os grficos mostram as cargas virais de RSV e influenza A obtidas para 26Resultados27

27Resultados28

Falsos negativos obtidos no NPFS tinham poucas clulas positivas 2829NPFS uma tcnica menos invasiva do que NPA (til em crianas)Colheita por NPFS fcil, conveniente e no requer equipamentos especializados Colheita por NPFS pode produzir menos aerossis do que o NPA (que envolve suo) o que diminui o risco de contaminao

DiscussoBibliografia 30[1] Chan, K. H., Peiris, J. S., Lim, W., Nicholls, J. M., & Chiu, S. S. (2008). Comparison of nasopharyngeal flocked swabs and aspirates for rapid diagnosis of respiratory viruses in children. J Clin Virol, 42(1), 65-69.

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30Bibliografia 31http://www.copanusa.com/products/collection-transport/floqswabs/ (Acesso a 23-05-2015). Informao sobre flocked swabs

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