manual - virologia prática

Expresso de GFP - clulas GHOST

Manual Virologia PrticaMestrado Integrado

em Cincias Farmacuticas

HIV-2ALI; JM Azevedo Pereira resultados no publicados

3 Edio

Lisboa 2008

Este manual foi elaborado com o objectivo de dar apoio s aulas prticas da cadeira de Virologia do Mestrado Integrado em Cincias Farmacuticas da Faculdade de Farmcia da Universidade de Lisboa. Aqui so abordados vrios temas relacionados com o diagnstico laboratorial das infecces virais. Para algumas das infecces virais mais importantes, so aprofundados os conceitos e procedimentos usados nesse diagnstico.

Docentes: Jos Miguel Azevedo Pereira (Professor Auxiliar da FFUL) Contacto: Telf: 217946400; ext: 266 e-mail: [email protected] home page: http://web.mac.com/jmiguelap/Entrada_geral/Entrada.html http://www.ff.ul.pt/paginas/jazevedo/Site/Welcome.html

Quirina Santos Costa (Assistente da FFUL) Contactos: Telf.: 217946200; ext: 226 e-mail: [email protected] home page: http://web.mac.com/santoscostaq/santoscostaq/Santos-CostaQ.html

Abreviaturas usadas:

Ac- AnticorpoAg- AntignioCMSP- Clulas mononucleadas do sangue perif-ricoCMV- CitomegalovirusDNA- cido DesoxirribonucleicoEBV- Vrus Epstein-BarrEIA- Ensaio imunoenzimticoHHV-8- Herpes vrus humano tipo 8HIV- Vrus da Imunodeficncia HumanaHPV- Vrus do Papiloma HumanoHSV- Vrus Herpes Simplex

HTLV- Human T-cell Lymphotropic VirusIF- ImunofluorescnciaIHA- Inibio de hemaglutinaoLCR- Lquido cfalo-raquidianoME- Microscopia electrnicaPCR- Polymerase chain reactionRFC- Reaco de fixao do complementoRIA- Ensaio imuno-radioactivoRNA- cido RibonucleicoRSV- Vrus Respiratrio SinccialTTV- Transfusion Transmited VirusVZV- Vrus da Varicela-Zona

ndice

I- Mtodos de diagnstico em Virologia 4

1- Mtodos directos 42- Deteco de anticorpos especficos (serologia) 123- Cultura de clulas eucariotas 15

II- Diagnstico da Infeco por HSV 17

1- Caractersticas gerais 172- Diagnstico 19

III- Diagnstico da Infeco pelo citomegalovirus (CMV) 21

1- Caractersticas 212- Diagnstico 21

IV- Diagnstico da Infeco pelo vrus da rubola 25

1- Caractersticas 252- Sndroma de Rubola congnita 253- Diagnstico laboratorial 25

V- Diagnstico da Infeco pelo vrus da hepatite B (HBV) 28

1- Caractersticas 282- Diagnstico da infeco pelo HBV 28

VI- Diagnstico da Infeco pelo HIV 32

1- Caractersticas 322- Organizao genmica 323- Ciclo replicativo 334- Patognese da infeco 355- Diagnstico da infeco pelo HIV 356- Principais problemas no diagnstico da infeco pelo HIV 397- Outros marcadores de diagnstico e monitorizao da infeco 408- Mtodos usados na monitorizao e prognstico da infeco: 409- Quantificao da carga viral 41

Anexos 43

Perfil serolgico de uma infeco crnica pelo VHB 43Perfil serolgico de uma infeco aguda pelo VHB 43

4Prticas de Virologia J. Miguel Azevedo Pereira

Duma forma geral, os mtodos de diagnsti-co usados no diagnstico de viroses humanas podem ser agrupados em duas categorias di-ferentes: os mtodos directos e os mtodos indirectos. Nos mtodos directos pretende-se identificar, na amostra clnica, a presena do vrus ou de componentes desse vrus. Assim, englobam-se nesta categoria a microscopia electrnica (ME), a cultura viral, a deteco de antignios virais (Ag) e a deteco do cido nucleico viral.Nos mtodos indirectos pesquisa-se a presena de anticorpos especficos para um determinado vrus (serologia). Este tipo de mtodos consti-tuem a maioria das tcnicas executadas num laboratrio de virologia, uma vez que a maioria das infeces virais pode ser diagnosticada por este tipo de mtodos. O diagnstico serolgico de uma infeco viral pode ser feito detectando a presena ou a subida do ttulo de anticorpos especficos para um determinado vrus. Esta deteco envolve, normalmente, os anticorpos da classe IgG ou a totalidade de anticorpos cir-culantes presentes (IgG+IgM). Em alguns casos

igualmente possvel detectar-se a presena/subida de anticorpos da classe IgM. As tcnicas disponveis para a deteco e quantificao de anticorpos so:

Ensaios imunoenzimticos (EIA: ELISA, ELFA, etc.)

Ensaios radioimunolgicos (RIA)AglutinaoWestern-blotRecombinant immunoblot assay (RIBA)ImunofluorescnciaFixao de complementoInibio de hemaglutinao

1- Mtodos directos1.1. Deteco de antignio viral

A principal vantagem destes mtodos a rapi-dez com que o resultado obtido. No entanto, na maior parte dos casos, trata-se de tcnicas que envolvem a correcta interpretao das ob-servaes feitas, o que torna os resultados me-nos objectivos. A sensibilidade e especificidade so igualmente menores quando comparadas

Figura 1- Clula epitelial infectada pelo HSV-1 detectada por IF

Figura 2- Antignio pp65 do CMV detectado nos ncleos de neutrfilos do

sangue perifrico detectado por IF

Figura 1- Clula epitelial infectada pelo HSV-1 detectada por IF

Figura 2- Antignio pp65 do CMV detecta-do nos ncleos de neutrfilos do sangue

perifrico detectado por IF

I- Mtodos de diagnstico em Virologia


com outras tcnicas. Est muito dependente da qualidade da amostra clnica. So ainda tcni-cas no automatizadas que envolvem a inter-veno frequente do operador.Exemplos de deteco de antignios como m-todo de diagnstico de viroses: deteco de clulas infectadas por RSV, ou adenovirus, em aspirados naso-farngeos ou bronco-alveolares; deteco de HSV (Figura 1) ou VZV em zaraga-toas de leses cutneas (exemplos em que se utiliza a tcnica de imunofluorescncia); detec-o de rotavirus ou adenovirus nas fezes (por reaco de aglutinao de partculas de ltex); deteco de antignio p24 do HIV no soro ou plasma (antigenmia); deteco de antigenmia pp65 do CMV (por mtodos imunoenzimticos - EIA).

1.2. Microscopia electrnica (ME)

As partculas virais so detectadas e identifica-das com base na sua morfologia. A sua princi-pal vantagem reside no facto de ser possvel vi-sualizar directamente a partcula viral. Desta forma possvel examinar a amostra sem que para tal seja necessrio o conhecimento prvio dos possveis agentes causais, em contraste com outros mtodos que usam clulas (cultura celular) ou sondas especficas (PCR, deteco de antignio, deteco de anticorpos).

Figura 3- Partculas virais de Adenovirus pre-sentes nas fezes

A rapidez outra das vantagens da ME, poden-do por isso ser usada em diagnstico virolgico rpido. No entanto, exige que na amostra clni-ca existam partculas virais em quantidade sufi-ciente para poderem ser visualizadas (105-106 partculas virais/ml). Devido a isso, a sua sensi-bilidade baixa, podendo, no entanto, ser aumen-tada utilizando a imuno-microscopia electrnica (IME), onde so usados anticorpos especficos do vrus a pesquisar, por forma a aglutinar as partculas virais, tornando-as mais fceis de vi-sualizar e reconhecer. Para alm da sua baixa sensibilidade, a ME tem como desvantagem ser uma tcnica dispendiosa, quer na aquisio do equipamento, quer na sua manuteno e utili-zao, exigindo pessoal devidamente treinado. Devido a isso, e ao facto dos mtodos de de-teco de antignios e de diagnstico molecu-lar, se terem tornado mais fiveis, sensveis e econmicos, fizeram com que cada vez menos se utilize a ME como mtodo de diagnstico. Ac-tualmente a ME usada no diagnstico de gas-trenterites virais a partir das fezes (rotavirus, adenovirus - Fig 3, astrovirus, calicivirus, etc). Menos frequentemente pode ser usada para a deteco de vrus em leses cutneas, como por exemplo o HSV ou o HPV.

Figura 4- Corpos de Negri (setas) presentes no citoplasma de um neurnio infectado com

o vrus da raiva

1.3. Deteco de corpos de incluso

A replicao viral provoca, por vezes, alteraes histolgicas (corpos de incluso) nas clulas in-fectadas in vivo. Estas alteraes podem ser


caractersticas ou no-especficas. Os corpos de incluso, observveis por microscopia ptica nas clulas presentes na amostra clnica, so basicamente conjuntos de partculas virais que esto a ser produzidas pela clula infectada no ncleo ou no citoplasma. Exemplos de corpos de incluso so os corpos de Negri (Fig. 4) e os corpos de incluso citomeglicos, encontrados nas infeces pelos vrus da Raiva e pelo CMV (citomegalovirus), respectivamente. Embora pouco sensvel e especfica, a identificao his-tolgica dos corpos de incluso pode, ainda as-sim, ser til no diagnstico de algumas viroses, em conjunt com outros mtodos mais especfi-cos e sensveis.

1.4. Deteco do genoma viral

Os mtodos baseados na deteco do genoma viral, so igualmente conhecidos como mto-dos de biologia molecular. Embora estes mto-dos tenham, nos ltimos anos, aumentado de importncia no contexto do diagnstico viral, o papel desempenhado por eles na rotina labora-torial ainda pequeno, quando comparado com os outros testes convencionais.Os testes clssicos de deteco do genoma viral englobam as tcnicas de dot-blot e de

Southern-blot os quais dependem do uso de sondas marcadas (com radioactividade ou com enzimas) especficas do DNA/RNA a pesquisar (por hibridao da sonda com a sequncia alvo). A especificidade depende das condies usadas durante o processo de hibridao. A sensibilida-de destas tcnicas , em geral, idntica obser-vada para os testes convencionais.As tcnicas mais recentes, tal como a polymera-se chain reaction (PCR), a ligase chain reaction (LCR), a nucleic acid based amplification (NAS-BA), e branched DNA (bDNA), dependem todas elas de alguma forma de amplificao, seja do cido nucleico a pesquisar, seja do prprio si-nal emitido pela reaco final. Destas tcnicas a mais sensvel e a que mais usos tem tido no diagnstico virolgico o PCR. Teoricamente, pela tcnica de PCR possvel amplificar-se uma nica cpia de DNA alvo presente na amos-tra clnica. Devido a esta extrema sensibilidade, a execuo desta tcnica traz consigo alguns problemas, o maior dos quais tem a ver com a possibilidade de contaminaes, uma vez que basta a presena duma quantidade mnima de DNA contaminante para se obter um resulta-do falsamente positivo. Por outro lado, a detec-o por PCR de DNA de um determinado vrus, no significa necessariamente que se esteja na

B

A

Figura 5- Exemplo de reaco de hibridao in situ. A- Deteco de clulas infectadas com o vrus do papiloma humano numa amostra obtida do colo do tero; B- Deteco de clulas

infectadas com o HHV-8 numa amostra de uma leso do Sarcoma de Kaposi

Figura 5- Exemplo de reaco de hibridao in situ. A- Deteco de clulas infectadas com o vrus do papiloma humano numa amostra obtida do colo do tero; B- Deteco de clulas infectadas com o

HHV-8 numa amostra de uma leso do Sarcoma de Kaposi


presena real duma patologia. Casos como a deteco de genomas virais identificados como sendo do vrus da hepatite G ou do TTV (transfu-sion transmited virus) no permitem, por si s, fazer a respectiva associao com qualquer es-tado patolgico agudo ou crnico. Tambm nos casos de infeces por vrus que se mantm latentes no hospedeiro, a deteco de genoma viral a nvel celular, no implica necessariamen-te que esteja a ocorrer uma manifestao pato-lgica desse vrus.Dentro deste grupo de testes h ainda a refe-rir os que utilizam as reaces de hibridao in situ (Fig. 5). Neste caso a integridade da clula mantida, sofrendo somente uma permeabili-zao de forma a permitir a entrada da sonda molecular marcada com uma enzima. Uma vez que a estrutura celular e tecidular so manti-das, permite quantificar o nmero de clulas in-fectadas e quais os tipos de clulas, ou compar-timentos celulares, onde o genoma viral existe.

1.5. Isolamento viral

O isolamento de vrus a partir de amostras cl-nicas constitui um importante mtodo de diag-nstico de infeces virais. Este pode ser conse-guido por inoculao das amostras clnicas em clulas eucariotas mantidas em cultura in vitro, ou, em alternativa, por inoculao em animais ou ovos embrionados. Estas duas ltimas alter-nativas so usadas somente em casos muito particulares, devido principalmente maior di-ficuldade na sua manuteno. Assim, este tipo

de mtodo utiliza quase sempre culturas de c-lulas mantidas in vitro. As clulas eucariotas variam muito quanto sua susceptibilidade aos diferentes vrus. de importncia crucial a escolha da(s) clula(s) mais susceptveis para um determinado vrus suspeito de estar presente numa determina-da amostra (dependendo dos sinais clnicos). Alm disso, a amostra dever ser enviada ao laboratrio o mais rapidamente possvel aps a colheita.Depois de recebida a amostra, esta inoculada em diferentes tipos de culturas celulares depen-dendo dos vrus supostamente envolvidos. Este inculo mantido durante pelo menos 1 hora at ao mximo de 16-18 horas (overnight). As clulas so mantidas a 37C em estufa com at-mosfera controlada (5% CO2).As culturas celulares podem ser de diferentes tipos. Assim podemos classific-las quanto ao modo de cultura ou quanto ao tipo de clulas.

Quanto ao modo de cultura, as clulas podem ser classificadas como clulas em suspenso ou clulas em monocamada. As primeiras, como o nome indica, crescem no aderentes ao suporte slido, dispersas no meio de cultura. As segundas crescem aderentes s paredes internas do frasco de cultura ou outro suporte slido. Esta caracterstica est dependente da origem das clulas: se as clulas, in vivo, exis-tirem em suspenso (clulas sanguneas por exemplo) mantm essa caracterstica in vitro. Se in vivo as clulas formarem tecidos ou r-

Figura 6- Exemplos de efeitos citopticos (ECP) induzidos por alguns vrus. Da esquerda para a di-reita: ECP do HSV-1, HIV-2 e RSV


gos slidos, existindo aderentes entre si, man-tero essa propriedade in vitro.Quanto ao tipo de clulas, estas podem ser clas-sificadas como clulas primrias, clulas secun-drias e clulas contnuas (ver mais adiante no texto).

1.5.1. Deteco dos vrus em culturaAps inoculao da amostra, e aps o tempo necessrio para que a replicao viral ocorra, a deteco de replicao viral nas clulas ino-culadas pode ser feito pela visualizao do efei-to citoptico (ECP - Fig 6). Com esse objectivo, as culturas inoculadas devem ser observadas diariamente. Regularmente tambm, o meio de cultura deve ser mudado por forma a manter as clulas em crescimento e em bom estado fisiolgico.Alguns vrus, no entanto, no induzem o apa-recimento de ECP. Nesses casos tem que se recorrer a tcnicas de deteco alternativas. Uma dessas tcnicas a hemadsoro. Esta tcnica baseia-se no facto de alguns vrus (in-fluenza e parainfluenza, por exemplo) induzirem a expresso de hemaglutininas, de origem viral, na membrana da clula infectada. Desta forma, a clula adquire a capacidade de fixar hemcias na sua membrana. Nesta tcnica, o meio de cultura removido e as clulas so incubadas com uma suspenso de hemcias a 4C ou TA durante 30 minutos. A suspenso de hemcias removida e o tapete celular ob-servado ao microscpio. Caso exista hemadsor-o (Figura 7), as hemcias vo ficar aderentes a algumas clulas (clulas infectadas e por isso expressando hemaglutininas virais).

Alternativamente, a presena de vrus em cul-tura pode ser feita recorrendo tcnica de he-maglutinao ou tcnica de interferncia viral. No primeiro caso, pesquisa-se a presena de protenas com capacidade de aglutinar hem-cias de espcies animais especficas (humanas tripsinizadas, de pombo, etc.). Essas protenas so pesquisadas no sobrenadante da cultura infectada pondo em contacto esse sobrenadan-te com uma suspenso de hemcias em placas com cpulas de fundo em V. Caso existam he-maglutininas, as hemcias ficam em suspenso no se concentrando no fundo da cpula (vrti-ce do V). Os resultados possveis esto repre-sentados na Figura 11.A tcnica de interferncia viral usada nos ca-sos em que nenhuma das anteriores tcnicas pode ser usada. O seu princpio baseia-se no facto de haverem determinados vrus que inter-ferem com a replicao de outros que se mul-tiplicam nas mesmas clulas, impossibilitando estes ltimos de fazerem o seu ciclo replicativo. O sistema vrus-clula portanto constitudo por um tipo de clulas e por dois vrus: o vrus que se pretende detectar (vrus A que inter-ferente) e o vrus indicador (vrus B). Este lti-mo ter de ser capaz de induzir um ECP claro e rpido. Caso na cultura celular inoculada existir o vrus A, ele vai impedir que, aps inoculao posterior do vrus B, este possa fazer o seu ci-clo de replicao e por isso no aparea o ECP esperado. Caso no exista o vrus A na cultura, a inoculao do vrus B ir resultar no apareci-mento do ECP esperado e caracterstico. Este procedimento obviamente mais laborioso e, como j foi dito s usado em casos particula-res em que nenhuma das tcnicas anteriores passvel de ser utilizada. Alm disso, impe a conhecimento presuntivo de qual o vrus que dever estar presente em cultura para que a escolha do vrus B possa ser convenientemente feita. Essa suspeita baseia-se em vrios par-metros dos quais os mais importantes so: tipo de sintomatologia, amostra biolgica usada e o facto de se verificar a ausncia de ECP.

1.5.2. Identificao dos vrus em culturaA identificao presuntiva de um vrus em cultu-ra pode ser feita com base no seu ECP, na ca-pacidade de induzir hemadsoro e no tipo de

Figura 7- Exemplo de um resultado positi-vo pela tcnica de hemadsoro. Reparar na acumulao de hemcias junto de algu-

mas clulas (seta)


clula onde esse vrus foi capaz de se replicar (susceptibilidade celular). No entanto, para a identificao cabal e objectiva do vrus em ques-to, torna-se necessrio recorrer a tcnicas como a imunofluorescncia, imunoperoxidase, neutralizao, inibio da hemaglutinao, mi-croscopia electrnica e eventualmente a tcni-cas de biologia molecular (amplificao, clona-gem e sequenciao do genoma viral).

1.5.3. Vantagens e desvantagens do isola-mento e cultura do vrus in vitroA principal vantagem do isolamento viral, no mbito do diagnstico viral, a especificidade e a capacidade de usar os vrus obtidos para futuras caracterizaes. No entanto esta tc-nica tem vrias desvantagens: necessidade de existirem linhas celulares adequadas em cultu-ra, laboratrio devidamente apetrechado para a manipulao de amostras contendo vrus pa-tognicos, pessoal devidamente treinado, cus-tos elevados. Alm disso, as culturas celulares so, devido aos meios de cultura extremamente ricos que so utilizados, facilmente contamin-veis por bactrias e/ou fungos.

10-5 10-6 10-7

Figura 9- Mtodos das placas. Foram inoculadas as diluies 10-5,10-6 e 10-7; as placas formadas em cada diluio so visveis aps

adio do corante vermelho neutro

1.5.4. Cultura viral com centrifugaoUm dos avanos mais importantes, no diagns-tico rpido das infeces virais, foi a aplicao da centrifugao cultura viral tradicional. Esta tcnica baseia-se no facto de se conseguir au-mentar a eficincia de infeco (infecciosidade) de alguns vrus quando, aps inoculao da amostra, se submete as culturas a uma fora centrfuga de baixa velocidade. As clulas assim tratadas so incubadas, 24-48 horas depois da inoculao, com anticorpos monoclonais mar-cados, especficos de antignios precoces do v-rus suspeito de estar presente na amostra bio-lgica inoculada (presumido a partir dos sinais clnicos e do tipo de amostra colhida). Um dos melhores exemplos de aplicao desta tcnica o diagnstico precoce da infeco pelo CMV (citomegalovirus). Neste caso a amostra ino-culada numa cultura de fibroblastos humanos (Fig.8).

1.5.5. Titulao de um vrusEm Virologia, existem dois mtodos para quan-tificar (titular) uma suspenso viral: o mtodo das placas e o da diluio limite.

Mtodo das placas:Baseia-se no princpio de que um vrus, ao infec-tar uma clula e ao ser transmitido s clulas vizinhas, ir provocar a morte a essas clulas. Estas clulas mortas sero visualizadas, aps adio de um corante vital (vermelho neutro).As clulas susceptveis ao vrus a titular so pos-tas em cultura, numa placa de Petri ou numa cpula de dimenses apropriadas, e usadas quando tiverem numa densidade correspon-dente sub-confluncia.

A suspenso viral a titular diluda sucessi-vamente, num factor de diluio 1:10 e cada

Figura 8- Exemplo do resultado obtido pela tcnica de cultura com centrifugao. Uma cultura de fibroblastos humanos (MRC-5) foi inoculada com uma amostra contendo CMV, submetida a centrifugao e incuba-da com anticorpo monoclonal para o anti-gnio precoe do CMV, pp72, marcado com

fluorescena

Figura 9- Mtodos das placas. Foram inocula-das as diluies 10-5, 10-6 e 10-7; as placas formadas em cada diluio so visveis aps

adio do corante vermelho neutro

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Prticas de Virologia J. Miguel Azevedo Pereira

uma das diluies ser inoculada numa placa individualmente. Na prtica, sero inoculadas somente as diluies mais provveis de darem uma leitura adequada (por exemplo as diluies 10-5, 10-6 e 10-7). Aps a inoculao as clulas inoculadas so inundadas com meio de cultu-ra contendo agarose, por forma a favorecer as infeces clula-clula e no permitir a difuso das partculas virais entretanto formadas. Ao fim de algum tempo (varivel consoante o tipo

A diluio correspondente TCID50

est localizada entre as diluies 10-5 e 10-6 (83% e 17%, respectivamente). Para se calcular essa diluio recorre-se formula de interpolao:

% de infeco > 50% - 50%% de infeco > 50% - % de infeco < 50%

No caso do exemplo ser:

83 - 50/83-17 = 33/66 = 0,5

O valor encontrado multiplicado pelo negativo do log10 do factor de diluio, que no caso do exemplo d igual a -1, ficando por isso

-1 x 0,5 = -0,5

O log10 da diluio que corresponde TCID50

obtido adicionando o valor obtido anteriormente ao valor do log10 da diluio acima dos 50%. Ou seja:

-5 + (-0,5) = -5,5

Ou seja, a diluio correspondente TCID50

igual a 10-5,5 e portanto o ttulo da suspenso 105,5 TCID

50

Diluio viral

N de culturas

infectadas/inoculadas

Total acumulado

de culturas infectadas

Total acumulado

no infectadas

Taxa de infeco

Percentagem infectadas

10-4 5/5 10 0 10/10 100%

10-5 4/5 5 1 5/6 83%

10-6 1/5 1 5 1/6 17%

10-7 0/5 0 10 0/10 0%

Tabela 1- Esquema do clculo da TCID50 por inoculao de clulas susceptveis

de vrus), adicionado o corante vermelho neu-tro que ir corar de vermelho as clulas vivas e manter incolor as clulas mortas (Figura 9). O clculo da concentrao de partculas virais feita usando a diluio que melhor contagem apresentar (nem demasiado elevada nem bai-xa demais). Nessa, sero contadas as zonas de morte celular (denominadas placas), e multipli-cadas pelo inverso da diluio usada como in-culo (ex: 50 placas na diluio 10-5, correspon-

11


de um ttulo de 50x105 ou seja 5x106). H ainda que ter em conta o facto de o ttulo ser dado em PFU (plaque forming units; ou UFP, unidades for-madoras de placas) por mililitro. Assim sendo, ter-se- ainda que multiplicar o resultado pelo inverso da fraco de mililitro que foi usada (se s se inoculou 0,1 ml, ter que se multiplicar por 10 para se ter o valor por mililitro; ou seja, no exemplo dado anteriormente, ficar como resultado final: 5x107 PFU/ml).

Mtodo da diluio limite:Neste caso calcula-se a diluio que provoca a infeco em 50% das culturas inoculadas (TCID

50 ou dose infectante 50%). A suspenso

viral diluda sucessivamente (factor de diluio 1:10 normalmente) e as diferentes diluies so inoculadas individualmente em culturas de clulas susceptveis. Para cada diluio, e ao fim do tempo adequado replicao viral, vai-se observar qual o nmero de culturas inoculadas

que apresentam sinal de infeco (por pesquisa do ECP, por exemplo). O objectivo identificar aquela diluio para a qual se conseguiu infec-tar metade das culturas inoculadas. Constri-se assim uma tabela onde vo figurar o nmero de culturas infectadas e no infectadas para cada diluio, bem como os totais acumulados de cul-turas infectadas e no infectadas para uma das diluio (Tabela 1). Os clculos a realizar, para se calcular a TCID

50 esto tambm esquema-

tizados na Tabela 1. Este mtodo mais labo-rioso mas tem a vantagem de poder ser usado mesmo em vrus que no induzam a morte ce-lular, a qual, como foi referido, a marca que, no mtodo das placas nos permite quantificar o ttulo da suspenso viral em estudo.

1.5.6. Linhas celulares susceptveisNo diagnstico baseado no isolamento dos vrus in vitro, bem como na sua titulao, importan-te a escolha das clulas sobre as quais se vai

Vrus Exemplos de Clulas Susceptveis

Herpes Simplex (HSV) Vero, Hep-2

Varicela-Zona (VZV) Clulas diplides humanas (HEK, HEL)

Citomegalovirus (CMV Fibroblastos humanos (MRC-5

Adenovirus Hep-2, HEK

Poliovirus MK, BGM, LLC-MK2, Vero

Coxsackie B MK, BGM, LLC-MK2, Vero

Echovirus MK, BGM, LLC-MK2

Influenza A e B MK, LLC.MK2, MDCK

Parainfluenza MK, LLC-MK2

Papeira MK, LLC-MK2, HEK, Vero

Respiratrio Sinccial (RSV) Hep-2, Vero

Rinovirus HEK, HEL

Sarampo MK, HEK

Rubola Vero, RK13

Tabela 2- Exemplos de alguns vrus possveis de serem isolados in vitro e algumas clulas usadas para o seu isolamento.

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inocular a amostra. Na Tabela 2 apresentam-se alguns exemplos de linhas celulares possveis de serem usadas para vrios vrus. Quando o v-rus novo, ou seja em que a experincia ainda restrita, deve-se seguir a norma de se utilizar in vitro as clulas mais provveis de serem as clulas-alvo in vivo. Convm ainda realar que, sempre que possvel devero ser usadas clu-las primrias ou secundrias, pois so essas as que mais prximas esto da situao in vivo.

2- Deteco de anticor-pos especficos (serolo-gia)O diagnstico baseado na deteco de anticor-pos especficos, constitui a maioria dos ensaios de rotina em viroses humanas. Baseia-se no facto de, aps a exposio a um antignio, o sis-tema imunolgico responder com a produo de anticorpos especficos para esse antignio. Os primeiros anticorpos a aparecerem so da classe das IgM, seguidos dos anticorpos da classe IgG. No caso de uma reinfeco, o nvel das IgM especficas poder aumentar, enquan-to que as IgG aumentam significativamente. Existem vrios tipos de tcnicas serolgicas. Nalgumas delas possvel descriminar a pre-sena de IgM e de IgG (caso das tcnicas EIA e RIA), enquanto que noutras somente possvel avaliar a presena da totalidade dos anticorpos (fixao do complemento, inibio da hemaglu-tinao). De igual forma, a sensibilidade e espe-cificidade dos mtodos varia significativamente. Assim os mtodos EIA e RIA so em geral mais especficos e sensveis do que as tcnicas de fixao do complemento (FC) ou inibio da he-maglutinao (IHA).

2.1. Critrios para o diagnstico duma primo-infeco

Um aumento significativo do ttulo de anti-corpos especficos (IgG ou totais) entre uma amostra colhida durante a existncia de sin-tomas (fase aguda) e a convalescena. Os principais problemas deste tipo de critrio a definio de subida significativa e o facto de ser um diagnstico retrospectivo.

Presena de IgM: uma forma rpida

de detectar uma primo-infeco, no entan-to a deteco especfica de IgM por vezes difcil de se conseguir devido a reaces cruzadas/interferncia (factor reumati-de), presena de IgM devido a reinfeces e ainda devido persistncia das IgM vrios meses/anos aps a infeco primria.

Seroconverso: definida como sendo a evoluo duma situao de ausncia de anti-corpos para uma outra onde esses anticor-pos passam a estar presentes.

Uma nica amostra com ttulo elevado de IgG (ou anticorpos totais): mtodo muito pouco fivel pois no permite confirmar se se trata duma infeco primria, reinfeco ou vacinao.

2.2- Critrios para o diagnstico duma reinfeco/reactivao

Na maior parte dos casos difcil de distinguir uma reinfeco de uma reactivao, e, em certas circunstncias, estas de uma infeco primria. Embora seja verdade que em muitos casos no primordial distinguir uma primo-infeco de uma reinfeco, outros h em que essa distino fundamental. o caso da infec-o pelo vrus da rubola (ver captulo referen-te ao diagnstico por este vrus mais adiante) durante o primeiro trimestre da gravidez, onde uma primo-infeco est associada a um alto risco de mal-formaes enquanto que a reinfec-

Figura 10- Evoluo dos nveis de anticorpos em consequncia de uma primo-infeco e rein-feco. De notar que, na reinfeco, as IgM podem estar ausentes ou presentes transito-

riamente a baixas concentraes.

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o no est.

Em geral, durante a reinfeco/reactivao, ocorre um aumento rpido dos nveis de IgG com ausncia, ou presena de nveis muito bai-xos, de IgM (Figura 10).

2.3- Limitaes do diagnstico serol-gico

A utilidade do diagnstico serolgico vai depen-der do vrus em questo.Assim:

Para vrus como os da rubola ou da he-patite A, o aparecimento dos sinais clnicos coincide com o desenvolvimento de anticor-pos. Desta forma, a deteco de IgM ou ttu-los de IgG aumentados no soro do indivduo, indica uma infeco activa

Noutros casos, no entanto, os sinais cl-nicos surgem antes do aparecimento dos anticorpos. o caso dos vrus responsveis por infeces respiratrias ou por diarreias. Nestes casos, o diagnstico serolgico ser sempre retrospectivo e por isso sem inte-resse prtico.

Outros vrus provocam o aparecimento de manifestaes clnicas muitos meses/anos aps a seroconverso. Servem de exemplos para esta situao o HIV e o vrus da raiva. Nestes casos a simples presena de anticorpos suficiente para fazer um diagnstico definitivo, excepto nas situaes em que esses anticorpos possam ter sido transmitidos passivamente (caso da trans-misso vertical do HIV).

Em casos de infeces localizadas, como por exemplo as leses herpticas a nvel la-bial ou genital, podem no induzir uma res-posta humoral significativa

Ocorrncia de reaces cruzadas entre vrus devidas a identidades antignicas (por ex: HSV/VZV) que podem levar a falsos re-sultados positivos

Ocorrncia de falsos positivos devido a anticorpos interferentes: frequente em do-entes com Lupus Eritematoso disseminado ou com mononucleose infecciosa.

Indivduos imunodeficientes podem ter uma resposta humoral ausente ou muito reduzida.

Em indivduos que sofreram transfuses de sangue, podem existir anticorpos devido transferncia passiva desses anticorpos a partir do dador.

2.4- Presena de anticorpos no LCR

Numa pessoa saudvel, poucos ou nenhuns an-ticorpos devem ser detectados no LCR. Em situ-aes de meningite ou encefalite, podero ser produzidos anticorpos especficos do vrus em causa. A presena de anticorpos no LCR diz-se que significativa quando a razo entre o ttulo de anticorpos no soro e no LCR inferior a 100. No entanto, isto s verdade se a barreira he-mato-enceflica estiver intacta (o que frequen-temente deixa de ser verdade numa meningite ou encefalite). Caso contrrio os anticorpos do soro podem passar facilmente para o LCR. O mesmo se passa quando a colheita do fluido espinal tiver sido feita com a ocorrncia de he-morragia. Nesse caso o LCR vir contaminado com sangue, o que invalida a interpretao da razo de anticorpos sangue/LCR. Uma forma de comprovar a no contaminao do LCR com sangue (seja por compromisso da barreira he-mato-enceflica, seja por m colheita) pesqui-sar, no LCR, a presena de anticorpos especfi-cos para um vrus para o qual toda a populao tenha sido vacinada (papeira, sarampo, rubo-la...). Caso no tenha havido contaminao com sangue, a presena de anticorpos no LCR ser muito baixa ou nula.

2.5- Testes usados na deteco de an-ticorpos especficos

2.5.1- Reaco de fixao do complemento (RFC)A RFC um testes simples, rpido e que exige pouco equipamento e reagentes. A sua utiliza-o cada vez menor, tendo gradualmente sido substitudo por testes mais sensveis e especfi-cos (EIA e RIA). Este teste consiste em duas re-aces antignio-anticorpo (Ag-Ac) sucessivas, uma das quais (a segunda) serve de teste indi-cador. A primeira reaco, entre um antignio viral conhecido e titulado e o soro em estudo, ocorre na presena de uma quantidade pr-de-terminada de complemento. Este complemento

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ir ser removida ou fixada pelo complexo Ag-Ac eventualmente formado. A segunda reaco Ag-Ac consiste na juno de hemcias de car-neiro e hemolisina (tambm esta previamente titulada). Quando este sistema indicador adi-cionado primeira reaco, as hemcias sero lisadas somente na presena de complemento livre (no fixado pela primeira reaco Ag-Ac.

Desta forma indirecta ficamos a saber se na amostra de soro em estudo existiam Ac espe-cficos do Ag usado. Exige a titulao prvia do antignio, complemento e hemolisina usados.

2.5.2- Reaco de inibio da hemaglutinao (IHA)Vrios vrus possuem a capacidade de aglutinar hemcias de algumas espcies de mamferos e de aves (Fig. 11). A espcie cujas hemcias so aglutinadas depende do vrus. Exemplos de vrus que possuem hemaglutininas so: influen-za, parainfluenza, adenovirus, rubola, flavivirus, e algumas estirpes de picornavirus. O princpio deste teste baseia-se no facto de, caso existam Ac especficos do vrus em estudo (com capa-cidade hemaglutinante), estes Ac iro impedir a hemaglutinao por parte do Ag. Tal como a RFC, a IHA um teste simples e que requer muito pouco equipamento/reagentes. mais sensvel que a RFC mas menos do que o EIA ou o RIA. Diluies sucessivas do soro em estudo (1:10, 1:20, 1:40, 1:80, ...) so postas em con-tacto com uma quantidade constante e pr-de-terminada de hemaglutinina viral. Em seguida adicionada uma suspenso de hemcias. Caso existam Ac no soro em estudo, estes iro ligar-se ao Ag especfico (com capacidade hemaglu-tinante), impedindo que este aglutine as hem-cias presentes. Uma vez que este ensaio envolve a diluio sucessiva do soro, permite quantificar

qual a maior diluio, desse mesmo soro, para a qual ainda se verificou a inibio da hemaglu-tinao. O inverso dessa diluio corresponde ao ttulo de anticorpos especficos para o vrus

Figura 12- Microplaca de um ensaio de ELISA: as cpulas coradas indicam reaces positivas; as incolores revelam a ausncia de

anticorpos nas amostras testadas.

Figura 11- Reaco de hemaglutinao. Na au-sncia de hemaglutininas livres, as hemcias sedimentam no fundo da microplaca. Caso es-sas hemaglutininas estejam presentes, iro aglutinar as hemcias impedindo a formao

do boto devido sua sedimentao

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em estudo (ex: maior diluio=1:160, logo o ttulo=160).

2.5.3- Mtodos imunoenzimticos (EIA) e imu-no-radioactivos (RIA)Baseiam-se na formao de complexos Ag-Ac e posterior deteco destes complexos pela adio de um segundo Ac marcado enzimati-camente (EIA) ou radioactivamente (RIA). No segundo caso, quanto maior o nmero de com-plexos Ag-Ac formados maior a quantidade de radioactividade presente. No primeiro caso, a quantidade destes imuno-complexos ir deter-minar a quantidade de enzima presente e esta por sua vez ir degradar em maior quantidade o substracto adequado, entretanto adicionado reaco, donde resulta um composto corado. Assim, quanto maior a intensi dade da colora-o, maior a quantidade de enzima e, portanto, maior a quantidade de complexo Ag-Ac forma-dos no incio (Fig 12).Os mtodos EIA e RIA apresentam maior sensi-bilidade, maior especificidade e so mais prti-cos de executar, tendo ainda a vantagem de se-rem automatizveis, com benefcios em termos de diminuio de erros de execuo, de maior objectividade e rapidez e de permitir uma me-lhor organizao do laboratrio.

3- Cultura de clulas eucariotasAs culturas celulares em virologia so funda-mentais, na medida em que permitem a multi-plicao in vitro dos vrus presentes nas amos-tras biolgicas. So, por isso, um elemento fundamental em todos as tcnicas virolgicas que envolvam o isolamento (no diagnstico das infeces virais) ou a propagao (estudos de caracterizao fenotpica) de vrus.Tratando-se de vrus causadores de patologias no ser humano, as clulas a utilizar tm de ser necessariamente eucariotas (os fagos multi-plicam-se em clulas procariotas). As clulas eucariotas so muito mais difceis de manter em cultura do que as clulas procariotas. Elas exigem meios de cultura muito ricos e so, por isso, muito susceptveis contaminao por mi-croorganismos como as bactrias e fungos.Duma forma simples, podemos distinguir as

culturas celulares de trs formas: pela forma como se propagam in vitro, conforme a sua morfologia e consoante o tipo de clulas.

1- Quanto forma de propagao, as culturas celulares podem-se classificar em:

Culturas em suspenso: as clulas cres-cem sem estarem aderentes entre si ou ao suporte slido (paredes interiores do frasco de cultura ou outro recipiente onde estejam a ser cultivadas)

Culturas em monocamada: crescem aderindo ao suporte slido e entre si. Estas clulas necessitam, para serem transferi-das para outro suporte slido, de serem dis-sociadas entre si e do suporte slido onde se fixaram. Os mtodos de dissociao se-ro referidos mais adiante.

2- Quanto sua morfologia as clulas podem-se classificar em:

Epiteliais: com morfologia poligonalFibroblsticas: com morfologia fina e

alongadaOutras: com outros tipos de morfologias

(clulas sanguneas, nervosas, musculares, etc.)

Figura 13- Clulas MRC5; fibroblastos de pulmo hu-mano; so usadas para, por exemplo, isolar e propagar

o CMV

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3- Quanto ao tipo de clulas as culturas celula-res podem-se classificar em:

Clulas primrias: constituem o melhor sistema celular uma vez que permitem a re-plicao de um maior nmero de vrus e so aquelas que mais se assemelham s clulas in vivo, constituindo, por isso, o modelo mais prximo desse sistema. So clulas normais, obtidas directamente de animais. Permitem um nmero muito limitado de passagens (1 a 2). Tm inibio de contacto: uma vez justapostas, param de se dividir. Para alm disso so difceis de manter em quantidade suficiente. Exemplos de culturas de clulas primrias: linfcitos humanos.

Clulas secundrias: So obtidas ori-ginalmente a partir de um dador animal e, se as condies de cultura forem as ideais, podem-se dividir e crescer durante algum tempo in vitro (entre 50-100 geraes ou passagens). No entanto, elas no tm a ca-pacidade de se dividirem e crescer indefini-

damente e eventualmente, ao fim de algum tempo, as suas caractersticas alteram-se e acabam por entrar em senescncia e morrem. Os factores que controlam a ca-pacidade de propagao destas clulas in vitro esto relacionados com o grau de di-ferenciao das clulas - em geral, as clu-las mais diferenciadas so mais difceis de manter em cultura do que as clulas menos diferenciadas (menos especializadas). Exem-plo de cultura de clulas secundrias: clu-las MRC5 (Fig 13) - fibroblastos humanos obtidos a partir do pulmo e que em geral conseguem atingir as 60-70 geraes.

Clulas contnuas: Tambm denomina-das (erradamente) de clulas imortalizadas, as clulas contnuas tm a capacidade de crescerem indefinidamente in vitro, desde que as condies de cultura sejam as ade-quadas. Tambm so denominadas clulas transformadas uma vez que as suas carac-tersticas fisiolgicas normais foram altera-das. Em geral so obtidas a partir de tecidos neoplsicos (cancros, linfomas, leucemias) ou, alternativamente, so o resultado da transformao in vitro de clulas normais atravs, por exemplo, da infeco com v-rus com capacidade transformante (EBV, HHV-8, HTLV, etc). Estas clulas caracteri-zam-se por, em geral, terem perdido a ini-bio por contacto, isto , quando duas clulas adjacentes se tocam, continuam a dividir-se, ao contrrio do que acontece nas clulas normais em que esse facto sinaliza as clulas para pararem de se dividir. As c-lulas HeLa (Fig. 14) so um exemplo de c-lulas contnuas. Estas so clulas epiteliais obtidas dum carcinoma do colo do tero e esto infectadas com o vrus do papiloma humano tipo 18 (HPV 18).

Figura 14- Clulas HeLa; clulas epiteliais obtidas a partir dum carcinoma do colo do te-ro; so usadas, nomeadamente, no isolamento

e propagao do HSV

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1- Caractersticas geraisA infeco pelos vrus Herpes simplex (HSV) das infeces virais de maior prevalncia na po-pulao mundial. Existem dois serotipos: HSV-1 e HSV-2. So vrus com genoma DNA, da fam-lia Herpesviridae, possuindo cerca de 50% de homologia na sua sequncia nucleotdica. Esta identidade leva ocorrncia de reaces cru-zadas entre os dois tipos de antignios. Apesar disso, possvel identificar e diferenciar os dois serotipos recorrendo a tcnicas de deteco de anticorpos (no soro ou plasma) ou de anti-gnios (directamente nas clulas de leses her-pticas).A transmisso ocorre por contacto com as mu-cosas infectadas, principalmente se existirem escoriaes ou quebras de continuidade da pele e mucosas, durante as relaes sexuais e durante o parto. A disseminao do vrus ocor-re por migrao centrfuga das partculas vi-rais atravs dos nervos sensoriais perifricos. Na porta de entrada, na derme e na epiderme, ocorre o processo de replicao, e as partcu-las virais so transportadas pela terminao nervosa at ao ncleo dos neurnios sensitivos. Conhece-se menos a sucesso de eventos a partir desse ponto. Em alguns casos, ocorre a infeco com replicao viral e morte celular. Em outros, o vrus fica em estado de latncia (Fig. 15). Os factores envolvidos nos mecanis-mos de persistncia do HSV e a sua reactiva-o peridica permanecem por esclarecer.

Figura 15- Latncia ao nvel dos gnglios ner-vosos do trigemio, associada infeco oro-

labial pelo HSV

Aps o primeiro contacto com o HSV (primo-infeco), podem surgir sinais e sintomas envolvendo leses nas mucosas. A durao dos sintomas, a infecciosidade das leses e a possibilidade de complicaes durante a pri-mo-infeco maior do que nos episdios de

Figura 16- Exemplo de leso oro-labial causadapor HSV-1

Figura 17- Exemplo de leses vulvares causadas pelo HSV-2

II- Diagnstico da Infeco por HSV

Figura 16- Exemplo de leso oro-labial causa-da por HSV-1

Figura 17- Exemplo de leses vulvares causa-das pelo HSV-2

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reactivao. A gengivoestomatite aguda a ma-nifestao mais comum das primo-infeces, as quais ocorrem mais frequentemente entre 1 e 4 anos de idade. O herpes labial e as lceras da crnea (queratites herpticas) so as manifes-taes clnicas mais frequentes nos casos de reactivao.As manifestaes clnicas e a evoluo da in-feco dependem da idade, da localizao, do estado imunolgico do paciente e do tipo anti-gnico do vrus. A exposio ao sol (luz ultravio-leta), a imunossupresso e traumas cutneos podem levar reactivao. Ocasionalmente, vrias estirpes do mesmo subtipo viral podem ser detectadas num mesmo paciente, princi-palmente nos imunodeficientes (doentes com SIDA ou transplantados). Este facto sugere a possibilidade de poder haver infeco exgena por diferentes estirpes virais. A infeco pelo HSV tipo 1 (HSV-1) , em ge-ral, adquirida mais cedo do que a do tipo 2 (HSV-2). Cerca de 90% dos adultos com idade de 50 anos, apresenta anticorpos contra HSV-1. Nas populaes socio-econmicas mais desfavore-cidas, esta percentagem encontrada na fai-xa etria dos 30 anos. Os anticorpos contra o HSV-2 no so normalmente detectados at a puberdade. As taxas de prevalncia desses anticorpos correlacionam-se com o incio da

Figura 18- Esquema das possveis localizaes e manifestaes clnicas das infeces pelo HSV-1 e HSV-2

vida sexual activa, o que distingue este vrus do HSV-1. A percentagem de indivduos com anti-corpos para o HSV-2 aumentou 30 pontos nos ltimos 12 anos nos Estados Unidos. Numa avaliao obsttrica, 25% da populao estu-dada tinham anticorpos para o HSV-2; destes, apenas 10% apresentavam histria clnica de leses genitais. Cerca de 50% dos adultos he-terossexuais, com vida sexual activa, apresenta anticorpos positivos, sendo a taxa 5% maior en-tre as mulheres.O HSV tipo 1 est associado a uma variedade de infeces envolvendo leses mucocutneas orolabiais (Fig. 16), oftlmicas, meningoencef-licas, podendo eventualmente causar leses vis-cerais e genitais, enquanto o HSV tipo 2 (HSV2) est associado a infeces genitais sexualmen-te adquiridas (Fig. 17). Ambos os tipos podem causar leses nas diferentes localizaes, e os sinais clnicos so idnticos (Fig. 18).Tanto o HSV-1 como o HSV-2 podem ser respon-sveis por leses mucocutneas primrias em qualquer localizao. A durao e a intensidade da infeco no dependem do serotipo envolvi-do. No entanto, o tipo de vrus e a localizao da primo-infeco podem afectar a frequncia e a probabilidade das recidivas. Estudos recen-tes demonstram que tanto a frequncia como a probabilidade so maiores quando a infeco causada pelo HSV-2. A infeco genital por

Figura 18- Esquema das possveis localizaes e manifestaes clnicas das infeces pelo HSV-1 e HSV-2

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HSV-2 ocorre com uma frequncia oito a dez vezes maior que a infeco genital por HSV-1. Por outro lado, a infeco oral-labial por HSV-1 ocorre mais frequentemente do que a infeco oral-labial por HSV-2. A probabilidade de reacti-vao da infeco causada pelo HSV-2 duas vezes maior. Em indivduos imunocompetentes, a infeco limita-se s localizaes mucocutanas e aos gnglios sensoriais. Em indivduos imunodefi-cientes, as leses causadas tanto pela primo-infeco como pelas reactivaes tendem a ser mais extensas e a persistir por muito mais tem-po do que nos indivduos imunocompetentes. Nesses pacientes, o quadro grave, geralmen-te com comprometimento esofgico, pneumoni-te intersticial e infeco disseminada com com-prometimento visceral. A infeco pelo HSV-2 um tipo de infeco oportunista importante em indivduos infectados pelo HIV. Calcula-se que at 90% desses indivduos estejam coinfecta-dos com o HSV-2. Num pequeno nmero de casos, a infeco pelo HSV pode levar a uma encefalite viral com danos neurolgicos severos. O HSV, principal-mente o do tipo 1, pode causar encefalite em adultos pela reactivao dos vrus latentes. As infeces mais agressivas, com risco de vida, so a perinatal e as que ocorrem em indivdu-os imunodeficientes, em particular os doentes com SIDA.Existem dados que demonstram que os pacien-tes que apresentam uma infeco primria mais agressiva e no tratada tm ndices mais elevados de recorrncia a longo prazo.As respostas imunolgicas, humorais e celula-res manifestam-se nas primeiras semanas e persistem por toda a vida. Embora no possu-am capacidade neutralizante, induzem o apare-cimento de manifestaes clnicas mais atenua-das e apresentam reaces cruzadas entre os dois subtipos.

2- Diagnstico O isolamento viral em cultura de clulas eucario-tas o mtodo de referncia para o diagnstico e tipagem do HSV. O HSV pode ser detectado em cultura 2 a 8 dias aps inoculao, mas, em vrios casos, como nos de baixos ttulos virais, convalescena das leses ou leses atpicas, o

vrus pode no ser isolado. A sensibilidade do isolamento do HSV em cultura de clulas de aproximadamente 105 partculas virais por mL. A deteco em geral conseguida pela visuali-zao do ECP caracterstico: arredondamento das clulas e formao de sinccios e ainda, aps colorao com hematoxilina-eosina, pelo aparecimento de clulas apresentando uma in-cluso eosinfila intra-nuclear (Fig. 19).Actualmente, a reaco em cadeia da poli-merase (PCR) o mtodo mais sensvel para o diagnstico da infeco por HSV (Fig. 20). altamente sensvel (at 5 viries por amostra), especfica (98-100%), e pode identificar o gen-tipo e ainda permitir a quantificao viral. O PCR

Figura 19- Exemplos de ECP induzido pelo HSV in vitro

Figura 19- Exemplos de ECP induzido pelo HSV in vitro

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quantitativo pode ser til para a monitorizao da resposta terapia antiviral. Alm disso, o ensaio realizado por PCR, permite o diagnstico utilizando-se diferentes amostras como sangue, LCR, lquido amnitico e sangue fetal.O lquido amnitico poder ser colhido a partir da 12 semana at o final da gestao. No en-tanto, a altura ideal situa-se entre a 14 e a 16 semana. Em relao ao sangue fetal a altura

Figura 20- Esquema da reaco de PCRFigura 20- Esquema da reaco de PCR

ideal para essa colheita situa-se entre 18 e a 22 semana de gestao. Em alternativa, o diagnstico das infeces por HSV pode ser feito recorrendo tcnica de imunofluorescncia (Fig. 21 e Fig. 1 da p-gina 3). Esta tcnica sensvel e especfica uma vez que se utilizam anticorpos monoclo-nais dirigidos para o HSV-1 e HSV-2. Esses anticorpos so marcados com um fluorocro-mo (FITC - isotiocianato de fluorescena, por exemplo). Caso as clulas colhidas a partir da leso estejam infectadas, vo expressar an-tignios virais que sero reconhecidos pelos respectivos anticorpos marcados. Assim, as clulas infectadas iro apresentar fluorescn-cia enquanto que as no infectadas manter-se-o no fluorescentes (Fig. 21).Esta tcnica exige no entanto um particular cuidado na obteno da amostra, uma vez que o que se pretende obter nessa amostra so clulas da base da leso. por isso ne-cessrio retirar previamente, com uma zaragatoa de algodo, os possveis contaminantes e s depois proceder co-lheita de clulas da leso propriamente dita com o recurso a uma zaragatoa abrasiva (em plstico com reentrncias). Este cuida-do na colheita particularmente importante em leses situadas no colo do tero, onde as clulas de descamao e outras, devem ser cuidadosamente retiradas, antes da colheita, por forma a evitar-se os resultados falsamen-te negativos (devidos m colheita).

Figura 21- Imunofluorescncia em clulas no infectadas (esquerda) e infectadas pelo HSV-1 (direita). Fluorocromo usado: FITC; a cor vermelha das clulas no infectadas deve-se ao uso do contra-corante,

azul de Evans

Figura 21- Imunofluorescncia em clulas no infectadas (esquerda) e infectadas pelo HSV-1 (direi-ta). Fluorocromo usado: FITC; a cor vermelha das clulas no infectadas deve-se ao uso do contra-

corante, azul de Evans

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1- CaractersticasO CMV pertence famlia Herpesviridae, sub-fa-mlia Betaherpesvirinae, podendo ser tambm denominado por HHV-5. Encontra-se largamen-te distribudo na espcie humana. Dados dos EUA apontam para que 50-80% da populao, com mais de 40 anos, possua anticorpos para este vrus. A sua prevalncia maior quanto mais baixo for o nvel scio-econmico das po-pulaes.A transmisso ocorre por via vertical (durante a gestao, no trabalho de parto ou no aleita-mento), ou por contacto com lquidos biolgicos onde o vrus pode estar presente, nomeada-mente: urina, saliva, sangue, smen e fluidos va-ginais. Para alm disso a transmisso tambm pode ocorrer em consequncia de transfuses ou transplantes de rgos (Fig. 22).Na maior parte dos casos, a infeco pelo CMV est associada ausncia de sintomatologia ou a situaes benignas, podendo em alguns ca-sos ocorrer um sndroma mononuclesico com febre ou ainda hepatite. Aps esta infeco primria, o vrus fica latente podendo sofrer re-activaes ao longo da vida do hospedeiro. No entanto, em certos grupos de risco, a infeco

urina, saliva

in utero, parto, aleitamento, saliva

esperma, fluidos vaginais, saliva

me

infantriocriana

adolescenteadulto

transfusotransplante

urina, saliva

relaes sexuais

Figura 22- Esquema das vias de transmisso da infeco pelo CMV

pelo CMV pode tornar-se extremamente preo-cupante. Exemplos destes grupos so os imuno-deficientes e a mulher grvida, esta ltima pelo risco de poder transmitir a infeco ao feto.Durante a gravidez, o maior risco para o feto provm de uma primo-infeco (Fig. 23). Nas situaes em que j tenha ocorrido uma infec-o por CMV no passado (reactivaes), o risco para o feto praticamente nula. Ainda dentro da infeco me-filho, de referir que o risco maior est associado infeco congnita (ad-quirida durante a gestao). As infeces peri-natal (trabalho de parto) ou ps-natal (aleita-mento) esto, em geral. associadas a situaes de muito menor gravidade para a criana.

2- DiagnsticoO diagnstico da infeco pelo CMV feito re-correndo a vrias tcnicas:

Deteco de anticorpos por reaco imunoenzimtica (ELISA)

Deteco de antignio viral (pp65) por IF

Cultura do vrus in vitro em fibroblastos humanos

Deteco do genoma viral por PCR

III- Diagnstico da Infeco pelo citomegalovirus (CMV)

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A deteco de anticorpos pode ser feita quer para as IgG quer para as IgM. A deteco de IgM em geral problemtica visto que podem ocorrer falsos positivos (devido por exemplo presena de factor reumatide) ou falsos nega-tivos. Por outro lado, as IgM podem manter-se em circulao por vrios meses (anos, eventu-almente), podendo conduzir a falsas interpre-taes relativamente ao momento da primo-infeco. H a acrescentar ainda o facto de, em alguns casos de reactivaes, poderem surgir, de novo, IgM em circulao, conduzindo a falsas

interpretaes de primo-infeces.Por outro lado, a presena de IgG no recm nascido no tem qualquer significado, visto elas terem sido adquiridas passivamente a partir do sangue materno. Tambm nas crianas, a pes-quisa de IgM pode conduzir a interpretaes errneas, uma vez que a sua ausncia pode ser somente devido imaturidade do seu sistema imunolgico e no real ausncia de uma pri-mo-infeco.Por tudo isto, o uso da deteco de anticorpos especficos para o CMV (IgG ou IgM) carece de uma cuidadosa interpretao. Mais recente-mente, a quantificao do grau de avidez das IgG revelou-se extremamente til como auxiliar da interpretao dos dados serolgicos uma vez que permite, com alguma segurana, des-criminar as infeces antigas (h mais de 3 meses) das mais recentes. Pode-se assim con-firmar, ou no, a existncia de uma possvel pri-mo-infeco recente, o que, a verificar-se numa

mulher grvida, constitui um grave risco para o feto devido possibilidade de ocorrer uma in-feco congnita.No contexto do diagnstico da infeco por CMV na mulher grvida, h dois pontos de ex-trema importncia que convm aqui realar:

Somente a infeco congnita apresen-ta um risco elevado para o recm-nascido

Somente a primo-infeco apresenta ris-co para o recm-nascido

Da que o intuito do diagnstico vise, por um lado, averiguar da presena ou no de uma primo-infeco recente, e por outro, localizar a infeco durante o perodo de gestao ou fora dele.

O diagnstico de uma infeco pelo CMV pode ser feito:

No perodo pr-natal (durante a gesta-o), recorrendo ao sangue da mulher gr-vida e pesquisando a presena de IgG e IgM. Pretende-se nesta fase identificar uma pos-svel infeco primria.

Caso se suspeite de uma primo-infeco pelo CMV, essa suspeita ter de ser confir-mada recorrendo ao Western-blot para as IgM e avidez das IgG.

No perodo pr-natal recorrendo am-niocentese para confirmar a infeco fetal, atravs da tcnica de PCR ou cultura viral. De notar que, apesar de poder ter ocorri-

Figura 23- Esquema mostrando as consequncias de uma infeco primria na mulher grvida

Infeco primria durante a gravidez

40% fetos infectados 60% fetos no infectados

10% recm-nascidos sintomticos

A maioria afectando o SNC, surdez,

ictercia, trombocitopnia,

hepatoesplenomeglia

90% recm-nascidos assintomticos; dos

quais cerca de 10-20% apresentam

surdez, atraso mental a mdio prazo

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do uma primo-infeco na grvida, isso no significa forosamente que tenha havido in-feco fetal (40% de possibilidades; ver Fig. 23).

No perodo ps-natal precoce (at s 3 semanas de vida do recm-nascido), recor-rendo ao sangue ou (mais frequentemente) urina do recm-nascido. As tcnicas neste caso sero a pesquisa de IgM no soro (pou-co sensvel), ou de preferncia a cultura viral ou PCR a partir das clulas do sedimento urinrio.

No perodo ps-natal tardio (aps as 3 semanas de vida), recorrendo s mesmas tcnicas referidas anteriormente e, caso o resultado aponte para um infeco do recm-nascido, a pesquisa do genoma viral por PCR no sangue dos Guthrie Cards, com vista a distinguir uma eventual infeco con-gnita de uma infeco adquirida aps ou durante o parto.

Assim e em esquema, com as possveis inter-pretaes (ver tambm as Figuras 24 e 25):

A- Diagnstico serolgico pr-natal (tambm aplicvel a outros grupos para alm das mulhe-res grvidas); exemplos de situaes provveis:

Urina

Negativo Positivo

Sem infeco por CMV

Guthrie card - PCR

Negativo Positivo

Infeco perinatal Infeco congnita

Figura 24- Esquema do procedimento a seguir no diagnstico ps-natal, no caso da amostra ser co-lhida aps as 3 primeiras semanas de vida

IgM-/IgG+IgM-/IgG-IgM+/IgG- IgM+/IgG+

B- Diagnstico ps-natal

Mtodos Isolamento do vrus (mtodo de refern-

cia)PCRAmostraUrinaSalivaSangue

Quando: nas 3 primeiras semanas de vida

C- Diagnstico ps-natal tardio (aps as 3 se-manas de vida; Fig. 24)

Amostra: Sangue (Guthrie cards)Mtodo: PCR (pesquisa de DNA viral)

Teste de avidez das IgG:O teste de avidez das IgG usado, como j foi referido, para distinguir infeces que ocorre-ram menos de 3 meses das que ocorreram h mais tempo. Baseia-se no facto de os anticor-

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pos recentemente formados, terem uma me-nor afinidade para os respectivos antignios, do que os que resultam de infeces mais antigas. Esta diferena de afinidade pode ser posta em evidncia se, durante a incubao do soro com os antignios da fase slida, estiver presente um agente desnaturante (ureia, normalmen-te). A presena deste composto, ir dificultar a formao dos complexos antignio-anticorpo, diminuindo a quantidade de complexos forma-dos. No final, devido reduo de anticorpo li-gado, o resultado da reaco colorimtrica (ou outra, consoante o formato do teste usado) vir significativamente menor, quando comparado com a mesma incubao feita na ausncia de ureia. A razo do valor da reaco na presena da ureia, sobre o valor na ausncia desta ser, caso a avidez dos anticorpos seja baixa, signifi-cativamente inferior a 1 (na realidade ser infe-rior a 0,65). Desta forma possvel identificar os soros provenientes de indivduos que tiveram

uma infeco recente dos que tiveram uma in-feco h mais tempo.O recurso ao teste de avidez das IgG no caso do CMV (e em geral em todas as infeces virais) tem interesse sempre que os testes serolgi-cos apresentem resultado positivo ou duvidoso para IgM, com a presena bvia de IgG espec-ficas.Para alm do CMV, existem outras infeces virais nas quais se torna importante determi-nar a avidez das IgG para identificar infeces recentes:

RubolaVZVHSVHHV 6Parvovirus B19HCVEBVVrus do Sarampo

Figura 25- Esquema do procedimento a ter no caso de uma amostra de uma grvida apresentar IgM positiva

IgM positiva(desconhecimento do estadoimunitrio antes da gravidez)

Avidez IgG

Compatvel comInfeco Primria

Recente

0,8

Semanas de gestao

Western-blot IgM

Compatvel comInfeco antiga

ProvvelInfeco Primria

Recente

Pos Neg

0,6- 0,8>12

25


1- CaractersticasO vrus da Rubola pertence famlia Togaviri-dae, gnero Rubivirus. um vrus com invlucro e genoma RNA de cadeia simples, polaridade positiva.Transmite-se por gotculas de saliva ou pelas secrees naso-farngeas. O indivduo infecta-do contagioso 8 dias antes a 8 dias aps o incio dos sinais clnicos. O perodo de incuba-o de 14-21 dias (mdia: 15 dias), durante o qual ocorre a virmia e a disseminao do vrus. Os sintomas que esto em geral associados a esta infeco consistem em: erupo mculo-papulosa generalizada (Fig. 26), aparecendo em primeiro lugar na face e alastrando para o tronco e membros; artralgias e lifoadenopatias acompanhadas de febre moderada.Aps esta infeco inicial (infeco primria ou primo-infeco) surgem anticorpos protecto-res. Apesar disso, as situaes de reinfeco podem ocorrer, sendo estas, no entanto, em geral assintomticas. Devido presena de sintomatologia inespecfi-ca ou, na maior parte dos casos, ausncia de sintomatologia, o diagnstico da infeco pelo vrus da rubola s pode ser feito recorrendo aos dados laboratoriais. Estes envolvem a de-teco de anticorpos especficos (IgM e IgG), isolamento viral e deteco do genoma viral por RT-PCR.

2- Sndroma de Rubola congnitaDurante a virmia, o vrus da rubola pode, numa mulher grvida, atravessar a placenta e causar infeco fetal. Esta infeco ocorre em pratica-mente todos os casos numa situao de primo-infeco materna durante o primeiro trimestre de gravidez. Os riscos para o feto advm dos mecanismos patognicos envolvidos na infec-o por este vrus: morte celular, aberraes cromossomais e paragem do ciclo celular. Este conjunto de acontecimentos particularmente

gravoso durante a fase de embriognese (pri-meiro trimestre de gravidez), levando ao apare-cimento de graves mal-formaes. A partir do primeiro trimestre, o risco de mal-formaes decresce significativamente.Perante este cenrio, fcil perceber que o principal objectivo no diagnstico da infeco pelo vrus da rubola o de identificar primo-infeces na mulher grvida e de as localizar no perodo de gestao: primeiro trimestre, vs. segundo ou terceiro trimestre.

3- Diagnstico laborato-rialTestes serolgicos A deteco de anticorpos especficos constitui a base do diagnstico do vrus da rubola. Uma infeco recente pelo vrus da rubola pode ser identificada por:

Figura 26- Apresentao tpica da erupo mculo-papulosa caracterstica da infeco

pelo vrus da rubola

IV- Diagnstico da Infeco pelo vrus da rubola

26


Deteco de IgM especficasAumento do ttulo de anticorpos nos en-

saios de ELISA ou de IHA (inibio de hema-glutinao)

Seroconverso (ausncia de anticorpos na primeira amostra; presena de anticor-pos numa segunda amostra)

A acompanhar os testes serolgicos funda-mental obter o mximo de informao relativa-mente data e tempo da possvel exposio ao agente viral, bem como a data de incio dos sin-tomas (caso haja sintomatologia). Uma histria de vacinao anterior para o vrus da rubola ou de testes anteriormente feitos, so tambm auxiliares importantes na interpretao dos da-dos serolgicos.A amostra de sangue deve ser colhida o mais cedo possvel aps o possvel contgio, ou o mais precocemente possvel aps o inicio dos sintomas. Desta forma, por comparao com uma segunda amostra colhida numa altura ade-quada, ser possvel por em evidncia uma subi-da do ttulo de anticorpos em IHA ou em ELISA. Esta segunda amostra (S2) dever ser colhida, regra geral, 15 dias aps a primeira (S1). Em alternativa, caso S1 tenha sido colhida ainda durante o perodo de incubao (menos de 15 aps o possvel contgio), dever-se- colher S2 15 dias depois do incio dos sintomas (ou 15 dias aps o final do perodo de incubao no caso de se tratar de uma infeco assintom-tica).O soro S1 deve ainda ser colhido o mais preco-cemente possvel a fim de se poder observar um aumento ntido do ttulo e anticorpos no soro S2. De referir a propsito que o ttulo m-ximo do anticorpos atingido ao fim de 3 dias a 3 semanas aps o incio dos sintomas, depen-dendo do hospedeiro (Ver Anexo).A pesquisa de IgM um dado importante na identificao de uma primo-infeco. A sua in-terpretao, no entanto, requer algumas caute-las, principalmente se no houver dados relati-vos a duas amostras espaadas no tempo (S1 e S2). Assim, h que ter em conta os seguintes dados:

A durao em circulao das IgM , em geral, entre a 3 e as 6 semanas aps o incio dos sintomas, aps o qual tendem a desa-parecer

A sua presena pode ser detectada em situaes de reinfeces, embora com n-veis baixos e transitoriamente

Podem perdurar em circulao para alm do tempo normal

Por tudo isto necessrio por vezes recorrer a testes adicionais a fim de confirmar uma pri-mo-infeco recente. Uma vez mais, e tal como acontecia com o CMV, o teste da avidez das IgG pode ser extremamente til, uma vez que nos ir permitir distinguir infeces antigas de infeces recentes (ver captulo respeitante ao diagnstico do CMV).

Isolamento viralEsta tcnica usada normalmente nos casos de diagnstico ps-natal de uma infeco pelo vrus da rubola. Com ela possvel identificar infeces congnitas (adquiridas durante a ges-tao) e determinar a durao da excreo do vrus pelo recm-nascido. A amostra (zaragatoa naso-farngea) inoculada em clulas RK13 ou SIRC. Alternativamente, pode ser inoculada em clulas Vero seguida de passagem para RK13 ou SIRC. O ECP lento a aparecer e pouco per-ceptvel, pelo que a identificao do vrus em cul-tura , em geral, feito recorrendo a tcnica de IF ou de hemaglutinao.

Diagnstico da infeco congnitaO diagnstico de uma infeco adquirida duran-te a gestao feito, no recm-nascido, por:

Presena de IgM especfica no sangue do cordo ou no sangue do recm-nascido (a possibilidade de contaminao com san-gue materno tem de ser cuidadosamente excluda)

Deteco de IgG para alm do tempo normal de durao dos anticorpos mater-nos (para alm dos 6 meses)

Isolamento viral

O diagnstico de uma infeco congnita pode ser feito ainda durante o perodo pr-natal, re-correndo s seguintes tcnicas:

Pesquisa de IgM no sangue fetal. No en-tanto o feto no produz IgM em quantidade suficiente para serem detectadas antes da 22 semana de gestao

27


Isolamento do vrus da rubola a partir do lquido amnitico

Deteco do genoma viral ou de prote-nas virais a partir do lquido amnitico.

Perfil serolgico duma infeco pelo vrus da rubola

Primo-infeco

Reinfeco

28


1- CaractersticasO HBV um vrus com invlucro pertencente famlia Hepadnaviridae, com genoma DNA, par-cialmente bicatenrio.A infeco por este vrus pode apresentar-se clinicamente de duas formas: infeco aguda (com ou sem sintomatologia) e infeco crni-ca (com ou sem sintomatologia). Uma infeco aguda pode ou no evoluir para uma infeco crnica, dependendo do tipo de vrus e, princi-palmente, da resposta imunolgica do hospe-deiro. A transmisso ocorre por contacto com fluidos biolgicos, nomeadamente, sangue, es-perma, fluidos vaginais, saliva e leite materno. Aps um perodo de incubao longo (45-180 dias; em mdia: 60-90), surgem os sintomas que incluem ictercia (Fig. 27), fadiga, dores

abdominais, perda de apetite, nuseas e vmi-tos. Estes sintomas resultam da destruio dos hepatcitos infectados, mediada pela resposta imunolgica do hospedeiro (reaco inflamat-ria e resposta por linfcitos T-citotxicos). Esta resposta imunolgica vai, na maioria dos casos, ser suficiente para a resoluo da infeco

com eliminao do agente viral, convalescena e cura. No entanto, em cerca de 10% dos ca-sos, a resposta imunolgica menos vigorosa, dando origem a sintomas mais atenuados, e favorecendo a manuteno da infeco. Nes-tas circunstncias no se d a eliminao viral, havendo lugar ao surgimento de uma infeco crnica no seguimento da infeco aguda no resolvida. Esta infeco crnica pode conduzir a uma situao de hepatite crnica que, por sua vez, pode conduzir a cirrose heptica e a carci-noma hepatocelular.

2- Diagnstico da infec-o pelo HBVUma hepatite comea por ser diagnosticada clinica e bioquimicamente (aumento das tran-saminases e bilirrubina). No entanto, devido s vrias causas possveis para essa hepatite, somente atravs do diagnstico laboratorial possvel identificar o agente causal e, no caso das infeces provocadas pelo HBV, distinguir infeces agudas de infeces crnicas. O diagnstico laboratorial da infeco pelo HBV baseia-se na deteco serolgica de antignios virais e dos respectivos anticorpos, bem como do DNA viral (constituinte do genoma viral). Os antignios que so possveis de detectar em cir-culao so: AgHBe e AgHBs; por parte dos an-ticorpos podem-se detectar: anti-HBs, anti-HBe e anti-HBc, (IgG e IgM). Vejamos as principais caractersticas de cada um destes marcado-res:

1- AgHBs: antignio de superfcie do HBVJuntamente com o DNA viral, o primei-

ro marcador da infeco a ser detectvel (2-6 semanas antes dos sintomas)

A sua presena, juntamente com o anti-corpo anti-HBc, indica infeco activa

A sua persistncia em circulao por

Figura 27- Ictercia devida a hepatite provocada por infeco pelo HBV

Figura 27- Ictercia devida a hepatite provoca-da por infeco pelo HBV

V- Diagnstico da Infeco pelo vrus da hepatite B

(HBV)

29


mais de 6 meses aps o incio dos sintomas, indica uma infeco crnica

Em contrapartida, a sua desapario do soro sugere a resoluo da infeco com a consequente convalescena e cura. Esta desapario ocorre, em geral, ao fim de 4-6 meses aps o aparecimento dos sintomas e seguida, aps algumas semanas (por ve-zes meses), pelo aparecimento em circula-o do respectivo anticorpo (anti-HBs).

produzido em grande quantidade, po-dendo por isso existir em circulao no as-sociado a partculas virais.

2- AgHBe: antignio de replicao viral considerado um marcador de replica-

o e de infecciosidade do HBV, indicando, a sua presena no soro, que se trata de uma hepatite activa

Ag HBs

Ag HBe

Anti-HBc IgM

Anti-HBc IgG

Anti-HBe

Anti-HBs

DNA-HBV

Interpretao

+ -/+ - - - - + Fase de incubao

+ + + + - - + Fase aguda

+ + - + -/+ - +Infeco crnica c/ replicao viral

+ - - + -/+ - +Infeco crnica c/ replicao viral (mutantes do pr-core)*

+ - - + -/+ - -Infeco crnica s/ replicao viral (portador assintomtico)

- - - + +/- - -Perodo de janela ou anti-HBs com ttulo baixo

- - - + +/- + -Imunidade aps infeco pelo HBV

- - - - - + - Imunidade aps vacinao

- - - - - - - Ausncia de contacto prvio

A sua presena est geralmente asso-ciada com a deteco de DNA viral no soro.

Aparece em circulao pouco tempo aps o aparecimento do AgHBs, e normal-mente antes do aparecimento dos sinto-mas.

No caso de infeco aguda com reso-luo, desaparece de circulao antes do AgHBs, dando-se a seroconverso para anti-HBe.

Deriva do AgHBc por modificaes ps-traduo

Nos indivduos infectados por vrus com mutaes na regio promotora do gene core e pr-core (denominados mutantes do pr-core), o AgHBe pode no ser detectado em circulao

Tabela 3- Interpretao dos marcadores serolgicos da infeco pelo HBV

* Estes mutantes podero prevalecer no incio da infeco (estirpe infectante), ou serem seleccio-nados no decurso da infeco. Tm sido associados a situaes mais graves como hepatites fulminan-tes, uma taxa mais elevada de cirrose e reactivaes mais frequentes ao longo da infeco crnica.

30


Soro

AgHBs

Anti-HBc

Anti-HBc

Anti-HBs

Anti-HBs

Susceptvel Imunedevido

a vacinao**

Quatrointerpretaes

possveis*

Imunedevido

a infeconatural

Perodode

incubao

Anti-HBc IgM

Anti-HBs -

Anti-HBs -

Infecocrnica

Infecoaguda

Neg

Neg

Neg Neg

Neg

Neg

Pos

Pos

Pos Pos

Pos

Pos

* Convalescena de uma infeco aguda (perodo de janela); Infeco antiga (a sensibilidade do tes-te no suficiente para detectar as baixas concentraes de anti-HBs); Susceptvel (falso positivo para anti-HBc); Infeco crnica (nveis indetectveis de AgHBs).** Nveis protectores de anti-HBs pressupem um ttulo 10 mU/ml. O teste ps-vacinao deve ser efectuado 1-2 meses aps a ltima (3) dose da vacina.

Figura 28- Algoritmo do diagnstico da infeco pelo HBV

31


3- AgHBc: antignio do core um antignio intracelular que detec-

tado nos hepatcitos infectados mas no no soro

4- Anti-HBs: anticorpo especfico do AgHBsMarca a recuperao e resoluo da in-

feco pelo HBV, podendo persistir por toda a vida, conferindo imunidade protectora.

Em cerca de 10% dos pacientes com he-patite aguda pelo HBV no se desenvolve o anti-HBs (infeces crnicas)

Pode coexistir com o AgHBs em situa-es excepcionais onde tenha havido lugar a sobre-infeco por subtipos diferentes de vrus.

Deve estar presente aps vacinao efi-caz.

5- Anti-HBc: anticorpo especfico do AgHBc IgM

Predomina durante a fase aguda da in-feco

o primeiro anticorpo a ser detectadoSurge cerca de 1 ms aps o apareci-

mento do AgHBs, desaparecendo, em geral, ao fim de 6 meses.

Em geral a sua deteco significa uma infeco aguda pelo HBV

Pode, no entanto, persistir, em baixos t-tulos, nas infeces crnicas.

IgGNo indicador de imunidade, nem in-

duzido pela vacinaoPode aparecer isoladamente durante o

perodo de janela, quando o AgHBs j no detectado e o anti-HBs ainda no apareceu.

Em certas circunstncias pode ainda surgir isoladamente muitos anos aps a in-feco crnica pelo HBV (quando o anti-HBs tem nveis indetectveis) ou durante a infec-o crnica quando o AgHBs apresente n-veis abaixo do limite de deteco.

6- Anti-HBe: anticorpo especfico do AgHBeSurge em circulao, nos casos de reso-

luo da infeco, antes do anti-HBsPode persistir durante anos aps a reso-

luo de uma infeco aguda por HBVNormalmente vem associado ao declnio

da infecciosidade e o seu aparecimento ge-ralmente corresponde resoluo da infec-o activa

7- DNA-HBV: genoma do HBVAparece no soro ao mesmo tempo ou

ligeiramente antes do AgHBs o indicador mais sensvel da replicao

viral activaOs doentes AgHBe+ so, por regra, po-

sitivos para o DNA-HBV, excepto os mutan-tes do pr-core que no possuem AgHBe

Desaparece nos casos de infeco resol-vida (auto-limitada).

A tabela 3, apesar de no ser exaustiva em to-das as circunstncias que podem estar envolvi-das numa infeco pelo HBV, d uma ideia da complexidade de interpretao dos dados sero-lgicos resultantes de uma infeco pelo HBV. No entanto, a maioria dos casos de diagnstico, podero ser interpretados usando um algorit-mo mais simplificado (Fig. 28). Este algoritmo, convm realar, no substitui a tabela anterior. Ver ainda o esquema duma infeco aguda e duma infeco crnica na seco Anexos.

Definies de alguns termos usados na infec-o pelo HBV:

Hepatite B crnica: doena necro-infla-matria crnica do fgado causada por uma infeco persistente pelo HBV. Esta hepatite crnica pode ser AgHBe+ ou AgHBe-

Portador assintomtico: Infeco persis-tente do fgado pelo HBV sem doena ne-cro-inflamatria significativa associada. Tm AgHBs+ e AgHBe-.

Hepatite B resolvida: tambm denomina-da hepatite auto-limitada, indica a existncia de uma infeco prvia pelo HBV sem evi-dncia, no presente, de sinais virolgicos, bioqumicos ou histolgicos de infeco.

32


1- CaractersticasO vrus da imunodeficincia humana (HIV) per-tence famlia Retroviridae, sub-famlia Ortho-retrovirinae e ao gnero Lentivirus. Existem dois tipos, HIV-1 e HIV-2, e so ambos os agentes causais do sndroma de imunodeficincia adqui-rida (SIDA).A estrutura da partcula viral (Fig. 29) revela a presena de um invlucro de natureza lipdica, onde se inserem duas protenas de origem viral: a glicoprotena de superfcie (SU) e a glicoprote-na transmembranar (TM). A sua cpside tem um formato cnico, contendo no seu interior as duas molculas de RNA genmico e vrias enzi-mas necessrias ao ciclo replicativo viral, nome-adamente a retrotranscriptase (RT). Esta DNA polimerase RNA-dependente caracterstica de todos os retrovrus e sintetiza uma cadeia de DNA a partir de um molde de RNA.

Figura 29- Esquema da partcula viral do HIV

2- Organizao genmica

A sua estrutura genmica (Fig. 30) revela uma organizao complexa, com trs genes estru-turais - gag, pol e env - que codificam para as protenas que constituem a partcula viral. Para alm destes, o genoma do HIV possui mais 6 genes, ditos reguladores ou acessrios, que codificam para protenas importantes no ciclo replicativo viral: vif, vpr, vpu (s no HIV-1), vpx (s no HIV-2), tat, rev e nef. Finalmente, o geno-ma proviral ainda composto por duas regies no codificantes, iguais entre si, localizadas nas duas extremidades desse mesmo genoma. Es-sas regies, denominadas LTR (Long Terminal Repeat), contm, entre outros elementos, as regies de ligao de factores de activao ce-lulares e virais, funcionando como regies pro-motoras.

VI- Diagnstico da Infeco pelo HIV

Figura 29- Esquema da partcula viral do HIV

33


3- Ciclo replicativoDurante o seu ciclo replicativo, o HIV infecta c-lulas que possuam na sua membrana os recep-tores CD4 e um dos receptores das quimioci-nas (normalmente o CCR5 ou o CXCR4). Devido a isso, o seu tropismo celular in vivo resume-se praticamente aos linfcitos T-auxiliadores (ou T-CD4+), aos moncitos, aos macrfagos e s

Figura 30- Organizao genmica do HIV-1 e HIV-2. A cheio esto representados os genes estruturais e a tracejado os genes reguladores e acessrios. Esto referidos ainda, os principais antignios virais,

codificados por cada gene estrutural

p55; p24; p18p68; p52; p34 gp160; gp120; gp41

p56; p26; p16 p68; p52; p34gp140;gp105;gp36

Figura 30- Organizao genmica do HIV-1 e HIV-2. A cheio esto representados os genes estruturais e a tracejado os genes reguladores e acessrios. Esto referidos ainda, os principais antignios

virais, codificados por cada gene estrutural

Virio

maduro

Virio

imaturo

adsoro

descapsidao

sada do

ncleo

transporte

para o ncleo

reunio das protenas e

libertao

core PIC

CD4

CCR5 ou CXCR4

citoplasma

ncleo

RE, Golgi

RT

Transcrio

reversa

IN

IntegraoNef

Rev

Tat

Processamento

do env

Gag

Reunio das

protenas

Vif, Vpr

e Vpu

PR

Clivagem

Virio

maduro

Virio

imaturo

adsoro

descapsidao

sada do

ncleo

transporte

para o ncleo

reunio das protenas e

libertao

core PIC

CD4

CCR5 ou CXCR4

citoplasma

ncleo

RE, Golgi

RT

Transcrio

reversa

IN

IntegraoNef

Rev

Tat

Processamento

do env

Gag

Reunio das

protenas

Vif, Vpr

e Vpu

PR

Clivagem

Figura 31- Esquema representando as principais etapas do ciclo replicativo do HIV. RT=retrotranscriptase; core= nucleocpside; PIC= complexo de pr-integrao; IN= integrase; RE=

retculo endoplasmtico; PR= protease

Figura 31- Esquema representando as principais etapas do ciclo replicativo do HIV. RT= retrotrans-criptase; core= nucleocpside; PIC= complexo de pr-integrao; IN= integrase; RE= retculo endo-

plasmtico; PR= protease

clulas dendrticas.Resumidamente, o ciclo replicativo do HIV (Fig. 31) pode ser dividido em duas fases: a primeira que culmina com a integrao do genoma pro-viral (j sob a forma de DNA de dupla cadeia) no genoma celular; a segunda que culmina com a produo de novas partculas virais. Durante a primeira fase, intervm quase exclu-sivamente protenas e enzimas de origem viral.

34


Assim, aps a ligao (denominada adsoro) do vrus clula, por intermdio da interaco entre a glicoprotena SU e o receptor CD4, d-se a fuso do invlucro viral com a membrana celular. Nesta fuso intervm as duas glico-protenas do invlucro viral (SU e TM) e os re-ceptores celulares (CD4 e CCR5 ou CXCR4). Aps esta fuso, a nucleocpside libertada no interior do citoplasma celular, iniciando-se a retrotranscrio do RNA genmico em DNA de dupla cadeia. Esta retrotranscrio me-diada pela enzima RT. O DNA de dupla cadeia assim formado (denominado DNA proviral), ir ser integrado no genoma da clula hospedeira por aco de uma outra enzima viral denomina-da integrase e que tambm est presente na partcula viral infecciosa. A partir daqui o DNA proviral do HIV pode seguir dois caminhos: ou a clula est activada e, nesse caso, existem factores de transcrio celulares que induzem a transcrio desse DNA, dando assim origem aos RNAm que sero traduzidos em prote-nas que daro forma partcula viral; ou, pelo contrrio, a clula no est activada e, nessa circunstncia, o DNA no ser transcrito, no havendo lugar produo de novas partculas virais. O DNA proviral mantm-se no entanto in-tegrado, sendo por isso transmitido s clulas filhas em cada diviso celular, perpetuando-se no hospedeiro. Desta forma, num indivduo in-

Figura 32- Esquema da evoluo, ao longo do tempo, da infeco pelo HIVFigura 32- Esquema da evoluo, ao longo do tempo, da infeco pelo

HIV

Figura 33- Esquema da reaco imunoenzimtica com leitura final colorimtrica

Figura 33- Esquema da reaco imunoenzimti-ca com leitura final colorimtrica

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fectado possvel detectar-se o DNA proviral nas clulas alvo do HIV: linfcitos e moncitos (clulas mononucleadas do sangue perifrico - CMSP).

4- Patognese da infec-oA infeco pelo HIV uma infeco dita crnica/persistente uma vez que o hospedeiro infectado incapaz de eliminar o agente infeccioso. O per-

curso patognico desta infeco passa por trs fases principais e sequenciais (Fig. 32):

Fase inicial ou primria: caracterizada por uma elevada replicao viral e ausncia de resposta imunolgica por parte do hos-pedeiro

Fase assintomtica ou de latncia clni-ca: caracterizada por cargas virais (concen-trao de vrus no plasma) baixas (por vezes indetectveis) devido forte resposta imu-nolgica do hospedeiro

Fase sintomtica: aparecimento de in-feces oportunistas devidas diminuio da resposta imunolgica, devida, nomeada-mente, diminuio dos linfcitos T-CD4+,

a qual foi ocorrendo gradualmente ao longo da fase assintomtica.

5- Diagnstico da infec-o pelo HIV

Os mtodos de diagnstico da infeco pelo HIV dividem-se em dois grupos:

Mtodos directos, onde se pe em evidncia a

presena da partcula viral ou de componentes dessa partcula viral:

Isolamento viralPCRAgp24

Mtodos indirectos, onde se pe em evidncia a presena de anticorpos especficos para os antignios virais

Testes de rastreioTestes de confirmao

A forma mais normal e rotineira de se fazer o diagnstico da infeco pelo HIV pesquisan-do a presena de anticorpos especficos. Para

Figura 34- Esquema da reaco de WB, desde a separao das protenas, em gel de poliacrilamida, at deteco dos anticorpos especficos para cada antignio

Figura 34- Esquema da reaco de WB, desde a separao das protenas, em gel de po-liacrilamida, at deteco dos anticorpos especficos para cada antignio

36


esse objectivo usa-se como amostra o sangue, mais propriamente o soro/plasma, e um dos testes de rastreio disponveis no mercado. Es-tes testes de rastreio baseiam-se em ensaios imunoenzimticos com uma leitura final colori-mtrica (Fig. 33) ou fluorimtrica. Em qualquer dos casos o sinal detectado no final da reaco imunoenzimtica directamente proporcional quantidade de anticorpos presente na amos-tra. A presena de anticorpos numa amostra suficiente, devido s caractersticas da infeco pelo HIV, para concluir que se trata de algum infectado pelo HIV. Isto s no verdade no caso de crianas recm-nascidas cujas mes sejam seropositivas para o HIV, uma vez que os anticorpos maternos (IgG) so transferidos passivamente atravs da placenta. Assim, a presena de anticorpos, antes da idade de 18 meses, no significa necessariamente a exis-tncia de uma infeco pelo HIV.Os testes de rastreio apresentam como carac-tersticas principais o terem uma sensibilidade de 100% (no admissvel ocorrerem falsos negativos) e uma especificidade abaixo dos

Figura 35- WB positivo para o HIV-1; notar a

localizao dos vrios

antignios virais

Figura 35- WB po-sitivo para o HIV-1; notar a localiza-o dos vrios an-

tignios virais

100%. Este ltimo facto faz com que possam ocorrer reaces falsamente positivas, pelo que qualquer resultado positivo no teste de ras-treio impe a sua confirmao por testes com uma especificidade maior.Estes testes de confirmao esto, hoje em dia, limitados ao teste de Western-blot (WB). Neste teste ocorre igualmente uma reaco imunoen-zimtica em fase slida (tal como nos testes de rastreio), mas em que possvel descriminar para que antignios virais existem anticorpos na amostra em estudo. Isso possvel porque os antignios virais so previamente separados entre si (devido aos seus diferentes pesos rela-

Figura 36- Seroconverso numa infeco pelo HIV-1.As amostras de soro colhidas ao longo dos vrios

dias aps a infeco (referidos direita), foram testadas em simultneo. A ltima tira de WB

representa um controlo positivo

Figura 36- Seroconverso numa infeco pelo HIV-1. As amostras de soro colhidas ao longo dos vrios dias aps a infeco (referidos direita), foram testadas em simultneo. A l-tima tira de WB representa um controlo po-

sitivo

ControloHIV-2 +HIV-1 +

Figura 37- Teste de Pepti-LAV. Resultados (da esquerda para a direita): HIV-1 +; HIV-1 e HIV-2 +;

HIV-1 +; HIV-2 +

Figura 37- Teste de Pepti-LAV. Resultados (da esquerda para a direita): HIV-1 e HIV-2 +; HIV-1

+; HIV-2 +

37


tivos), atravs de uma electroforese em gel de poliacrilamida (Fig. 34), antes de serem trans-feridos para o suporte slido final (neste caso, uma membrana de nitrocelulose).

Consoante o perfil de anticorpos presente na amostra (ou seja dependendo para quais dos antignios existem anticorpos), assim os soros sero classificados como positivos, negativos ou indeterminados. Os critrios para esta clas-sificao so os preconizados pela OMS e so os seguintes:

Positivo: presena de anticorpos para, pelo menos, duas das trs protenas codifi-cadas pelo gene env (gp160, gp120 e gp41, no caso do HIV-1; gp140, gp105 e gp36, no caso do HIV-2), independentemente se exis-tem, ou no, anticorpos para as restantes protenas dos outros genes (ver Fig. 35 e Fig. 30 para tomar conhecimento de quais

os antignios virais codificados por cada gene estrutural e da sua localizao nas ti-ras de WB)

Negativo: ausncia de anticorpos para qualquer das protenas virais. Este resulta-do negativo anula a positividade detectada no teste de rastreio.

Indeterminado: presena de anticorpos para uma ou mais protenas virais mas em que o critrio de positividade no preen-chido.

Se a interpretao dos resultados positivos e negativos se revela simples, j a classificao da serologia em indeterminada revela-se pro-blemtica, uma vez que no permite a conclu-so sobre o diagnstico do indivduo em estudo. As razes para uma serologia indeterminada podem ser:

Seroconverso aps infeco recente pelo HIV

Reaces cruzadas de certos anticorpos com os antignios do HIV

Em qualquer dos casos o procedimento a se-guir passa por:

Pedir uma nova amostra passadas 4-6 semanas

Recorrer, na primeira amostra (e even-tualmente na segunda), aos mtodos direc-tos de diagnstico

Caso se trate de uma seroconverso, no s possvel detectar a presena do HIV pelos mto-dos directos, como, na segunda amostra, ser possvel de observar uma evoluo do perfil de

Teste de rastreio de 4

gerao positivo

Agp24 c/ dissociao

Pepti-LAV

HIV-1 + HIV-2 + HIV-1 e HIV-2 +

NegNegPos

WB parao HIV-1

WB parao HIV-2

WB parao HIV-1e HIV-2

Figura 38- Interesse do Pepti-LAV no rastreio de anticorpos especficos para o HIV

Figura 38- Interesse do Pepti-LAV no rastreio de anticorpos especficos para o HIV

Figura 39- Esquema da reaco de PCR (A) e resultado final da amplificao de um fragmento de DNA com cerca de 300 pb, visualizado num gel de agarose e

corado com brometo de etdeo (B)

A B

Figura 39- Esquema da reaco de PCR (A) e resultado final da amplificao de um fragmento de DNA com cerca de 300 pb, visualizado num gel de agarose

e corado com brometo de etdeo (B)

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anticorpos, presentes na amostra, pela tcnica de WB.Se, ao invs, se tratar de uma reaco cruzada, os testes de diagnstico directo no iro dar qualquer resultado positivo, bem co

manual - virologia prática

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