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VIII Workshop métodos rápidos y automatización en MICROBIOLOGÍA alimentaria

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International cooperation in food microbiology. Cécile Lahellec . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

La Polymerase Chain Reaction (PCR). Armand Sánchez Bonastre . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

Organismos Modificados Genéticamente (OMG): “Detección, Legislación y Evaluación de riesgos”. Teresa Esteve. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

Estudios de equivalencia europeos entre métodos para enumerar Escherichia coli y enterococos en aguas de baño. Ferrán Ribas Soler . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

Magneto Inmunosensores y Genosensores para bacterias patógenas.María Isabel Pividori y Salvador Alegret . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

Control de calidad interno en laboratorios de microbiología. David Tomás Fornés. . . . . . . . 24

Sistemas BD para identificación. BD (Becton, Dickinson and Company) . . . . . . . . . . . . . . . 26

Modernos métodos validados de detección y recuento de microorganismos: máximas eficiencia, exactitud y comodidad. Laboratorios MICROKIT S.L. . . . . . . . . . . . . . 27

Sistema RiboPrinter® para la caracterización genética microbiana. Oxoid S.A.. . . . . . . . . . 28

Optimización en un laboratorio de calidad: análisis de patógenos. Bioser S.A. . . . . . . . . . . 29

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Good morning . It is my very great ple-asure to be here today and I would li-ke to thank the organizers for invitingme once more in Barcelona to presentthe introductive paper to theInternational workshop on Rapid me-thods and automation in Food micro-biology. The title of my presentation today is the“ International Cooperation in FoodMicrobiology”which, I guess, does notlooks so strange as an introductionto an International workshop . In fact,looking at my past professional life andcomparing with other people aroundme , I can’t do otherwise as to be con-victed that , from a long time, I havebeen lucky to be introduced in an inter-national world . So, I thought it wouldbe interesting , during a few minutes ,to look at the exceptional position wehave, as Food microbiologists , in theworld of globalization ; some of youhave probably a wider experience thanmine in that field ; the youngest maketheir first steps in that new world . WhatI propose to you this morning is just tohave a look to some of the possibili-ties of international cooperation wemay have in our specialized field. In a first part, I would like to share withyou some views referring especially tomy personal experience . In a second part, I shall describe withmore details some of the internationalorganizations connected with Food mi-crobiology . The last part will be a short conclusion.

From now, we are all involvedin International cooperation inFood microbiologyAs we are participating in anInternational workshop , all of us are,today , involved in international coo-peration… of course, there is always afirst step for everything and I think it isnice to remember the first foreignscientist we met; personally, I like to doso: it was in December 1966; at thattime, I was working in PloufraganBrittany); there was no laboratory inthe place, only a control lab far from

a few kilometers. My project was towork about quality of poultry meat andthe most important seemed to help in-dustrials improving the shelf -life ofpoultry meat, as it was sold as refri-gerated while the conditions of proces-sing were not so good; I had to makechoices about the type of sample, thetypes of microorganisms to be studied,the statistics to be applied; so, it wasnecessary for me to receive some ad-vice, even before building the labora-tory... it was the beginning of the ad-venture...So my director suggested me to wri-te to a scientist who was well known inthat field: Dr Ella. M Barnes; she wasworking at the Food Research Institutein Norwich (UK) and, each year, shegave a course in Pasteur Institute inLille on poultry meat microbiology; im-mediately, she proposed me to welco-me me in her laboratory for a few days;she was so nice as to make me showas well the laboratory work as the workin the processing plants; she also ga-ve me some very good advice to be-gin some applied research in that fieldand invited me to go back and discussof my projects with her later on; so I didand we had very fruitful discussions;that helped me a lot to build the basisof the future work of a laboratory whichhas been expanding its activities alongthe years... Maybe it is not possible foreverybody to have such an experien-ce but, anyway, I think the first interna-tional contacts may be very importantin our lives. Later on ,the laboratorywas built and we began to work, thenpresent our results during internatio-nal symposia.

The participation in international me-etings is of major importance; perso-nally, the first international symposiumI have been participating in, was asymposium on quality of poultry meatwhich was held in Roskilde ( DK) in1973 under the World’s PoultryScience Association; many others fo-llowed, of course but I can’t forget themeeting on “Rapid methods and au-tomation in Food microbiology” whichwas held in Kiel ( D) in 1974. I did notpresent anything on that day; I wasjust learning and listening at the diffe-rent papers when, suddenly, we hadwe had a very interesting and unusualpresentation: the speaker, a youngAmerican Chinese was quite “dan-cing”, showing beautiful slides: the mi-niaturized methods used to detect orenumerate microorganisms frompoultry was the subject of the presen-tation: he was using microplates inste-ad of tubes and a micro-inoculator ins-tead of platina loops… As I was wor-king on poultry meat microbiology andwas very much interested by rapid andeconomic methods in order to study alarge number of strains simultane-ously, I met Dr Fung at the end of thesession, asking for informations andreprints; I must say it was the begin-ning of a long story... first because hesent me reprints and even his thesisand, from that time we became verygood friends but I must say, too , thatit opened me new horizons, new con-tacts and a willingness to communi-cate about the possibilities which we-re offered to food microbiologists: theycould use rapid method which were, tillthat period, used in the medical field

International cooperation in foodmicrobiology

Cécile Lahellec Honorary research director AFSSA (French Food Safety Agency) France,[email protected] workshop on Rapid methods andautomation in Food microbiology –Barcelona – 24/11/2009

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only... for me, it was the beginning ofa long story in science and friends-hip….Of course, to give and receive thebest, we have to be able to communi-cate; in our world, that means to lis-ten, to understand, to answer in a pro-per language... I must say it was notso easy in Europe a few decades agoand, the first time I went to UnitedStates of America (that was in 1980, inDr’s Fung laboratory , I realized thateverybody was speaking English andthat the contacts were far more easierfor Americans to communicate with co-lleagues than for Europeans to com-municate with colleagues in Europe.Anyway, knowledge and friendship,usually comes from those contacts.Some of us have organized such me-etings and the organization is surelythe best school of International coope-ration; Josep and Marta surely knowquite everything about that; but we arepart of a chain: we receive advice andexamples from others: we have heretoday a perfect example as Josepwent to KState and participated in aworkshop before launching the works-hop here, in Barcelona... some of ushave, maybe, the same type of ex-perience.In that first part, if you don’t mind, Iwould like to add some words aboutmy personal professional life:Quite early, I have been requested toparticipate in meetings in Brussels, asit was decided at the beginning of se-venties to realize common experi-ments during which, using the sameprotocol in each country, we couldcompare the results and draw someconclusions about the type of sample,the effect of air or water chilling… Atthat time, we had to share experien-ce and results, of course but, veryearly, it became obvious we had to tryto understand as well as possible theway of thinking, the way of working ofour colleagues, the environment inwhich they were living and working ,some elements of economy, of politicssometimes; that was the guidelines

we had to consider as rules... Thatwas really important at that time es-pecially when, through those experi-ments on poultry meat and processingplants , we were somewhat like buil-ding one small part of the EuropeanCommunity.I have to specify the good conditionsin which we were working: we had thepossibility to visit the laboratories of fo-reign colleagues, but also the differentprocessing plants; those visits werereally very fruitful in all the ways of ex-change and knowledge...I spoke earlier about my first participa-tion to an international meeting on ra-pid methods and automation in Foodmicrobiology, but, the necessity of va-lidating the methods used appearedquite immediately, as similar resultscan be obtained only when the samemethods are used in different labora-tories; that was the reason why I be-came involved in the standardizationand, as I was in charge of the CentralFood Hygiene Laboratory in Paris, Iwas requested to be the convenor ofthe working group 6 of technical com-mittee 275 of CEN ( Comité Européende Normalisation); at that perio , I al-so participated to some meetings ofCodex alimentarius, some of theWorld’s Health Office; I have also be-en involved in some European mee-tings before the creation of the FoodSafety Agencies , gave some trainingto Vietnamese students... that wouldbe very long to describe, but I think itmay be useful to focus on some ofthem.

Short description of some in-ternational organizations con-nected with Food microbiology

ISO and CEN As you probably know, different officialbodies are concerned by standardiza-tion under different aspects for diffe-rent types of production and every-body knows ISO, i.e. the InternationalStandardization Organization; this or-ganization was created in October

1946; its seat is located in Geneva (CH ); the creation results from the fu-sion of two organizations: ISA, which was the InternationalFederation of National Associations ofStandardization, founded in New-Yorkin 1926, and UNSC, i.e. Committee forcoordination of standardization ofUnited Nations, created in 1944.The first national Assembly was heldin 1949 in the great amphitheater inSorbonne ( Paris) ISO is composedof 247 committees. All standards areobtained by consensus; however, theyare not mandatory...Concerning Food microbiology thetechnical committee in charge of isTC34 / SC9; the actual president isBertrand Lombard (F); the meetingsare held in a different country each ye-ar; for example , the last meeting washeld in Valencia ( Spain) and the orga-nizer was David Tomas ( I must say itwas very nice to participate in a mee-ting organized by such a dynamicscientist); next time, the meeting willbe held in Argentina; as usual, it will bea joined ISO/CEN meeting. From a general point of view, the CEN,Comité Européen de Normalisation (inEnglish “European Committee forStandardization“) has been created in1961 in order to harmonize the stan-dards elaborated in Europe; that me-ans that the standards are mandatoryin all countries of EC (at the contrary,the standards which are elaborated byISO are facultative, which means agreat difference… All members aremembers of ISO as well. The seat of CEN is located in Brussels(B).In the beginnings, it was createdby the national organisms for standar-dization from France, Germany andBenelux countries. Nowadays, the fullmembers are the 27 countries of EUand the three contries of AELE (Association Européenne de LibreEchange) which own such an orga-nism (Switzerland, Norway andIsland). CEN elaborates technicalstandards in favor of international tra-de.

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CEN/TC275/WG6 was created in1993 and I was nominated as the con-venor; nowadays , Alexandre Leclercqfrom Institut Pasteur in Paris, is incharge of the group. From the beginnings, one main prin-ciple has been followed during thework of this group, i.e. the ViennaAgreement; this agreement requiresthat, as often as possible, ISO me-thods are taken into account.In order to avoid any overlap, there isalso an agreement between differentgroups of CEN that only one group isin charge of a particular method . Forexample, TC302 in charge of milk anddairy products analysis may chooseone specific technique . In this case,it requests TC 275/WG6 to refer to thisspecific technique in the standard me-thod. The necessity of taking into ac-count the experience of other groupsaround the world, for example AOACand IDF (International DairyFederation), has also been emphasi-zed from the beginning and, presently,the basis for a good cooperation havebeen set up. However, whatever the method, itmust be validated by setting up inter-laboratory tests and compare the pro-posed method with the Referenceone... This is the reason why, underWG6 of CEN/TC275, a proposal for astandard method entitled “Evaluationof microbiological methods for detec-tion and/or enumeration of microbiolo-gical contaminants in foods“ has be-en presented and accepted as an EUproject SMT4/CT96-2098. The projecthas been carried on from 1996 to2000; the results for all types of conta-minants studied have been acceptedby the equivalent group of ISO and pu-blished in the “International Journal ofFood Microbiology” and later on, adap-ted as Codex standards. They havebecome Reference methods, whichwas essential for the development ofalternative methods…I have also to add something very im-portant : some trials were organized byEuropean and US laboratories in order

to compare the ISO method for the de-tection of Salmonella (6579 2002)with the AOAC method. Finally, ISO 6579:2002 was recom-mended to be adopted as officialFirst Action for the analysis of freshcheese, fresh chilled and frozenpoultry and dried egg product.Giving performance criteria to referen-ce method was, of course the first stepto make alternative methods accep-ted.During the whole week, you will studya lot of wonderful alternative methodswho present a lot of advantages ver-sus the reference ones: precision, ra-pidity and reproducibility, cost, simpli-city of use, training of technicians,quality and stability of reagents, qua-lity of after sales service… but theeventuality of acceptance of new tech-nologies, including PCR, as standardmethods was obtained after long dis-cussions Finally, An important resolution was taken du-ring the joined meeting ofISO/TC34/SC9 and CEN/TC275/WG6held in Parma (It) in April 2004.“Each time a standard method is beingrevised, the possibility of using newtechnologies, including PCR, must beexamined by comparing results withthose obtained when using the officialconventional method.For a given microorganism, in orderto complete the existing method, thedevelopment of standardised methodsbased on new technologies can beproposed when the purpose to be ob-tained (for example pathogenicity le-vel) makes it necessary .When new technologies, includingPCR, are used as alternative methods,they must be validated against the re-ference method .Those sentences look probably asquite simple, but I am sure you can-not imagine the number of hours ofdiscussions which were necessaryto obtain a consensus: that is “ in-ternational cooperation“.But the hours of discussions were veryfruitful... as, finally, rapid methods we-

re accepted according to the EC re-gulation 2073 15 December 2005 con-cerning microbiological criteria:“Test results are dependent on theanalytical method used and, therefore,a given reference method should beassociated with each microbiologicalcriterion. However, Food businessoperators have the possibility to useanalytical methods other than the re-ference method, in particular more ra-pid methods, as long as the use of the-se alternative methods provide equi-valent results“.Those informations are given in orderto show the usefulness of the standar-dization bodies but, in fact , there area lot of interconnexions between a lotof international organizations. To give an example, during the lastjoint meeting of ISO TC34/SC9 andCEN TC275/WG6 , the last part of themeeting concerned the liaison withother organizations: International Dairy Federation ( IDF ),Codex Committee on Food Hygiene ,AOAC (Association of OfficialAnalytical Chemists), WHO (WorldHealth Organization), IUMS(International Union of MicrobiologicalSocieties), OIE (Office Internationaldes Epizooties), and also NMKL (co-operation agreement between NMKL(Nordic Committee on Food Analysis)and ISO TC34/SC9 ), ISO TC347 andISO TC147/SC4 Water microbiology . This enumeration gives an idea ofInternational cooperation . But, as itis not possible to describe each ofthem , I would like to focus on someof them during a few minutes : theCodex alimentarius ( especially, theCodex Committee on Food Hygiene),WHO and IUMS .

Codex alimentarius Of couse, all of you have heard ofCodex alimentarius: the name meansa food code and is a compilation ofstandards for food, which can be ap-plied in all countries. Codex has beencreated in 1962 when the organizationof United Nations for Food and


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Agriculture (FAO) and the World’sHealth organization decided it was ne-cessary to elaborate internationalstandards which may be used by theFood industry which was in full expan-sion in order to protect consumer’s he-alth. in fact, in the first volume, it is saidthat the objectives of Codex alimen-tarius are: “to guide and promote theelaboration and setting up of defini-tions and criteria for food, in order tocontribute to their harmonization andfacilitate international exchanges. Codex alimentarius has a noticeableeffect on quality and safety of foodaround the world; it has allowed ,everywhere, to improve the standardswhich are applied at different steps ofthe food chain and to increase a lot theinternational exchanges. In the Codex alimentarius, there ishigh number of committees, i.e. twogroups of world committees, one ongeneral problems, the other on foodproducts. There are also some regio-nal committees . As Food hygienists, you may be ex-perts in many of those groups; perso-nally, I participated different times inthe committee “Food Hygiene” forwhich USA are the leader. All committees work in strong colla-boration with scientific organizations inorder to elaborate standards and re-commendations. As an example, I would like to remem-ber some sentences of one paper writ-ten in the “International Journal ofFood Microbiology” in 1998: “During the 21st session of CodexAlimentarius which was held in Rome,Italy in July 1995, the Commissionwas invited to adapt as Codex generalstandards, a number of draft texts sub-mitted at step 8 of the UniformProcedure for the Laboratory CodexStandards and related texts – i.e. ge-neral standards for contaminants andtoxins in foods – methods of analysisand sampling“. Chemical contami-nants were considered first but, when,under CEN collaborative studies we-re carried out and that precision para-

meters were introduced into the ISOstandards, they have been transmittedto Codex Alimentarius, so creating aninternational consensus.

WHOWHO is the specialized Agency ofUnited Nations Organization speciali-zed for Health problems and dependsdirectly on the Economical and SocialCouncil of United Nations. This organization finds its origin in thewars which happened at the end of thenineteenth century; after the first worldwar and the epidemic of Spanish in-fluenza, in 1918-1919 (20 millions ofdeaths), the Society of Nations createsthe Committee for Hygiene which canbe considered as the embryo of WHO. The main place is Geneva (CH ). 193member states participate in the work.The role is multiple: harmonization ,classification of diseases, sanitary me-asures, help to less developed coun-tries, research, prequalification ofdrugs. Different collaborator centershelp WHO in its tasks. Some of you may have participated insome of the strategic meetings orga-nized by WHO. To give you an idea ofthe content of such meetings, one ofthem was organized in February 2001in order to define the strategic basis ofthe action of WHO in the field of FoodSafety and Risks appreciation, appliedto microbiology, chemical contami-nants and biotechnologies. One othermeeting in which I participated and or-ganized previously concerned theslaughtering plant of the year 2000 !these are only examples, but theyshow obviously the place ofInternational cooperation...

IUMSFinally, I would like to say a few wordsabout IUMS (International Union ofMicrobiological Societies). As youknow, there is a national microbiologi-cal society in different countries allaround the world. IUMS is one of the 29 Scientific Unionsof the International Council of Science

( ICSU ); it was founded in 1927 as theInternational Society of Microbiology. The objectives are” to promote thestudy of microbiological sciences inter-nationally, initiate, facilitate and coor-dinate research and other activitieswhich involve international coopera-tion, ensure the discussion and dis-semination of the results of internatio-nal conferences , symposia and mee-tings and assist the publication of theirreports. A congress is held in a different coun-tries every three years; the last onewas held in 2008 in Istanbul (Turkey);the next one will be held in Sappara(Japan) in 2011. As I told you previously, liaison withIUMS is one of the topics reported du-ring ISO/CEN meetings; the reportsare presented by Pr Skovgaard fromCopenhagen (DK); that is anotherexample of international cooperationin Food microbiology. Of course, mem-bers of IUMS being present in a lot ofcountries whose development are verydifferent, the communication betweencountries is of upper importance.Among the IUMS Committees, ICFMHhas a special focus on Food safety indeveloping countries. Moreover, con-sidering the trade between differentcountries, it seems very important toknow about some types of microorga-nisms which may be unknown in deve-loped countries…

ConclusionIt may be possible to add a lot ofexamples , as, in Food microbiology,International cooperation is presenteverywhere from a long time and es-pecially nowadays due to Internet(which was not the case a few deca-des ago).. We have to be aware of thefact that, as Food microbiologists , weare, “de facto” submerged” in what wecall “globalization“... Communicatingwith scientists from different countries,different continents is really wealth forus… In that context , I wish you all thebest for a fruitful week of Internationalcooperation.


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La reacción en cadena de la polime-rasa (conocida como PCR por sus si-glas en inglés, Polymerase ChainReaction) es un método de análisis deácidos nucleicos, desarrollado porKary Mullis a mediados de los años80, para producir grandes cantidadesde un fragmento específico de ADNde secuencia y longitud definida apartir de una pequeña cantidad dematerial inicial.La técnica permite amplificar selecti-vamente una molécula de ADN o ARNvarios millones de veces en pocas ho-ras. Mediante la PCR podemos reali-zar la detección y análisis de secuen-cias específicas de un gen sin nece-sidad de aislarlo previamente por téc-nicas de clonación de ADN. Los aná-lisis pueden realizarse a partir deunas pocas células o de una mínimacantidad de muestra biológica sin lanecesidad de aislar previamentegrandes cantidades de ácidos nuclei-cos.La PCR ha revolucionado el campodel diagnóstico molecular y se ha con-vertido en una técnica de rutina en elámbito de la genética, la microbiolo-gía y la biotecnología.

Principios básicos de la PCR La PCR se fundamenta en la amplifi-cación enzimática de un fragmento deADN flanqueado por dos secuenciasde oligonucleótidos que hibridan en lacadena complementaria de la molécu-la molde que se va a amplificar (ceba-dores o “primers”) y que son utilizadospor una ADN polimerasa termoresis-tente (generalmente se emplea la dela bacteria termófila ThermusAquaticus, capaz de crecer a eleva-das temperaturas) para copiar la se-cuencia de la misma. La reacción es un proceso que cons-ta de 3 etapas (repetidas unas 30-35veces): desnaturalización, hibridaciónde los cebadores y extensión de losmismos.Desnaturalización: Para que puedainiciarse la reacción es preciso quelas moléculas de ADN molde se en-

cuentren en forma de cadena simple.Esto se consigue calentando a tem-peraturas de 90 a 95ºC para que pro-duzca la rotura de los enlaces puen-te de hidrógeno intercatenarios y laseparación de ambas cadenas. Paraasegurar la completa separación de ladoble cadena del ADN esta tempera-tura debe mantenerse unos minutos.Si el ADN solo se desnaturaliza par-cialmente éste tenderá a renaturali-zarse muy rápidamente dificultándo-se una eficiente hibridación de los pri-mers y la posterior extensión de losmismos.Hibridación: Una vez que el ADN es-tá desnaturalizado se disminuye latemperatura de la reacción hasta unrango comprendido entre los 40 y los60ºC para que se pueda producir lahibridación específica de los cebado-res a las secuencias flanqueantes delfragmento que se desea amplificar.Esta etapa se denomina también fa-se de “annealing” y la temperatura ala que se realiza debe establecersepara cada reacción en función de lalongitud de los cebadores y su se-cuencia (temperaturas inferiores a laóptima nos producirán hibridacionesinespecíficas de los cebadores y tem-peraturas superiores nos dificultaránla eficiencia de la misma). Extensión: Durante esta etapa laADN polimerasa termoresistente in-corpora nucleótidos en el extremo 3'del cebador utilizando como molde lacadena de ADN previamente desna-turalizada. La temperatura a la que serealiza esta etapa de la reacción sue-le ser de 72ºC ya que es la tempera-tura a la que la Taq polimerasa alcan-za su máxima actividad. Normalmenteuna extensión de 20 segundos es su-

ficiente para fragmentos menores de500 pares de bases, y 40 segundospara fragmentos por encima de1.2Kb. Al finalizar cada uno de los ciclos elnúmero de copias obtenidas se du-plica y después de 20 ciclos ya tene-mos aproximadamente 1 millón de co-pias de cada una de las moléculasmolde iniciales de ADN.La técnica puede usarse para la am-plificación de moléculas de ARN sipreviamente se realiza una copia delas mismas mediante la enzima trans-criptasa reversa. De este modo pode-mos realizar estudios sobre molécu-las de ARNm o bien la podemos apli-car para la detección de virus ARN.La elección de los cebadores y el ta-maño del fragmento amplificado esde gran importancia para el resulta-do final. En pruebas de diagnósticoel tamaño del fragmento amplificadono debe superar los 100-150 paresde bases de ADN si partimos demuestras que puedan haber sufridouna degradación de los ácidos nu-cleicos y la elección de los cebado-res debe realizarse para fragmentosespecíficos de la diana que quera-mos amplificar para evitar falsos po-sitivos.Una vez realizada la amplificación, seprocede a la identificación de la se-cuencia obtenida mediante electrofo-resis, hibridación con sondas comple-mentarias o técnicas de análisis depolimorfismos.El análisis por PCR puede ser de dostipos: cualitativo (detección de la pre-sencia o ausencia de un fragmento deADN determinado) o cuantitativo (de-tección de la cantidad de un fragmen-to de ADN determinado).


La Polymerase Chain Reaction(PCR)Dr. Armand Sánchez Bonastre Dep. de Ciencia Animal y de los

Alimentos. Facultad de Veterinaria.Universidad Autónoma de [email protected]

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Análisis cualitativo de ADNmediante PCR Este tipo de análisis se suele realizarcuando tan sólo es necesario conocerla presencia o ausencia de alguna se-cuencia específica de ADN o ARN,como por ejemplo la detección de lapresencia de un patógeno en unamuestra. El análisis del producto am-plificado suele realizarse medianteelectroforesis en gel o capilar y su vi-sualización por tinción en bromuro deetidio o por detección fluorescente sipreviamente hemos utilizado uno delos cebadores marcado con algún ti-po de fluorescencia.En algunos análisis resulta necesa-rio identificar la secuencia del produc-to amplificado y el producto de la PCRdebe ser sometido a un análisis espe-cífico (secuenciación, digestión conenzimas de restricción... etc.).

Análisis cuantitativo de ADNmediante PCR La PCR convencional no es una téc-nica cuantitativa ya que la amplifica-ción exponencial del ADN molde no semantiene constante especialmente enlos últimos ciclos de la reacción.Para poder realizar estimas cuantita-tivas se han desarrollado técnicas dePCR en “tiempo real” (PCR cuantitati-va) en las que es posible determinarla fase exponencial de la amplificacióny poder extrapolar de forma cuantita-tiva la cantidad de molde inicial que seesta amplificando.La metodología de PCR cuantitativa,facilita además la automatización y nosuele requerir el procesamiento ulte-rior del producto amplificado lo que re-duce el riesgo de contaminación. En la actualidad, existen en el merca-do varios equipos y protocolos parala realización de esta técnica. Desdeel punto de vista de la detección delproducto amplificado en cada ciclo,existen tres métodos principales deanálisis de PCR cuantitativa basadosen técnicas de fluorescencia y que sediferencian en el tipo de detección delos productos de PCR. Estos métodos

son: el que emplea una sonda con do-ble marcado fluorescente (TaqMan ®)específica de la secuencia amplifica-da, los basados en el uso de dos son-das que hibridan de forma adyacenteen el fragmento que amplificamos y,por último, el que utiliza una sustanciaintercalante que se une a la doble ca-dena de ADN denominado SYBRGreen I y produce emisión de fluores-cencia.El método más difundido, es el queemplea sondas TaqMan®. Este métodose basa en la actividad 5’-exonuclea-sa de la Taq polimerasa y en la ampli-ficación mediante PCR de una deter-minada secuencia diana en presenciade una sonda fluorescente específica(sonda TaqMan®) que hibrida con la se-cuencia diana que estamos amplifican-do. La sonda TaqMan®, de un tamañoaproximado de 20-30 bases, tiene uni-do un fluorocromo en posición 5’ y unsegundo fluorocromo que actua por in-terferencia con el primero cómo amor-tiguador de fluorescencia en posición3’. Además, esta sonda está fosforila-da en 3’ para evitar su extensión du-rante la reacción de PCR. Si la se-cuencia diana está presente en lamuestra, la sonda TaqMan hibridaráespecíficamente con ella, situándoseentre los dos cebadores. Cuando seproduce la etapa de extensión en lareacción de PCR, la actividad 5’-exo-nucleasa de la Taq polimerasa degra-da a la sonda TaqMan liberando elfluorocromo, que al quedar separadodel amortiguador emitirá una señalque puede ser captada por el sistemaóptico del equipo. Este proceso de de-gradación de la sonda tiene lugar encada uno de los ciclos y es directa-mente proporcional al número de mo-léculas que están siendo extendidasen cada uno de ellos que podemos vi-sualizar por el incremento de la señalde fluorescencia.Además, la Taq polimerasa no digie-re la sonda libre sino únicamente lahibridada, por lo que la cantidad deseñal fluorescente emitida es propor-cional a la cantidad de producto acu-

mulado. La medición de la intensidadde fluorescencia se realiza de formacontinua lo que nos proporciona unainformación dinámica en tiempo realdel proceso. El sistema de detecciónpermite establecer el ciclo umbral (Ct-cycle threshold), ciclo de la PCR a par-tir del cual la cantidad de fluorescen-cia emitida alcanza el nivel de detec-ción que hayamos fijado, lo que a suvez se correlaciona directamente conla cantidad de ADN molde de la mues-tra analizada. La cuantificación del nú-mero de copias de una muestra se re-aliza mediante la comparación de la Ctde la muestra problema con la Ct deuna serie de diluciones de una mues-tra control positiva. La cuantificaciónde la muestra control positiva permiteestablecer una curva estándar que re-fleja el número de copias y el númerode ciclo en el que ha sido realizada ladetección de forma objetiva y reprodu-cible.Cuando se realiza la cuantificación deuna muestra problema, el ciclo umbralde su detección se lleva a la curva es-tándar lo que permite conocer el nú-mero de copias de la secuencia dia-na existente en la muestra analizada.El método de PCR cuantitativa basa-do en la química por hibridación desondas, emplea dos sondas secuen-cia-específicas que hibridan en regio-nes adyacentes espaciadas entre unoy cinco nucleótidos. Una sonda estámarcada con un fluorocromo emisoren posición 3’ y la otra sonda estámarcada con un fluorocromo aceptoren su extremo 5’. Esta sonda ademástiene bloqueado su extremo 3’ con ungrupo fosfato para evitar su extensión.Sólo cuando las dos sondas han hibri-dado y están próximas se origina unaemisión de fluorescencia por el fluoro-cromo aceptor cuya intensidad au-menta proporcionalmente a la canti-dad de secuencia diana formada en lareacción de PCR. Esta metodologíase diferencia de la química de sondasTaqMan® en que no se requiere la hi-drólisis de sonda para la emisión defluorescencia.


10

El tercer tipo de detección de los pro-ductos específicos de PCR de la se-cuencia molde consiste en la utiliza-ción del agente intercalante SYBRGreen I. Esta sustancia se une espe-cíficamente a la doble hélice de lasmoléculas de ADN formadas en cadaciclo de la reacción de PCR produ-ciendo la emisión de fluorescencia. Deesta forma, la señal fluorescente se in-crementa en función de la cantidad deproducto amplificado. La ventaja deesta opción es que no se precisa lasíntesis de sondas fluorescentes es-pecíficas para cada tipo de detección,aunque su inconveniente reside en suinespecificidad ya que se detecta fluo-rescencia para todos los productos deADN de doble cadena presentes enla reacción (incluyendo los dímeros decebador que suelen producirse en lamayor parte de reacciones de PCR).La realización de estas técnicas dePCR en tiempo real requiere dispo-ner de un equipo que disponga de unsistema de detección de fluorescen-cia. Existen actualmente en el merca-do distintas alternativas cuyo costesuele estar relacionado con los nive-les de sensibilidad y capacidad deanálisis de muestras de los mismos.

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11

Introducción El mercado global de OMG en 2008se cifra en 7.500 millones de dólares,y se prevé que sea de 8.300 millonesen 2009 si se suspenden las morato-rias actualmente vigentes. Dichopotencial económico conlleva unincremento considerable de la super-ficie de cultivo de OMG a nivel globalen los últimos 3 años, teniendo encuenta el reconocimiento oficial de lapresencia de soja modificada genéti-camente (MG) en Brasil en 2003. Anivel mundial, los principales cultivosde OMG son de soja, maíz, algodón ycolza.El cultivo de OMGs plantea una seriede posibles efectos medioambienta-les y de coexistencia; y su consumo,de tipo sanitario y ético.Especialmente en Europa, un númeroimportante de consumidores deman-dan el derecho a consumir los tiposde productos agrícolas de su elec-ción, tanto si se trata de OMG, con-vencionales u orgánicos. En respues-ta, la UE ha establecido la obligatorie-dad de etiquetar todos los productospara el consumo humano fabricadostotal o parcialmente con OMG (a par-tir de un 0.9%, (CommissionRegulation (EC) No 1829 / 2003); y haimpulsado normativas dirigidas a ase-gurar la trazabilidad de los productosagroalimentarios y la correcta identifi-cación de aquellos que contenganOMG (Commission Regulation (EC)No 258 / 97, 1997; CommissionRegulation (EC) No.50 / 2000;Commission Regulation (EC) No.49 /2000; Commission Regulation (EC)1830 / 2003; Council Regulation (EC)No 1139 / 98, 1998). Otros países,notablemente Japón o Canadá, hanestablecido normativas equivalentes.Algunos países europeos están desarrollando actualmente normati-vas de coexistencia de OMG y pro-ductos convencionales y orgánicos.

Desarrollo Los alimentos transgénicos, antesde llegar al mercado sufren una

serie de rigurosas evaluacionessobre su seguridad alimentaria.Aunque se admite que la seguridadabsoluta no existe y no es, por lotanto, alcanzable, el objetivo deestos estudios es asegurarse de quecomo mínimo, el nivel de seguridaddel producto transgénico no es infe-rior al del producto convencional delque deriva. Éste es el concepto de“equivalencia sustancial” introducidopor primera vez por la OCDE(Organización de Cooperación yDesarrollo Económico) en 1993 yrecomendado en 1996 por la Foodand Agriculture Organization/WorldHealth Organization (FAO/WHO)

como base para los estudios deseguridad alimenticia de los OMGs.El International Life SciencesInstitute (ILSI, 2004) entiende laequivalencia sustancial no como unaconclusión extraída de la evaluaciónde inocuidad, sino como un procesode identificación de aquellas diferen-cias que justifiquen evaluaciones deinocuidad antes de la comercializa-ción.De acuerdo con la directiva1829/2003 de la UE, las empresasque notifiquen nuevos OMG deberánaportar, para obtener su aprobación,información relativa a su composi-ción nutricional y seguridad. Los


Organismos ModificadosGenéticamente (OMG):

“Detección, Legislación yEvaluación de riesgos”

Teresa Esteve Centre de Recerca en Agrigenòmica(CRAG), CSIC-IRTA-UABc/ Jordi Girona, 18-26; 08034 Barcelona, Españ[email protected]

Resumen

Mucho, y en profundidad, se ha debatido sobre los Organismos Modificados

Genéticamente (OMG) y las técnicas de Biotecnología que han permitido la introduc-

ción de genes en plantas, para producir OMG con características, entre otras, de

interés agronómico.

Aunque su cultivo sigue creciendo a nivel global (125 millones ha. en 2008 y 25 paí-

ses productores, ISAAA brief 39), su aceptación pública y la percepción social gene-

rada ha creado una cierta controversia. Algunas reacciones han sido positivas, espe-

cialmente entre los agricultores e industriales, pero la población en general ha reac-

cionado con incomprensión hacia una tecnología considerada innecesaria y de ries-

go. Muchos países han establecido una normativa para la regulación del cultivo y la

comercialización de OMG. La UE (entre otros), como importador importante de maíz

y soja desde USA y Argentina, así como en el caso de España como productor de

maíz transgénico, ha establecido además la obligatoriedad de trazabilidad y coexis-

tencia que ha conllevado la necesidad de métodos capaces de detectar, identificar

y cuantificar OMG en alimentos. La normativa europea establece un nivel máximo

de contaminación accidental de OMG, correspondiente al 0,9%, por encima del cual

es obligatorio el etiquetado de los alimentos.

12

ensayos de composición nutricionalaportados por las empresas paracumplir con el principio de equiva-lencia sustancial de composición dela línea MG respecto a la línea no-MG correspondiente se limita a losconsiderados necesarios para ase-gurar que dicho alimento es subs-tancialmente equivalente al no-MG(www.fao.org; www.oecd.org).La legislación citada anteriormentees muy compleja pero de toda ellacabe destacar la normativa sobre tra-zabilidad y etiquetado, que estableceel umbral del 0.9% de contenido detransgénicos, por encima del cual losproductos se tendrán que etiquetarcomo tales. Otro de los puntos clavea destacar de estas normativas es ladefinición de coexistencia. Así, lacoexistencia se refiere a la capacidadde los agricultores de poder optarentre una producción de cultivos con-vencionales, ecológicos o transgéni-cos siempre y cuando cumplan conlos requisitos legales establecidos.En este sentido la comisión Europeaaprobó las Recomendaciones sobrelas Directrices para la elaboración deestrategias y mejores prácticasnacionales con el fin de garantizar lacoexistencia. Cada estado miembrode la Unión Europea, deberá estable-cer sus propias directrices sobre labase de estas recomendaciones,adaptadas a las condiciones particu-lares de cada una de las zonas decultivo. Es evidente que estas direc-trices deberán estar orientadas acontrolar o limitar la presencia adven-ticia de material procedente deOMGs en los cultivos convencionaleso ecológicos.La presencia adventicia de OMGspuede producirse por diversas cau-sas que incluyen impureza de lassemillas, polinización cruzada, nas-cencia en campos de maíz conven-cional de plantas procedentes desemillas de maíz transgénico cultiva-do el año anterior o por mezcla delgrano durante la recolección y/o elalmacenaje.

Todo ello plantea la puesta a puntode unos métodos de análisis:• Adaptados a cada producto, bruto o

derivado, y a cada OMG buscado;• Fiables y sensibles, para responder a

la legislación y a la información (cali-dad) exigida por los consumidores;

• De acuerdo con otros laboratorioseuropeos, para consensuar elmejor método, garantizar los resul-tados (tests cruzados) y actualizarprotocolos y OMGs autorizados.

La tecnología basada en inmunode-tección de la proteína transgénicamediante bandas de flujo lateral(strips) es la más barata, rápida yadecuada para detectar OMG in situ.Pero la tecnología de PCR a tiemporeal se ha convertido en la técnicapor excelencia para la identificacióny cuantificación de OMG, admitiendodiferentes niveles de especificidad(screening, de característica, deconstrucción o de evento). Sus apli-caciones abarcan múltiples aplica-ciones. En nuestro laboratorio, elinterés en el empleo de la tecnologíade PCR a tiempo real se centra en eldiseño de sondas específicas parala detección y cuantificación deorganismos modificados genética-mente (OMGs) y más concretamen-te para plantas transgénicas.

Este tipo de análisis son de interéspara toda la línea agroalimentaria,desde las compañías de semillashasta los distribuidores, pasando porlos agricultores, silos, fabricantes deproductos semi-transformados (almi-dones, lecitinas,...) y finales, e inclu-ye certificación de semillas, etique-tado, trazabilidad de los produc-tos,... La investigación en la UE, concreta-mente en el marco del proyecto Co-ExTra, en el cual el Servei d’AnàlisisBiològiques Quantitatives del Centrede Recerca en Agrigenómica(CRAG) participa, tiene como intere-ses principales:• El desarrollo de nuevos métodos

capaces de incrementar el númerode OMG que se puedan analizarsimultáneamente, ya que el núme-ro de OMG autorizados estáaumentando a un ritmo muy eleva-do (destacan PCR multiplex aso-ciado a marcaje específico y CGE,desarrollado por nuestro laborato-rio, arrays de baja densidad,…).

• El desarrollo de sistemas paradetectar OMG no autorizados odesconocidos (algunas aproxima-ciones destacables se basan enuna matriz con muchos elementosconocidos, ensayos sistemáticos


Los alimentos transgénicos, antes dellegar al mercado sufren una serie de

rigurosas evaluaciones sobre su seguridadalimentaria. Aunque se admite que la

seguridad absoluta no existe y no es, porlo tanto, alcanzable, el objetivo de estos

estudios es asegurarse de que comomínimo, el nivel de seguridad del

producto transgénico no es inferior al delproducto convencional del que deriva

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de zonas flanqueantes o microa-rrays con secuencias al azar).

• La identificación de controlesespecíficos de especie adecuadospara la cuantificación de OMG(para algunas especies genética-mente compatibles o próximas filo-genéticamente constituye un pro-blema muy importante).

• La validación de métodos de ensa-yo multiplex mediante ring-trials; ylos métodos de muestreo (losOMG están distribuidos de formamuy heterogénea); además deherramientas de asistencia a latoma de decisiones y aspectoseconómicos y sociales.

• Finalmente, resulta indispensablela validación de los métodos desarrollados para su propuesta alComité Europeo de Normalización(CEN) como métodos de referen-cia.

Conclusiones La presión de la opinión pública engeneral y la aparición de las norma-tivas europeas anteriormente cita-das, hacen que próximamente sedeba elaborar una normativa espa-ñola que regule el cultivo del maíztransgénico y establezca las normasde coexistencia, etiquetado y traza-bilidad.Dado que estas normativas debenbasarse en datos experimentalesfiables, en el año 2003 se empeza-ron a realizar diversos ensayos enEspaña coordinados por elMinisterio de Agricultura, pesca yAlimentación (MAPA). Los análisisrelativos a dichos ensayos para ladetección, identificación y cuantifica-

ción de OMGs se realizaron y serealizan actualmente en nuestrolaboratorio, referente del MAPA, yperteneciente al Centre de Recercaen Agrigenòmica (CRAG) CSIC-IRTA-UAB.

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17.- Council Regulation (EC) No 1139 / 98, 1998.


La tecnología basada eninmunodetección de la proteína

transgénica mediante bandas de flujolateral (strips) es la más barata, rápida y

adecuada para detectar OMG in situ

14

Introducción La Directiva 2006/7/EC relativa a lagestión de la calidad de las aguas debaño (1) indica que la metodología ausar para el análisis bacteriológico delas aguas continentales, costeras y detransición es la contemplada en lanorma ISO 9308-1 o 9308-3 paraEscherichia coli (2) y en la ISO 7899-1 o 7899-2 para enterococos intesti-nales (3). Mientras que la Directivarecomienda el uso de las placas mul-tipocillo, las metodologías alternativasse permiten con tal que los estadosmiembro puedan proporcionar datossobre la equivalencia del métodoalternativo. Los métodos alternativosdeben ser equivalentes o tener recu-peraciones significativamente másaltas que los métodos estándar. Deacuerdo con las recomendaciones delEGM (Expert Group on Microbiology),ente consultor de la ComisiónEuropea, los datos suministradoscomo soporte de la equivalencia delos métodos alternativos deben cum-plir con los requisitos de la norma ISOpara ensayar la equivalencia de méto-dos microbiológicos (ISO17994:2004) (4).En los estudios descritos en este tra-bajo, se compararon dos métodos desustrato definido (Colilert®-18/Quanti-Tray® para E. coli (5,6) y Enterolert®-E/Quanti-Tray® para enterococos (6,7)y dos respectivos métodos ISO basa-dos en placas multipocillo (ISO 9308-3 para E. coli e ISO 7899-2 para ente-rococos). Cada comparación se ha

efectuado, de modo independiente,para muestras de agua dulce y mues-tras de agua marina, con lo cual sedispone de cuatro estudios de equiva-lencia independientes. En tres de losestudios han participado siete labora-torios y en el estudio restante seis,que es el número mínimo recomenda-do. En su conjunto, están representa-dos nueve países europeos distintos.Sólo dos laboratorios (Agència SalutPública, Barcelona, España, e IDHE-SA, Plouzane, Francia) y cuatro paí-ses (Francia, Italia, España y ReinoUnido) participaron en los cuatro estu-dios. Todos los laboratorios partici-pantes están acreditados por suscorrespondientes entes nacionales deacreditación.

Materiales y métodos

Preparación de muestrasLos distintos laboratorios prepararonsus propias muestras fortificando conefluente de agua residual, agua demar de alta calidad o agua superficialdulce de alta calidad hasta dar

recuentos de los microorganismosdiana en el rango 200-500 NMP/100mL. Cada laboratorio utilizó un míni-mo de seis muestras iniciales de aguasuperficial dulce o agua marina y seisefluentes distintos. Los protocolos de dilución e inocula-ción de muestras utilizados en los cua-tro estudios son variables de acuerdocon el tipo de agua de baño (dulce omarina), independientemente del tipode microorganismo diana.En el conjunto de los cuatro estudios seanalizaron 1065 muestras de agua uti-lizando simultáneamente dos métodos.

Métodos de enumeración de losmicroorganismosAntes del inicio de cada uno de losestudios, los analistas fueron entrena-dos en la realización de los dos méto-dos con el fin de asegurar, en la medi-da de lo posible, que los ensayos sellevan a cabo del mismo modo entodos los laboratorios.Los métodos ISO 9308-3 e ISO 7899-2 utilizan una placa multipocillo de 96pozos en los cuales se ha dispensadoun medio deshidratado (Figura 1). Lamuestra se dispensa entonces encada uno de los 96 pocillos (200 _L),utilizando pipetas multicanal, la placaes sellada con una cubierta de polite-no transparente y se incuba a 44ºCdurante 36-72 horas (cada uno de losmedios en dos estudios). Los mediosconstan de una base proteica, un sus-trato para el enzima específico e inhi-bidores de bacterias Gram positivas(Triton-X 100 en ISO 9308-3) o bacte-rias Gram negativas (Tween 80 yácido nalidíxico en ISO 7899-2). En el


Dilución Vol. muestra Dilución Vol. muestra

original original

Colilert-18 / 10:100 10 mL 6.8:100 6,8 mL

Enterolert-E

ISO 9308-3 / 1:2 (todos los 9,6 mL 1:2(64 pozos)+ 6,72 mL

ISO 7899-1 pozos) 1:20 (32 pozos)

Agua marina Agua dulce

Estudios de equivalenciaeuropeos entre métodos para

enumerar Escherichia coli yenterococos en aguas de baño

Ferrán Ribas Soler Comisión de Normalización y Validación.Sociedad Española de Microbiología

E.coli 328 259

Enterococos 226 252


15

método de E .coli (ISO 9308-3) el sus-trato es el 4-metil-umbeliferil �-D-glu-curónido y en el método de enteroco-cos (ISO 7899-2) el sustrato es el 4-metil-umbeliferil �-D-glucósido. Estossustratos son respectivamente rotospor la �-D-glucuronidasa presente enE. coli o por la �-D-glucosidasa pre-sente en los enterococos, dando unproducto fluorescente. Este productopuede ser detectado utilizando luzultravioleta a 366 nm. La enumeraciónse efectúa mediante el Número MásProbable (NMP), de acuerdo con elnúmero de pocillos positivos. Para la comparación con los métodosestándar se ha usado una metodolo-gía similar, basada en los mismosenzimas específicos: los productoscomercialmente asequibles de laTécnica del Sustrato Definido(Defined Substrate Technology®,DST®) Colilert®-18 para E. coli yEnterolert®-E para enterococos(Figura 2). Ambos consisten en reacti-vos en polvo predosificados, los cua-les utilizan el método enzima sustratoacoplado con formulaciones selecti-vas para detectar E. coli o enteroco-cos en muestras de agua. Para laenumeration por NMP se utiliza unQuanti-Tray® de Idexx sellado. Eneste caso, con el fin de adaptarambos métodos a los diferentes tiposde agua, se han utilizado distintastemperaturas y tiempos de incuba-ción. De acuerdo con los respectivos fabri-cantes, ninguno de los dos métodosempleados en cada estudio requierenconfirmación, dando resultados quepueden considerarse “confirmados”.No obstante, de cada muestra y méto-do, se ha verificado un pequeño por-centaje de pozos positivos en cultivosen placa específicos: agar TBX paraE. coli y agar bilis esculina azida(BAAA) para enterococos. Se han ino-culado cuatro pozos por muestra, unode cada cuadrante de Quanti-Tray oplaca de Bio-Rad. Se verificaron entotal aproximadamente 5000 cepasde E. coli y 4000 de enterococos.


Colilert-18 44ºC 40-48 h. 37ºC 40-48 h.

Enterolert-E 41ºC 24-48 h. 41ºC 24-48 h.


E.coli agua marina 98.3 % (1320) 96.3 % (1314)

Enterococos agua marina 97.8 % (893) 97.8 % (889)

E.coli agua dulce 98.7 % (1115) 98.2 % (1029)

Enterococos agua dulce 98.7 % (1008) 95.7 % (1002)

Métodos IDEXX Métodos ISO

Cuadro 1.- Tasas de verificación (%) en los diferentes ejercicios (entre paréntesis, núme-

ro de cepas ensayadas).

16

Análisis estadísticoDe acuerdo con los principios de lanorma ISO 17994, la comparación dedos métodos se basa en la diferenciarelativa media de los recuentos confir-mados. La diferencia relativa se defi-ne como:

xi = ln (ai) – ln (bi), donde

ai = recuento confirmado por el méto-do alternativo en la muestra i.bi = recuento confirmado por el méto-do de referencia en la muestra i.Si uno de los recuentos confirmadoses cero, la fórmula para la diferenciarelativa se aplica del siguiente modo:

xi = ln (ai + 1) – ln (bi + 1)

Esto se hace para evitar la necesi-dad de prescindir de las muestras

donde hay algún cero. Si con ambosmétodos da cero, la muestra seomite.La evaluación de la equivalencia sebasa en la diferencia relativa media(x), que es la media aritmética de lasdiferencias relativas en las diferentesmuestras, y en la incertidumbreexpandida (U), basada en la desvia-ción estándar de la media (errorestándar).

U = 2 sx

Una diferencia entre ambos métodosse considera estadísticamente signifi-cativa si es superior a un valor D defi-nido. En general, como ocurre en estecaso, una diferencia (x) de más de0.10 o, expresada en porcentaje, demás de un 10 %, se considera signifi-cativa.

Resultados

Resultados de la verificaciónLas tasas de verificación observadashan sido muy elevadas para todos losmétodos estudiados y para todo tipode muestras (Cuadro 1). La principalconsecuencia que se extrae de ello esque la comparación entre los métodospuede hacerse en base a los recuen-tos presuntivos en vez de hacerla, deacuerdo con lo que indica la normaISO 17994, en base a los recuentosconfirmados.

Análisis según la ISO 17994 Los resultados globales del análisisestadístico de acuerdo con la normaISO 17994 se muestran en el Cuadro2 y en la Figura 3.Aunque el análisis estadístico más


Enterococos 226 22.75 44.54 2.96 5.93 16.82 28.68 Diferente (+)

agua marina

E.coli 328 -1.56 38.62 2.13 4.26 -5.82 2.70 Equivalente

agua marina

Enterococos 252 11.25 52.01 3.28 6.55 4.70 17.80 Diferente (+)

agua dulce

E.coli 259 8.99 42.47 2.64 5.28 3.71 14.27 Diferente (+)

agua dulce

Ejercicios n Media SD SE U LO HI Evaluación

(x) (x-U) (x+U)

Cuadro 2.- Media e incertidumbre expandida de la diferencia relativa (en porcentaje) en los cuatro ejercicios de equivalencia. Recuentos

presuntivos. Evaluación de una sola vía.

n, número de muestras comparadas; Media (x), diferencia relativa media; SD, desviación estándar; SE, error estándar; U, incertidum-

bre expandida (U=2· SE); LO, límite inferior de la incertidumbre expandida alrededor de la media; HI, límite superior de la incertidum-

bre expandida alrededor de la media.

Enterococos 3 3 0 0 0

agua marina

E.coli 0 3 4 0 0

agua marina

Enterococos 2 1 4 0 0

agua dulce

E.coli 2 2 2 1 0

agua dulce

Ejercicios Diferente(+) Equivalente Inconclusivo Inconclusivo Differente(-)

x, x-U y x+U x-U x-U negativo x, x-U y

x+U positivo, negativo, pero > -10% x-Upositivos x-U negativo x+U positivo x+U positivo negativos

pero <10% pero <10% pero <10%

Cuadro 3.- Número de laboratorios con diferentes evaluaciones en cuatro ejercicios de equivalencia.

17

relevante es la comparación del con-junto de datos de todos los laborato-rios (más de 200 muestras en cadaejercicio), el número de laboratorioscon las distintas evaluaciones indivi-duales se indica en el cuadro 3.Tanto las evaluaciones Equivalentescomo las Inconclusivas con x+U posi-tivo pero < 10% corresponden a resul-tados no estadísticamente diferentes.No obstante, para considerar que elmétodo alternativo ha superado elejercicio, la evaluación debe serDiferente(+) o Equivalente (lo cualsignifica no estadísticamente diferen-te con x-U negativo pero > -10%).

Conclusiones En tres de los cuatro estudios (ejerci-cios de equivalencia) la recuperacióndel método alternativo es significativa-mente superior: 9% superior para elColilert en agua dulce, 11,3% superiorpara el Enterolert in agua dulce y22,8% superior para el Enterolert enagua marina. En esos tres casos,tanto la diferencia relativa media (x)como x-U y x+U tienen valor positivo(siendo U la incertidumbre expandi-da). Para E. coli en agua marina elColilert y el método estándar ISO sonequivalentes, porque la diferencia

relativa media es negativa (x = -1,56%), x+U es positivo (+ 2,70%) y x-U es negativo (-5,82%) pero superiora -10%. En consecuencia, los méto-dos basados en la Tecnología delSustrato Definido (Defined SubstrateTechnology®) son serios candidatos aser usados como métodos alternati-vos cooficiales en los países de laUnión Europea para el análisis de E.coli y enterococos en los diversostipos de aguas de baño.

Bibliografía1.- Official Journal of the European Union

(2006). Directive 2006/7/EC of the European

Parliament and of Council of the 15 February

2006 concerning the management of the

bathing water quality and repealing Directive

76/160/EEC.

2.- International Organization for

Standardization (1998). International standard

ISO 9308-3 – Water Quality – Detection and

enumeration of Escherichia coli and coliform

bacteria –Part 3: Miniaturized method (Most

Probable Number) for the detection and enu-

meration of E.coli in surface and waste water.



ISO 7899-1 and 2 – Water Quality – Detection

and enumeration of intestinal enterococci in

surface water.



ISO 17994. Water Quality – Criteria for esta-

blishing equivalence between microbiological

methods.

5.- Edberg, S.C., Allen, M.J., Smith, D.B. & The

National Collaborative Study (1988). National

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tation method. Applied and Environmental

Microbiology 54: 1595-1601.

6.- Eckner, F.F. (1998). Comparison of mem-

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by the Colilert and Enterolert methods for

detection of waterborne coliform bacteria,

Escherichia coli, and enterococci used in drin-

king and bathing water quality monitoring in

Southern Sweden. Applied and Environmental

Microbiology 64: 3079-3083.

7.- Fricker, E.J. & Fricker, C.R. (1996). Used of

defined substrate technology and a novel pro-

cedure for estimating the numbers of entero-

cocci in water. Journal of microbiological

methods 27: 207-209.


AGRADECIMIENTOSAl resto de coautores de los in-formes de cada uno de los cua-tro ejercicios de equivalencia enque se basa el presente trabajo:Seppo Niemelä, Haoyi Gu, CorrieAllaert y Colin Fricker.

A Idexx Laboratoires (EstadosUnidos), por la financiación delos ejercicios de equivalencia. A todos los laboratorios partici-pantes en el conjunto de los cua-tro ejercicios y a las personas decontacto de los mismos.

18

Las agencias reguladoras de la UniónEuropea y Estados Unidos recogen lanecesidad de desarrollo e implemen-tación de sistemas de control dirigi-dos al incremento de la seguridad y lacalidad de los alimentos y a la mejorade los sistemas de trazabilidad, defi-nidos por su capacidad de rastreo deun alimento desde sus orígeneshasta los consumidores, mediante laidentificación fiable de los componen-tes, el control sanitario estricto y elseguimiento del alimento en la cade-na de producción. Para conseguir elcumplimiento de estos programaspreventivos, ha sido establecidacomo prioridad el desarrollo de méto-dos de detección, de análisis y dediagnóstico que sean rápidos, sensi-bles y automatizables de un amplioespectro de agentes que amenazanla salud humana. Los biosensores sepresentan como los mejores candida-tos por conseguir este nuevo reto.

Los contaminantes microbia-nos en la seguridad alimentaria El concepto de seguridad alimentariaimplica garantizar la producción ycomercialización de alimentos que nosean un riesgo potencial para la saluddel consumidor (1).La innovación y el desarrollo de laindustria agroalimentaria pasan deforma general por dos ejes funda-mentales: la seguridad y la calidad delos alimentos. La cada vez más com-pleja cadena alimentaria exige el desarrollo de sistemas de trazabili-dad eficaces que aseguren la solidezde todos los eslabones de la cadena. Los contaminantes alimentarios pue-den agruparse según su origen ynaturaleza (2). Esencialmente, sepueden clasificar en contaminantesmicrobiológicos (bacterias, virus yparásitos), material exógeno, toxinasnaturales y compuestos químicostales como pesticidas, los metalespesados, o los residuos veterinarios,entre otros (3). Así como la deteccióny el control de aditivos tuvieron suimportancia, actualmente la proble-

mática más grave en salud alimenta-ria viene dada por los contaminantesmicrobiológicos, seguida de los pesti-cidas y de los residuos de medica-mentos en productos de origen ani-mal (4).Son muchos los factores que hancontribuido en las emergencias ali-mentarias recientes (5,6). La cadenade producción de los alimentos escada vez más compleja debido a lamasificación en la producción de ali-mentos. Además, las prácticas inten-sivas en granjas contribuyen tambiéna la infección de un gran número deanimales. Por afrontar este reto, las agenciasalimentarias han establecido progra-mas de control bien estrictos paraevitar que los contaminantes irrum-

pan en la cadena alimentaria. Así, laseguridad alimentaria sólo puede serasegurada mediante sistemas estric-tos de control de calidad en toda lacadena de producción alimentaria,tanto en la producción en las granjascomo en la elaboración de los alimen-tos, así también como en los puntosde comercialización y venta. Unos delos caminos por conseguir mejorar laseguridad en el sector alimentarioson las prácticas basadas en elAnálisis de Riesgos y Puntos Críticosde Control –del inglés “HazardAnalysis Critical Control Point”(HACCP)–. HACCP aporta unos prin-cipios muy bien definidos para esta-blecer, implementar y mantener unplan de calidad en un establecimien-to alimentario (1,3).


Magneto Inmunosensores yGenosensores para bacterias

patógenas

María Isabel Pividori ySalvador Alegret

Grup de Sensors i Biosensors (GSB),Departament de Química, UniversitatAutònoma de Barcelona, 08193, Bellaterrae-mail: [email protected] Fax: +34 581 2379; Tel: +34 93 581 4937http://einstein.uab.es/ipividori

En un futuro, será posible un control más

exhaustivo de las materias primas y los

productos alimentarios, tanto a pie de

proceso en la industria como por los mismos

consumidores finales. Las agencias

reguladoras y los laboratorios de control de

calidad podrán disponer de dispositivos

biosensores capaces de realizar análisis de

manera más rápida y económica en muestras

alimentarias complejas.

19

Métodos rápidos de detecciónde bacterias patógenas ali-mentarias Las metodologías de análisis debacterias patógenas en alimentosdeben ser capaces de llegar adetectar concentraciones del ordende 1 CFU por 25 g de alimento oinferiores 2. Los ensayos inmunológicos repre-sentan una alternativa de screeningrápida y fiable (7). En las últimasdécadas, la detección inmunológicade bacterias, células y esporas,virus y toxinas, y pequeñas molécu-las orgánicas ha empezado a sercada vez más sensible, específica yreproducible. Así, cada vez seencuentran en el mercado más kitsbasados en la detección inmunológi-ca. Los avances en la producción deanticuerpos específicos, de formacada vez más rápida y económica,han sido decisivos para el desarrollode este tipo de pruebas La detección de ácidos nucleicos demicroorganismos patógenos es pro-gresivamente más específica y sen-sible que los métodos inmunológicos(8,9). El desarrollo de técnicas deamplificación in vitro del DNA –tal ycomo la PCR– ha contribuido demanera decisiva a aumentar la sen-sibilidad y selectividad de los ensa-yos basados en ácidos nucleicos.Estos métodos tienen ventajas dis-tintivas sobre los métodos de cultivoe inmunológicos, tal como una mejorespecificidad, sensibilidad, rapidez ycapacidad de detectar pequeñascantidades de ácido nucleico en unamuestra. Además son capaces dedetectar varios patógenos simultá-neamente en un único ensayo. Unproblema asociado es que el DNApuede permanecer intacto en ali-mentos procesados, en forma libre opresente en bacterias muertas, y sereventualmente amplificado y poste-riormente detectado resultando enfalsos positivos. Este método requie-re, por lo tanto, un periodo de enri-quecimiento que retrasa los resulta-

dos pero que asegura la sensibilidadal orden de 1 UFC por 25 g de ali-mento. Otro problema asociado dela PCR es la dificultad de realizarlaen matrices complejas debido a lapresencia de inhibidores de la reac-ción, de ahí que se deban incluir unprocedimiento previo de extracciónde DNA que puede ser tedioso. Porotro lado, las bacterias de crecimien-to lento o las que no pueden creceren condiciones habituales de cultivotambién pueden identificarsemediante su genoma. Para certificarla seguridad alimentaria, los labora-torios de control oficiales deberánser capaces de procesar un grannúmero de muestras en un periodocorto de tiempo. Debido a estosrequerimientos, tiene mucha impor-tancia el desarrollo de nuevas técni-cas rápidas, económicas, sensiblesy capaces de realizar medidas decampo, las cuales puedan serempleadas como alarma para ladetección rápida del ‘riesgo' de con-taminación. Debido a sus caracterís-ticas, los biosensores se van confor-mando en unas herramientas deanálisis con numerosas aplicacionesen la industria agroalimentaria (10-17). Las características más desta-cadas de estos dispositivos que losconvierten en opciones altamenteatractivas son: y) su especificidad, ii)alta sensibilidad, iii) corto tiempo deanálisis, iv) capacidad de inclusiónen sistemas integrados, v) facilidadde automatización, vi) capacidad detrabajar en tiempo real, vii) versatili-dad, que permite el diseño de dispo-sitivos «a la carta», viii) su bajocoste, ix) no destructivos, lo que per-mite el control de procesos in situ, x)no contaminantes, amigables con elmedio ambiente (18). Los sensoresson, por lo tanto, ideales para suimplementación en protocolos deAnálisis de Riesgos y PuntosCríticos de Control para el estableci-miento, implementación y manteni-miento de un plan de calidad en todala cadena alimentaria.

Sensores químicos y biosensoresComo resultado de la demanda cre-ciente de información relacionadacon el análisis de forma rápida, fiabley descentralizada, se ha favorecido eldesarrollo de sensores químicos ybiosensores como alternativa de aná-lisis a la instrumentación analíticaconvencional. La necesidad de análi-sis de diferentes componentes atiempo real en áreas cada vez másdiversas ha promovido en estos últi-mos años que los esfuerzos realiza-dos en el desarrollo de instrumenta-ción analítica se dirijan hacia la cons-trucción de dispositivos que sean deuso simple y de bajo coste. Los sen-sores químicos existen desde hacemucho tiempo. Se han estudiado enprofundidad y han encontrado entodo este tiempo un gran campo deaplicación. Se conocen muy bien porsu uso cotidiano en el laboratorio loselectrodos redox, los electrodosselectivos a iones, especialmente elde pH, entre otros. Los biosensores,de aparición más reciente, constitu-yen un campo multidisciplinar de I +Dy un mercado muy atractivo.Originariamente la investigación eneste campo provenía principalmentedel sector clínico y biomédico.Actualmente los biosensores no sonpatrimonio exclusivo de la investiga-ción biomédica. La industria alimen-taria demanda métodos rápidos paraestimar la identidad, la caducidad, eldeterioro o la contaminación de losalimentos. A la industria en general, ya la alimentaria en particular, le esnecesario controlar de manera fiableparámetros analíticos en matricesmuy complejas. Un sensor está formado por dos par-tes. Una de estas partes es el deno-minado «elemento de reconocimientomolecular» o «receptor» que interac-ciona con un determinado compo-nente de la muestra, de maneraespecífica, es decir, el resto de lamuestra no interfiere en la medición.El otro componente, se conoce como


20

«transductor». Cuando el componen-te que se busca determinar en lamuestra compleja interacciona con el«receptor» del sensor, se produce uncambio que es detectado por el«transductor» y transformado en unaseñal eléctrica mensurable por uninstrumento (Figura 1). Esta configuración tan simple dereconocimiento y transducción es laque ha permitido el diseño de unainstrumentación con característicasprácticas e innovadoras en el campodel análisis. Mediante este esquemaanalítico tan simple es posible elimi-nar varias etapas convencionales delproceso analítico, como son el trata-miento de la muestra o la separacióndel resto de la muestra del compo-nente que se quiere determinar, loscuales complican un procedimientoclásico de análisis cuando se usaequipamiento analítico complejo. Mientras más simple y fiable sea elproceso de reconocimiento, más loserá el dispositivo resultante. Lainvestigación y el desarrollo de lossensores químicos están dirigidosprincipalmente a la obtención dereceptores de moléculas cada vezmás selectivos. Sin embargo, los ele-mentos de reconocimiento o recepto-res de naturaleza sintética presentanun grado de reconocimiento limitado.Se conoce la selectividad limitada dela mayoría de las reacciones utiliza-das en el análisis químico, que obli-ga a tratar previamente la muestracon el fin de eliminar las interferen-cias. Este hecho ha ocasionado quesólo un número reducido de reaccio-nes químicas sean aprovechadascomo sistemas receptores en lossensores químicos, puesto que estosse diseñan para funcionar en deter-minaciones directas sin tratamientode la muestra. Esta limitación hizoque se consideraran como «elemen-tos de reconocimiento» los recepto-res de naturaleza biológica o biore-ceptores, para la construcción desensores con materiales biológicosde reconocimiento molecular, mucho

más selectivos que los de naturalezasintética. Estos sensores químicosque incorporan materiales biológicosen su construcción se conocen como«biosensores». Un biosensor es unsensor químico con un receptorconstituido por material biológicopara el reconocimiento molecular delanalito. El reconocimiento molecularbiológico es la clave de la vida celu-lar, de su organización y manteni-miento. La comunicación químicaentre células mediante sistemasmoleculares complementarios es unproceso de vital importancia, respon-sable de la organización y la protec-ción de organismos y de la regula-ción de su metabolismo. Este tipo dereconocimiento, optimizado por laevolución biológica, se usa para eldesarrollo de los biosensores.Efectivamente, las interaccionesentre enzimas y sustratos o inhibido-res, entre anticuerpos y antígenos ohaptenos, entre diversos receptoresy hormonas, fármacos y neurotrans-misores y entre fragmentos de DNAhan servido de modelo a varios siste-mas biosensores, algunos ya comer-cializados. Los sensores y biosensores son ide-ales para ser utilizados en medicio-

nes directas, es decir, sin un trata-miento preliminar de la muestra. Sonparticularmente adecuados en losprocesos industriales. Por ser portá-tiles y robustos, los sensores quími-cos y los biosensores son apropia-dos en la medición de procesos,junto a reactores industriales. Lossensores pueden conectarse dealguna manera con el proceso paraseguirlo controlarlo en forma conti-nua. Es decir, el sensor se integra aun sistema de toma de muestraautomatizado. Los sensores y bio-sensores pueden ser fabricadosmasivamente a muy bajo coste. Así,con una fabricación económica,estos dispositivos podrían ser de«uso personal» y descartables, esdecir, de usar y tirar. En este sentidotiene una gran importancia el hechoque los sensores se puedan desarrollan con tecnologías planas,de capas delgadas microlitográficas,las cuales se utilizan en la fabrica-ción de dispositivos microelectróni-cos y en circuitos impresos.Eventualmente pueden construirsesensores de capas gruesas que norequieren inversiones muy elevadas,como los producidos con técnicasserigráficas.


Figura 1.- Diagrama esquemático del funcionamiento de un sensor. El «elemento de

reconocimiento molecular» o «receptor» sólo reconoce un componente de la muestra. La

señal proveniente del proceso de reconocimiento se convierte en una señal eléctrica

mediante el «transductor». Esta señal es amplificada y posteriormente procesada y pre-

sentada en forma digital. El receptor puede interactuar con el analito mediante mecanis-

mos físicos, químicos o biológicos, como en el supuesto que se muestra en la figura.

21

La separación magnética y losmagneto sensores Las micropartículas y nanopartículasmagnéticas, constituidas por unnúcleo de ferrita de propiedadesparamagnéticas y recubiertas por unpolímero inerte, representan una delas estrategias más prometedorasen bioanálisis y bioseparación (19-21). Pueden ser modificadas condiferentes grupos orgánicos paraacoplarse covalentemente a biomo-léculas (enzimas, DNA o anticuer-pos), o ser modificadas directamen-te con biomoléculas como estrepta-vidina, Proteína A o poli(dT). Lasmoléculas que se quieren analizarpueden unirse a las partículas mag-néticas mediante una reacción bioló-gica específica y separarse de lamatriz biológica mediante la aplica-ción de un campo magnético, y así elanalito presente en la muestra ali-mentaria se preconcentra en lasuperficie de las esferas. La figura 2muestra la inmunoseparación mag-nética de Salmonella en una mues-tra de leche, mediante la reacción dela bacteria con partículas magnéti-cas modificadas con el anticuerpoespecífico.Las partículas magnéticas están dis-ponibles comercialmente con unavariedad de grupos funcionales y detamaños. En la estrategia planteada por elGSB, las reacciones biológicas (deinmovilización, de reacción inmunoló-gica y de hibridación) se llevan a tér-mino en las esferas magnéticas, con-siguiéndose que las bioreaccionesasí como las etapas de lavado seanmás efectivas (22). Tras las modifica-ciones, las esferas magnéticas con elanalito pueden capturarse con unossensores magnéticos de propiedadeselectroquímicas mejoradas, diseña-dos en el GSB y basados en un com-pósito conductor grafito-epoxi queincluye un pequeño imán (m-GEC)(22). Estos magneto sensores soncapaces de captar esferas paramag-néticas micrométricas y nanométri-

cas, y detectar electroquímicamentemicroorganismos o biomoléculasinmovilizadas en las esferas. En laFigura 3 se muestra la dimensión delprototipo del sensor magnético desarrollado por el Grup de Sensors iBiosensors de la UAB. El Grupo de Sensores y Biosensores(GSB), en colaboración con elDepartament de Genètica iMicrobiologia, de la UniversitatAutònoma de Barcelona dirige suslíneas de investigación en este senti-do. A continuación se explican losprincipales avances conseguidos en

el campo de la determinación de bac-terias patógenas por este grupo.

Magneto Inmunosensor elec-troquímico para la detecciónde bacterias patógenas en ali-mentos El GSB ha diseñado un sistema elec-troquímico para la detección rápida ysencilla de Salmonella en leche,basado en la captura inmunomagné-tica de Salmonella y en una reaccióninmunológica de tipo sándwich (23).Para tal fin, se utilizaron partículasmagnéticas recubiertas por anticuer-


Figura 2.- Izq. Diagrama esquemático de la inmunoseparación magnética (IMS) de

Salmonella en muestras de leche. Der. Imágenes de la microscopía electrónica de barri-

do, luego de la inmunoseparación magnética de Salmonella (104 CFU/ml). Voltaje de

aceleración 15 kV.

Figura 3.- Aspecto macroscópico del sensor magnético desarrollado en el GEB compa-

rativamente con una moneda de un euro.

22

pos específicos anti-Salmonella y unsegundo anticuerpo anti-Salmonellamarcado con la enzima peroxidada(Figura 4). Entre procedimientos diferentes, losmejores resultados se obtuvieron con

las reacciones inmunológicas lleva-das a cabo en un paso, hecho quetrae asociado el acortamiento y lasimplificación del proceso. El procedi-miento IMS/m-GEC/inmunosensorfue utilizado por primera vez para la

detección de Salmonella inoculadaartificialmente en muestras de leche.Se obtiene con esta estrategia unlímite de detección de 5 103 cfu mL-1 yde 7,5 103 cfu mL-1 en LB y en lechediluída 1/10 en caldo LB, respectiva-mente, en 50 min sin ningún pretrata-miento. Si la leche se preenriquecedurante 6 horas, el método puededetectar tan sólo 1,4 cfu mL-1, mien-tras que si se preenriquece durante 8horas, se pueden detectar tan sólo0,108 cfu mL-1 (2,7 cfu en 25 g deleche, en 5 muestras de 5 mL, segúnel Real Decreto 1679/1994, BOE 24-09-94). Además, el método puededistinguir entre bacterias patógenasalimenticias como Salmonella y E.coli.

Magneto Genosensor electro-químico combinado con PCR ycon separación inmunomagné-tica para la detección de bac-terias patógenas En el GSB se ha desarrollado unmétodo sensible de detección debacterias que combina la separacióninmunomagnética (IMS), la PCR condoble marcación y la detección elec-troquímica mediante un magnetosensor (24). La bacteria se capturadesde la muestra alimentariamediante partículas magnéticasmodificadas con el anticuerpo espe-cífico. Luego de la separación, y dela ruptura de la membrana celular, elgenoma de la bacteria se amplificapor PCR (reacción en cadena de lapolimerasa). La estrategia se basaen el uso de un set de primers dise-ñados para la amplificación específi-ca por PCR, marcados con biotina ycon digoxigenina, respectivamente(25). Durante la amplificación de lasecuencia específica IS200 de laSalmonella el producto, además deamplificarse, se marca doblementecon biotina y con digoxigenina encada extremo. Tras la amplificación,se consigue la inmovilización de lasecuencia amplificada a partículasmagnéticas recubiertas de estrepta-


Figura 4.- Representación esquemática de la estrategia de determinación de Salmonella

basada en uno magneto sensor. (i) Tras la captación de las bacterias de la muestra ali-

mentaria, y la reacción con un segundo anticuerpo marcado con la peroxidasa, las partí-

culas magnéticas modificadas con el anticuerpo específico son captadas por el sensor

magnético. (ii) El sensor se polariza a -0,1 V (vs. Ag/AgCl) y se detecta electroquímica-

mente la señal tras la adición de los reactivos necesarios.

Figura 5.- Representación esquemática de la estrategia de determinación de Salmonella

basada en la captura inmunomagnética (A), la lisis de la bacteria (B), la amplificación y

el marcaje del genoma por PCR (C) y la detección electroquímica mediante un magneto

genosensor.

23

vidina, mediante la reacción con labiotina, y la marca enzimáticamediante el otro extremo modificadocon digoxigenina. Posteriormente,las partículas magnéticas modifica-das son captadas por el magnetosensor y se realiza la detección elec-troquímica basada en la actividadenzimática (Figura 5). Esta estrategia puede detectar tansólo 1 CFU mL-1 de bacterias en LBasí como en leche diluida 1/10 enLB, sin mostrar ningún efecto dematriz, a causa del uso de partículasmagnéticas. El inmunoseparaciónmagnética permite reemplazar elcultivo selectivo mientras que laPCR de doble marca y detecciónelectroquímica basada en el magne-to sensor reemplaza las etapas depruebas bioquímicas y confirmaciónserológica del método de referencia.El tiempo del ensayo se consiguereducir considerablemente desde 3-5 días a 3-5 h. Es importante desta-car que esta estrategia puede darresultados positivos con células bac-terianas dañadas o muertas, perosin embargo, y a diferencia de laPCR convencional, no da resultadospositivos con DNA liberado duranteel procesamiento del alimento.Además, los inhibidores de la PCRse evitan en esta estrategia alextraer el DNA en el interior de lacélula bacteriana y liberarlo una vezeliminada la muestra (y los posiblesinhibidores que contenga). Si lamuestra se preenriquece por 6 h enLB, se pueden detectar tan sólo 0.04CFUs mL-1 de Salmonella con unaseñal/ruido de 20. Este procedimien-to es adecuado por el análisis in siturápido y sensible de Salmonella enHACCP.La especificidad de esta estrategiaestá dada tanto por el reconocimien-to inmunológico del anticuerpo duran-te la separación inmunomagnéticaasí como por el set de primers duran-te el PCR, mientras que la sensibili-dad viene dada por el magneto geno-sensor electroquímico.

Las perspectivas futuras del GSB sedirigen al desarrollo de un sistemamultiplexado de screening de micro-organismos patógenos viables ente-ros, tal y como Salmonella, Listeria yEscherichia coli, para la detecciónrápida de estos patógenos en mues-tras alimentarias complejas.

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24

Introducción El control de calidad interno en loslaboratorios de análisis es una herra-mienta imprescindible para asegurarla adecuación de los métodos deensayo al uso previsto así como paraevaluar tendencias y evaluar la inci-dencia de los diversos factores quepueden afectar al resultado.Es por ello que la Norma UNE-ENISO 17025:2005 (punto 5.9) incluyeque “el laboratorio debe tener proce-dimientos de control de calidad pararealizar el seguimiento de la validezde los ensayos”. También la Guíapara el examen microbiológico dealimentos UNE EN ISO 7218:2007(punto 15.1) establece la necesidadde realizar este control al objeto de“asegurar la consistencia de losresultados día tras día y su confor-midad en base a criterios bien defini-dos”.Los datos deben ser analizados y, sino satisfacen los criterios predefini-dos, se deben tomar acciones planifi-cadas para corregir el problema y evi-tar resultados incorrectos. Estos crite-rios pueden venir incluidos en el pro-pio método a emplear así como obte-nerse a partir de los valores reales delas pruebas de verificación o valida-ción interna realizados para asegurarla correcta puesta a punto del métodoen nuestro laboratorio.

Factores que afectan al con-trol de calidad de los ensayos Como se puede observar en la figura1, son múltiples los factores que afec-tan a la calidad de los resultados ana-líticos, estando a su vez relacionadosentre sí.Cada uno de estos factores tiene a suvez diversos puntos que permitengarantizar el adecuado control de losmismos. No obstante, el control decalidad planificado debe realizarse deforma que todos estos factores no seestudien de forma independiente, sinode forma integrada, de modo quepuedan evidenciarse interferenciasentre los mismos.

Tipologias de control de cali-dad interno Controles de 1er nivelEste nivel consiste en un autocontrolque pretende evaluar el trabajo diario,que incluye las operaciones de controlque realiza el analista durante la eje-cución de los ensayos, así como lasupervisión directa de los resultadospor la persona cualificada para ello.Muchas de estas operaciones se rea-lizan de forma rutinaria sin generarregistros, y otras deben ser planifica-das de forma específica, entre las quepodemos incluir:• Controles de esterilidad o controles

negativos, para asegurar la esterili-dad de los medios de cultivo emple-ados y la asepsia de las operacio-nes de análisis.

• Siembra de duplicados mediante lasiembra de varias placas de unamisma dilución, de forma que sepueda evaluar la diferencia ennúmero de colonias según lo esta-blecido en ISO 14461-2:2005.

• Control del factor de dilución, paraque se asegure que las coloniasobtenidas en diferentes dilucionescumplen con un determinado rangode tolerancia (por ejemplo el esta-blecido en ISO 14461-2:2005)

• Verificación del estado del equipo yajustes necesarios.

Controles de 2º nivelEl objeto de dichas pruebas es garan-tizar la reproducibilidad entre los diver-sos analistas, equipos y condicionesde ensayo, así como la influencia delas matrices y flora natural presente enlas muestras que habitualmente anali-za el laboratorio. Dichos controles serealizarán de forma periódica y seránsupervisados y preparados por unapersona independiente de los analis-tas que participen en los ensayos.Los controles de segundo nivel con-sisten básicamente en la realizaciónde ensayos intralaboratorio (que a suvez pueden formar parte de un interla-boratorio, si bien en este caso deben


Control de calidad interno enlaboratorios de microbiología

David Tomás Fornés Jefe Laboratorio MicrobiologíaAinia centro tecnológicoC/Benjamin Franklin 5-11 46980 Paterna (Valencia)Tlf: 961366090 [email protected]

Figura 1.-

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contemplarse si estos incluyen elefecto matriz). Su frecuencia y el per-sonal implicado así como el modo deevaluación de los resultados debenser previamente definidos en el plande evaluación de la calidad que seelabora periódicamente. Los ejercicios intralaboratorios pue-den estar constituidos por muestrasciegas (los analistas conocen que setrata de un ensayo de control de cali-dad pero desconocen el valor diana) opor doble ciegas (además se desco-noce que se trata de un ensayo deevaluación de calidad).• Métodos cuantitativos, al objeto de

asegurar que la precisión y la exac-titud (o recuperación) del métodoestán bajo control, mediante elempleo de muestras con un valordiana conocido así como la realiza-ción de duplicados. Estos ensayosdeben permitir estudiar tendenciasde los mismos, para lo cual puedenemplearse gráficos de control.

• Métodos cualitativos (presen-cia/ausencia) para evaluar la efica-cia del mismo (coincidencia con elvalor diana), pudiendo realizarsemediante la inoculación de lasmatrices que habitualmente se ana-lizan con material de referencia ocon un cultivo del microorganismodiana preparado por el laboratorio aniveles cercanos al límite de detec-ción (habitualmente no superior a10 veces este límite).

Controles de 3er nivelLos controles de tercer nivel en reali-dad no son propiamente dichos unoscontroles de calidad internos sinoque, al contrario que en los anteriorescasos, la evaluación del resultado delcontrol de calidad la realiza un orga-nismo externo al propio laboratorio.Suelen denominarse ejercicios inter-laboratorios o intercomparativos. Parala ejecución de estos ensayos esnecesario contar con un organismoorganizador del mismo, que debemostrar reconocida solvencia en laejecución de los mismos.

Este tipo de ejercicios consisten en larecepción de una o varias muestrasque han sido inoculadas con diferen-tes microorganismos y concentracio-nes. El laboratorio participante en elmismo debe recibir instruccionesdetalladas de cómo preparar la mues-tra a analizar, cuales son los ensayosa realizar y los plazos para la realiza-ción de los análisis. Es importantetambién revisar detalladamente laforma de envío de resultados, pararegistrar adecuadamente todos losdatos que nos solicita el organizador.La evaluación de estos ensayos sesuele realizar a partir del índice Z

(Zscore), que se obtiene mediante elestudio estadístico de los resultadosglobales obtenidos por todos los labo-ratorios. Un resultado satisfactoriosuele tener un Zscore inferior a ±2.Los resultados de Zscore entre ±2 y

±3 suelen ser cuestionables e inacep-tables los superiores a ±3. No obstan-te, es conveniente que el laboratoriorealice además una evaluación com-plementaria de los resultados eva-luando si el rango de Zscore es eladecuado (lo deseable sería que, engeneral el rango Zscore ±2 no fuerasuperior a 1-2 log ufc/g).Es importante incorporar en nuestrosistema de gestión de proveedoresuna evaluación específica de la cali-dad de los organizadores de este ser-vicio como si se tratara de un provee-dor más, para lo cual se deben con-templar aspectos como la acredita-

ción del organizador del circuito, elnúmero de laboratorios que partici-pan, el informe de resultados que seremite, así como la posibilidad demantener una comunicación fluida ytransparente.


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• Sistemas rápidos (4-48 horas),seguros y con resultados fiables.

• Sistemas herméticos de fácilmanipulación, < 1 minuto por test.

• Gran número de sustratos bioquí-micos (15-30) para realizar unaidentificación más precisa.

• No necesita de muchas pruebasprevias. Deben usarse con aisla-dos puros.

• No necesita revelado de los resul-tados.

• La mayor base de datos de identi-ficación de microorganismos,incluyendo gran cantidad de bac-terias ambientales.

BD BBL™ ENTEROTUBE II • Es un método para la identifica-

ción que utiliza 15 substratos bio-químicos para la identificaciónpresuntiva de bacterias entéricas.Más de 80 especies con el BDEnterotube II por medio de 3Bases de Datos.

• Selección del sistema a usar:• colonias oxidasa negativas ‡

Enterotube II.• colonias oxidasa positivas ‡

Oxi/Ferm Tube II.

BD BBL CRYSTAL • Sistema de identificación manual o

semiautomático (Autoreader) parala identificación de Bacteriasempleando 29 ó 30 sustratosFluorogénicos, Cromogénicos yAzucares.

• ID de 370 especies con 4 panelesde BD Crystal (Entéricos/NoFermentadores (E/NF) y GramPositivos (GP), Gram PositivosRápidos (RGP), Neisseria/Haemophilus (N/H) y Anaerobios(ANR).


Sistemas BD para identificación

BD (Becton, Dickinson and Company)

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La microbiología clásica mediantemedios de cultivo permite la detec-ción y el recuento de microorganis-mos de la forma más segura y en lamayor proporción de matrices ali-mentarias, aguas, medicamentos,cosméticos, superficies, aire... Sinembargo tiene algunos problemas,de los que destacan dos principales:1-es un método lento en la obtenciónde resultados, 2-es laborioso y sue-le requerir protocolos que involucranal analista durante varios días, loque resulta sumamente incómodo.Un gran paso adelante de los ulti-mos años ha sido la adición a losmedios de cultivo, de substratos cro-mogénicos más o menos específi-cos, que disminuyen el nivel de co-lonias sospechosas falsamente po-sitivas. Esto permite ahorrar muchotiempo y dinero en las muestras conpresuntos patógenos. El problemainicial de los medios cromogénicosera estar presentes en el mercadosólo en formato preparado de es-casa caducidad y elevado coste,que además no solía permitir lassiembras en masa, pero se ha re-suelto mediante la gama deshidrata-da CROMOKIT® de MICROKIT®. De modo que con el medio cromogé-nico deshidratado hemos ganadotiempo, ahorrado trabajo y por tantodinero, minimizando los dos grandesproblemas de la microbiología clá-sica, pero además sin perder sus in-mejorables ventajas acerca de la re-producibilidad y la robustez del mé-todo.El problema remanente ahora era laincomodidad de preparar medios(pesar, disolver, autoclavar, refun-dir...) para poder sembrar en masa,como muchos parámetros microbio-lógicos requieren. Este problematambién queda resuelto con las mo-dernas Compact Dry Plates®. Se tra-ta de medios cromogénicos deshi-dratados pero ya preparados en pla-ca. Absorben directamente por auto-difusión 1 ml de muestra y la siem-bran en masa sin necesidad de fun-

dir medios (ahorran el punto críticode agregar agares demasiado ca-lientes que impiden el crecimientode una proporción más o menos im-portante de ufc). Para recuentos,con placas normales se necesitan 3para absorber 1 ml de muestra, demodo que estas novedosas placasademás ahorran dinero. Ahorrantambién las asas de siembra nece-sarias en las placas preparadas con-vencionales, espacio en la nevera(no necesitan refrigeración), en laestufa y en el bidón de residuos. Alestar deshidratadas, su caducidades de 1 año desde fabricación. Sonherméticas y 100% estériles. La ga-ma de medios es completísima:Aerobios totales, Hongos (levadurasy mohos), Coliformes y E.coli,Bacillus cereus, Enterobacterias,Enterococos, Staphylococcus au-reus, Salmonella spp., Vibrio para-haemolyticus.A pesar de su formato con aspectode kit, las Compact Dry Plates® handemostrado ser un método tan ro-busto como la microbiología clásicade las Normas ISO, e incluso mejo-ran las sensibilidades, especificida-des y exactitudes de las técnicasclásicas. Todo ello puede compro-barse en las numerosas validacio-nes AOAC, Nordval, Microval yMicrokit existentes para este produc-to, tanto para alimentos, como paraaguas y para cosméticos. Añada a

ello el importante ahorro de tiempoy de trabajo: ¡de la muestra a la es-tufa en 10 segundos!; y comprobaráque las Compact Dry Plates® son lamejor forma de la que un laborato-rio del siglo XXI dispone para hacersus análisis microbiológicos.

Modernos métodos validados dedetección y recuento de

microorganismos: máximaseficiencia, exactitud y comodidad

Laboratorios MICROKIT, S.L. Apartado 44,28210-Madrid Tel: 91-897 46 16, Fax: 91*897 46 41,email: [email protected], web:www.microkit.es

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Los sistemas BAX® para la identifica-ción de patógenos alimentarios yRiboPrinter® para la caracterización mi-crobiana de DuPont Qualicon son he-rramientas avanzadas para mantenerla garantía de calidad en los productosy entornos de producción alimentaria.El Sistema RiboPrinter® es un sistemade caracterización microbiana a nivelgenético que proporciona la velocidad,precisión, reproducibilidad y resoluciónnecesarias para identificar las bacte-rias y compararlas a nivel de cepa pa-ra una caracterización eficaz y consis-tente. El sistema RiboPrinter® proporcionauna instantánea genética automatiza-da o, patrón RiboPrint™, de cualquierbacteria. Los patrones de RiboPrintTMproporcionan caracterizaciones a nivelde cepa de los elementos aislados enel ambiente, patógenos, organismosde putrefacción, cepas de control, or-ganismos beneficiosos o cualquierbacteria importante para el sector ali-mentario. Se pueden analizar hasta ocho bacte-rias de forma simultánea y los resulta-dos se obtienen ocho horas despuésde la introducción de la muestra. Dadoque el sistema puede aceptar lotesnuevos cada dos horas, en un día detrabajo normal se pueden cargar has-ta 32 muestras. Desde el principio al fin, el proceso delsistema RiboPrinter® está automatiza-do, lo que simplifica la formación de losoperadores y reduce al mínimo loserrores debido a la tecnología. La car-ga y el funcionamiento de la unidadde caracterización son sencillos e in-tuitivos. El software de la estación detrabajo es de fácil utilización, y pro-porciona un análisis de datos sofisti-cado que elimina la necesidad de re-alizar interpretaciones subjetivas delos resultados. Por todo ello, el sis-tema es muy consistente y aportaprocedimientos normalizados.Las librerías del sistema contienen enla actualidad más de 6.900 patrones

RiboPrintTM, lo que representa 219géneros bacterianos y más de 1.440especies y serotipos, incluyendo:- 1 EcoRI – 5.685 patronesRiboPrintTM- 1 PvuII – 1.062 patronesRiboPrintTM- 1 PstI - 203 patrones RiboPrintTMEl sistema RiboPrinter® combina la au-tomatización y la potencia del ADN pa-ra ir más lejos en la identificación y do-cumentación de un problema microbia-no. Cada vez que se introduce unamuestra, el sistema produce una ins-tantánea genética exacta de los orga-nismos vinculada con datos históricos.Con una visión exhaustiva y dinámicade cualquier entorno microbiano, lostécnicos pueden seguir y manipular losdatos a nivel de cepa, lo que les per-mite determinar la contaminación conmayor velocidad, facilidad y precisiónque nunca. De forma práctica en unaplanta de producción, el sistemaRiboPrinter® permite identificar los cen-tros potenciales de contaminación yvincularlos a lasbacterias encontra-das en otras áreas.Con el tiempo sepuede localizar el fo-co de contamina-ción y posteriormen-te eliminarlo.Además se puedecrear un perfil micro-biológico completode las bacterias au-tóctonas de cadaplanta.Asimismo, el siste-ma RiboPrinter® esmuy flexible en lo re-lativo a las enzimasde restricción, al po-

der realizar el ribotipado de las bacte-rias con una enzima de restricción yapreparada o una configuración perso-nalizada, al mismo tiempo que se con-servan las ventajas de una completaautomatización.

Sistema RiboPrinter® para lacaracterización genética

microbiana

Oxoid, S.A.

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Bioser S.A. distribuye Productos deCalidad y aconseja a las industriasalimentarias, laboratorios a tercerosy laboratorios de salud pública conel fin de colaborar con ellos para sa-tisfacer sus objetivos con Garantíade Calidad. Bioser. S.A. participó enel VIII Wokshop de la UniversidadAutónoma de Barcelona para am-pliar y difundir los conocimientos te-óricos y prácticos sobre métodos in-novadores para detectar, contar, ais-lar y caracterizar rápidamente losmicroorganismos habituales en ali-mentos y aguas. Entre ellos se pre-sentaron métodos rápidos basadosen movilidad (SESAME SALMONE-LLA TEST), cromogénicos (COM-PASS LISTERIA+L.MONO CON-FIRM) y PCR real time. A continua-ción se detallan sus característicasy ventajas competitivas:

Detección rápida deSalmonella en alimentosBioser S.A. presenta el SesameSalmonella Test para la detecciónrápida de Salmonella. El kit constadel Sesame Salmonella Enrichment,para el enriquecimiento de la mues-tra y del Sesame SalmonellaDetection para la lectura de los re-sultados. Cuando en la placa deSesame Salmonella Detection el ha-lo blanco y opaco es igual o superiora los 3 cm. significa que el resulta-do es positivo. Se obtienen resultados negativos en42 horas incluyendo el preenriqueci-miento. La confirmación de lasmuestras presuntamente positivasse puede realizar usando el COM-PASS Salmonella Agar, que requie-re una incubación adicional de 24horas y las colonias aparecen de uncolor magenta. El Test tiene comoventajas principales la rapidez deobtención de resultados, está valida-do por AFNOR (según ISO 16140),es fácil de interpretar y el medio deenriquecimiento se puede utilizar co-mo agua de peptona para otros aná-lisis. El tiempo total invertido con

Sesame Salmonella Test es de 3 dí-as con confirmación en comparacióncon el método según ISO 6579 don-de se obtienen resultados en 5 – 6días.

Detección rápida de Listeriamonocytogenes en alimentosBioser S.A. presenta los medios cro-mogénicos Compass Listeria yL.mono Confirm para la detección rá-pida de Listeria monocytogenes.Inicialmente se utiliza como medio deenriquecimiento el caldo Half-Fraser,a continuación como medio selecti-vo se emplea COMPASS ListeriaAgar para aislar y diferenciar. Las co-lonias características de Listeria mo-nocytogenes se presentan azules oazul-verdosas y están rodeadas porun halo opaco. Debe remarcarse que

algunas variedades de Listeria ivano-vii pueden producir a veces coloniascaracterísticas, sin embargo son nor-malmente de tamaño mucho menor.Las colonias características se con-firman utilizando L.mono Confirm, uti-lizando una única raya para cadaconfirmación. Cuando en la raya apa-rece un cambio de color a amarillo yun halo opaco alrededor, el resulta-do es positivo para géneros & espe-cies de Listeria monocytogenes. ElTest tiene como ventajas principalesla rapidez de obtención de resultadosresultados (negativos en 48 horas yse confirman los positivos en 24 ho-ras adicionales), está validado porAFNOR (según ISO 16140), es fácilde interpretar. Es posible efectuarhasta 6 confirmaciones en una mis-ma placa. El tiempo total invertido

Optimización en un laboratoriode calidad: análisis de

patógenos

Bioser S.A. presenta el SesameSalmonella Test para la detección

rápida de Salmonella. El kit consta delSesame Salmonella Enrichment, para el

enriquecimiento de la muestra y delSesame Salmonella Detection para la

lectura de los resultados. Cuando en laplaca de Sesame Salmonella Detection

el halo blanco y opaco es igual osuperior a los 3 cm. significa que el

resultado es positivo

Bioser S.A.

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con Compass Listeria y L.monoConfirm es de 2 días resultados ne-gativos y 3 días resultados positivosen comparación con el método segúnISO 11290-1 donde se obtienen re-sultados negativos en 3 días y posi-tivos en 5 días.

Automatización PCR:La PCR a tiempo real es una técni-ca cada vez más utilizada en los la-boratorios de calidad por su especi-ficidad, tiempo de reacción, produc-tividad, multiplicación de la capaci-dad de análisis y optimización de losrecursos humanos, materiales ytemporales. La utilización de la PCRa tiempo real requiere unos nivelesde inclusividad máximos para obte-ner la plena fiabilidad en el análisis.El método consta de 4 etapas: pre-enriquecimiento de las muestras(18-48 horas), extracción, amplifica-ción y detección del ADN y análisisde los resultados (3-4 horas). BioserS.A les presenta los kits completosque permiten la detección rápida porPCR a tiempo real de Microbial. Sebasan en un primer paso de extrac-ción de ADN con DNAready (tampónde lisis), seguido de la detección conSalmofast, Legiofast, Bactoplex, etc.

(dianas genéticas especificas), queincorporan los elementos necesariospara detectar y amplificar el ADN; in-cluyen reacción Taq DNAPolimerasa, Nucleotidos (dNTPs),IAC Control Interno reamplificación,Primers o cebadores (Gen diana),Sondas Taqman® y la concentración

adecuada de MgCl2. Se obtienen re-sultados en 24-28 horas. Los kits deMicrobial tienen la ventaja de poderser utilizados con cualquier termo-ciclador del mercado y todos los kitstiene el mismo procedimiento. Fáciluso y se comercializan en formatode 50, 100 y 500 test.

La PCR a tiempo real es una técnicacada vez más utilizada en loslaboratorios de calidad por su

especificidad, tiempo de reacción,productividad, multiplicación de la

capacidad de análisis y optimización delos recursos humanos, materiales y

temporales. La utilización de la PCR atiempo real requiere unos niveles deinclusividad máximos para obtener la

plena fiabilidad en el análisis

viii workshop métodos rápidos y automatización en ... · otras aplicaciones ofimáticas como...

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