AJCristóvão, Departamento Zoologia Universidade Coimbra 2003

INDUÇÃO E REPRESSÃOCATABÓLICA DE ß

GALACTOSIDASE EM E.Coli

Via Catabólica

Lactose = dissacarídeo

ß-galactosidase

Glicose + galactose

AJCristóvão, Departamento Zoologia Universidade Coimbra 2003

Expressão de genespor observação

fisiológica

Lactose Glicose Expressão do geneActividade B-galactosidade

- + - baixa+ + - baixa- - - baixa+ - + alta

AJCristóvão, Departamento Zoologia Universidade Coimbra 2003

Parte experimental 1

E. Coli 18h sem lactose.

Glicose 0,4% glicose + lactose(0,4% de cada) lactose 0,4%

Centrifugar a10 000 rpm

durante 5 min

Resuspender osedimento

em 10 ml H2O

Células quecresceram

em glicose 0,4%

Células quecresceram em lactose

0,4%

Células que cresceram em glicose+lactose 0,4%

X 3

No final temos:

C

A B

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Parte experimental 2Suspensão 1:3 ml células

Crescidas em A+ Tolueno

Suspensão 2:3 ml células

Crescidas em Bsem Tolueno

Suspensão 3:3 ml células

Crescidas em B+ Tolueno

Suspensão 4:3 ml células

Crescidas em C+ Tolueno

Erlenmeyer 1:Iniciar experiência

com2 ml suspensão 1

Adicionar a cada erlenmeyer de 50 ml:12 ml tampão fosfato 100 mM1,5 ml de o-NPG 50 mMIncubar 15 min 37ºC

Após a adição MARCAR O TEMPO (t0)Continuar a incubar a 37ºC.Retirar 1 ml de 10 em 10 min para tubos que preparou previamente com 1 ml de Na2CO3 1M

Erlenmeyer 2:Iniciar experiência

com2 ml suspensão 2

Erlenmeyer 3:Iniciar experiência

com2 ml suspensão 3

Erlenmeyer 4:Iniciar experiência

com2 ml suspensão 4

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Acção da ß-galactosidase

Após a obtenção dos pontos, adicionar 8ml de água destilada a cada tubo.Misturar muito bem.Ler a Absorvância (D.O.) a 420 nmUsar como branco água destilada

Construir a curva padrão e relacionar os valorescom a curva padrão.

Preparação dos tubos para leitura no espectrofotómetro:

AJCristóvão, Departamento Zoologia Universidade Coimbra 2003

O Uso da curva padrão

y = 0.404xR2 = 0.9997

Método A(em papel milimétrico)

Método B

0,252,51

0,220,81

0,151,50,61

0,110,41

0,0750,750,31

0,050,50,21

0,0250,250,1

µmolesoNPG/ml

µmolesoNPG

Absorvância420 nM

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 1 2 3

Abs

a 420 n

m

µmoles o-NPGX

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Valoresexperimentais

0,1430 min

0,1220 min

Lactose -0,1110 min

0,05730 min

0,04920 min

Lactose+

0,04510 min

0,05830 min

0,05220 min

Glucose+

0,06410 min

CondiçãoAbs 420Tempo

+ ou - tolueno

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Control da expressãode genes

• Negativa–Ligação do regulador

(repressor) ao DNA inhibe aexpressão do gene= OFF

• Positiva–Ligação do regulador

(indutor) ao DNA activa aexpressão do gene = ON

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Operão Lac• Repressor = proteína que se liga ao

DNA - liga ao local do operador de umoperão e impede a transcrição

• A proteína repressora é codificada pelogene regulador (lacI)

Km= 2,5 mMVmáx= 32,6

Km= 1,2 mMVmáx= 49,6

AJCristóvão, Departamento Zoologia Universidade Coimbra 2003

Glicose = fonte energéticapreferencial

Que molécula nas célulasreflecte os níveis de glicose?

= AMP cíclico (cAMP)

Alta glicose = cAMP baixoBaixa glicose = cAMP elevado

O cAMP liga a proteínareceptora de cAMP (CRP)

= regulador alostérico deproteínas que se ligam aoDNA

AJCristóvão, Departamento Zoologia Universidade Coimbra 2003

Glucose: Fonte energéticapreferencial

cAMP+CRP = indutor detranscrição activo

sem cAMP+CRP = indutorinactivo

AJCristóvão, Departamento Zoologia Universidade Coimbra 2003

Lactose ausente

Lactose presente MAS…

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alta glucose (cAMP baixo)

A afinidade da RNA polimerase para o indutor do operão lacé: BAIXA sem cAMP-CRP--> pouca transcrição

baixa glucose (cAMP alto)

A afinidade da RNA polimerase para o indutor do operão lac é:ALTA com cAMP-CRP--> muita transcrição

AJCristóvão, Departamento Zoologia Universidade Coimbra 2003

Como ocorre ocrescimento no meio de

glicose + lactose?

Tempo (h)

D.O.

glicose + lactose