AJCristóvão, Departamento Zoologia Universidade Coimbra 2003
INDUÇÃO E REPRESSÃOCATABÓLICA DE ß
GALACTOSIDASE EM E.Coli
Via Catabólica
Lactose = dissacarídeo
ß-galactosidase
Glicose + galactose
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Expressão de genespor observação
fisiológica
Lactose Glicose Expressão do geneActividade B-galactosidade
- + - baixa+ + - baixa- - - baixa+ - + alta
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Parte experimental 1
E. Coli 18h sem lactose.
Glicose 0,4% glicose + lactose(0,4% de cada) lactose 0,4%
Centrifugar a10 000 rpm
durante 5 min
Resuspender osedimento
em 10 ml H2O
Células quecresceram
em glicose 0,4%
Células quecresceram em lactose
0,4%
Células que cresceram em glicose+lactose 0,4%
X 3
No final temos:
C
A B
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Parte experimental 2Suspensão 1:3 ml células
Crescidas em A+ Tolueno
Suspensão 2:3 ml células
Crescidas em Bsem Tolueno
Suspensão 3:3 ml células
Crescidas em B+ Tolueno
Suspensão 4:3 ml células
Crescidas em C+ Tolueno
Erlenmeyer 1:Iniciar experiência
com2 ml suspensão 1
Adicionar a cada erlenmeyer de 50 ml:12 ml tampão fosfato 100 mM1,5 ml de o-NPG 50 mMIncubar 15 min 37ºC
Após a adição MARCAR O TEMPO (t0)Continuar a incubar a 37ºC.Retirar 1 ml de 10 em 10 min para tubos que preparou previamente com 1 ml de Na2CO3 1M
Erlenmeyer 2:Iniciar experiência
com2 ml suspensão 2
Erlenmeyer 3:Iniciar experiência
com2 ml suspensão 3
Erlenmeyer 4:Iniciar experiência
com2 ml suspensão 4
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Acção da ß-galactosidase
Após a obtenção dos pontos, adicionar 8ml de água destilada a cada tubo.Misturar muito bem.Ler a Absorvância (D.O.) a 420 nmUsar como branco água destilada
Construir a curva padrão e relacionar os valorescom a curva padrão.
Preparação dos tubos para leitura no espectrofotómetro:
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O Uso da curva padrão
y = 0.404xR2 = 0.9997
Método A(em papel milimétrico)
Método B
0,252,51
0,220,81
0,151,50,61
0,110,41
0,0750,750,31
0,050,50,21
0,0250,250,1
µmolesoNPG/ml
µmolesoNPG
Absorvância420 nM
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
0 1 2 3
Abs
a 420 n
m
µmoles o-NPGX
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Valoresexperimentais
0,1430 min
0,1220 min
Lactose -0,1110 min
0,05730 min
0,04920 min
Lactose+
0,04510 min
0,05830 min
0,05220 min
Glucose+
0,06410 min
CondiçãoAbs 420Tempo
+ ou - tolueno
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Control da expressãode genes
• Negativa–Ligação do regulador
(repressor) ao DNA inhibe aexpressão do gene= OFF
• Positiva–Ligação do regulador
(indutor) ao DNA activa aexpressão do gene = ON
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Operão Lac• Repressor = proteína que se liga ao
DNA - liga ao local do operador de umoperão e impede a transcrição
• A proteína repressora é codificada pelogene regulador (lacI)
Km= 2,5 mMVmáx= 32,6
Km= 1,2 mMVmáx= 49,6
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Glicose = fonte energéticapreferencial
Que molécula nas célulasreflecte os níveis de glicose?
= AMP cíclico (cAMP)
Alta glicose = cAMP baixoBaixa glicose = cAMP elevado
O cAMP liga a proteínareceptora de cAMP (CRP)
= regulador alostérico deproteínas que se ligam aoDNA
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Glucose: Fonte energéticapreferencial
cAMP+CRP = indutor detranscrição activo
sem cAMP+CRP = indutorinactivo
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Lactose ausente
Lactose presente MAS…
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alta glucose (cAMP baixo)
A afinidade da RNA polimerase para o indutor do operão lacé: BAIXA sem cAMP-CRP--> pouca transcrição
baixa glucose (cAMP alto)
A afinidade da RNA polimerase para o indutor do operão lac é:ALTA com cAMP-CRP--> muita transcrição
AJCristóvão, Departamento Zoologia Universidade Coimbra 2003
Como ocorre ocrescimento no meio de
glicose + lactose?
Tempo (h)
D.O.
glicose + lactose