vetores de clonagem para eucariotos
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ACADÊMICOS:Kelton SilvaMarlon AlmeidaRichardson FrazãoOlivaldo Ataíde
MACAPÁ-APOUTUBRO/2004 www.oncogenes.com.br
E. Coli: Mais utilizada como organismo hospedeiro,disponibilidade de maiores vetores de clonagem para este.
E. coli Estuda Características Básicas da Biologia Molecular
- Estrutura e Função do Gene
S. cerevisiaeAtravés da clonagem, controle a melhora a Síntese de produtos Metabólicos
- Hormônio, tal como a Insulina;- Introdução de resistência a herbicida em uma planta cultivável.
- VETORES DE CLONAGEM PARA ORGANISMOS DIFERENTES DE E. COLI
Levedura Saccharomyces cerevisiae- Uma das mais utilizadas;
- Processo de clonagem estimulado pela descoberta do plasmídeo 2 µm;
- Vantagens da utilização do círculo 2 µm para um vetor de clonagem;
- Desvantagens da utilização do círculo 2 µm para um vetor de clonagem.
Vetores baseados no plasmídeo 2 µm- Denominados de Plasmídeos epissômicos para leveduras ou YEps;
- YEp13 = contém apenas a origem de replicação;
- YEp13 = apresenta várias características dos vetores de leveduras.
Plasmídeo 2 µm de levedura. REP1 REP2 estão envolvidos na replicação do plasmídeo, e FLP codifica uma proteína que pode converter a forma A do plasmídeo para forma B, na qual a ordem dos genes foi reorganizada pela
combinação intramolecular. A função de D não é exatamente conhecida
Outros tipos de Vetores de clonagem para leveduras
1 – Plasmídeos integrativos para levedura (YIps)
- Basicamente plasmídeos bacteriano;
- Não pode replicar-se;
- Sua sobrevivência depende de sua interação no DNA cromossomal.
2 – Plasmídeos replicativos para levedura (YRps)
- Capacidade de multiplicar-se como plasmídeos independentes;
- Possuem uma seqüência de DNA cromossômico ;
Cromossomos artificiais de leveduras
- Conseqüência da pesquisa sobre cromossomos eucarióticos
- Possuem uma seqüência de DNA cromossômico ;
- Capacidade de multiplicar-se como plasmídeos independentes;
Outros tipos de Vetores de clonagem para leveduras
Cromossomos artificiais de leveduras (YACs)
- Uma abordagem nova para a clonagem gênica;
- O desenvolvimento dos YACs foi subproduto de pesquisas sobre cromossomos eucarióticos;
- Identificando componentes fundamentais de um cromossomo, como:
- Centrômero, essencial para que os cromossomos sejam corretamente distribuídos para as células-filhas durante a divisão celular;
- Telômeros, são necessárias para as extremidades serem replicadas corretamente, além de impedirem que o cromossoma seja degradado por exonucleases;
- As origens de replicação, posições ao longo do cromossomo, nas quais a replicação do DNA inicia, similares à origem de replicação de um plasmídeo.
Foram desenvolvidos na década de 80, originando os GM
1 – Vetores baseados nos plasmídeos que ocorrem normalmente em Agrobacterium;
2 - Transferência gênica direta utilizando diversos tipos de DNA plasmidial;
3 – Vetores baseados nos vírus de plantas.
Três tipos de Vetores têm sido empregados:
- Deu origem ao atualmente chamado de OGM’s;
- Apresentando benefícios potenciais muito importantes;
- Produção de plantas resistentes a vírus e insetos.
Menor Engenheiro genético da Natureza.
- O A. tumefaciens geneticamente programa as células da planta para seu próprio benefício.
- É encontrado do Solo;
- Causador da doença do tumor da Galha em muitas espécies de plantas;
- A capacidade de causar a doença está associada a presença do Plasmídeo Ti das células bacterianas;
Percebe-se então que o Plasmídeo Ti poderia ser utilizado para introduzir novos genes no interior de células vegetais.
Se a A. tumefaciens com plasmídeo Ti modificado foi inserido pelo ferimento no caule. Somente as células do tumor da galha resultante irão possuir o gene clonado.
- Plasmídeo de Agrobacterium rhyzogenes;
- Semelhante ao Ti;
- A diferença está no T-DNA;
- O plasmídeo Ri não resulta em um tumor de Galha, mas na doença da raiz Cabeculada.
- É diferente da integração de um vetor de levedura no cromossomo, pois não há necessidade de uma região de Homologia. Entre o plasmídeo bacteriano e o DNA da planta.
- A integração ocorre aleatoriamente em qualquer cromossomo da Planta.
- O uso seria conveniente, pois a transformação seria obtida simplesmente por meio da fricção do DNA viral sobre a superfície de uma folha;
- O problema do uso, está no seu Genoma, que é o RNA, não sendo úteis como Vetores de Clonagem;
- Apenas duas classes de Vírus de DNA são utilizados, os caulimovírus e os Geminivírus.
- São usados para a síntese de proteínas Recombinantes;
- Desenvolver Técnicas para a Teoria Gênica;
- Existem dois sistemas de clonagens para Animais:
- Vetores de Clonagem para Mamíferos;
- Vetores de Clonagem para Insetos.
- A mosca-das-frutas Drosophila melanogaster, é o mais importante organismo com constituição gênica para vetores de clonagem;
- Como nenhum plasmídeo é conhecido na Drosophila, a clonagem é obtida, através de um transposon, chamado elemento “P”
- Vetores Virais não são Desenvolvidos para a clonagem gênica em Drosophila;
- Outros insetos, possuem como vetores de clonagem o vírus bacolovírus;
- A utilização dos vetores destes vírus está na produção de proteínas recombinantes.
Realizada por 3 Razões:
1 – Para obtenção de um gene nocaute;
2 – Para produção de proteína Recombinante;
3 – Na teoria Gênica
• Atualmente, os retrovírus são os vetores mais utilizados para a clonagem de genes em células de mamíferos.
- Realizada através de microinjeção de plasmídeos bacterianos, dentro do núcleo das células de mamíferos;
- É mais satisfatório que a utilização de um vetor Viral, pois evita a possibilidade de que o DNA viral infecte as células e promova mutações.
ALBERTS, Bruee. Biologia Molecular da Célula. 3ª Edição. Porto Alegre. Artes Médicas, 1997.
BROWN, T. A. Genética – um enfoque celular. Ed: Guanabara Koogan. 3º Edição. Rio de Janeiro, 1999.
ZAHA, A. Biologia Molecular Básica. Ed. Mercado Aberto. Porto Alegre, 1996.
http://www.biomania.com.br http://router.ceap.tche.br/projetos/8sClonagem/clonagem.htm http://pt.wikipedia.org/wiki/Fago
http://www.dbio.uevora.pt/LBM/Foco/Vectores/vectores.html