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VETORES DE CLONAGEM PARA EUCARIOTOS

Disciplina: Biotecnologia Farmacutica

VETORES DE CLONAGEM

Vetores para leveduras e outros fungos

Vetores para plantas superiores

Vetores para animais

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VETORES PARA LEVEDURAS E OUTROS FUNGOS

A maioria das estirpes de S. cerevisae tem um plasmdeo natural, o plasmdeo 2m que apresenta algumas caractersticas:

Pequeno (6Kbp).

70-200 cpias por clula.

Tem origem de replicao.

No tem marca de seleo um problema. um problema.

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As marcas de seleo introduzidas no plasmdeo 2m so geralmente marcas metablicas.

YEps Plasmdeos epissomais de levedura

YEps so plasmdeos derivados do 2m e so do tipo vai-vm pois replicam tanto em E. coli como em S. cerevisae.

Um exemplo deste tipo de plasmdeos o YEp13:

- Tem origem de replicao do plasmdeo 2m permite replicao em levedura.

- Tem gene LEU2 permite seleo de recombinantes em meio mnimo de leucina (seleo em levedura).

- Tem sequncia de pBR322 permite replicao e seleo em E. coli.

-20-50 cpias.

- um vetor de transfernciatransferncia.

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YACs Cromossomos artificiais de levedura

YACs so utilizados para clonar longos (at 1400Kbp)fragmentos de DNA.

Tm a estrutura de um cromossomo e, portanto,apresentam 3 componentes essenciais:

Centrmero: necessrio correta separao do cromossomo durante a diviso celular.

Telmeros: para replicao das extremidades do cromossomo e proteo contra exonucleases.

Origens de replicao: vrias ao longo do cromossomo permitem a replicao do DNA.

Colnias brancas so

recombinantes

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VETORES PARA PLANTAS SUPERIORES

Trs tipos de Vetores tm sido empregados:Trs tipos de Vetores tm sido empregados:

1 Vetores baseados nos plasmdeos que ocorrem normalmente em Agrobacterium;

2 - Transferncia gnica direta utilizando diversos tipos de DNA plasmidial;

3 Vetores baseados nos vrus de plantas.

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Vetores baseados nos plasmdeos que ocorrem normalmente em

Agrobacterium

Os vetores de clonagem mais usados so baseados noTi, plasmdeo natural de AgrobacteriumAgrobacterium tumefacienstumefaciens.

Menor Engenheiro gentico da Natureza.Menor Engenheiro gentico da Natureza.

- encontrado do Solo;

- Causador da doena do tumor da Galha em muitas espcies de plantas;

- A capacidade de causar a doena est associada a presena do Plasmdeo Ti das clulas bacterianas;

- O A. tumefaciensgeneticamente programa as clulas da planta para seu prprio benefcio.

Percebe-se ento que o Plasmdeo Ti poderia ser utilizado para introduzir novos genes no interior de clulas vegetais.

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Se a A. tumefacienscom plasmdeo Timodificado foi inseridopelo ferimento no caule.Somente as clulas dotumor da galharesultante iro possuir ogene clonado.

Produo de plantas transformadas com o Produo de plantas transformadas com o PlasmdeoPlasmdeo TiTi

- Plasmdeo de Agrobacterium rhyzogenes;

- Semelhante ao Ti;

- A diferena est no T-DNA;

- O plasmdeo Ri no resulta em um tumor de Galha, mas na doena da raiz Cabeluda.

Limitaes de A.tumefaciens e A. rhizogenes infectam apenas dicotiledneas

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Transferncia gnica direta utilizando diversos tipos de DNA

plasmidial

BIOBALSTICA

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Vetores baseados nos vrus de plantas

Caulimovrus Vrus do mosaico da couve flor (CaMV)

- Experimentos restritos a faixa de hospedeiros deste vrus

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VETORES PARA ANIMAIS

Vetores de clonagem para animais

- Existem dois sistemas de clonagens para Animais:

- Vetores de Clonagem para Insetos;

- Vetores de Clonagem para Mamferos.

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Clonagem em Insetos

Moscas-das-frutas: Drosophila melanogaster

- Como nenhum plasmdeo conhecido na Drosophila,a clonagem obtida, atravs de um transposon,chamado elemento P colocado dentro de umplasmdeo.

Ou vetores de clonagem baseados em Vrus de Insetos:

- Vetores Virais no so desenvolvidos para a clonagem gnica em Drosophila;- Outros insetos possuem como vetores de clonagem o vrus bacolovrus;

- A utilizao dos vetores destes vrus est na produo de protenas recombinantes.

Clonagem em Mamferos

Realizada por 3 Razes:

1 Para obteno de um Gene-Nocaute;

2 Para produo de Protena Recombinante;

3 Na Terapia Gnica

Atualmente, os retrovrus so os vetores mais utilizados para a clonagem de genes em clulas de mamferos.

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- Realizada atravs de microinjeo de plasmdeosbacterianos, dentro do ncleo das clulas demamferos;

- mais satisfatrio que a utilizao de um vetor Viral, pois evita a possibilidade de que o DNA viral infecte as clulas e promova mutaes.

Clonagem gnica sem um vetor

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... E continua na prxima aula !!!... E continua na prxima aula !!!