vetores de clonagem e de expressão bom
TRANSCRIPT
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Tcnicos AnalisesClinicas
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VETORES DE CLONAGEM
PCRSEQUENCIAMENTO
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1970 - The Beginning of the Revolution
Descoberta de uma enzima de restrio em bactria
Haemophilus influenzae
1973 - ligao de fragmentos obtidos pela
clivagem com enzimas de restrio e ligao dos
mesmos com a enzima T4 DNA ligase (COHEN e
cols., 1973)
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FENOMENO DE RESTRIO MODIFICAO
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PRINCIPAIS CONCEITOS
CLONAGEM GNICA: isolamento, amplificao e purificao de um
gene ou de genes, a partir do material gentico de um dado
organismo
VETORES: veculos de clonagem que permitem que os fragmentosde DNA a serem clonados sejam introduzidos e propagados em
uma clula hospedeira adequada
CLULA HOSPEDEIRA: clulas de fcil manipulao, crescimento
rpido e constituio gentica bem conhecida - ex: bactrias,
leveduras, clulas de cultura de tecidos de mamferos e insetos
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OBJETIVOS
DESENVOLVIMENTO DE MODELOS PARA:
Estudo da estrutura/funo de genes
Estudo da estrutura/funo de protenas
Produo de protenas recombinantes (importncia mdica)
Produo de organismos transgnicos
Melhoramento Gentico
Clonagem teraputica
Clonagem reprodutiva
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COMO FAZER???....
Isolamento
Amplificao
Digesto
Purificao do Fragmento alvo
Clonagem em vetores
Transformao de clulas hospedeiras e seleo dos clones
Replicao
Anlise
Expresso do DNA e da protena
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ROMPIMENTO DAS BARREIRASENTRE AS ESPCIES
Possibilidade de reunir num s organismo qualidades de
seres diferentes:
ITAKURA e cols. (1977): conseguiu produzir interferon
humano em Escherichia coli
MULLIGAN e BERG (1980): xito obtido na expresso de
genes bacterianos em clulas de mamferos
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CLONAGEM GNICA
Gerar grande nmero de cpias de um determinado
DNA alvo
Insero de fragmentos de DNA em vetores
Replicao de vetores contendo o inserto Recuperar (purificar) os fragmentos dos vetores
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CLONAGEM GNICA
1. Clivagem do vetor e do DNA com enzimas de restrio
2. Ligao do vetor ao inserto
3. Replicao do vetor em clulas competentes
4. Purificao do inserto
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CARACTERSTICAS DOS VETORES DE DNA
Origem de replicao, que permite que sua replicaoindependentemente do cromossomo hospedeiro
Marca de seleo, que permite que as clulas contendo o vetor e o DNA inserido neste - sejam facilmente identificadas
Stios nicos para uma ou mais enzimas de restrio permiteque os fragmentos de DNA sejam inseridos em um local
definido dentro de um vetor, com as outras pores intactas
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CARACTERISTICAS DOS VETORES DE DNA
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DIGESTO DO ALVO DO VETOR
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TIPOS DE VETORES EM BIOLOGIA MOLECULAR
VETOR HOSPEDEIRO TIPO DE CLONAGEM TAMANHO DOINSERTO
PLASMDEO Bactria Genmica / cDNA 5-10kb
BACTERIFAGO Bactria Genmica / cDNA
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PLASMDEOS
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pequenas molculas de DNA de cadeia dupla
contm os elementos necessrios sua replicao
um gene que confere resistncia a um antibitico
Podem estar presentes em duas ou mais cpias na clula
podem variar entre 5 e 400 kb (kilobases)
PLASMDEOS
http://images.google.com.br/imgres?imgurl=http://www.infoescola.com/files/2010/01/plasmideo.jpg&imgrefurl=http://www.infoescola.com/reino-monera/plasmideo/&usg=__Zk2Ih-PWLMjblE5WyaN5N5oAUpE=&h=319&w=360&sz=33&hl=pt-BR&start=68&itbs=1&tbnid=nT2aJB295Jf_MM:&tbnh=107&tbnw=121&prev=/images?q=plasmideos&start=60&hl=pt-BR&sa=N&gbv=2&ndsp=20&tbs=isch:1 -
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um gene que codifique uma substncia que possa
distinguir uma clula transformada de uma
no transformada - resistncia a um
antibitico - clulas que possuem o gene so
capazes de crescer em meios com o
antibitico enquanto que as restantes no
sobrevivem
PLASMDEOS
ter uma origem de replicao - sequncia de DNA que
permite a replicao do vetor na clula hospedeira;
Mltiplos Stios de Clonagem - locais nicos declivagem para endonucleases de restrio - stio de
insero no vetor de clonagem
CLONAGEM EM PLASMDEOS
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CLONAGEM EM PLASMDEOS
Plasmdeo apresentando: origem de replicao
(ori), gene que confere resistncia a um antibitico
- ampicilina e stio(s) de restrio (stio de
restrio para a EcoRI), que pode ser usado para
inserir fragmentos de DNA
O DNA inserido ligado ao vetor e os
plasmdeos recombinantes so transformados em
bactrias
As bactrias so plaqueadas em meios contendo
o antibitico para o qual o plasmdeo confere
resistncia, como forma de selecionar as bactrias
resistentes (transformadas)
Desenvolvem-se colnias de bactrias com o
plasmdeo recombinante
http://images.google.com.br/imgres?imgurl=http://www.infoescola.com/files/2010/01/plasmideo.jpg&imgrefurl=http://www.infoescola.com/reino-monera/plasmideo/&usg=__Zk2Ih-PWLMjblE5WyaN5N5oAUpE=&h=319&w=360&sz=33&hl=pt-BR&start=68&itbs=1&tbnid=nT2aJB295Jf_MM:&tbnh=107&tbnw=121&prev=/images?q=plasmideos&start=60&hl=pt-BR&sa=N&gbv=2&ndsp=20&tbs=isch:1 -
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CLONAGEM
EMPLASMDEOS
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BACTERIFAGOS
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BACTERIFAGOS
bacterifago que se comporta como um vrus da E. coli
uma partcula viral constituda por protenas e DNA em igual quantidade,
que se apresenta como uma molcula linear de cadeia dupla
injetado na clula hospedeira - particularidade das suas extremidades (stio
cos) serem de cadeia simples, constitudas por cerca de 12 nucletidos que,
sendo complementares na sequncia de bases, permitem ao DNA adquirir
uma forma circular antes da sua insero.
O genoma do fago codifica para 50 protenas, aproximadamente.
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CLONAGEM EM BACTERIFAGOS
O vetor contm um stio de restrio (EcoRI)para insero do DNA clonado
Adicionalmente, stios cos, para empacotar o
DNA nos fagos nas extremidades do vetor de
DNA - necessrio para lisogenia
DNA inserido ligado ao vetor e as molculas
recombinantes so empacotadas nos fagos
fagos recombinantes so usados para infectarbactrias como a E. coli
Cada fago recombinante, que carrega um
fragmento nico do DNA clonado, forma uma
placa nica no interior da cultura bacteriana
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CLONAGEM EM BACTERIFAGOS
http://pathmicro.med.sc.edu/mayer/phage1.jpg -
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COSMIDEOS
CLONAGEM EM COSMDEOS
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Ultrapassa algumas limitaes da clonagem em fagos e plasmdeos
No fago , os fragmentos de DNA a serem inseridos no podem ultrapassar os 15 kb -
na maior parte das vezes, os genes so maiores (35 a 40 kb) o que torna impossvel a
sua insero
Os cosmdeos so assim, plasmdeos (com origem de replicao e genes que
conferem resistncia a antibiticos), que contm um fragmento de DNA do fago
incluindo o local cos
Utilizados como veculos de clonagem molecular
As enzimas de empacotamento reconhecem dois locais cos com distncia de 35 a 49
kb, o que limita o tamanho dos fragmentos passveis de serem empacotados.
O DNA clivado com enzima de restrio que produz grandes fragmentos de DNA que
vo se ligar ao cosmdeo anteriormente clivado com enzima semelhante.
CLONAGEM EM COSMDEOS
CLONAGEM EM COSMDEOS
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CLONAGEM EM COSMDEOS
Situao ideal - cada fragmento de DNA genmico possui um local cos nas
extremidades que, durante o empacotamento, vo ser reconhecidos por
enzimas
Uma vez injetado no interior da clula hospedeira, vai circularizar e replicar
como um plasmdeo normal, sem exprimir qualquer funo do fago, sendo
igualmente reconhecido com base na resistncia adquirida a um antibitico
especfico
COSMIDEOS
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COSMIDEOS
CLONAGEMEM
COSMDEO
VETORES DE EXPRESSO
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VETORES DE EXPRESSO
Permite no apenas aumentar o nmero de cpias de um determinado fragmento, como
os vetores de clonagem, mas tambm o produto desse fragmento clonado
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vetor de expresso deve apresentar:
Promotor forte e eficiente para produzir elevadas quantidades da protena
desejada e de baixo nvel basal para evitar toxicidade;
Terminador a fim de evitar a trascrio no desejada
Sequncia para o inicio da traduo
Repressor para evitar a produo de protena em quantidades txicas;
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A insero do DNA recombinante em clulas hospedeiras pode
ser efetuada de diferentes maneiras
Uma delas transformao
consiste na formao de clulas competentes
efetuado um tratamento com cloreto de clcio antes datransformao - Normalmente, a carga negativa do DNA (devidoao fosfato) repelida pela carga negativa da membrana dasbactrias (devido aos fosfolpidos), assim, o on Ca 2+ neutralizaestas foras, facilitando a entrada do DNA de interesse nasbactria
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BIBLIOTECA GENMICA
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Atualmente, os vetores mais utilizados na construo de
bibliotecas genmicas so fagos e cosmdeos
Em ambos os casos, fragmentos grandes de DNA obtidos por
fragmentao aleatria, ligam-se ao DNA do vetor para poderem
ser empacotados em partculas de fago .
BIBLIOTECA GENMICA
BIBLIOTECA GENMICA
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BIBLIOTECA GENMICA
Bibliotecas construdas com vetores so armazenadas e propagadas na forma de
fagos recombinantes
Estes vetores possuem um fragmento central limitado por dois fragmentos essenciais
O fragmento ou brao esquerdo, codifica as protenas da cpsula, e o brao
(fragmento) direito, tem a origem de replicao do fago e promotores de outros genes
essenciais
Entre o fragmento central e os dois braos esto os stios de restrio usados na
clonagem,
A extremidade de cada brao apresenta um segmento de cadeia simples (cos).
Estes segmentos so complementares entre si, permitindo assim a recircularizao
da molcula e consequente replicao do fago dentro da clula hospedeira.
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BIBLIOTECA GENMICA
Vetor de substituio
Fragmentos clonados so ligados aos braos do fago, previamente
preparados com a enzima, a mistura empacotada in vitro em partculas virais
Para selecionar apenas os fagos recombinantes, estes so infectados numa
bactria lisognica
A suspenso de fagos resultante pode ser armazenada durante vrios anos
em frigorfico, com algumas gotas de clorofrmio para prevenir crescimento
bacteriano
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APLICAES
Hormnio de crescimento
Insulina humana
Vacina da hepatiteB
Hormnios sexuais
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CLONAGEM TERAPUTICA
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