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Andréa Márcia de Souza
CLONAGEM E EXPRESSÃO DO GENE DA TOXINA ÉPSILON DEClostridium perfringens TIPO D E SUA APLICAÇÃO NA
IMUNIZAÇÃO DE ANIMAIS
Tese apresentada à Universidade Federal De MinasGerais, Escola de Veterinária, como requisito parcialpara obtenção de grau de Doutor em Ciência Animal.
Área de concentração: Medicina Veterinária Preventiva
Prof. Francisco Carlos Faria Lobato (Orientador)Prof. Evanguedes Kalapothakis (Co-orientador)
Belo HorizonteEscola de Veterinária da UFMG
2008
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S729c Souza, Andréa Márcia de, 1964- Clonagem e expressão do gene da toxina Épsilon de Clostridiumperfringens tipo D e sua aplicação na imunização de animais / AndréaMárcia de Souza. –2008. 56 p.: il.
Orientador: Francisco Carlos Faria LobatoCo-orientador: Evanguedes KalapothakisTese (doutorado) – Universidade Federal de Minas Gerais, Escola deVeterináriaInclui bibliografia
1. Clostridium perfringens – Teses. 2. Enterotoxinas – Teses. 3. Animais -Doenças – Teses. 4. Vacinas – Teses. I. Lobato, Francisco Carlos Faria.II. Kalapothakis, Evanguedes. III. Universidade Federal de Minas Gerais.Escola de Veterinária. IV. Título.
CDD – 636.089 693
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Aos meus pais, Nilo Alves de Souza (inmemorian) e Maria Gomes Cardoso de Souza,por todos os esforços e sacrifícios que mepermitiram chegar até aqui;
À Patrícia e Mônica, minhas irmãs, pelocompanheirismo;
Ao Rafael e Júlia, por serem tão importantespara mim.
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Dê sempre o melhor...E o melhor virá!
Às vezes as pessoas são egocêntricas, ilógicas e insensatas...Perdoe-as assim mesmo!
Se você é gentil,As pessoas podem acusá-lo de egoísta e interesseiro...Seja gentil assim mesmo!
Se você é um vencedor,Terá alguns falsos amigos e alguns amigos verdadeiros...Vença assim mesmo!
Se você é honesto e franco, as pessoas podem enganá-lo...Seja honesto e franco assim mesmo!
O que você levou anos para construir,Alguém pode destruir de uma hora para outra...Construa assim mesmo!
Se você tem paz e é feliz, as pessoas podem sentir inveja...Tenha paz e seja feliz assim mesmo!
O bem que você faz hoje pode ser esquecido amanhã...Faça o bem assim mesmo!
Dê ao mundo o melhor de você,Mas isso pode nunca ser o bastante,Dê o melhor de você assim mesmo!
E veja você que no final das contas é entre você e Deus,Nunca foi entre você e eles!
Madre Teresa de Calcutá
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AGRADECIMENTOS
Ao Professor Francisco Carlos Faria Lobato, pela dedicação, colaboração e ricas sugestões,além de estar sempre disponível e acessível;
Ao Professor Evanguedes Kalapothakis, pela paciência, pela paz transmitida dia-a-dia, peloapoio e ensinamentos que foram tão importantes para mim;
Ao Professor Jenner Karlisson Pimenta dos Reis, pela tranqüilidade, disponibilidade ecolaborações que foram de grande valia para este trabalho;
À Profa. Zélia Inês Portela Lobato, que participou da minha qualificação e colaborou de formaexpressiva para a condução desse trabalho;
À Pós-graduação em Ciência Animal e ao Departamento de Medicina Veterinária Preventiva,da Escola de Veterinária da UFMG;
Aos amigos do Laboratório de Biologia da Reprodução, do ICB/UFMG e, especialmente, aoProfessor Gérman Arturo Bohorquez Mahecha, pela disponibilidade e importante colaboraçãopara os trabalhos de microscopia;
Às amigas da Escola de Veterinária/UFMG, Telma (Fófis), Ana Cláudia, Gissandra, Andreza,Bárbara, Nádia, Cleusa, Sueli, Cassinha, Luciana Aramuni (Lu) e Andréa Vieira (Déia) pelocarinho da nossa amizade e pelos momentos alegres (Adoro vocês!);
Aos antigos e atuais amigos do Laboratório de Bacterioses e Pesquisa, Theonys, Eduardo,Felipe, Catarina, Phricylla, Rodrigo da Escola de Veterinária, pela ajuda direta e indireta;
Aos antigos e atuais amigos do Laboratório de Marcadores Moleculares e Biotecnologia,ICB/UFMG, Ana Luisa, Gabriel, Lidiane, Juliana (Ju), Híggor, Ana Paula, Isabella, Flavinha,Anderson, André, Denise, Carol (PUC), Tatiana, Tatiana Barroca e Maria, pela rica convivênciapessoal e acadêmica, e, por mostrarem como é possível trabalhar em uma equipe grande, emum espaço pequeno, com enorme harmonia, mantendo e respeitando a individualidade decada um. (Adorei trabalhar com vocês!);
À Elizângela (Zanja), que é praticamente minha irmã, pela nossa amizade sempre...
À Carol Campolina, que eu considero tanto, e, sei que posso contar sempre;
À Thaís, pela imprescindível ajuda, não só pela colaboração direta neste trabalho, mas tambémpelos momentos de convivência, amizade leal e ensinamentos (Aprendi muito com você!);
Aos funcionários do Departamento de Medicina Veterinária, Nelson Éder, Gustavo, Renata,Mirli, Júnia, Graziele, Eduardo, Doraci, Joãozinho pela atenção e disponibilidade em ajudar;
Às funcionárias da Diretoria da Escola de Veterinária, sempre solícitas e educadas;
Ao Laboratório Nacional Agropecuário (LANAGRO) - Pedro Leopoldo/MG do Ministério daAgricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), nas pessoas do Dr. Maurício Baltazar deCarvalho Filho e Dr. Ronnie Assis, pela imprescindível colaboração;
À Fazenda Experimental “Prof. Hélio Barbosa”, pelo pronto-atendimento no fornecimento deanimais;
Ao CNPq, pelo apoio financeiro;
Aos meus amigos pessoais, que não participam da minha vida acadêmica, e, meus familiaresque me apoiaram e me ajudaram indiretamente para a concretização desta etapa da minhavida;
MUITO OBRIGADA!
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SUMÁRIOLISTA DE ABREVIATURAS ................................................................................................ 10
RESUMO .............................................................................................................................. 11
ABSTRACT .......................................................................................................................... 11
1- INTRODUÇÃO.................................................................................................................. 12
2- LITERATURA CONSULTADA......................................................................................... 122.1- Clostridium perfringens e a toxina épsilon..................................................................... 122.2- Enterotoxemias .............................................................................................................. 132.3- Expressão de proteínas em Escherichia coli................................................................. 142.4- Vacinas .......................................................................................................................... 15
3- MATERIAL E MÉTODOS................................................................................................. 183.1- Fluxograma geral do trabalho........................................................................................ 183.2- Local de realização dos trabalhos experimentais.......................................................... 193.3- Animais utilizados .......................................................................................................... 193.4- Cultivo bacteriano e testes bioquímicos ........................................................................ 193.5- Produção, padronização e titulação da toxina épsilon nativa ....................................... 193.6- Extração e quantificação do DNA.................................................................................. 193.7- Reação da cadeia da polimerase (PCR) para detecção do gene etx nas amostras deC. perfringens tipo D ............................................................................................................. 193.8- Amplificação do gene etx através de PCR .................................................................... 213.9- Análise dos produtos de PCR........................................................................................ 233.10- Purificação dos produtos de PCR................................................................................ 233.11- Estratégia para clonagem e expressão do gene etx ................................................... 233.11.1- Sistema de expressão .............................................................................................. 243.11.2- Clonagem no sistema TOPO TA .............................................................................. 253.11.3- Preparação do vetor pET para a subclonagem........................................................ 253.11.4- Subclonagem no sistema pET-11a .......................................................................... 253.11.5- PCR e sequenciamento para a confirmação da clonagem ...................................... 253.11.6- Expressão do gene etx ............................................................................................. 253.11.7- Solubilização dos corpos de inclusão....................................................................... 253.11.8- Estimativa da dosagem de proteína recombinante .................................................. 253.12- Titulação da toxina recombinante................................................................................ 253.13- Preparo do inóculo para a imunização ........................................................................ 253.14- Produção de soro antitoxina épsilon recombinante..................................................... 253.15- Toxinotipia e soroneutralização cruzada ..................................................................... 273.16- Teste de potência ........................................................................................................ 27
4- RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................................................... 274.1- Cultivo bacteriano e testes bioquímicos ........................................................................ 274.2- Extração do DNA das amostras 34 e U10 de Clostridium perfringens ......................... 284.3- PCR para detecção do gene etx.................................................................................... 284.4- Padronização da PCR para amplificação do gene etx .................................................. 294.5- Clonagem e expressão do gene etx .............................................................................. 294.5.1- Clonagem do gene etx................................................................................................ 294.5.2- Expressão do gene etx ............................................................................................... 344.6- Obtenção da proteína recombinante na forma solúvel.................................................. 384.7- Solubilização dos corpos de inclusão............................................................................ 424.8- Dosagem da toxina recombinante ................................................................................. 45
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4.9- Titulação da toxina épsilon recombinante ..................................................................... 474.10- Produção de soro antitoxina épsilon recombinante..................................................... 494.11- Toxinotipia e soroneutralização cruzada ..................................................................... 494.12- Teste de potência ........................................................................................................ 50
5- CONCLUSÕES................................................................................................................. 52
6- PERSPECTIVAS FUTURAS............................................................................................ 52
7- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................................ 52LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Testes bioquímicos das amostras 34 e U10 de Clostridium perfringens tipoD ........................................................................................................................ 28
Tabela 2 - Níveis de antitoxina épsilon de Clostridium perfringens tipo D em pool desoros de coelhos imunizados com a toxina épsilon recombinante ................... 50
LISTA DE FIGURASFigura 1 - Seqüência de nucleotídeos do fragmento de DNA que codifica a toxina
épsilon de Clostridium perfringens (Hunter et al., 1992)................................... 21Figura 2 - Esquema do mapa do plasmídeo pET-11a....................................................... 24Figura 3 - Clonagem e expressão do gene etx.................................................................. 29Figura 4 - Seqüência de nucleotídeos e aminoácidos do fragmento de DNA
codificante da toxina épsilon de Clostridium perfringens tipo D, subclonadono plasmídeo pET-11a ...................................................................................... 33
Figura 5 - Expressão do gene etx de Clostridium perfringens tipo D no sistema pET-11a..................................................................................................................... 35
Figura 6 - Expressão do gene etx de Clostridium perfringens tipo D no sistema pET-11a em relação ao tempo de indução ............................................................... 37
Figura 7 - Expressão do gene etx de Clostridium perfringens tipo D no sistema pET11a nas formas solúvel e insolúvel, após a lise bacteriana .............................. 39
Figura 8 - Expressão do gene etx de Clostridium perfringens tipo D no sistema pET11a a 20°C, antes e após a indução ................................................................. 41
Figura 9 - Solubilização com uréia 6,0 M dos corpos de inclusão obtidos a partir daexpressão do gene etx de Clostridium perfringens tipo D ............................... 43
Figura 10 - Estimativa da dosagem da toxina épsilon recombinante .................................. 47Figura 11 - Níveis de antitoxina épsilon de Clostridium perfringens tipo D em soro de
coelhos imunizados com a toxina épsilon recombinante, aos 37 dias e 169dias .................................................................................................................... 49
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LISTA DE ABREVIATURAS
Blastn - Basic Local Alignment Search Tool – nucleotide
BSA – bovine serum albumine (soro albumina bovina)
CFR – Code Federal Regulation
CNPq – Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
dA – resíduo de deoxiadenosina
DNA – ácido desoxirribonucléico
dNTP - Desoxinucleotídeo 5’-trifosfato
DO – densidade óptica
dT – resíduo de deoxitirosina
F – fita senso
g – grama
ICB – Instituto de Ciências Biológicas
IPTG - Isopropil-β-D-1-tiogalactopiranosídeo
LANAGRO – Laboratório Nacional Agropecuário
LB - Luria Bertani
MAPA – Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento
ND – não detectado
NIBISC – National Institute for Biological Standards and Control
PAGE – Polyacrylamide gel electrophoresis
pb – pares de bases
PCR – reação em cadeia da polimerase
pH – potencial hidrogeniônico
pM – picomoles
R- fita anti-senso
RNA – ácido ribonucléico
SDS – Sódio Dodecil Sulfato
taq - Thermus aquaticus
TM – temperatura na qual 50% do DNA se encontra desnaturado
UFMG – Universidade Federal de Minas Gerais
UI – unidade internacional
USDA - United Stated Department of Agriculture
x-gal – 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactose
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RESUMO
A toxina épsilon é produzida pelo Clostridium perfringens tipos B ou D, sendo responsável pelaenterotoxemia em ovinos, caprinos e bovinos. A doença é de caráter agudo ou super agudo,causando morte súbita e grandes perdas econômicas. A evolução da doença dificulta qualquermedida terapêutica, e o processo pode ser prevenido através de imunizações com vacinascomprovadamente eficientes. O gene etx, que codifica a toxina épsilon, foi clonado noplasmídeo TOPO TA e subclonado em pET-11a, utilizando a linhagem de Escherichia coli BL21(DE3), para a expressão do gene da toxina épsilon de C. perfringens tipo D. A toxina épsilonrecombinante foi expressa, principalmente, na forma insolúvel, retida em corpos de inclusão, e,a dosagem, realizada por SDS-PAGE comparativamente com quantidades conhecidas de BSA,foi estimada em 10 mg/mL, com título em camundongo de 25 x 102 DL50/mL. Os resultadosforam confirmados pelo teste de soroproteção e soroneutralização cruzada em camundongos.Coelhos foram imunizados com 200, 100 e 50 µg da fração insolúvel da proteína recombinante,para o teste de potência, utilizando suspensão de hidróxido de alumínio como adjuvante,obtendo títulos de 40, 30 e 10 UI/mL, respectivamente. Esses valores foram superiores aosníveis de 5 UI/mL, exigido pela Farmacopéia Européia (1998), e, 2 UI/mL, exigido pelo Code ofFederal Regulation/USA. A toxina épsilon recombinante produzida neste trabalho mostrou-seuma forte candidata para a produção de uma vacina contra enterotoxemia causada pela toxinaépsilon de C. perfringens tipo D.
Palavras-chaves: Clostridium perfringens; toxina épsilon; gene etx; enterotoxemia; expressãoem Escherichia coli; vacina.
ABSTRACT
The epsilon toxin is produced by Clostridium perfringens types B and D, causingenterotoxaemia in sheep, goats and calves. Enterotoxaemia is a disease with acute or super-acute profile, causing sudden death and huge economic loss. The therapeutic intervention maybe difficult since the disease evolution is very rapid. However, this process can be prevented byimmunizations with specific immunogenic vaccines. In the present work the etx gene encodingthe epsilon toxin was cloned into pET-11a and the recombinant epsilon toxin was expressed asinclusion bodies. The protein concentration was determined and the lethal doses (LD) wereestimated in mice, reaching 25 x 102 LD50/mL. Serum protection and cross-serum neutralizationtests in mice were also used to characterize the recombinant toxin. For potency test, rabbitswere immunized with 200, 100 and 50 µg of recombinant toxin, using aluminum hydroxide gelas adjuvant. Obtained titers of 40, 30 and 10 UI/mL, respectively, were higher than the minimumlevel of 5 UI/mL required by the European Pharmacopoeia (1998) and the minimum level of 2UI/mL required by the Code of Federal Regulation/USA. The recombinant epsilon toxinproduced emerges as a strong candidate for the production of a vaccine againstenterotoxaemia caused by epsilon toxin of C. perfringens type D.
Keywords: Clostridium perfringens; epsilon toxin; etx gene; enterotoxaemia; expression inEscherichia coli; vaccine.
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1. INTRODUÇÃO
O gênero Clostridium compreende um grupode microrganismos anaeróbios, Gram-positivo, formador de esporos, queapresenta uma ampla distribuiçãogeográfica, sendo encontrado no solo, águadoce e salgada, alimentos de origem animale vegetal, além de, fazer parte da microbiotaresidente do trato intestinal do homem e deanimais.
Clostridium perfringens é uma bactériaubíqua, responsável por vários quadrosclínicos como diarréias, enterotoxemia,gangrena gasosa e enterite hemorrágica emanimais. A patogenicidade desse grupo estáassociada com as toxinas produzidas, o queestá intimamente relacionado à virulênciadas linhagens bacterianas. A toxina épsilon,uma das mais potentes toxinas de origemmicrobiana, após as neurotoxinas tetânica ebotulínica, é produzida pelo C. perfringenstipo B ou D, linhagens que apresentam umnúmero limitado de hospedeiros. Produzuma enterotoxemia fatal e grave, sendo quea infecção causada por C. perfringens tipo Bem carneiros, leva à disenteria, enquantoque aquela causada por C. perfringens tipoD causa doença neurológica nessesanimais. A taxa de mortalidade em ambosos quadros clínicos chega a 100% e, o surtodessas doenças é de grande importânciaeconômica em criações intensivas (Rood etal., 1997).
A enterotoxemia não é transmissível, massurtos esporádicos podem ocorrer quando oequilíbrio da microbiota intestinal é afetado,seja pelo tratamento dos animais comantibióticos, seja por mudanças bruscas nadieta.
A evolução da doença em animais jovens équase sempre de caráter agudo ou superagudo, dificultando qualquer medidaterapêutica. Todavia, o processo pode serprevenido através da imunização comvacinas monovalentes e polivalentes(Lobato et al., 2000a). A imunizaçãoutilizando toxóides de C. perfringens tipo Ce D tem sido realizada para controlar as
enterotoxemias, e, para aumentar apotência desses toxóides, estratégias paraobter altos títulos de toxinas que induzemaltos títulos de anticorpos têm sidoestudadas (Goswami et al., 1996).
Este trabalho teve por objetivo produzir atoxina épsilon de Clostridium perfringenstipo D, a partir da expressão do gene etx emEscherichia coli e testar sua aplicação naimunização de animais.
2. LITERATURA CONSULTADA
2.1 Clostridium perfringens e a toxinaépsilon
C. perfringens é classificado em cinco tipostoxigênicos: A, B, C, D e E, dependendo datoxina produzida (Rood et al., 1997). Atoxina alfa é comumente produzida peloscinco tipos, sendo a toxina predominante deC. perfringens tipo A; é uma fosfolipase C,que hidrolisa lecitina em fosforilcolina ediglicerídio, considerado o grande fatorresponsável pela patologia tecidual (Awadet al., 1995). A toxina beta é produzida porC. perfringens tipos B e C, sendo umpolipeptídeo de cadeia única comaproximadamente 40 kda, altamentesensível à ação da tripsina (Hunter et al.,1993). A toxina iota é produzida somentepelo C. perfringens tipo E, como umaprototoxina que atravessa a paredevascular, resultante de uma ativaçãoproteolítica (Perelle et al., 1993). A toxinaépsilon, com aproximadamente 32,7 kDa, éproduzida pelo C. perfringens tipos B e D,apresentando estas linhagens um númerolimitado de hospedeiros. Estirpes de C.perfringens tipo B ou D são isoladasprincipalmente de ovinos, ocasionalmentede caprinos e bovinos, sendo raramenteencontradas no homem (Rood et al., 1997).
C. perfringens cresce vigorosamente emtemperaturas entre 20-50°C, sendo atemperatura ótima em torno de 45°C, para amaioria das linhagens. Sobre ágar sangue,as colônias formam uma dupla hemólisecaracterística, sendo o halo interno devido àtoxina teta, e, o halo externo devido à toxina
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alfa. Sobre ágar gema de ovo, as colôniassão circundadas por uma ampla área deprecipitação, conhecida como reação delecitinase, relacionada à produção de toxinaalfa. São imóveis, reduzem nitrato efermentam glicose, lactose, maltose,sacarose e outros açúcares. Liquefazemgelatina, causam fermentação turbulenta noleite devido à fermentação da lactose comprodução de gás e coágulos, entretanto,não digerem caseína (Hatheway, 1990).
A produção de toxinas por C. perfringens éum dos aspectos mais importantes napatogenia das doenças causadas por essabactéria. A toxina épsilon, produzida pelosC.perfringens tipos B e D, é secretada comouma prototoxina inativa de 311 aminoácidose peso molecular de 32.700 daltons. Aremoção proteolítica de 13-14 resíduos deaminoácidos da porção amino-terminal e 29resíduos da porção carboxi-terminal daprototoxina, resulta na produção de umatoxina ativa de 31.200 daltons, na mudançado ponto isoelétrico de 8.02 (prototoxina)para 5.36 (toxina totalmente ativa) ou 5.74(toxina parcialmente ativa) e, uma mudançasignificativa na conformação (Worthington eMulders, 1977), produzindo uma toxinaativa, com uma dose letal de 100 ng/kg emcamundongos (Cole et al., 2004).
A estrutura da prototoxina épsilon éalongada, sendo dividida em três domínioscontendo principalmente folha β, mostrandouma similaridade estrutural com a aerolisina,uma toxina formadora de poros, da bactériaGram negativa Aeromonas hydrophilia. Estaanalogia, juntamente com estudosexperimentais, sugere que a toxina épsiloné também uma formadora de poros (Cole etal., 2004). Apesar das similaridades, asduas toxinas diferem em especificidade dascélulas-alvo e na toxicidade; a toxina épsiloné 100 vezes mais potente que aerolisina, e,não é hemolítica (Petit et al., 1997; Petit etal., 2001).
A toxina épsilon ativa leva a um aumento napermeabilidade intestinal, facilitando aentrada da bactéria na corrente sanguínea.Seu acúmulo nos rins e cérebro altera opotencial osmótico desses tecidos causandoo extravasamento de proteínas séricas e
hemáceas, produzindo um edemageneralizado no animal infectado (Cole etal., 2004).
O gene etx, que codifica a toxina épsilon, seencontra em plasmídios que diferem emtamanho nas diferentes linhagens de C.perfringens (Rood et al., 1997). Acomparação entre os genes etxB e etxD deC. perfringens tipo B e D, respectivamente,mostra dois nucleotídeos diferentes dentroda janela de leitura do gene, resultando nasubstituição de um único aminoácido naproteína (Havard et al., 1992).
Os genes etxB e etxD foram clonados eseqüenciados por Hunter et al. (1992). Aclonagem e a expressão do gene da toxinaépsilon de C. perfringens tipo B, linhagemNCTC 8533 induziu níveis de expressão emEscherichia coli extremamente baixos,resultado atribuído à instabilidade doproduto obtido ou aos processos detranscrição e tradução ineficientes.Goswami et al. (1996), em um estudosimilar, obtiveram altos níveis de expressãodo gene etx de C. perfringens tipo D,produzindo uma toxina recombinantealtamente imunogênica.
A atividade da toxina épsilon é determinadautilizando o teste de letalidade emcamundongos, considerado o teste padrãopara determinação de sua toxicidade(European Pharmacopeia, 1998).
2.2. Enterotoxemias
São patologias determinadas pelamultiplicação de Clostridium sp. no tratointestinal e órgãos abdominais de animaissusceptíveis. São distribuídas no Brasil,sendo responsáveis pelo aparecimento dosquadros clínicos, pela mortalidade deanimais jovens ou pelo retardo nocrescimento e desenvolvimento dos animaisque sobrevivem à infecção (El Idrissi et al.,1992; Rood et al., 1997)
A doença provocada pelo C. perfringens tipoD, que normalmente habita o sistemadigestivo de ovinos e outros ruminantes,varia amplamente entre os rebanhos. A
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bactéria não persiste muito tempo no solo e,sob certas condições, podem proliferarrapidamente no intestino e produzirquantidades letais de toxinas. As condiçõeszootécnicas em que a doença ocorre,incluem a pastagem em pastos viçosos emrápido crescimento ou com cereais recém-brotados, e, alimentação intensiva emrebanhos que recebem grãos (Songer,1996).
Em bovinos, a doença é de evolução rápida,com cerca de 2-36 horas, com o animalapresentando febre, anorexia, apatia,evoluindo para um quadro de convulsõesespasmódicas, coma e morte súbita. Asenterotoxemias são, junto com aborto, umadas infecções mais importantes em ovinos;acometem principalmente animais jovens,mais susceptíveis, em especial os filhotesde mães não vacinadas. Como todos osanimais de um rebanho são submetidos aosmesmos fatores de risco, as enterotoxemiaspodem provocar a morte simultânea devários animais em um mesmo rebanho(Helwig, 1967).
Nos últimos anos, alterações na criação degado, particularmente o uso de alimentosaltamente energéticos em bovinos de corteou leiteiro, levaram a um aumento nasusoeita de enterotoxemia causada pelo C.perfringens tipo D (Lobato et al., 2000a).
2.3. Expressão de proteínas em Escherichiacoli
Proteínas puras e funcionais são de grandedemanda em biotecnologia e, a grandemaioria normalmente é produzida, em suaforma nativa, em pequenas quantidades. Aengenharia genética permite a introduçãode genes codificantes em célulashospedeiras facilmente cultiváveis, apóspromotores reguláveis presentes emelementos genéticos independentes,principalmente, plasmídeos (Yokohama,2003).
O sistema de expressão em E. coli éutilizado pela maioria dos pesquisadores eas técnicas para expressar quantidadessuficientes da proteína desejada sãorelativamente simples. O tempo necessário
para crescer um clone que produz aproteína desejada é muito curto e, afamiliaridade com a tecnologia do DNArecombinante é o necessário para realizarexperimentos-piloto de expressão. Alémdisso, a E. coli tem outras vantagens para asua utilização na expressão de proteínascomercialmente importantes: o custo para ocrescimento de biomassa é baixo e o vastoconhecimento sobre sua genética, fisiologia,bioquímica e biologia molecular permite queE. coli seja o primeiro sistema de escolhapara expressão de muitas proteínasheterólogas (Makrides, 1996).
Modificações nos vetores e linhagens de E.coli têm sido frequentemente feitas nosentido de aumentar a eficiência eversatilidade do sistema original, quesomado ao advento de novos sistemas deexpressão em células de eucariotos,apontam para uma abordagem poderosa,revolucionando os estudos de estrutura,função, purificação e identificação de novasproteínas (Sorensen e Mortensen, 2005a;Cabrita et al., 2006).
Apesar da literatura científica descrever comsucesso a expressão de proteínas a partirde de vários genes clonados, cada novogene apresenta suas própriasparticularidades. Nenhum manual delaboratório pode descrever métodos quegarantirão o sucesso da produção de todasas proteínas. Até o momento, essatecnologia envolve tentativas para obter omelhor resultado, sendo que a maioria dasproteínas pode ser produzida em E. coli deforma a ser utilizada em uma variedade defunções. Os procedimentos empregadossão rápidos e descomplicados, sendo muitogrande a chance de sucesso (Ausubel et al.,2003).
Vários vetores encontram-se disponíveis nomercado para a expressão de proteínas emE.coli. Um dos mais referidos são da sériepET (plasmid for expression by T7 RNApolimerase), cuja expressão está sob ocontrole do promotor de transcrição 10 edos sinais de iniciação de tradução s10 daproteína do gene 10 (a principal proteína docapsídeo) do bacteriófago T7. A grandevantagem deste vetor é que ele é transcrito
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pela T7 RNA polimerase, que é muitoseletiva e ativa, sendo capaz de traduzircadeias de RNA aproximadamente cincovezes mais rápido que a RNA polimerase daE. coli. Alguns vetores da série pETapresentam o promotor T7-lac, colocando aexpressão da proteína sob o controle lac ereduzindo portanto o background deexpressão da proteína alvo na ausência deIPTG (Studier et al., 1990; Sorensen eMortensen, 2005b).
A expressão de grandes quantidades deproteínas em bactérias frequentementeresulta no acúmulo dos produtos na formade depósitos insolúveis no citoplasmacelular, denominados corpos de inclusão(Ausubel et al., 2003). Diante disto, ospesquisadores têm propostos métodos paraminimizar a formação desses agregadosatravés do controle de parâmetros, como:crescimento das culturas em temperaturasmais baixas (Chalmers et al., 1990),redução da taxa de expressão do generecombinante (Galloway et al., 2003), co-expressão das proteínas de interesse comchaperones (Wall e Plückthun, 1995),engenharia de proteínas (Murby et al., 1995;Forrer e Jaussi, 1998), entre outras.Entretanto, a expressão de proteínas naforma de corpos de inclusão pode servantajosa, pois, além da grande quantidadede proteínas produzida, grande parte delasestá protegida da degradação proteolítica.Sendo a proteína de interesse tóxica ou letalpara a célula hospedeira, sua produção naforma insolúvel pode ser o método maisviável (Misawa e Kumagai, 1999).
Os corpos de inclusão são depósitosprotéicos amorfos e densos, que podem serencontrados tanto no citoplasma quanto noespaço periplasmático da bactéria(Georgiou e Valax, 1999). Apesar de serempartículas densas são altamente hidratadose mostram uma arquitetura porosa (Carrió ecols, 2000). O grande desafio é tirarvantagem dos altos níveis de expressão deproteínas na forma de corpo de inclusão,sendo capaz de convertê-los em produtosbioativos solúveis (Sorensen e Mortensen,2005b) ou utilizá-los na forma insolúvel(Clark, 2001; Middelberg, 2002).
O gene etx que codifica a toxina épsilon deC. perfringens tipo B foi clonado e expressoem E. coli por Hunter et al. (1992), queutilizaram o plasmídeo pUC18, e, obtiveramum nível de expressão relativamente baixo,devido à instabilidade do produto, ou, pelatranscrição e tradução ineficientes. O geneetx de C. perfringens tipo D também foiclonado e expresso em E. coli por Goswamiet al. (1996), que expressaram uma proteínaligada à histidina utilizando o plasmídeopQE 32, na forma de corpo de inclusão. Aproteína recombinante obtida por essesautores mostrou-se antigênica e altamenteimunogênica.
2.4. Vacinas
O desenvolvimento pioneiro de Jenner, aquase dois séculos, da vacina contravaríola, marcou o início de uma nova erapara a medicina moderna. Desde então, aimunoprofilaxia contra doenças infecciosas,tem provado ser um dos melhores métodoscusto-efetivo de redução do sofrimentohumano e animal, e, das perdaseconômicas resultantes das infecçõesbacterianas e virais. A erradicação davaríola, o sucesso do programa devacinação contra a poliomielite e a reduçãoda morbidez e mortalidade causadas pordoenças infecciosas no homem e animais,são provas contundentes da importância davacinação.
As doenças causadas por Clostridium levamàs perdas consideráveis no rebanho, umavez que o tratamento, na grande maioriados casos, é impraticável. Além disso, aerradicação das doenças relacionadas aessas bactérias é praticamente impossível,devido às características ecológicas doagente e a sua forma esporulada deresistência.
Neste contexto, para Lobato e Assis(2000a), o controle e profilaxia devem-sebasear em medidas adequadas de manejo eem vacinações sistemáticas de todo orebanho. A eficiência das vacinas clostridiaisrelaciona-se à natureza do(s) antígeno(s)que as compõem – toxóides e/oubacterinas, e quando bem elaboradas,oferecem boa proteção aos animais. A
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maioria das vacinas comerciais épolivalente, o que na prática visa minimizaro problema de estresse e manejo dosanimais confinados, decorrente de múltiplasinoculações, assim como de reaçõesanafiláticas à inoculação de produtostóxicos, inflamações locais, traumas deinoculação, reações aos adjuvantes, dor efebre.
De acordo com Hatheway (1990), sabe-seque o gene relacionado à produção detoxina, na maioria das espéciespatogênicas, está localizado embacteriófagos ou plasmídeos que infectam abactéria. Repiques sucessivos das amostrasin vitro podem levar à perda dessesmateriais genéticos levando a umadiminuição ou mesmo à perda detoxigenicidade das amostras.
A produção de toxinas pelo Clostridium sp. éum dos aspectos mais relevantes a serconsiderado na linha de produção detoxóides eficientes. As linhagens utilizadas,a composição dos meios de cultura, pH,tempo, temperatura, atmosfera deincubação são fatores importantes e devemser rigorosamente controlados para aprodução de uma vacina eficiente.
Jansen (1961) e Pivnick e cols (1964; 1965)descrevem que os meios de cultivo paraclostrídeos devem conter fontes deaminoácidos utilizáveis, podendo sersintéticos, com infusão de carne ou pedaçosde carne cozida que também propiciamambiente de anaerobiose. A presença decarboidrato no meio de cultura como fontede energia pode influenciar o crescimento ea produção de toxinas. Concentrações deglicose entre 1%–2% apresentam melhoresresultados de produção. Segundo Rood eCobe (1991), a presença destescarboidratos favorece a produção de gasescomo H2 e CO2, que por sua vez ajudam amanter o ambiente de anaerobiose.Entretanto, a presença destes gases leva àacidificação do meio, interferindo naprodução de toxinas, sendo este um dospontos críticos na obtenção de culturasaltamente tóxicas. O pH do meio utilizadodeve ser mantido em torno da neutralidade
para produção de toxinas pela grandemaioria dos clostrídios (Smith, 1977).
O período de incubação também é um fatora ser considerado tanto na produção,quanto na estabilidade das toxinasproduzidas, como comentado por Sakurai eDuncan (1977), sendo variável de acordocom a espécie envolvida. Por exemplo, aprodução máxima de beta toxina por C.perfringens tipo C é obtida quando asculturas são incubadas por um período de4-8 horas e para produção de épsilon toxinapor C. perfringens tipo D é entre 5-12 horas.Períodos superiores podem levar àdegradação das toxinas por ação de outrassubstâncias produzidas pelo microrganismo.
Segundo Smith (1977), apesar dosclostrídios serem anaeróbios estritos, háuma variação quanto à tolerância deoxigênio, assim, a manutenção daatmosfera de anaerobiose é também umfator preponderante na produção de toxinas,sendo mantida com a utilização degeradores de anaerobiose, misturasgasosas ou meio de cultura contendoextrato de carne.
De acordo com Lobato e Assis (2000b),atualmente, no Brasil, há um incremento naprodução e comercialização de vacinas paraas clostridioses, em razão de modificaçõesocorridas nos sistemas criatórios, levandoao surgimento de novas doenças erecrudescimento de outras. No Brasil, deacordo com dados do Ministério daAgricultura, Pecuária e Abastecimento(MAPA), em 2004, foram produzidas150.254.123 doses de vacinas contraclostridioses, sendo que, 123.615.623 foramde vacinas polivalentes com diferentesassociações entre C. sordellii, C. chauvoei,C. septicum, C. novyi, C. perfringens B, C eD, C. tetani e C. botulinum C e D. Essasvacinas polivalentes contêm de cinco a onzeantígenos, sendo que apenas C. chauvoei eo toxóide botulínico tipo C e D sãocontrolados oficialmente quanto àesterilidade, inocuidade e potência peloMAPA, ficando os demais antígenos acritério dos laboratórios produtores (Lobatoet al., 2004).
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Trabalhos realizados por pesquisadoresbrasileiros sobre a eficiência de toxóidesclostridiais demonstraram a baixaantigenicidade dos produtos testados.Lobato et al. (2000b) ao avaliarem aeficiência de toxóides botulínicos dos tiposC e D, comercializados no País, verificaramque nenhum produto foi capaz de induzir aprodução de anticorpos neutralizantessuficientes para atender aos requisitosminímos exigidos no teste de potência.Azevedo et al. (1998) testaram a potênciade seis vacinas clostridiais, com múltiplosantígenos, que continham em suacomposição toxóides contra C. perfringenstipos C e D, demonstrando um baixo poderimunogênico dos produtos nacionaisdisponíveis no mercado. Lobato et al.(2000b) avaliaram seis vacinas comerciaiscontra C. perfringens tipos C e D e umtoxóide bivalente padrão, constatando queduas vacinas comerciais e o toxóide padrãoatenderam aos requisitos exigidos pelo testede potência em coelhos e, induziram aprodução de anticorpos neutralizantes embovinos vacinados. Balsamão et al. (2000)ao avaliarem 11 vacinas comerciais e umabacterina-toxóide padrão contra C. sordellii,verificaram que apenas o padrão e mais trêsvacinas comerciais atenderam aosrequisitos do teste de potência.
As vacinas ditas clássicas, ou seja, aquelasque não possuem a tecnologiarecombinante, empregam o cultivo doagente infeccioso para inativá-lo (vacinainativada), ou, para selecionarem mutantesnão-infecciosos, através de passagenssucessivas da cultura, que não causamdoença, podendo até causar infecções sub-clínicas (vacina viva modificada).
Neste contexto, o desenvolvimento denovos procedimentos para a produção devacinas tem despertado o interesse depesquisadores e empresas de produção deimunobiológicos. Esta possibilidade se tornapossível devido aos recentes avanços naimunologia, ao melhor entendimento dapatogênese da doença e aodesenvolvimento de novas técnicas, como:a tecnologia do DNA recombinante.
O Departamento de Agricultura dos EstadosUnidos (United, 2003) classifica as vacinasrecombinantes em quatro categorias:vacinas de subunidades, de genesdeletados, vetoriais e de DNA, que estãosendo amplamente pesquisadas para usotanto em humanos quanto em animais.
Vam Kampen (2001) comenta que avançoscientíficos trazidos pelo desenvolvimentodessa nova geração de vacinas têm sidoimplementados. As vacinas de subunidadesnão possuem o patógeno íntegro, sendoaltamente eficazes, seguras e capazes decentralizar a resposta imune a antígenosespecíficos, relacionados com a proteçãoimunológica contra a doença, ou seja, nãosendo necessário expor o sistemaimunológico a uma série de antígenos, alémde apresentar uma relação custo-benefíciovantajosa. Somando a tudo isto, existe apossibilidade de produção de vacinascombinadas (polivalentes) contra váriosagentes patogênicos, com moduladores deresposta imune, para proteger em umaúnica vacinação contra diferentes doenças,abrindo as portas para essa nova proposta.
Babiuk (1999) comenta que a vacina desubunidade contém somente as proteínasdo patógeno que estimulam uma respostaespecífica do sistema imune, sendo que,atualmente, é possível identificar asproteínas imuno-estimulantes e produzí-lasatravés da tecnologia do DNA recombinanteou, como peptídeos sintéticos. O aumentoda segurança e imunogenicidade devido àausência de componentesimunossupressores, constituem uma dasvantagens dessa categoria de vacina. Alémdisso, uma maior compatibilidade entre asvacinas e, por conseguinte, uma arquiteturavacinal melhorada, a capacidade paraatingir o sítio de imunidade e, finalmente, acapacidade de distinção entre o animalvacinado e infectado, também são possíveiscom o uso da tecnologia do DNArecombinante.
Para Babiuk (1999) e Ellis (1999), atecnologia recombinante permite produzirvacinas de subunidades em grande escala,tornando-a uma técnica muito maiseconômica quando comparada com vacinas
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inativadas de componentes sub-celularesextraídos diretamente de microrganismospatogênicos. As principais vantagens destavacina são: segurança; menor competiçãoantigênica, já que poucos componentesimunogênicos são encontrados na vacina; e,a possibilidade de produzir vacinas contraproteínas importantes comuns para váriosmembros da mesma família.
No País, atualmente, são comercializadasduas vacinas de subunidades expressas emE. coli, uma contra a doença de Lyme emcães, e, outra contra a leucemia felina. Pararuminantes, entretanto, não há nenhumavacina disponível que emprega essatecnologia.
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Fluxograma geral do trabalho:
Obtenção da linhagem deClostridium perfringens que contém
o gene etx
Obtenção do DNA do gene etxcodificante da toxina épsilon
Extração por proteinase K
Amplificação do gene etx
Lise alcalina com SDS
Clonagem no sistema TOPO TA
Subclonagem no sistema pET-11a
Expressão do gene etx
Teste de potência
Obtenção, dosagem e titulação datoxina recombinante
Toxinotipia
Soroneutralização cruzada
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3.2. Local de realização dos trabalhosexperimentais
Os experimentos foram realizados noLaboratório de Bacterioses e Pesquisa doDepartamento de Medicina VeterináriaPreventiva da Escola de Veterinária e, noLaboratório de Marcadores Moleculares eBiotecnologia do Instituto de CiênciasBiológicas, ambos na Universidade Federalde Minas Gerais.
3.3. Animais utilizados
Foram utilizados camundongos (Musmusculus) da raça swiss, linhagem webster,de ambos os sexos, gentilmente cedidospelo Laboratório Nacional Agropecuário(LANAGRO), Pedro Leopoldo/MG, e,coelhos (Oryctolagus cuniculus), machos,gentilmente cedidos pela FazendaExperimental “Prof. Hélio Barbosa”,Igarapé/MG.
3.4. Cultivo bacteriano e testes bioquímicos
Foi utilizada, nesse trabalho, a linhagem deClostridium perfringens tipo D (Uzal et al.,1997a) – amostras 34 e U10, pertencentesà bacterioteca do Laboratório deBacterioses e Pesquisa do DMVP/EV e,mantidas liofilizadas. Após a reconstituiçãocom meio de cultura BHI (Brain and HeatInfusion), foram inoculados 100 µL de cadaamostra em 10 mL de caldo tioglicolato(v/v); a incubação foi realizada a 37°C, emjarra de anaerobiose contendo misturagasosa (80% N2; 10% CO2; e 10% H2), por24 horas. Foram realizadas coloração deGram e caracterização bioquímica, por meiodos seguintes testes: maltose, lactose,sacarose, glucose, salicina, leite-ferro, indol,nitrato, tio-gel, conforme descrito por Chief eChief (1981).
3.5. Produção, titulação e padronização datoxina épsilon nativa
A produção, titulação e padronização datoxina épsilon nativa foram realizadas noLaboratório de anaeróbios do LaboratórioNacional Agropecuário (LANAGRO), doMinistério da Agricultura, Pecuária e
Abastecimento (MAPA), em PedroLeopoldo/MG.
As amostras 34 e U10 de C. perfringens tipoD foram testadas quanto à produção datoxina épsilon em meio de produção detoxina (Lobato e cols, 2000b). A titulação foifeita em camundongos, após ativação comsolução de tripsina 1% (p/v), segundometodologia descrita por Sebald e Petit(1997), para a determinação da dose letal50% – DL50 (quantidade de toxina que mata50% dos animais inoculados). Em seguida,a toxina épsilon foi padronizada no nível deteste L+/10 (menor quantidade de toxinaque quando misturada com 0,1 UI deantitoxina padrão homóloga, causará amorte de 50% dos camundongosinoculados), contendo, no mínimo, 20 DL50em cada L+/10 (European Pharmacopoeia,1998).
A toxina nativa, titulada e padronizada, foiutilizada como controle durante osexperimentos com a toxina recombinante.
3.6. Extração e quantificação de DNA
A extração de DNA das amostras 34 e U10de C. perfringens tipo D foi feita utilizandoduas metodologias: Método de extraçãocom fenol–clorofórmio (Takeuchi et al.,1997) e Método de lise alcalina com SDS(Sambrook e Russell, 2001). Para aquantificação do DNA extraído utilizou-seuma estimativa em gel de agarose 1% (p/v).
3.7. Reação da cadeia da polimerase (PCR)para detecção do gene etx nas amostras deC. perfringens tipo D
Para detectar a presença do gene etx econfirmar que as amostras 34 e U10 são deClostridium perfringens tipo D, realizou-se aPCR descrita por Uzal et al. (1997). Foramutilizados os pares de iniciadores para aamplificação dos genes alfa, beta e épsilon:
- alfa: 247pb
senso: 5’ TGC TAA TGT TAC TGC CGTTGA TAG 3’ – TM (50mM NaCl): 55°C
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anti-senso: 5’ ATA ATC CCA ATC ATC CCAACT ATG 3’ – TM (50mM NaCl): 52,6°C
- beta: 1025pb
senso: 5’ AGG AGG TTT TTT TAT GAA G3’ – TM (50mM NaCl): 44,8°C
anti-senso: 5’ TCT AAA TAG CTG TTA CTTTGT 3’ – TM (50mM NaCl): 46,6°C
- épsilon: 403pb
senso: 5’ TAC TCA TAC TGT GGG AACTTC GAT ACA AGC 3’ – TM (50mM NaCl):68°C
anti-senso 5’ CTC ATC TCC CAT AAC TGCACT ATA ATT TCC 3’ – TM (50mM NaCl):65°C
Além dos testes bioquímicos, as amostrasforam consideradas como C. perfringenstipo D por apresentarem amplificaçõespositivas com os iniciadores alfa e épsilon.
3.8. Amplificação do gene etx de C.perfringens tipo D por PCR
Com a finalidade de amplificar o gene etxdas amostras de C.perfringens tipo D foipadronizada uma PCR, sendo os iniciadoresdesenhados com base na seqüência dofragmento de DNA que codifica a toxina
épsilon, depositada no GeneBank sobnúmero de acesso AY858558 (HUNTER etal., 1992). Foram desenhados cincoiniciadores – três senso (F) e dois anti-senso (R) cujas seqüências são mostradasabaixo. Para a inserção do fragmentoamplificado no plasmídeo pET-11a foiadicionando o sítio de restrição da enzimaBamHI à extremidade 5’ dos iniciadores F3e R2.
- senso:
F1- 5' GTCGTAAATGTTGGAGCTACCCC3’ – TM (50mM NaCl): 57,6°C
F2- 5' TGAAAGGGTGGTTTTATG 3’ – TM(50mM NaCl): 47,1°C
F3- 5' GCAATCGCATCAGCGGTGATATCC3’ – TM (50mM NaCl): 60,3°C
- anti-senso:
R1- 5' GAACCCTCACGATCTCTTGG 3’ –TM (50mM NaCl): 55°C
R2- 5' CTTATTTTATTCCTGGTGCC 3’ –TM (50mM NaCl): 48,8°C
A localização dos iniciadores no fragmentode DNA que codifica a toxina épsilon éapresentada na figura 1.
Legenda: Barra vertical vermelha indica o início e o final do gene; em itálico e sublinhado, a seqüência dopeptídeo sinal; em negrito, a seqüência do peptídeo N-terminal clivado para ativação da prototoxina; asseqüências dos iniciadores estão marcadas em: F1 - laranja; F2 - verde; F3 - amarelo; R1 - rosa; R2 -azul.
Figura 1 – Seqüência de nucleotídeos do fragmento de DNA que codifica a toxina épsilon deClostridium perfringens tipo D (Hunter et al., 1992).
GATCGTTTTTAGTTCTATTTAAATAAACGATTTAATAATAAAAATTTTTAACTTGGGTTTTGTCGTAAATGTTGG
AGCTACCCCAATATAATAAAATTTGTATATTAAATAATTTTATTTATATTATTTACTTTTTTTAAAAAATATAGA
AAAATATAGAAAAATATATTAATGAAAGGGTGGTTTTATGAAAAAAAATCTTGTAAAAAGTTTAGCAATCGCAT
CAGCGGTGATATCCATCTATTCAATAGTTAATATTGTTTCACCAACTAATGTAATAGCTAAGGAAATATCTAATA
CAGTATCTAATGAAATGTCCAAAAAAG.......TATTAAGGCACCAGGAATAAAATAAGATTATTTATTAGAA
GTAAAAATAAGATTTTAGTTTTATAGATTAATATTAATTCTAATAAAAACTCTAATATAGATTTGTATGTAATCT
AATTTTCCTCTTAAAGATAAATTAGACTTTCAAAATTAAAACTTTGTAATCTTAAGTCTAATTTGAGAGTGTAAA
ATAGTCTGTGTAAACTAATAA|GATGATATAATTAAATATCATATAAAAGGAGGGTGCACAGACTATATCTTATGC
CGAAAAAGAATTGATAAAACAACTAATATAGAGACTGCTGAATATGCTCAAAATGTTATTAAAAGTTTATTTGGT
GGTTTAATTCAACAAATACTTGAAGCTGAAATGGAAGAATATTTAGGATATTTAAAATATGATTATTCAAATAAA
AATACTACTGATTCTCGTAATTGGGAAAATGAGAAAACTGTTAAATTTG|ATTTAGATATCCCAAGAGATCGTGAG
GGTTCTTTC......
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Foram testadas todas as seis combinaçõespossíveis e o respectivo do tamanho dofragmento amplificado, está descrito abaixo:
- F1R1: 1.569 pb
- F1R2: 1.112 pb
- F2R1: 1.460 pb
- F2R2: 1001 pb
- F3R1: 1420 pb
- F3R2: 960 pb (flanqueado com sítio deBamHI)
Para essa reação foram utilizados: tampãoda enzima 1X, 1,7 mM MgCl2, 0,2 mMdNTP, 0,5 U Taq polimerase, 2,5 pMoles decada iniciador, 1 µg de DNA molde. Areação foi feita utilizando termociclador MJResearch Inc. – modelo PTC 100 e osparâmetros de amplificação descritos noprograma 1:
Programa 1
Em seguida, foi realizada uma segundaPCR, utilizando as seis combinações deiniciadores, as mesmas concentrações dereagentes e o programa um de amplificação,
utilizando como DNA molde, o produtoamplificado na primeira reação com osiniciadores F1R1.
Para obter uma melhor amplificação edefinir os parâmetros da reação de PCRforam testadas diferentes temperaturas deanelamento, aumentando e diminuindo em2°C os passos três e sete do programa um.
3.9. Análise dos produtos de PCR
Todos os produtos de PCR obtidos foramanalisados em gel de agarose 1% (p/v) esubmetidos a um sistema de eletroforesehorizontal a 100 volts/150 mA. O gel foitratado com uma solução de brometo deetídio 1µg/mL, analisado sob luz ultravioletae fotodocumentado (Sambrook e Russell,2001).
3.10. Purificação dos produtos de PCR
Para a purificação dos produtos de PCR foiutilizado o kit DNA Purification System(Promega, cat. A7170), conformerecomendação do fabricante.
3.11. Estratégia para clonagem e expressãodo gene etx
3.11.1. Sistema de expressão
A família de vetores pET, desenvolvidaoriginalmente por Studier et al. (1990),permite a expressão regulada de genesheterólogos pela RNA polimerase dobacteriófago T7. Estes vetores carregam oreplicon da colicina E1 (colE1) e conferemresistência a ampicilina ou kanamicina. Seusítio de clonagem múltipla permite que asequência codificante inserida seja colocadasob o controle do promotor natural da RNApolimerase de T7 ou promotor T7lac (Fig. 2).
1- 94°C - 3 minutos2- 94°C – 30 segundos3- 56°C - 1 minuto4- 72°C - 1 minuto5- 5 vezes de 2 a 46- 94°C – 30 segundos7- 52°C – 1 minuto8 – 72°C – 1 minuto9 – 30 vezes de 6 a 810 – 72° - 5 minutos11 – 4°C - ∞.
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Legenda: PT7/lacO: promotor/operador T7/lacO; RBS: sítio de ligação do ribossomo; gene 10 leader:seqüência do gene 10; ampicillin: gene de resistência a ampicilina; pBr322: origem de replicação.
Figura 2 - Esquema do mapa do plasmídeo pET-11a.
3.11.2. Clonagem no sistema TOPO TA
O produto de PCR obtido com os iniciadoresF1R1 foi utilizado como molde para umaPCR utilizando novos iniciadores com sítiode restrição de BamHI (F3R2B). O produtofinal desta reação foi purificado, de acordocom ítem 3.9 e, foi clonado no vetor TopoTA (kit Topo TA Cloning, Invitrogen).
Para a propagação do plasmídeo cominserto, utilizou-se a linhagem E. coli XL1-Blue quimiocompetente, transformada porchoque térmico (amostras mantidas em gelopor 30 minutos, seguido por incubação a42°C, por 90 segundos). Após o
plaqueamento em ágar LB/ampicilinacontendo X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-b-D-galactopiranosídeo), foi realizada aincubação a 37°C em aerobiose, por 18horas. A seleção das colônias foi feita peladiferenciação entre brancas (com inserto) eazuis (sem inserto) (Sambrook e Russell,2001).
O DNA das colônias selecionadas foiextraído por lise alcalina, conforme descritopor Sambrook e Russell (2001) e realizada adigestão enzimática com BamHI, conformerecomendação do fabricante, paraverificação da presença do inserto.
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A análise da restrição foi feita em gel deagarose 1% (p/v) (Sambrook e Russell,2001) e, para a confirmação, os clonessugestivos de conterem o inserto foramutilizados como molde para uma reação dePCR, utilizando o par de iniciadores internosF3R2B, conforme a padronização no ítem3.8. Em seguida, o produto de PCR obtidofoi purificado a partir do gel de agarose,utilizando o kit DNA Purification System(Promega, cat. A7170), conformerecomendação do fabricante, e, usado paraa subclonagem no sistema pET-11a.
3.11.3. Preparação do vetor pET-11a para asubclonagem
A propagação do plasmídeo pET-11a foirealizada em E.coli XL1-Bluequimiocompetente. Após a lise alcalina, oDNA foi tratado com RNAse, e, purificadoem gradiente de cloreto de césio(SAMBROOK e RUSSELL, 2001).
3.11.4. Subclonagem no sistema pET-11a
O produto de PCR purificado e obtido noítem 3.11.2 foi subclonado no plasmídeopET-11a preparado na etapa anterior. Apósa etapa de clonagem, realizada conforme arecomendação do fabricante, E. coli XL1-Blue quimiocompetente foi transformada porchoque térmico (amostras mantidas em gelopor 30 minutos, seguido por incubação a42°C, por 90 segundos). O plaqueamentofoi feito em ágar LB/ampicilina e as placasforam incubadas a 37°C, por 18 horas e ascolônias foram selecionadas aleatoriamentee realizada a lise alcalina (Sambrook eRussell, 2001).
3.11.5. PCR e sequenciamento paraconfirmação da clonagem
Para a confirmação da presença do insertono plasmídeo pET-11a, foi realizada umaPCR utilizando o par de iniciadores internosF3R2, e, os parâmetros da reaçãopadronizada no item 3.8., e, a digestãoenzimática com BamHI, conformerecomendação do fabricante.
O sequenciamento das amostras positivasfoi feito utilizando os sistemas MegaBace(Amersham Biosciences do Brasil Ltda) eABI 3130 (Applied Biosystem). As reaçõesforam feitas de acordo com recomendaçõesdos fabricantes. Para o primeiro sistema foiutilizado o kit Dyenamic Dye Terminator(código US81090A) e, para o segundosistema, foi utilizado o kit Big Dye versão3.1, sendo as seqüências analisadas noprograma Sequence Scanner.
Para sequenciar a construção pET/inserto,no sistema MegaBace, utilizou-se o iniciadorM13; no sistema ABI 3130, utilizou-se osiniciadores T7 promoter (5’-TAA TAC GACTCA CTA TAG G – 3’) e T7 reverse (5’-GCTAGT TAT TGC TCA GCG G-3’).
3.11.6. Expressão do gene etx
O plasmídeo contendo o inserto foi utilizadopara a transformação da linhagem E. coliBL21(DE3) quimiocompetente por choquetérmico (amostras mantidas em gelo por 30minutos, seguido por incubação a 42°C, por90 segundos). Após o plaqueamento emágar LB/ampicilina, foi realizada aincubação a 37°C em aerobiose, por 18horas. As colônias foram selecionadasaleatoriamente para a indução da expressãoutilizando IPTG (Sambrook e Russell, 2001).
A expressão foi analisada no lisado celularem gel de poliacrilamida 12% (T30% -C2,7%) contendo SDS (sodium dodecylsulfate) e Western blot (Towbin et al., 1970).A corrida eletroforética foi realizada a 100volts e, para a coloração do gel foi utilizadasolução de Azul de Coomassie (Laemmli,1970). O western blot foi realizado utilizandocomo anticorpo primário, um policlonal decoelho antitoxina épsilon nativa, produzidopor Parreiras (2001).
Para avaliar a expressão com relação aotempo de indução, foi feita uma curva deexpressão com 2, 4, 6, 8 e 24 horas. Umacultura da bactéria com plasmídeo seminserto foi utilizada como controle.
Após a indução da expressão, a lisebacteriana foi realizada com lisozima e
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submetida a vários ciclos de sonicação(amplitude 40%, três pulsos, 8 segundos)para liberação da proteína recombinante.
Para tentar produzir a proteínarecombinante na forma solúvel, a expressãofoi realizada a 20°C, e, utilizando IPTG0,1M. Para efeito comparativo, foi realizadaa leitura da densidade óptica (DO) dasamostras e, aplicado no gel a mesmaquantidade em todos os experimentos.
3.11.7. Solubilização dos corpos de inclusão
A fração insolúvel da proteína recombinantecontida em corpos de inclusão foisolubilizada utilizando as seguintessubstâncias desnaturantes – NaOH 4,0 N,SDS 10% (p/v), acetato de sódio 3,0 M pH5,2, tiocianato de guanidina 6,0 M pH6,8,iodeto de sódio 3,0 M, uréia (0,5, 1, 2, 3, 4,5 e 6 M).
A análise da solubilização dos corpos deinclusão foi feita em gel de poliacrilamida12% (T30% - C2,7%) contendo SDS. Acorrida eletroforética foi realizada a 100volts e, para a coloração do gel foi utilizadasolução de Azul de Coomassie (Laemmli,1970).
3.11.8. Estimativa da dosagem da proteínarecombinante
A quantidade de proteína na fraçãoinsolúvel foi estimada em gel depoliacrilamida 12% (T30% - C2,7%)contendo SDS, comparativamente aquantidades conhecidas de soro albuminabovina (BSA): 5 µg, 10 µg e 20 µg. A corridaeletroforética foi realizada a 100 volts e,para a coloração do gel foi utilizada soluçãode Azul de Coomassie (Laemmli, 1970).
3.12. Titulação da toxina recombinante
Utilizaram-se camundongos da raça Swiss,linhagem Webster, pesando cerca de 17 a20 gramas (g); foram utilizados cincoanimais por diluição, inoculados 0,2 mL por
via endovenosa. Foram testadas as fraçõessolúveis e insolúveis da toxinarecombinante.
As frações foram tratadas com tripsinadurante 30 minutos em banho maria 37°C,e, as diluições decimais das amostrasforam feitas em salina peptonada 1%. Paracontrole, foram testadas as frações sem otratamento com tripsina. O resultado foicalculado pela dose letal que causa 50% deóbito por mililitro (DL50/mL), segundo Reed eMuench (1938).
3.13. Preparo do inóculo para imunização
A preparação do inóculo para imunizaçãode coelhos, para a produção de soroantitoxina épsilon recombinante e o teste depotência, foi feita conforme instruções doNational Institute for Biological Standardsand Control (NIBISC), com modificações.Foi utilizada a proporção de uma parte dafração insolúvel para uma parte desuspensão de hidróxido de alumínio(concentração de Al2O3 2,5≥3,5%, pH 5,5-8). A mistura foi mantida sob agitação, emtemperatura ambiente, overnight.
3.14. Produção de soro antitoxina épsilonrecombinante
Foram utilizados coelhos machos, da raçaHimalaia, pesando cerca de 2,0 kg,inoculados com a toxina recombinante,contendo 160 µg de proteína recombinante.A administração da vacina foi feita viasubcutânea. As sangrias parciais foramrealizadas através da veia marginal daorelha, após assepsia local e, para asangria total, os animais foram anestesiadoscom zoletil® (20 mg/kg) para a canulaçãoda artéria carótida. A determinação do nívelde antitoxinas nos soros dos animaisvacinados foi feita pela técnica desoroneutralização em camundongos,descrita no item 3.15.
O esquema de imunização foi realizado deacordo com diagrama abaixo:
27
3.15. Toxinotipia e soroneutralizaçãocruzada
Para a confirmação do tipo de toxinarecombinante produzida, foi utilizada ametodologia descrita por Batty e Glenny(1947) com modificações, que consistiu namistura de 1,0 mL da fração insolúvel datoxina épsilon recombinante, com 1,0 mL deantitoxina homóloga, produzida contra atoxina épsilon nativa, contendo 1,0 UI/mL.Como controle positivo, 1,0 mL da fraçãoinsolúvel da toxina recombinante foimisturado com 1,0 mL de salina peptonada1% (p/v).
A soroneutralização cruzada foi realizadamisturando 1,0 mL da toxina nativa com 1,0mL (contendo 1,0 UI/mL) da antitoxinarecombinante produzida em coelhos, e,misturando 1,0 mL da toxina épsilonrecombinante com 1,0 mL (contendo 1,0UI/mL) da antitoxina nativa produzida emcoelhos. Os controles positivos forampreparados misturando 1,0 mL de cada umadas toxinas, nativa e recombinante, com 1,0mL de salina peptonada 1% (p/v).
Nos dois testes, as misturas toxina-antitoxina e os controles foram mantidos embanho-maria, a 37°C, por 30 minutos, antesda inoculação, e, em seguida, administrado0,2 mL, por via endovenosa em quatrocamundongos. Os animais foramobservados por 72 horas e o resultado foideterminado pela sobrevivência dosanimais.
3.16. Teste de potência
Foi realizado conforme recomendações daFarmacopéia Européia (European
pharmacopeia, 1998), utilizando oitocoelhos saudáveis, machos, de 3–6 mesesde idade. A injeção foi feita por viasubcutânea, aplicando duas doses doinóculo, sendo a segunda dose aplicadaapós 21 dias. As sangrias foram realizadasantes das imunizações e após 14 dias dasegunda dose, através da veia marginal daorelha, realizando assepsia local. Ao finaldos experimentos, os animais foramdisponibilizados para doação. Foramutilizados três grupos inoculados comquantidades diferentes da toxinarecombinante. Foram aplicados 200, 100 e50 µg, respectivamente aos grupos I, II e III.
O valor de referência para a aprovação dopool de soro, não deve ser menor que cincoUI/mL, segundo recomendação dafarmacopéia européia (Europeanpharmacopeia, 1998). A determinação donível de antitoxinas nos soros dos animaisvacinados foi feita por soroneutralização emcamundongos, descrita no item 3.15.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. Cultivo bacteriano e testes bioquímicos
As amostras de Clostridium perfringens tipoD 34 e U-10, quando avaliadas pelo métodode Gram, apresentaram-se puras,observando-se somente bastonetes Grampositivos. Os resultados das provasbioquímicas estão apresentados na tabela1, confirmando ser ambas as amostrasClostridium perfringens.
Sangria pré-imune
1ª dose 2ª dose 3ª dose
Sangria
1º booster 2º booster 3º booster 4º booster
Sangriatotal
1ºdia15 dias 30 dias
37 dias
89 dias 117dias 138dias 162dias169dias
28
Tabela 1 - Testes bioquímicos das amostras 34 e U10 de Clostridium perfringens tipo D.
Testes Bioquímicos Amostra 34 Amostra U10Maltose Positivo PositivoLactose Positivo PositivoSacarose Positivo PositivoGlicose Positivo PositivoSalicina Positivo Positivo
Leite-ferro Coagulase positivaProdução de gás
Coagulase positivaProdução de gás
Indol Reativo de Kovac’s negativoÁc. Sulfanílico positivo
Reativo de Kovac’s negativoÁc. Sulfanílico positivo
Nitrato Alfa-naftilamina negativo Alfa-naftilamina negativoTio-gel Negativo Negativo
4.2. Extração do DNA das amostras 34 eU10 de C. perfringens tipo D
O DNA obtido por lise alcalina mostrou-se,em gel de agarose, como uma banda forte elimpa, sem bandas inespecíficas.
A lise alcalina em combinação com odetergente SDS, descrito por Sambrook eRussel (2001), tem sido utilizada a mais deduas décadas para isolamento de DNAplasmidial de E. coli. É uma técnicaadequada para trabalhar com todas aslinhagens de E. coli e outras culturasbacterianas fornecendo um DNA dequalidade que pode ser utilizado em váriosexperimentos. O método de proteinase Ktambém oferece um DNA de boa qualidade,entretanto, o fenol apresenta efeitosadversos à saúde, podendo causarqueimaduras graves, além de serneurotóxico e carcinogênico, exigindoprocedimentos rígidos de biossegurança.
Canard e cols (1992) realizando omapeamento genético para investigar adiversidade genômica e virulência emlinhagens de C. perfringens, demonstraramque o gene etx da toxina épsilon encontra-se em grandes plasmídeos que diferem emtamanho nas diferentes linhagens. Nestecontexto, o método de extração de DNA porlise alcalina mostrou-se apropriado para aobtenção do gene etx de C. perfringens tipoD, fornecendo um material adequado e deboa qualidade para utilização como moldenas reações de PCR, sendo o método
escolhido para a extração de DNA, nestetrabalho.
4.3. PCR para detecção do gene etx
A detecção do gene etx por PCR mostrouque na amostra U10 foram amplificados osgenes para as toxinas épsilon e alfa, nãoapresentando amplificação para o gene datoxina beta, confirmando a presença dogene etx, e, a identidade da amostra de C.perfringens tipo D. Na amostra 34 foiamplificado somente o gene para a toxinaalfa, confirmando ser a amostra de C.perfringens, mas sem a presença do geneetx.
Os estudos de Blaschek e Solberg (1981),Canard e cols (1992) e Cornillot e cols(1995) demonstraram que o gene etx datoxina épsilon encontra-se em plasmídeos,que são elementos genéticos instáveis. Asamostras 34 e U10 são provenientes damesma linhagem, sendo submetidas arepiques sucessivos. Esses procedimentos,assim como condições de cultivo earmazenamento, podem causar mudançasfenotípicas nas amostras, como perda ouaquisição da toxicidade. Essa mudança debiótipo em C. perfringens constitui aprincipal barreira encontrada para aprodução da toxina épsilon em larga escala,utilizando linhagens nativas. Diante dessesresultados, a amostra 34 foi descartada esomente o DNA extraído da amostra U10,onde foi detectada a presença do gene etx,foi utilizada nesse estudo para a obtençãoda toxina épsilon recombinante.
29
4.4. Padronização da PCR paraamplificação do gene etx
Na padronização para a amplificação dogene etx, a melhor reação foi conseguidacom uma PCR do tipo nested, caracterizadapela utilização de um produto de PCR, cominiciadores mais externos ao gene (F1R1)como molde para uma segunda reação comos iniciadores mais internos (F3R2),obtendo um produto de 972 pb. O aumentoem 2°C nas temperaturas de anelamentodos passos três e sete do programa um,descrito no item 3.8., melhoram ascondições da reação, resultando naobtenção de uma boa amplificação, sembandas inespecíficas. O produto de PCRobtido foi purificado e mostrado na figura 3,sendo utilizado para a etapa de clonagem.
A PCR do tipo nested é feita por meio doprocessamento de duas etapas de PCR. Nasegunda rodada é utilizado um par deseqüências iniciadoras que reconhecemuma região interna do produto daamplificação da primeira reação. Com isso,
além de ocorrer uma diluição de possíveismoléculas inibidoras presentes na amostra,também ocorrerá um aumento na proporçãoda seqüência-alvo entre a primeira esegunda etapa da reação, aumentando asensibilidade da reação e fornecendo umDNA de boa qualidade, que é pré-requisitopara o sucesso dos experimentos declonagem gênica.
4.5. Clonagem e expressão do gene etx
4.5.1. Clonagem do gene etx
Foram selecionados 30 clones após atransformação da bactéria E. coli XL1-Bluecom TOPO TA recombinante. Três clonesdigeridos com BamHI liberaram o fragmentode 972 pb (Figura 3), que após purificaçãofoi subclonado em pET-11a.
Dos 24 clones obtidos após a transformaçãoda bactéria E. coli BL21(DE3) com pET-11arecombinante, três foram submetidos àdigestão com BamHI para a confirmação dasubclonagem e liberaram o fragmento de972 pb (Figura 3), como esperado.
Legenda: Gel de agarose 1%. (a) 1- padrão de peso molecular; 2- fragmento de 972 pb purificado obtidoapós a padronização da PCR tipo Nested, usando os iniciadores externos F1R1 e, internos F3R2B (comsítio de BamHI); (b) Clonagem em TOPO TA; 1- fragmento de 972 pb liberado após digestão com BamHI;(c) Subclonagem em pET-11a; 1- plasmídio antes da digestão com BamHI; 2- fragmento de 972 pbliberado após digestão com BamHI
Figura 3 – Clonagem e expressão do gene etx de Clostridium perfringens tipo D.
2027 pb
564 pb972 pb
1 2 3 1
972 pb
1 2
972 pb
(a) (b) (c)
30
Estratégias para a expressão de altos níveisde proteínas heterólogas em bactérias têmsido discutidas por Makrides (1996),Georgiou e Valax (1999) e, Olins e Lee(1993). Devido ao vasto conhecimentosobre sua genética, bioquímica e biologiamolecular, E. coli tem sido o primeirosistema de escolha para a expressão demuitas proteínas heterólogas, e, nos últimosanos, várias proteínas recombinantes têmsido expressas nesse sistema.
Como Ausubel e cols (2003) discutem,fatores como tamanho, quantidade e, se aproteína heteróloga é requerida na formaativa ou não, influenciam a escolha dosistema para a expressão. A estratégiaescolhida para a clonagem do gene etx,utilizando um vetor de clonagem antes dovetor expressão, teve como objetivo garantira eficiência da obtenção da proteínarecombinante na forma ativa e em grandesquantidades. A taq polimerase utilizada nareação de PCR adiciona à extremidade 3’dos produtos amplificados, um resíduo dedeoxiadenosina (dA), devido à sua atividadeterminal-transferase. O vetor TOPO TAlinearizado permite a clonagem diretadesses fragmentos de DNA, devido a umresíduo de deoxitirosina (dT) na suaextremidade 3’, adjacente a uma seqüência5’-CCCT-3’. Este arranjo permite opareamento dos resíduos de dA e dT doproduto de PCR e do vetor,respectivamente, sendo essa ligaçãocatalisada pela topoisomerase I, isolada dovírus Vaccinia, sem utilização de ligases,sítios específicos de enzimas de restriçãoou qualquer outro procedimento pós-PCR,permitindo a clonagem em um único passo.A função biológica da topoisomerase I éclivar e reunir a fita de DNA durante suareplicação, reconhecendo especificamente aseqüência pentamérica 5’-CCCTT-3’. O sítiode clonagem do vetor TOPO, situado dentrodo fragmento do gene lacZ, que codifica aβ-galactosidase, não interrompe a janela deleitura desse gene, permitindo a síntese daenzima ativa. Entretanto, quando umfragmento de DNA é clonado dentro dessaregião, a janela de leitura do gene lacZ éinterrompida, não permitindo suatranscrição. Quando E. coli transformada
com TOPO sem inserto é plaqueada emmeio contendo X-gal, um análogo dalactose, sua clivagem pela β-galactosidaseproduz uma substância azul insolúvel, e, ascolônias com plasmídeo sem inserto,apresentam a coloração azul. Ao contrário,quando colônias com plasmídeo, contendoo inserto, crescem em meio de cultura comX-gal, a β-galactosidase não é produzida eas colônias são brancas, sendo facilmentedistinguidas daquelas colônias azuis, seminserto.
O sistema pET de vetores, originalmentedesenvolvidos por Studier et al. (1990)permite a expressão regulada de genesheterólogos pela RNA polimerase dobacteriófago T7. É um poderoso sistemapara clonagem e expressão de proteínasrecombinantes em E. coli. O gene deinteresse é clonado no plasmídeo pET sob ocontrole de forte promotor do bacteriófagoT7. A RNA polimerase é tão seletiva e ativaque quase todos os recursos da célulahospedeira são convertidos para aexpressão do gene de interesse e, oproduto desejado pode compreender maisde 50% das proteínas totais celulares apóspoucas horas de indução, como estudadopor Kelley e cols (1995) que descreveram osparâmetros que afetam a regulação daexpressão de proteínas em vetores dafamília pET. Uma outra vantagemimportante desse sistema é a sua habilidadeem manter o gene de interesse em “silênciotranscricional” no estado não induzido. Alémdisso, esses vetores possuem também ogene 10 do bacteriófago T7 que promoveum alto nível de transcrição e tradução. ARNA polimerase do bacteriófago éaltamente específica para a seqüência dopromotor, garantindo que este não seráreconhecido pela RNA polimerase da célulahospedeira, promovendo uma traduçãoaltamente eficiente, uma vez que aseqüência codificante do gene de interesseé clonada em BamHI, após o gene 10.
Ainda, no sentido de garantir a eficiência daclonagem, utilizando DNA de boa qualidade,foi realizada a purificação do plasmídeo pETem gradiente de cloreto de césio. Essapurificação, apesar de laboriosa, é eficiente
31
na remoção de RNA, polissacarídeos,proteínas e outros contaminantes daamostra de DNA. Clegg et al. (1997)utilizaram esse método para purificar DNAde comunidades bacterianas diretamente dosolo, obtendo amostras de excelentequalidade.
Os clones com o fragmento de 972 pb,considerados positivos, foramseqüenciados, e mostraram que o DNA deinteresse foi inserido corretamente na janelade leitura do plasmídeo, após o códon deiniciação ATG, como pode ser visto nafigura 4. A seqüência obtida neste trabalho,analisada pelo programa Blastn, apresentou
100% de homologia com a seqüência dogene etx de C. perfringens tipo D,depositada no GeneBank por Hunter et al.(1992).
Goswani et al. (1996) descrevem comsucesso a obtenção da toxina épsilonrecombinante no sistema E. coli, utilizando aclonagem direta no vetor de expressão pQE32. Apesar do amplo conhecimentoacumulado sobre a clonagem e expressãode proteínas recombinantes, cada geneapresenta suas particularidades e, podemostrar expressão eficiente mesmo comestratégias diferentes.
32
33
1
52
103
154
205
256
307
358
409
460
511
562
613
664
715
766
817
868
919
970
1021
1072
rbs G K G N I P L STO N N F V STO L STO E Gggt aag ggg aac att ccc ctc tag aat aat ttt gtt taa ctt taa gaa gga Códon de iniciação BamHI D I H M A S M T G G Q Q M G R G Sgat ata cat atg gct agc atg act ggt gga cag caa atg ggt cgc gga tccInício do gene etx A I A S A V I S I Y S I V N I V Sgca atc gca tca gcg gtg ata tcc atc tat tca ata gtt aat att gtt tca P T N V I A K E I S N T V S N E Mcca act aat gta ata gct aag gaa ata tct aat aca gta tct aat gaa atg S K K A S Y D N V D T L I E K G Rtcc aaa aaa gct tct tat gat aat gta gat aca tta att gag aaa gga aga Y N T K Y N Y L K R M E K Y Y P Ntat aat aca aaa tat aat tac tta aag aga atg gaa aaa tat tat cct aat A M A Y F D K V T I N P Q G N D Fgct atg gca ttt gat aag gtt act ata aat cca caa gga aat gat ttt tat Y I N N P K V E L D G E P S M N Ytat att aat aat cct aaa gtt gaa tta gat gga gaa cca tca atg aat tat L E D V Y V G K A L L T N D T Q Qctt gaa gat gtt tat gtt gga aaa gct ctc tta act aat gat act caa caa E Q K L K S Q S F T C K A T T T Vgaa caa aaa tta aaa tca caa tca ttc act tgt aaa aat act gat aca gta T A T T T H T V G T S I Q A T A Kact gca act act act cat act gtg gga act tcg ata caa gca act gct aag F T V P F N E T G V S L T T S Y Sttt act gtt cct ttt aat gaa aca gga gta tca tta act act agt tat agt F A N T N T N T N S K E I T H N Vttt gca aat aca aat aca aat act aat tca aaa gaa att act cat aat gtc P S Q D I L V P A N T T V E V I Acct tca caa gat ata cta gta cca gct aat act act gta gaa gta ata gca Y L K K V N V K G N V K L V G Q Vtat tta aaa aaa gtt aat gtt aaa gga aat gta aag tta gta gga caa gta S G S E W G E I P S Y L A F P R Dagt gga agt gaa tgg gga gag ata cct agt tat tta gct ttt cct agg gat G Y K F S L S D T V N K S D L N Eggt tat aaa ttt agt tta tcg gat aca gta aat aag agt gat tta aat gaa D G T I N I N G K G N Y S A V M Ggat ggt act att aat att aat gga aaa gga aat tat agt gca gtt atg gga D E L I V K V R N L N T N N V Q Egat gag tta ata gtt aag gtt aga aat tta aat aca aat aat gta caa gaa Y V I P V D K K E K S N D S N I Vtat gta ata cct gta gat aaa aaa gaa aaa agt aat gat tca aat ata gta Final do gene etx BamHI K Y R S L S I K A P G I K STP G S Gaaa tat agg agt ctt tct att aag gca cca gga ata aaa taa gga tcc ggc Códon de terminação C STO Q S P K S V I Ctgc taa caa agc ccg aaa gaa gtt att tgt
Legenda: Em rosa, destaca-se o sítio de ligação do ribossoma (rbs) do vetor pET-11a; Em vermelho,destaca-se os códons de iniciação e terminação do vetor pET-11a; Em azul, destaca-se o sítio declonagem BamHI; O início e o final do gene etx seqüenciado se encontra entre os nucleotídeos 103 e1062, respectivamente; Em verde, destaca-se o peptídeo N-terminal clivado proteoliticamente durante aativação da prototoxima.
Figura 4 – Seqüência de nucleotídeos e aminoácidos do fragmento de DNA codificante datoxina épsilon de Clostridium perfringens tipo D, subclonado no plasmídeo pET-11a.
34
35
4.5.2. Expressão do gene etx
O produto da expressão do gene etx,analisada no lisado celular, foi significativa
quando comparada com o controle, comopode ser visto na figura 5.
Legenda: (a) SDS-PAGE, gel de poliacrilamida 12%; 1- padrão de peso molecular; 2- E. coli BL21(DE3)sem plasmídeo/sem inserto após indução; 3- E. coli BL21(DE3) recombinante após indução. (b) Westenblot; 1- padrão de peso molecular; 2- E. coli BL21(DE3) sem plasmídeo/sem inserto após indução; 3- E.coli BL21(DE3) recombinante após indução.
Figura 5 – Expressão do gene etx de Clostridium perfringens tipo D no sistema pET-11a.
Após a transferência, houve reaçãoespecífica com antitoxinas produzidas emcoelhos imunizados com a toxina épsilonnativa, mostrando uma identidadeantigênica da toxina recombinante com anativa.
A clonagem e expressão do gene etx quecodifica a toxina épsilon, também foirealizada por Hunter et al. (1992) e Goswaniet al. (1996). O primeiro trabalho utilizou ogene etx de C. perfringens tipo B, clonado eexpresso em E. coli, usando como vetor o
plasmídeo pUC18, e, o segundo, clonou ogene etx de C. perfringens tipo Ddiretamente no plasmídeo pQE-32 e oexpressaram usando também o sistema E.coli, obtendo uma concentração máxima daproteína recombinante com 6 horas após aindução.
Após a avaliação de alguns parâmetrosbioquímicos e imunológicos da toxinarecombinante obtida neste trabalho, avaliou-se a expressão em relação ao tempo deindução, como mostrado na figura 6.
1 2 3
37,7 kDa
28,5 kDa
18,4 kDa
32 kDa32 kDa
28 kDa
14 kDa
38 kDa
1 2 3
(a) (b)
36
37
Legenda: SDS-PAGE, gel de poliacrilamida 12%; 1- padrão de peso molecular; 2- Toxina épsilon nativa;3-4-5-6-7- E. coli BL21(DE3) recombinante após 2, 4, 6, 8, 24 horas de indução, respectivamente; 8- E.coli BL21(DE3) sem plasmídeo/sem inserto após 6 horas de indução.
Figura 6 – Expressão do gene etx de Clostridium perfringens tipo D no sistema pET 11a emrelação ao tempo de indução.
Observou-se que a toxina épsilonrecombinante foi expressa até 24 horasapós a indução, e, atingiu um nívelsatisfatório de produção com 6 a 8 horas.No processo de otimização da produçãodessa toxina recombinante em larga escala,este período de tempo pode ser facilmenteassimilado pela indústria.
A expressão de proteína recombinante é umprocesso que envolve várias tentativas parase obter o melhor resultado e,frequentemente, a principal proposta destatecnologia consiste na obtenção de altosníveis de produto solúvel, como discutidopor Sorensen e Mortensen (2005b) em umarevisão sobre a expressão de proteínas emE. coli. Entretanto, nesse sistema procarioto,uma quantidade significativa de proteínarecombinante é produzida contida em
corpos de inclusão, na forma insolúvel,podendo uma outra parte ser expressatambém solúvel. Os resultados obtidosneste trabalho confirmaram essasafirmações e mostraram que, após a lisebacteriana, uma grande quantidade datoxina épsilon recombinante ficava retida nopellet, contida em corpos de inclusão(Figura 7)
Após a reação de Western blot, observa-seuma reação específica das antitoxinasproduzidas em coelhos imunizados com atoxina épsilon nativa. Esses resultadosconfirmam a identidade antigênica daproteína recombinante produzida nestetrabalho, com a toxina épsilon nativa, tantona forma solúvel quanto insolúvel, comomostrado na figura 7.
1 2 3 4 5 6 7 8
Nativa 37,6 kDa
28,5 kDa
18,4 kDa
38
39
Legenda: (a) SDS-PAGE, gel de poliacrilamida 12%; 1- padrão de peso molecular; 2- sobrenadantecontendo a fração solúvel; 3- pellet contendo a fração insolúvel. (b) Western blot; 1- padrão de pesomolecular; 2- sobrenadante contendo a fração solúvel; 3- pellet contendo a fração insolúvel.
Figura 7 – Expressão do gene etx de Clostridium perfringens tipo D no sistema pET 11a nasformas solúvel e insolúvel, após a lise bacteriana.
4.6. Obtenção da proteína recombinante naforma solúvel
A formação de corpos de inclusão ocorrecomo uma resposta ao acúmulo deproteínas desnaturadas no citoplasma dacélula hospedeira. Bentley e kompala (1990)descrevem como a expressão de proteínasheterólogas sobrecarregam o metabolismoda célula hospedeira e, como aumentar aformação de proteína solúvel in vivo,controlando alguns parâmetros durante aindução da expressão.
Na tentativa de se obter a toxina épsilonrecombinante na forma solúvel, algumasestratégias foram testadas. Quando atemperatura do cultivo foi diminuída de 37°Cpara 20°C, antes e após a indução,observou-se que parte da proteína estavana forma solúvel, mas a maior parte, aindacontinuava no pellet, insolúvel, retida emcorpos de inclusão, como mostrado nafigura 8.
18,4 kDa
28,5 kDa
37,6 kDa
1 2 3 1 2 3
28 kDa
17 kDa
38 kDa
40
41
Legenda: SDS-PAGE, gel de poliacrilamida 12%; 1- padrão de peso molecular; 2- toxina épsilon nativa;3- sobrenadante contendo a fração solúvel; 4- pellet contendo a fração insolúvel.
Figura 8 – Expressão do gene etx de Clostridium perfringens tipo D no sistema pET 11a a20°C, antes e após a indução.
Essas estratégias são comentadas porVillaverde e Carrió (2003), Sorensen eMortensen (2005a) e Sorensen e Mortensen(2005b) que descrevem como a formaçãodos corpos de inclusão pode ser minimizadapor meio do tipo de plasmídeo usado, dalinhagem bacteriana, da seqüência daproteína recombinante, da co-expressão degenes que codificam chaperones e, dascondições do cultivo. A indução daexpressão a baixas temperaturas (15-20°C),segundo Sorensen e Mortensen (2005b) e omanual do plasmídeo pET (System Manual,11ªth edition, Novagen), pode facilitar aexpressão da proteína recombinante naforma solúvel.
A concentração de IPTG usado para induziro promotor lac do vetor pode tambéminfluenciar a taxa de expressão, que se formais lenta, pode facilitar a produção daproteína recombinante na forma solúvel,sobrecarregando menos a maquinaria dacélula hospedeira. Sambrook et al. (2001)
sugerem testar empiricamente váriasconcentrações de IPTG, começando com1,0 mM, para estabelecer uma concentraçãoótima. Neste trabalho, quando aconcentração final do IPTG foi diminuída de0,5 mM para 0,08 mM, observou-se que amaior quantidade da proteína recombinanteainda continuava insolúvel nos corpos deinclusão. Goswani et al. (1996), queexpressaram o gene etx de C. perfringenstipo D, usaram uma concentração de IPTGque variou de 1,0 mM a 0,05 mM parainduzir a expressão em E. coli e, a maiorparte da proteína recombinante tambémficou retida em corpos de inclusão.
1 2 3 4
Nativa
37,6 kDa
28,5 kDa
18,4 kDa
42
43
4.7. Solubilização dos corpos de inclusão
Como não se conseguiu obter grandesquantidades da toxina recombinante naforma solúvel, reagentes desnaturantesforam utilizados na tentativa de solubilizá-la.Vários autores descrevem a utilização deagentes desnaturantes para solubilizar oscorpos de inclusão, o que pode causarimpacto nas etapas subseqüentes derenaturação e no custo total do processo.Clark (2001) descreveu a utilização decloreto de guanidina e uréia, maiscomumente utilizados para a solubilizaçãodos corpos de inclusão. O processo se dádevido ao rompimento completo da estruturaprimária da proteína ou pelo rompimento deinterações intermoleculares, levando a umadesnaturação parcial da proteína. Para esteprocedimento, foi utilizado NaOH 4,0N, SDS10% (p/v), acetato de sódio 3,0M pH 5.2,tiocianato de guanidina 6,0 M pH 6.8, iodetode sódio 3,0 M e uréia 6,0 M. A
solubilização foi parcial quando se utilizouSDS 10% (p/v) e iodeto de sódio 3,0M. Nãose observou solubilização, utilizando NaOH4,0N e acetato de sódio 3,0M. Os melhoresresultados, obtendo uma solubilização totaldos corpos de inclusão foram utilizandotiocinato de guanidina 6,0 M e uréia 6,0 M.
Quando se comparam esses reagentesdesnaturantes em termos de metodologia ecusto-benefício, Cho et al. (2007), Afzal etal. (2007) e Gallucio et al. (2007) indicam autilização da uréia para a solubilização doscorpos de inclusão, como método simples,econômico e eficiente. Para se conseguiruma solubilização adequada e determinar aquantidade mínima do agente desnaturante,optou-se, neste trabalho, em utilizar a uréiae, os resultados utilizando as quantidadesque variaram de 0,5 a 6,0 M, mostraramuma solubilização completa somente comuréia 6,0 M, como mostrado na figura 9.
Legenda: SDS-PAGE, gel de poliacrilamida 12% (p/v); 1- padrão de peso molecular; 2- solubilização comsalina 0,85% (p/v); 3- solubilização com uréia 6,0 M.
Figura 9 – Solubilização com uréia 6,0 M dos corpos de inclusão obtidos a partir da expressãodo gene etx de Clostridium perfringens tipo D.
37,6 kDa
28,5 kDa
18,4 kDa
1 2 3
44
45
Observa-se que na coluna 3, uma banda de32 kDa correspondente à toxina épsilon,após a solubilização dos corpos de inclusãocom uréia 6,0 M. Na coluna 2, utilizou-sesalina 0,85% (p/v), como controle doexperimento e, não observou-se nenhumabanda na fração solúvel da amostra.
A maioria dos trabalhos demonstra que parase obter, por meio de processosdesnaturantes, a proteína solúvel e ativa, énecessário realizar uma etapa posterior dereenovelamento in vitro. Como discutido porVillaverde e Carrió (2003), Sorensen eMortensen, (2005b), Afzal (2007) eMedynski et al. (2007), este processo podeafetar a integridade da proteínarecombinante obtida, e envolve umempenho grande, de alto custo, comresultados muitas vezes indesejáveis, nemsempre conduzindo a processos úteis paraprodução em alta escala. Neste contexto,procedimentos de reenovelamento in vitronão foram realizados neste trabalho.
Uma vez que os corpos de inclusão podemser facilmente purificados por repetidascentrifugações a baixas rotações e, emalguns casos, podendo ser utilizadosdiretamente como antígenos para aprodução de anticorpos, como demonstradopor Harlow e Lane (1988). A produção deproteínas recombinantes na forma insolúvel,contida em corpos de inclusão, mantém ascaracterísticas de antigenicidade eimunogenicidade, preservando os epítopos.Além disso, a obtenção dos corpos deinclusão a partir do lisado celular, nãodemanda processos complicados eonerosos, viabilizando sua utilização emescala industrial.
Visto que, nenhuma das estratégias para seconseguir a proteína recombinante na formasolúvel foi satisfatória, e, devido àsimplicidade de obtenção e purificação doscorpos de inclusão, o que em termos decustos totais, chega a ser até 80% inferioraos processos mais complexos depurificação de proteínas utilizando resinas
e/ou HPLC (1), decidiu-se utilizar essa formainsolúvel nos experimentos deimunogenicidade, inocuidade e proteção,que são objetivos desse trabalho.
4.8. Dosagem da toxina recombinante
Para estimar a quantidade de toxinarecombinante na forma de corpos deinclusão, os métodos tradicionais (Lowry etal., 1951; Bradford, 1976) não se mostraramviáveis. Foi feita uma comparação entreconcentrações conhecidas de BSA comvolumes conhecidos da suspensão datoxina na forma insolúvel, em gel depoliacrilamida SDS – PAGE. Observou-seque a toxina épsilon recombinante obtidaneste trabalho, após as etapas de lavagense recuperação dos corpos de inclusão, seapresentou como duas bandas fortes, umacom cerca de 32 kDa, como esperada e,outra de aproximadamente 36 kDa.Considerando a banda esperada de 32 kDa,a concentração estimada, para estetrabalho, de toxina recombinante obtida, foide 10 mg/mL, como mostrado na figura 10.Todavia, investigações futuras deverãoesclarecer se a banda de aproximadamente36 kDa é correspondente a uma variação daproteína recombinante. Neste caso, haveriaum acréscimo na concentração deaproximadamente 100%, ou seja, 20mg/mL.
1 Comunicação pessoal feita pelo Prof. Dr.Evanguedes Kalapothakis (Laboratório deMarcadores Moleculares e Biotecnologia, ICB,UFMG, 2008).
46
47
Legenda: SDS-PAGE, gel de poliacrilamida 12%; 1- Padrão de peso molecular; 2-3-4- BSA: 5 µg, 10 µg e20 µg, respectivamente; 5- toxina épsilon recombinante.
Figura 10 – Estimativa da dosagem da toxina épsilon recombinante.
Hunter et al. (1992) conseguiram umaconcentração máxima de toxina épsilonrecombinante após 6 horas de indução e, onível de toxina foi estimado entre 5 a 25µg/mL de cultivo, valores ligeiramentemenores ao obtido neste trabalho.
4.9. Titulação da toxina épsilonrecombinante
As frações solúvel e insolúvel da toxinaépsilon recombinante foram tituladas emcamundongos e os resultados obtidos foramde 12,5 x 102 e 25 x 102 DL50/mL,respectivamente.
Os títulos da toxina obtidos neste trabalhoforam muito superiores àqueles obtidos coma toxina nativa como demonstrado porAzevedo (1997), que produziu a toxinanativa utilizando diferentes meios de culturae métodos para concentrá-la, obtendo umtítulo máximo de 8,0 x 102 DL50/mL, queforam ainda superiores aos obtidos por ElIdrissi e Ward (1992) que trabalharam comtoxinas purificadas.
Tradicionalmente, a atividade da toxinaépsilon é determinada usando o teste deletalidade em camundongos, como descritopor Rood et al. (1997). Neste trabalho, umaDL50, determinada em camundongoequivaleu a 4.000 ng da fração insolúvel datoxina épsilon recombinante. Payne et al.(1994), ao titularem a toxina épsilon nativapurificada, determinou que em uma DL50continha 78 ng da proteina, valor 51 vezesinferior ao encontrado, que foi de 4.000 ng.Pode-se inferir que a toxina recombinantefoi menos tóxica, sendo inclusiveempregada na imunização dos coelhos sempassar por um processo de destoxificação.Esta observação foi também feita porHarlow e Lane (1988), em relação àproteína na forma insolúvel retida em corposde inclusão, podendo a mesma serempregada diretamente na imunização deanimais.
1 2 3 4 5
36 kDa
48
49
4.10. Produção de soro antitoxina épsilonrecombinante
Os níveis de antitoxina épsilonrecombinante em soro de coelhosimunizados, utilizando como adjuvante
suspensão em hidróxido de alumínio, com atoxina épsilon recombinante, mostrou conterapós três doses, aos 37 dias, um título de30 UI/mL. Após mais quatro doses, aos 169dias, o título chegou a 80 UI/mL (Fig. 11).
Figura 11 – Níveis de antitoxina épsilon de Clostridium perfringens tipo D em soro de coelhosimunizados com a toxina épsilon recombinante, aos 37 dias e 169 dias.
Esses resultados mostram que a toxinaépsilon recombinante foi eficiente emproduzir uma boa resposta imunológica emcoelhos. Acredita-se que, com o esquemade imunização feito com adjuvante completoe incompleto de Freund, e, possivelmente,associado aos métodos de purificação dosanticorpos, os títulos obtidos seriamexpressivamente superiores aosencontrados.
4.11. Toxinotipia e soroneutralizaçãocruzada
O tipo da toxina recombinante foiconfirmado ser épsilon, pela neutralizaçãocom uma antitoxina padrão homóloga. Oteste de soroneutralização cruzada mostrouque todos os camundongos inoculados com
a mistura toxina recombinante e antitoxinanativa, e, toxina nativa e antitoxinarecombinante, sobreviveram. Todos osanimais inoculados com as misturas-controle morreram. Esses resultadosconfirmam a identidade antigênica da toxinaépsilon recombinante produzida nestetrabalho, com a toxina épsilon nativa.
As alterações patológicas e fisiológicas,após a inoculação da toxina épsilonrecombinante, produzidas emcamundongos, geraram sintomasneurológicos característicos da toxinaépsilon nativa, corroborando com osresultados bioquímicos e imunológicos,obtidos neste trabalho.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Título de antitoxina
épsilon recombinante
(UI/mL)
37 dias 169 dias
período após vacinação
50
Estes resultados foram obtidos também porGoswani et al. (1996), que produziram umatoxina épsilon recombinante que foireconhecida por anticorpos monoclonaisantitoxina épsilon nativa, mostrando tambémuma identidade antigênica com a toxinanativa, e, o soro policlonal produzido emcoelhos imunizados com essa toxina
recombinante, reconheceu tanto arecombinante quanto a nativa.
4.12. Teste de potência
Os resultados dos testes de potência datoxina épsilon recombinante obtida nestetrabalho estão apresentados na tabela 2.
Tabela 2 – Níveis de antitoxina épsilon de Clostridium perfringens tipo D em pool de soros decoelhos imunizados com a toxina épsilon recombinante.
Título de antitoxina épsilon recombinante (UI/mL)Grupo/ quantidade detoxina inoculada Pré-imunização 32 dias
I /200 µg ND* 40II /100 µg ND* 30III / 50 µg ND* 10
*ND – título de antitoxina não detectado
O grupo I, imunizado com 200 µg da toxinarecombinante, apresentou título de 40UI/mL; o grupo II, imunizado com 100 µg,apresentou título de 30 UI/mL; e, o grupo III,imunizado com 50 µg, apresentou título de10 UI/mL. Observa se que os níveis deanticorpos neutralizantes obtidosapresentaram uma relação direta com aconcentração da proteína recombinanteempregada em cada grupo.
Considerando os níveis mínimos deaprovação de antitoxina épsilon de 5 UI/mL,pela Farmacopéia Européia, e de 2 UI/mL,pelo CFR, os níveis de anticorposneutralizantes obtidos com a dose de 50 µgde toxina recombinante, a menor utilizadaneste trabalho, ainda foram 2 vezessuperiores àquele exigido pela FarmacopéiaEuropéia e, 5 vezes superiores ao exigidopelo Code Federal Regulation (CFR). NoBrasil, o teste de potência exigido peloMAPA para a aprovação do toxóide épsiloné o mesmo valor exigido pelo CFR, o quepermitiria a utilização de níveis mais baixosda proteína recombinante. Os níveis deproteína empregados foram inferiores aosrecomendados na preparação de referênciainternacional do toxóide épsilon de C.perfringens, utilizada para a padronizaçãode vacinas contendo o toxóide épsilon,recomendada pelo National Institute for
Biological Standards and Control (NIBISC).Cada dose de toxóide épsilon contém 9.192µg da toxina nativa. Comparando estaquantidade com a menor dose utilizadaneste trabalho, 50 µg, observa-se que foiutilizado uma quantidade 184 vezes menorque a contida no padrão de referênciainternacional, elicitando uma boa respostanos animais imunizados.
Neste estudo, após processos de lavagempor centrifugação, com um litro da culturaobteve-se uma concentração aproximada de10.000 µg de toxina épsilon recombinante, oque seria teoricamente suficiente paraproduzir 200 doses do toxóide. Entretanto, orendimento de proteína recombinante porlitro de cultura, ainda poderia serincrementado. De acordo, com resultadosanteriores de expressão de outrasproteínas, obtidos pelo Laboratório deMarcadores Moleculares e Biotecnologia(ICB/UFMG), o rendimento máximo, usandoo sistema pET-11a, já alcançou níveis deexpressão em torno de 50 mg/litro decultura, o que daria um rendimento deaproximadamente cinco vezes o obtidoneste trabalho.
Os títulos de antitoxina produzidos contra atoxina épsilon recombinante foramsignificativamente superiores aos obtidos
51
com vacinas comerciais produzidas a partirda toxina nativa. Azevedo (1997) vacinoucoelhos utilizando seis vacinas polivalentescomerciais contendo C. perfringens tipo D eobteve níveis de antitoxinas épsilon de 9,0UI/mL em pool de soro de coelhos,coletados aos 35 dias após a aplicação deduas doses, para uma única vacina. Asoutras cinco vacinas não apresentaramníveis detectáveis de antitoxina sérica.Quando a imunização foi feita utilizando otoxóide padrão, o título sorológico foi 15UI/mL, aos 35 dias, após a vacinação.
Outros estudos que testaram a eficiênciadas vacinas comercializadas no Brasil,mostraram resultados semelhantes aos deAzevedo (1997), com títulos de antitoxinamais baixos em relação aos obtidos com atoxina épsilon recombinante produzidaneste trabalho. Dholakia et al. (1980)vacinaram coelhos com uma vacinacomercial e obtiveram títulos de antitoxinaépsilon de 4,0 UI/mL, aos 35 dias após asegunda dose. Lobato et al. (2000a)avaliando a resposta imune contra seisvacinas polivalentes comerciais e toxóidepadrão em coelhos, obtiveram títulos de 5, 6e 7,0 UI/mL, somente para duas das vacinastestadas. As outras não apresentaram níveisdetectáveis de antitoxinas, enquanto otoxóide padrão mostrou um título de 45,2UI/mL.
As doenças causadas por Clostridium levama perda considerável no rebanho, uma vezque o tratamento, na grande maioria doscasos, é impraticável. Além disso, aerradicação das doenças relacionadas aessas bactérias é praticamente impossível,devido às características ecológicas doagente e a sua forma esporulada deresistência. O controle e profilaxia dasclostridioses devem-se basear em medidasadequadas de manejo e em vacinaçõessistemáticas de todo o rebanho.
De acordo com os últimos dados disponíveisdo Instituto Brasileiro de Geografia(www.sidra.ibge.gov.br), o Brasil possui umefetivo bovino de cerca de 205.886.244cabeças, 10.401.449 cabeças de caprinos e16.019.170 de ovinos, no ano de 2006,sendo um dos principais mercados
consumidores de vacinas contraclostridioses no mundo. Como discutido porLobato e Assis (2000b), em relação àsvacinas clostridiais, não há controle oficialque ateste quanto à inocuidade, esterilidadee potência de todos os antígenos presentesnas vacinas, com exceção de C. chouvoei eo toxóide botulínico tipos C e D, que sãosistematicamente avaliados pelo MAPA,sendo a qualidade dos demais antígenos,deixados a cargo das próprias indústrias.
A vacinação contra enterotoxemia causadapor C. perfringens, desde que realizada comvacinas comprovadamente eficientes, é aforma de profilaxia indicada para se evitaros prejuízos econômicos causados peladoença, pois os animais estão sujeitos àinfecção em todas as etapas de sua vidareprodutiva, como mostrado por Lobato etal. (2000b).
O processo de produção de vacinas parasaúde animal tradicionalmente se baseia emvacinas inativadas ou vivas atenuadas. Apartir dos anos 70, estudos utilizando abiologia molecular abriram as portas paranovas tecnologias de produção de vacinas,as vacinas recombinantes. O mercadoveterinário já dispõe de vacinas comtecnologia recombinante para algumasdoenças e estas podem oferecer um novoperfil de eficiência contra as enfermidadesdos animais. Dados publicados pela MerialSaúde Animal (Últimas, 2007) mostram aeficácia de vacinas recombinantes, jádisponibilizadas pela indústria veterinária,produzidas contra leucemia felina ecinomose.
A toxina recombinante produzida nestetrabalho se mostrou uma forte candidatapara a produção de uma vacina contraenterotoxemia causada pela toxina épsilonde C. perfringens tipo D. O sistema utilizadopara a produção da toxina recombinante emEscherichia coli permite trabalhar emcondições aeróbicas, e, a utilização diretada fração insolúvel da toxina recombinanteapresenta a vantagem de diminuir os custosde produção, evitando processos depurificação e concentração da proteína,além de ser eficiente na estimulação debons níveis sorológicos de antitoxina em
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animais, podendo ser o sistema melhoradoconforme as necessidades e demandas daindústria.
5. CONCLUSÕES
A estratégia de clonagem e expressão degene etx, que codifica a toxina épsilon deClostridium perfringens tipo D, emEscherichia coli, apresentou-se eficiente,produzindo altas concentrações de toxinarecombinante, com identidade antigênica efarmacológica frente à toxina nativa.
A toxina épsilon recombinante produzidaneste trabalho foi imunogênica, induzindoaltos níveis de anticorpos em animaisvacinados, mostrando-se forte candidata auma vacina contra enterotoxemia causadapor Clostridium perfringens tipo D.
6. PERSPECTIVAS FUTURAS
Avaliação da resposta imunológica da toxinaépsilon recombinante, produzida nestetrabalho, nas espécies-alvo: caprinos,ovinos e bovinos.
Produção de outras toxinas recombinantesde Clostridium perfringens, como as toxinasalfa e beta, com o objetivo de prepararvacinas polivalentes contra enterotoxemiasproduzidas por essa bactéria.
Estudo imunológico do pool de proteínasrecombinantes em animais.
Otimização do processo de produção datoxina épsilon recombinante em escalaindustrial.
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