Sistemas de clonagem em eucariotos e procariotos

Profa. Dra. Irene Soares (isoares@usp.br)FCF/USP - 2010

Isolamento de DNA

Clonagem de DNA

Transformação pelo DNA

Seleção e análise derecombinantes

Expressão de proteínasrecombinantes

Purificação de proteínasrecombinantes

Aplicações da tecnologiado DNA recombinante

Ferramentas básicas

• Gene de interesse

• Célula hospedeira (bactérias)

• Vetores de clonagem e expressão

• DNA ligases

• Enzimas de restrição

• Aparato de eletroforese de DNA

• Sondas de DNA, Primers

• DNA genômico

• cDNA

• Produto de PCR

• Gene sintético

Podem ser utilizados para construção de Bibliotecas de DNA

Isolamento de DNA

Vetores de clonagem

• Plasmídios: fragmentos de até 10 Kb

• Fago lambda: fragmentos de 5-20 Kb

• Cosmídios: fragmentos de 20-50 Kb

• BAC (Bacterial Artificial Chromosomes): 100-500 Kb

• YAC (Yeast Artificial Chromosomes): 100 Kb – 1Mb

De 1.000 até 20.000 pares de bases

Gene que codifica resistência a antibiótico

Origem de replicação

DNAexógeno

PlasmídioscomerciaispUCpGEMpMOS

Regiãopromotora

Componentes de um plasmídio

Sítio de Clonagem

DNA genômico, cDNA,Produto de PCR, Gene sintético

Sítio de Clonagem(polilinker)

Plasmídio para clonagem de produtos de PCR

Ligação

Plasmídio linearizadoDNA ligase

Plasmídios recombinantesDNA cromossômico

Gene a se clonado

Transferência do plasmídio para uma linhagem de bactéria

Métodos de Transformação pelo DNA

Tratamento comCloreto ou Fosfato de Cálcio

Transformaçãodireta por eletroporação

Bactérias(Escherichia coli)

Incubação no gelo

Choque térmico (42ºC)

E. coli competente

+ DNA plasmidial

Métodos de seleção de recombinantes(bactérias transformadas)

Bactérias: Baseado na resistência a antibiótico

BactériaSEM DNA plasmidial

BactériaCOM DNA plasmidial

Plasmídioreligado

(sem inserto)

Plasmídiocom inserto

IPTG + X-gal

Seleção azul e branca

Gene lacZ

Inserto

Colônias brancas

Não há expressão da -galactosidase

Gene lacZ

Colônias azuis

Expressão da-galactosidase

Seleção com sondas de DNA

Cultura bacteriana: E. coli contendo o plasmídioFase estacionária (overnight)

Lise alcalina:

Obtenção de DNA plasmidial

Enzima Sítio de restrição Fonte

EcoRI G AATT C Escherichia coli RY13C TTAA G

NcoI C CATG G Nocardia corallinaG GTAC C

XbaI T CTAG A Xantomonas badriiAGATC T

SmaI CCC GGG Serratia marcescensGGG CCC

Análise de restrição

3 - OH

5 - fosfato

3 - OH

5 - fosfato

Gel de agarose

Eletroforese em gel de agarosecorado com brometo de etídeo

(exposto a luz UV)

Eletroforese em gel de agarose

HindIII

Plasmídionão digerido

Plasmídio

Inserto

(-)

ATGAGGGCATCCATCTTTCTCGCTCTTGCCATTCTCGTTATTACCGTTGTCGCTGCCCCTACCGATGATAAGGGACCTGAGGATCTGAAG90

TACTCCCGTAGGTAGAAAGAGCGAGAACGGTAAGAGCAATAATGGCAACAGCGACGGGGATGGCTACTATTCCCTGGACTCCTAGACTTC

È Ò Å Î ˜ É Â Å Â Å ˜ Â Ê È Ñ Ê Ê Å Å Ì Ñ Í Í Ò Ö Ì Í Í Â ÏÓ Ö Ç Ì Î É ‰ Í É Ì ˆ ‰ ˆ ˆ Ì ˆ Î Í Ì Â Ì È È Ò Í Â Ò È Œ ÒÍ Ö ˜ „  ‰  ‰ Œ „ ‰  † †  Œ  Œ Ì † Â Ó Á Ö Ñ Œ Ö Î Í Í

BstF5I SfaNI BbvI

HpyCH4IIITseI

Fnu4HI

BseMIIMnlI

AvaIIEcoO109IPpuMISau96I

NlaIVBsu36IDdeI

BstYISau3AI

DpnIBsmFIHpy188I

AlwI

Mapeamento de restrição

TG40

G G G G TA C A TG50

C T C T C A C G T G60

T T G CT GCAG T70

C A T G G C A T C C80

C G C A A A C A C A90

Sequenciamento do DNA

Bactérias, levedurasou baculovirus

Produção doantígeno in vitro

Transformação

Purificação

Expressão de proteínas recombinantes

Sistemas heterólogos de expressão

• Bactérias: Escherichia coli

• Leveduras: Sacharomyces cerevisiae,

Pichia pastoris

• Células de inseto (infectadas com baculovirus)

• Células de mamíferos

• Plantas

• Animais

Elementos genéticos essenciais em um vetor de expressão

Vetores indutíveis por IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)

Na ausência de IPTG Na presença de IPTG

Operon Lac

Subclonagem de genes em vetor para expressão de proteínas recombinantes em fusão com GST

Promotor Lac:Expressão em bactéria na presença de IPTG

Subclonagem de genes em vetor para expressão de proteínas recombinantes em fusão com His-tag

• Bactéria: Escherichia coli (diversas linhagens)• Vantagens: fácil manipulação, rápido crescimento,

alto rendimento de proteínas e baixo custo• Otimização da expressão:

- Curva dose-resposta do indutor, tempo e temperaturade indução

- Utilização de cepas de bactérias códon plus

Expressão de proteínas recombinantesem bactérias

Considerações gerais:

• Desvantagens:Formação de corpos de inclusão proteínas insolúveis e não funcionais- Solubilização - “Refolding” de proteínas

• Proteínas de fusão- Melhoram a solubilidade- Facilitam a purificação

Expressão de proteínas recombinantesem bactérias

Considerações gerais:

Proteínas solúveis

Corpos de inclusão

Cultura de bactérias (E. coli)

Indução com IPTGFase log: DO=0,4-0,6nm

Lise(cong./descong., sonicação, French press)

Purificação

Expressão da Proteína recombinante

Avaliar em SDS-PAGE: extrato total, precipitado e sobrenadante

Padronizar: Tempo, temperatura,curva-dose resposta de IPTG

Eletroforese de proteínas emgel de poliacrilamida

PM 1 2 3

116,0

66,2

45,0

35,0

25,0

18,4

Análise da expressão da proteína recombinante em SDS-PAGE

1. Extrato total (lisado bacteriano)2. Sobrenadante 3. Precipitado (corpos de inclusão)

Métodos de detecção de clones recombinantes

• Reconhecimento por anticorpos específicos

(ou anti-GST, anti-His)

• Função da proteína (ensaio enzimático)

• Seleção por PCR

Métodos de purificação de proteínas recombinantes

• Afinidade• Troca iônica• Fase reversa• Gel filtração

Extrato bacteriano

1ª. Etapa de purificação

Etapas de purificação de proteínas recombinantes

Etapa final depurificação

Subclonagem de genes em vetor para expressão de proteínas recombinantes em leveduras

(Pichia pastoris)

• Leveduras: Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris

• Otimização da expressão:

- Curva dose-resposta do indutor, tempo e temperaturade indução

- Otimização do códon: mutagênese

• Vantagens (Pichia pastoris): altos níveis de expressão, modificações pós-traducionais (glicosilação, pontes dissulfeto), secreção da proteína

Considerações gerais:

Expressão de proteínas recombinantes em leveduras

Aplicações da tecnologiado DNA recombinante: terapêutica

- Hormônio de crescimento humano e bovino (somatotrofina);- Insulina humana;- Calcitonina;- LH-RH- Somatostatina;- Gonadotrofina coriônica (HCG) e sérica (PMSG);- LH - Hormônio luteinizante bovino e suíno;- FSH – Hormônio folículo estimulante humano e bovino;- IGF-I (Fator de crescimento insulina dependente);- Interferon alfa, Interferon beta e Interferon gama -Toxina Botulinica;- Eritropoietina;- Glucagon- Fatores de coagulação: VIII e IX

Aplicações da tecnologiado DNA recombinante: diagnóstico laboratorial

- HIV, HCV, HBV, HEV, HTLV, EBV, CMV, Rubéola

- H. pylori, Mycobacterium tuberculosis, Treponema

pallidum, Chlamydia

- Toxoplasma gondii, Trypanosoma cruzi

Antígeno S

Purificação

Levedura

Vetor Vacina

Gene Ag S

Proteína

Aplicações da tecnologiado DNA recombinante: vacinas

Hepatite B

Pichia pastoris ouHansenula polymorpha

Aplicações da tecnologiado DNA recombinante: vacinas

Engerix-B SmithKline Beecham/US

Recombivax HB Merck/USA

GenHevac B Pasteur/France

Instituto Butantan

Aplicações da tecnologiado DNA recombinante: vacinas

Os subtipos 16 e 18 estão implicados como causa de 70% dos cânceres de colo de útero

HPV HPV

Dept. of ImmunologyWalter Reed Army Institute of ResearchWashington, DC