VARIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE AMINOÁCIDOS TOTAIS EM TECIDOS DE PLÂNTULAS DE CALOPOGONIUM CAERULEUM

Fardin, F. H.1; Camargos, L.S .1;Aguiar L.F.1 1Laboratório de Fisiologia Vegetal – Departamento de Ciências Naturais – Universidade Federal de Mato Grosso

do Sul/ UFMS – Campus de Três Lagoas, MS (flavio_fardin@hotmail.com ; lfaguiar@ceul.ufms.br)

Introdução:

O autotrofismo permite aos vegetais a síntese de compostos orgânicos a partir da incorporação

de compostos inorgânicos presentes no ambiente, produzindo assim todas as biomoléculas

necessárias para seu crescimento e desenvolvimento. Boa parte dessas, tais como enzimas,

aminoácidos e ácidos nucléicos, dependem da presença de Nitrogênio em sua composição

molecular.

O Nitrogênio está presente na natureza em várias formas, porém a maior parte está na

atmosfera em sua forma molecular (N2) muito estável e não assimilável por organismos superiores;

para isso, ele precisa ser convertido em amônia (NH3). O aparato enzimático para essa conversão é

encontrado apenas em alguns grupos bacterianos de vida livre ou simbionte, como alguns

representantes pertencentes ao gênero Rhizobium. A Amônia é a única forma assimilável em

moléculas orgânicas vegetais, daí o Nitrogênio pode seguir para os outros níveis tróficos na biosfera.

Ao longo da evolução algumas leguminosas estabeleceram relação simbiôntica com estas

bactérias, que se alojam em seu sistema radicular, formando estruturas altamente especializadas, os

nódulos. Sua formação se dá pela infecção do sistema radicular por bactérias, estas são fagocitadas

e incorporadas ao citoplasma; tal associação desencadeia expressão gênica diferenciada em ambos

os indivíduos, de tal modo que a bactéria assemelha-se a uma organela citoplasmática,

denominando-se bacterióide. O benefício mútuo neste caso dá-se pelo fornecimento de amônia para

o vegetal sintetizar suas biomoléculas e este fornece compostos orgânicos para a manutenção da

bactéria.

A amônia quase nunca esta presente no ambiente tendo em vista que esta é rapidamente

oxidada a nitrato e posteriormente a nitrito por ação de outras bactérias. Estes compostos

nitrogenados por sua vez podem ser aproveitados por outras plantas que os absorvem e os

convertem em amônia para então os incorporar em suas biomoléculas.

Do ponto de vista agrícola a fixação biológica do nitrogênio é um fator crítico, dado que à

presença de compostos nitrogenados no solo é extremamente importante para o processo produtivo

de diversas culturas, sendo a adubação nitrogenada responsável por grande parte do custo agrícola.

A adubação verde é praticada pela plantação de alguma leguminosa que através da associação

simbiôntica fixe grandes quantidades de nitrogênio atmosférico; em vez de ser colhida, a planta é

incorporada ao solo para que a matéria orgânica seja degradada e se torne disponível para outras

plantas a serem cultivadas.

O Calopogonium caeruleum, tribo Phaseolae, subfamília Papilionoideae, família Fabaceae é

uma leguminosa tropical de ampla distribuição e muito utilizada em adubação verde. Apresenta

rápido crescimento, tem aspecto de liana e possui uma razoável tolerância à seca (o que foi

observado em experimentos preliminares). No entanto dados sobre o metabolismo de nitrogênio

desta espécie são inexistentes. O Objetivo deste trabalho foi verificar o comportamento da espécie,

em fase de plântula, na presença de nitrato e em sua ausência, através da dosagem de aminoácidos

solúveis totais em folhas e raízes.

Materiais e Métodos Material biológico Calopogonium caeruleum (L.) – Fabaceae; Papilionoideae; Phaseolae.

Cultivo das plantas As sementes de Calopogonium caeruleum foram fornecidas pela EMBRAPA/CENARGEN, e

multiplicadas em área experimental do CPTL/UFMS. A germinação foi feita coletivamente em vaso de

4 litros contendo vermiculita, posteriormente as plântulas foram transplantadas individualmente para

tubetes de 0,5 litros e mantidos a pleno sol.

Todas as plantas foram tratadas com solução nutritiva incompleta (sem nitrato) durante duas

semanas para garantir sua nodulação. Posteriormente foram divididas em dois lotes: um continuou a

receber solução nutritiva incompleta e o outro passou a receber solução nutritiva completa (contendo

15 mM de nitrato) no período de 28 dias.

Coleta do Material Foram coletados semanalmente três exemplares de cada lote, sendo a primeira coleta feita

sete dias após o início dos tratamentos, e assim seguiram as sessões de tratamento até a quarta

coleta. As plantas tiveram seus tecidos separados em: folhas, raízes e nódulos (estes não utilizados

neste experimento), após isto foram armazenados em freezer para analises posteriores.

Extração de compostos nitrogenados Através do método descrito por Bieleski & Turner (1966) os compostos nitrogenados foram

extraídos para as análises posteriores dos tecidos de folhas e raízes.

Análise Quantitativa de Aminoácidos Método: Yemm & Cocking (1.955)

O seguinte método foi utilizado para quantificar as variações na concentração de aminoácidos

solúveis totais presentes nas folhas e raízes de plantas que receberam solução nutritiva completa e

as que receberam solução incompleta.

Foram utilizados 100µl de faze aquosa +990µl de água destilada+500µl de tampão

citrato+200µl de solução ninhidrina 5 % em metil Glicol+1 ml solução KCN 0,0002 M. O ensaio foi

aquecido a 100ºC por 20 minutos e, após, resfriado por 10 minutos em temperatura ambiente.

Acrescentou-se 1ml de álcool etílico 60%, seguindo-se leitura em espectrofotômetro em λ=570 nm.

Resultados

Aos 7 dias após o tratamento, observou-se que as plantas tratadas com solução nutritiva

incompleta (-N) apresentavam menor concentração de aminoácidos solúveis em folhas, 1,42

micromoles/gMF, enquanto as tratadas com solução nutritiva completa (+NO3-) apresentaram 1,69

micromoles/gMF. O mesmo padrão observou-se em raízes, onde -N apresentou 1,10

micromoles/gMF e +NO3-, 1,24 micromoles/gMF (tabela 1).

Aos 14 dias após o tratamento, observou-se, em folhas, 4,51 micromoles/gMF de aminoácidos

solúveis totais, em –N, enquanto +NO3-apresentou 4,55 micromoles/gMF. Em raízes, -N apresentou

3,36 micromoles/gMF de aminoácidos solúveis totais, ao lado de 2,18 micromoles/gMF, em +NO3-

(tabela 1) .

DAT Tratamento

Aminoácidos solúveis (folhas) Aminoácidos solúveis (raízes)

-N 1,42 1,10 7 dias N03

+ 1,69 1,24

-N 4,51 3,36 14 dias

N03+ 4,55 2,18

-N 0,89 0,31 21 dias

N03+ 0,53 0,13

-N 0,60 0,36 28 dias

N03+ 1,90 9,69

Tabela 1: Concentração de aminoácidos solúveis totais em tecidos de plântulas Calopogonium caeruleum. Os dados representam a média de 3 repetições. Dados expressos em em micromoles/gMF. DAT: dias após tratamento; -N: plantas recebendo solução nutritiva sem nitrogênio; +NO3-: plantas recebendo solução nutritiva com 15 mM de nitrato.

Aos 21 dias, em folhas, o conteúdo de aminoácidos em -N foi de 0,86 micromoles/gMF,

enquanto em +NO3- foi 0,53 micromoles/gMF. Nas raízes, observou-se 0,31 micromoles/gMF em -N e

0,13 micromoles/gMF em +NO3- (tabela 1).

Aos 28 dias, folhas de -N possuiam 0,60 micromoles/gMF de aminoácidos totais, enquanto

+NO3-apresentava 1,90 micromoles/gMF. Em raízes, 0,36 micromoles/gMF de aminoácidos totais

foram observados em –N, ao lado de 9,69 micromoles/gMF em +NO3- (tabela 1).

Discussão e Conclusões Pode-se observar que aos 7 dias as folhas não apresentaram uma grande diferença na

concentração de aminoácidos, sendo que as plantas tratadas com solução +NO3- apresentaram níveis

ligeiramente maior; o mesmo aconteceu com as raízes. Assim, observou-se que a exposição ao

nitrato refletiu-se positivamente no acúmulo de aminoácidos totais.

Aos 14 dias obteve-se uma similaridade nos valores obtidos para folhas de ambos os

tratamentos, senso que as tratadas com +NO3 tiveram uma concentração de aminoácidos levemente

maior; o mesmo não ocorreu com as raízes, pois as tratadas com a solução -N apresentaram níveis

maiores que as tratadas com +NO3.

Esta tendência foi observada por Camargos (2007), em Calopogonium muconoides, onde as

plantas tratadas com nitrato apresentaram maiores concentrações de aminoácidos totais em folhas e

raiz.

Os níveis de aminoácidos aos 21 dias de todos os tratamentos foram baixos se comparadas

com as anteriores. As folhas que receberam com solução -N tiveram a um desempenho ligeiramente

melhor do que as tratadas com a outra solução; as raízes também apresentaram níveis maiores nas

plantas que receberam -N. Estes resultados talvez sejam causados pelo aumento da síntese de

outros compostos nitrogenados no vegetal que resultaram na diminuição da concentração total de

aminoácidos, mas para comprovar isto outras análises deveram ser realizadas, porém deve se

considerar que todas as plantas utilizadas apresentavam um mesmo padrão de vigor. De acordo com

Bacanamwo & Harper (1997) e Vadez et al. (2000), o aumento nos teores de aminoácidos solúveis

totais, principalmente asparagina, desencadeia o processo que leva ao abandono da fixação em

presença de nitrogênio mineral.

Na amostragem feita aos 28 dias pode ser observada uma menor concentração de

aminoácidos em ambos tecidos das plantas tratadas com solução +NO3-, sendo nas folhas a

diferença ligeiramente maior e nas raízes bastante acentuada.

A conclusão deste trabalho revela que nas duas primeiras coletas as planta tratadas com +NO3-

obtiveram três dos melhores resultados. Na terceira todos os níveis foram baixos, sendo que as

plantas que receberam -N obtiveram um desempenho ligeiramente maior, esta redução talvez seja

resultado da síntese de outros compostos nitrogenados diferentes dos que foram estudados. Aos 28

dias o resultado das duas primeiras amostras se repetiu, onde plantas +NO3- obtiveram as maiores

níveis totais de aminoácidos.

Referencias Bibliográficas:

Bacanamwo, M.; Harper, J.E., 1997. The feedback mechanism of nitrate inhibition of nitrogenase activity in soybean may involve asparagines and/or products of its metabolism. Physiol. Plant. 100:371-377. Bieleski, R.L.; Turner, N.A., 1966. Separation and estimation of amino acids in crude plants extracts by thin-layer electrophoresis and chromatography. Anal. Biochem. 17: 278-293 Camargos, L.S., 2007. Alterações no metabolismo de compostos nitrogenados em Calopogonium mucunoides em resposta a diferentes fontes de nitrogênio:efeitos na nodulação e na fixação. UNICAMP: Tese de Doutorado, 128p.

Taiz,L.; Zeiger, E.. Fisiologia Vegetal. Editora Artmed. 3 ed.2004-Porto Alegre; cap.12; p. 285-307 Vadez, V.; Sinclair, T.R.; Serraj, R., 2000. Asparagine and ureide accumulation in nodules and shoots as feedback inhibitors of N2 fixation in soybean. Physiol. Plant. 110:215-223.

Yemm, E.W.; Cocking, E.C., 1955. The determination of amino acids with ninhydrin. Analyst. 80:209-213.