utilizaÇÃo de prÓpolis no controle da mastite bovina

JÚLIA GAZZONI JARDIM

UTILIZAÇÃO DE PRÓPOLIS NO CONTROLE DA MASTITE

BOVINA

MARECHAL CÂNDIDO RONDON - PR

2009



BOVINA

Trabalho de Graduação apresentado à Universidade Estadual do Oeste do Paraná, como parte das exigências do Curso de Zootecnia, para obtenção do título de “Zootecnista”.

MARECHAL CÂNDIDO RONDON - PR

2009



BOVINA

Trabalho de Graduação apresentado à Universidade Estadual do Oeste do Paraná, como parte das exigências do Curso de Zootecnia, para obtenção do título de “Zootecnista”.

APROVADO: 26 de novembro de 2009.

______________________________ __________________________

Profª PhD. Erika C. T.de Mello Peixoto D.Sc. Bruno Borges Deminicis

____________________________

Profª D.Sc. Regina Conceição Garcia

(Orientadora)

“Se o que você estiver fazendo não estiver lhe divertindo,

você não está fazendo coisa alguma.”

Carvalho e Nakagawa

”A ciência nunca resolve um problema sem criar pelo menos

outros dez.”

George Bernard Shaw

”O que somos é consequência do que pensamos.”

Buda

“Bom mesmo é ir à luta com determinação, abraçar a vida e

viver com paixão, perder com classe e viver com ousadia,

pois o triunfo pertence a quem se atreve, e a vida é muito

bela para ser insignificante.”

Charles Chaplin

ii

AGRADECIMENTOS

A UNIOESTE pela oportunidade de realização do curso.

Aos meus professores pelos ensinamentos transmitidos para minha formação

profissional.

Em especial às professoras DSc. Regina Conceição Garcia e DSc. Erika

Cosendey Toledo de Mello Peixoto, por fazerem do aprendizado não um trabalho, mas

um contentamento, obrigada pela paciência, atenção, amizade, apoio e

importantíssima colaboração e orientação no desenvolvimento deste trabalho.

Ao meu grande amigo Eduardo Luiz Heinzen por sua dedicação, incentivo,

companheirismo, sempre me apoiando em todo o trabalho, fazendo com que este se

concretizasse.

Ao Clauber Polese pela realização dos laudos laboratoriais das amostras de

própolis.

Ao Sr. Romeu Hepp por ceder seus animais e sua propriedade para a

realização desse trabalho.

A UNESP-Botucatu por ceder o Laboratório de Microbiologia do

Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública e pela realização das amostras

laboratoriais de CCS do leite.

Agradeço a Deus pelas pessoas que colocou em meu caminho por todo apoio

e carinho, por toda ajuda e incentivo.

Aos meus pais Jorge de Abreu Jardim e Ruth Regina Gazzoni Jardim por

acreditarem em mim, por tantas vezes que abdicaram de seus sonhos, para realizar os

meus.

Ao meu irmão Bruno Gazzoni Jardim por seu amor, alegria, carinho e apoio

incondicional nas horas difíceis de minha vida.

iii

Ao meu namorado Bruno Borges Deminicis pelo amor, carinho, paciência,

disposição a mim dedicados. Obrigada por estar sempre ao meu lado me divertindo,

me promovendo como pessoa, mulher e ser humano.

A Suzane Conceição Pantolfi Tostes pela amizade e pelos anos de

convivência na mesma moradia.

As minhas amigas por todas as experiências compartilhadas: Ângela Hinkel

(Anjinha), Andressa de Andrade (Xucra), Camila Hunoff (Camilão), Carine Ferreira de

Souza (Cacah), Carolina Mecabo, Elisângela Neuhaus, Fabiane Murakami e Taimara

Bernardi.

A todos aqueles que direta ou indiretamente contribuíram para a realização

deste trabalho.

MUITO OBRIGADA

iv

BIOGRAFIA

JÚLIA GAZZONI JARDIM, filha de Jorge de Abreu Jardim e Ruth Regina

Gazzoni Jardim, nasceu em 04 de novembro de 1986, na cidade do Rio de Janeiro,

Estado do Rio de Janeiro.

Cursou o 1º Grau no “Colégio Sagrada Família”, concluindo-o em dezembro

de 2000 e o 2º Grau na “Sociedade Educacional Professor Altair Mongruel – SEPAM”

em Ponta Grossa – Paraná, concluindo-o em dezembro de 2003.

Ingressou em 2006 no curso de graduação em Zootecnia da Universidade

Estadual do Oeste do Paraná – UNIOESTE, campus de Marechal Cândido Rondon

onde em dezembro de 2009 obteve o título de Zootecnista.

v

SUMÁRIO

AGRADECIMENTOS...................................................................................... iii

BIOGRAFIA..................................................................................................... v

SUMÁRIO........................................................................................................ vi

RESUMO........................................................................................................ viii

ABSTRACT..................................................................................................... ix

INTRODUÇÃO................................................................................................ 1

2. REVISÃO DE LITERATURA........................................................................ 4

2.1. Atividade antimicrobiana da própolis...................................................... 4

2.2. Atividade antiinflamatória da própolis..................................................... 5

2.3. Extrato de própolis................................................................................... 6

3. MATERIAL E METODOS.......................................................................... 9

3.1. Análise do Leite....................................................................................... 9

3.1. Preparo e análise do extrato de Própolis............................................... 12

3.1.2. Extrato Solúvel Seco (%)......................................................................

Erro! Indicador não definido.

3.1.3. Extrato Bruto Seco (mg/mL).................................................................


3.1.4. Compostos Fenólicos (%).................................................................... 12

3.1.5. Teor de Flavonóides em Quercetina (%)............................................. 12

3.1.6. pH........................................................................................................


vi

3.1.7. Propriedade Antioxidante....................................................................


3.1.8. Análises Microbiológicas......................................................................


3.2.1.6. Análise Estatística.............................................................................. 13

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................. 14

4.1. California Mastite Teste............................................................................ 15

4.2. Contagem de Células Somáticas.............................................................. 15

4.3. Análise Microbiológica do Leite............................................................... 18

4.4. Análise Físico-química da Própolis........................................................ 20

4.4.1. Peso Seco e Extrato Seco.....................................................................


4.4.2. Teores de Compostos Fenólicos e Flavonóides................................... 20

4.4.3 pH...........................................................................................................


4.4.4 Propriedade Antioxidante....................................................................... 21

4.4.5 Análise Microbiológica do Extrato Alcoólico de Própolis (EAP).............


5. CONCLUSÃO.............................................................................................. 22

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................ 23

vii

RESUMO

JARDIM, Júlia Gazzoni, Universidade Estadual do Oeste do Paraná, agosto de 2009, Utilização de própolis no controle da mastite bovina. Orientadora: Regina Conceição Garcia. Conselheiros: Erika Cosendey Toledo de Mello Peixoto, Bruno Borges Deminicis.

Mastite corresponde à inflamação da glândula mamária e apresenta-se de

forma clínica ou subclínica. O risco de resíduos de antibióticos no leite e a alta relação

custo / benefício, são fatores que devem ser considerados na implantação da terapia

durante a lactação. A tolerância e ausência de toxicidade conferem à própolis seu

valor medicinal quando administrada ao organismo animal. A mastite clínica foi

identificada pelo teste da caneca de fundo preto. A mastite subclínica foi identificada

pelo California Mastite Teste (CMT), contagem de células somáticas (CCS) e exame

microbiológico. Foram realizados quatro tratamentos: Grupo 1: uso de 5mL de extrato

alcoólico de própolis a 30%, por via oral, durante sete dias consecutivos; Grupo 2:

além do procedimento descrito no Grupo 1, foi utilizado 5mL de própolis a 30%

adicionado de glicerina líquida em igual volume na desinfecção por imersão dos tetos;

Grupo 3: uso de extrato alcoólico de própolis a 30% na desinfecção dos tetos e Grupo

4 (controle): os animais foram submetidos aos procedimentos de desinfecção por

imersão dos tetos antes e após a ordenha, rotineiramente empregados pela

propriedade. Os resultados foram analisados pelo teste não paramétrico Qui-quadrado

em nível de 5% de probabilidade, que demonstrou não ter havido diferença entre os

tratamentos.

Este estudo objetivou verificar as atividades terapêuticas e anti-sépticas da

própolis no controle de mastite bovina.

Palavras-chave: Agroecologia, leite, produção orgânica, biodinâmica.

viii

ABSTRACT

JARDIM, Júlia Gazzoni , Universidade Estadual do Oeste do Paraná, agosto de 2009, Propolis use in the control of the bovine mastitis. Adviser: Regina Conceição Garcia. Council member: Erika Cosendey Toledo de Mello Peixoto, Bruno Borges Deminicis.

Mastitis corresponds to the inflammation of the mammary gland and it comes of clinical

form or subclinical. The risk of residues of antibiotics in the milk and the high

relationship cost / benefit, they are factors that should be considered in the implantation

of the therapy during the nursing. The tolerance and toxicant absence check to your

propolis medicinal value when administered to the animal organism. The mastitis

clinical was identified by the test of the mug of deep black color. The mastitis

subclinical was identified by California Mastitis Test (CMT), somatic count cells (SCC)

and exam microbiological. Four treatments were accomplished: Group 1: I use from

5mL of alcoholic extract of propolis to 30%, orally, for seven consecutive days; Group

2: besides the procedure described in the Group 1, it was used 5mL of propolis to 30%

added of liquid glycerin in equal volume in the pre-dipping and post-dipping; Group 3:

use of alcoholic extract of propolis to 30% in the pre-dipping and post-dipping and I

Group 4 (it controls): the animals were submitted to the pre-dipping procedures and

post-dipping, routine used by the property. The results were analyzed by the technique

of variance non parametric in level of 5% of probability, that demonstrated not to have

had difference between the treatments.

This study aimed at to verify the therapeutic and antiseptic activities of the

propolis in the control of bovine mastitis.

Keywords: Agroecology, milk, production organic, biodynamic.

ix

INTRODUÇÃO

O consumidor em diferentes países exige, cada vez mais, alimentos naturais e

de melhor qualidade. O uso de promotores de crescimento, como os antibióticos, já

está proibido pelo Mercado Comum Europeu, na avicultura e suinocultura, desde

janeiro de 2006. Há necessidade de se restringir o uso de antibióticos em humanos e

na produção animal (MC CARTNEY, 2005). A demanda por produtos orgânicos e

naturais cresce a cada ano, só em 2008 o mercado mundial de orgânicos movimentou

41,5 bilhões de dólares e o Brasil acompanha essa tendência mundial. O incentivo à

produção orgânica foi uma das metas do governo em 2005 e vem sendo incentivada

até a atualidade (ALVES, 2005). Além disso, a implantação de medidas de qualidade e

controle vem contribuindo para os avanços na produção de alimentos, inclusive sobre

a cadeia leiteira. Mudanças nos conceitos de produção exigem que o leite seja

produzido em condições higiênicas, por animais sadios e que não estejam eliminando

resíduos de antibióticos ou de outras drogas; essa preocupação não é recente e tem

sido demonstrada já há muitos anos (LOPES e VIANA, 1996).

A fim de garantir produtos de melhor qualidade na mesa do consumidor, a

instrução normativa 51 (BRASIL, 2002), regulariza a produção, transporte e venda do

leite e produtos lácteos, e está sendo implantada pelo Ministério da Agricultura

Pecuária e Abastecimento nos diferentes estados brasileiros, devendo estar

efetivamente implantada até 2012. É constituída de regulamentos técnicos que

padronizam a produção de leite, determinando parâmetros de identidade (leite A, B e

C) e qualidade (requisitos microbiológicos e físico-químicos), além de proibir a

presença de resíduos de antibióticos no leite.

A mastite bovina compromete a qualidade do leite pelo risco de veiculação de

agentes patogênicos, causando grandes prejuízos para a atividade, sendo citada

como a principal doença da bovinocultura leiteira (BRITO e BRESSAN, 1996; VEIGA,

1998; PINTO et al., 2001; CARAVIELLO, 2004).

As maiores perdas estão relacionadas à diminuição da produção (BRITO e

BRESSAN, 1996; HOLANDA JÚNIOR et al., 2005), responsável por 66% das perdas

diretas. Porém, gastos indiretos com medicamentos, leite descartado, serviços

veterinários, descarte prematuro de animais, diminuição do valor comercial dos

animais e do leite quando se remunera por qualidade, além do aumento de mão de

obra para realização de tratamentos, devem ser contabilizados. Além disso, alterações

na composição do leite como diminuição de caseína, gordura e lactose (VEIGA, 1998),

prejudicam o rendimento industrial (BRIETZKE, 2004) e o tempo de conservação do

produto no comércio.

A mastite caracteriza-se por uma enfermidade multifatorial, e para ser

controlada, faz-se necessário rigoroso monitoramento dos animais, do homem,

ambiente, instalações, manejo de ordenha, entre outros (BRITO, 2000). Assim, esta

afecção apresenta difícil controle e erradicação. Quanto mais precocemente for

detectada, e tratada maiores chances de recuperação e menores chances de

proliferação e contágio entre os animais (SANTOS, 2005a). Animais doentes podem

contaminar outros por meio de resíduos nos equipamentos de ordenha, assim como

pelo contato direto entre eles (VEIGA, 1998; SANTOS, 2003). Portanto, toda

propriedade leiteira deve estabelecer rigoroso controle da mastite, incluindo a forma

subclínica (VEIGA, 1998), uma vez que o fator que mais contribui para o alto índice de

mastite é a duração das infecções (BRITO e BRITO, 2000).

Entretanto, a intervenção terapêutica nos casos subclínicos é pouco frequente

entre os produtores, principalmente pela necessidade de descarte do leite, quando se

utilizam produtos à base de antibióticos (SANTOS, 2000). A viabilidade econômica

desse tratamento só é demonstrada nos casos de apresentação simultânea de mastite

clínica em um ou mais quartos do mesmo animal, pois neste caso, já se teria o custo

do descarte do leite (SANTOS, 2005b). Além disso, ainda que se realize o tratamento

em apenas um quarto mamário, os outros também podem eliminar resíduos

antimicrobianos, devido à passagem sanguínea (BRITO, 2000). Assim, o tratamento

da mastite subclínica normalmente é protelado até o final da lactação e somente

instituído na fase de secagem. Portanto, o não tratamento da mastite subclínica tem

sido questionado, pois pode favorecer a evolução do quadro (SANTOS, 2005d), uma

vez que infecções crônicas são mais difíceis de se curar (BRITO e BRITO, 2000),

principalmente nas infecções por Staphylococcus aureus, que é o principal agente

causador de mastite bovina (SANTOS, 2000).

2

A necessidade de intervenção farmacológica é unânime, pois a taxa de cura

espontânea é baixa (SANTOS, 2005a) e as bactérias estão se tornando cada vez mais

resistentes aos tratamentos convencionais (SFORCIN, 1996; BRITO, 2000; TAYLOR

et al., 2002), porém, seu emprego gerou preocupação quanto à presença de resíduos

no leite.

Portanto, determinou-se a busca por soluções alternativas que tratem do

problema sem gerar descarte do leite. Se os meios alternativos forem eficientes no

controle da mastite e envolverem soluções naturais e ecologicamente favoráveis,

estarão em consonância com a demanda de um mercado consumidor cada vez mais

exigente, favorecendo inclusive maior lucratividade à atividade leiteira.

Ao longo da história o homem aprendeu a utilizar produtos naturais na

medicina e um dos produtos mais utilizados tem sido a própolis (PEREIRA, 2002). Sua

atividade antibacteriana (GARCIA et al.,2004a; GOULART, 2000; FERNANDES

JÚNIOR, et al., 1994, 2001, 2005) e antiinflamatória (ALMEIDA e MENEZES 2002;

ORSI et al., 2000; SFORCIN et al., 2002) foram extensivamente estudadas.

Porém, a despeito de diversos estudos comprovarem as propriedades

farmacológicas da própolis, a maioria ocorreu em condições controladas, geralmente

em animais de laboratório (MENEZES, 2005). Assim a necessidade de se realizar

ensaios clínicos capazes de determinar as doses a serem administradas e seu real

efeito in vivo, a campo, foi considerada (ALMEIDA e MENEZES 2002; MENEZES,

2005, LOGUERCIO et al., 2006 ). Além disso, a vegetação da região onde a própolis é

coletada (TEIXEIRA et al., 2006; FERNANDES JÚNIOR et al., 2006) e a genética da

rainha (GHISALBERTI, 1979), podem influenciar sua composição e sua potência,

justificando assim, estudos regionalizados.

Portanto, objetivou-se no presente estudo avaliar as atividades terapêuticas e

anti-sépticas da própolis no controle da mastite bovina.

3

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1. Atividade antimicrobiana da própolis

Os efeitos bacteriostáticos e bactericidas da própolis foram demonstrados tanto

em bactérias classificadas como Gram positivas como negativas, porém as primeiras

apresentaram maior sensibilidade (GOULART, 2000; PINTO et al.,2001; VARGAS et

al., 2005; FERNANDES JÚNIOR et al., 2006). Efeito bactericida sobre bactérias Gram

negativas foi demonstrado por Orsi et al.(2005a), entretanto esses autores ressaltaram

que os resultados foram dependentes da região na qual a própolis foi coletada. Assim,

a atividade biológica da própolis varia conforme seu tipo (PARK et al., 1998; ALMEIDA

e MENEZES, 2002).

A própolis foi classificada, por meio de marcadores químicos, objetivando a

padronização do produto nas diferentes regiões brasileiras (MARCUCCI, 1995).

Observou-se efeito inibitório sobre os gêneros Streptococcus, Staphylococcus,

Bacillus e Mycobacterium, principais bactérias causadoras da mastite bovina

(GRANGE e DAVEY, 1990; LANGONI et al., 1996; KOO et al., 2002; MIORIN et al.,

2003) e efeito parcialmente efetivo em gêneros como Pseudomonas, Escherichia,

Klebsiella, Proteus e Salmonella (GRANGE e DAVEY, 1990; LANGONI et al.. 1996;

FERNANDES JÚNIOR et al., 1995, 1997, 2005).

Murakami (2007) utilizou o extrato alcoólico de própolis (EAP) e mel como

veículo, via intramamária para o tratamento da mastite subclínica em bovinos. Além da

utilização do EAP a 30% com glicerina líquida no pré-dipping e pós-dipping.

Efeito bactericida em Salmonella foi demonstrado ainda, no controle de rações

avícolas (MAZZUCO et al., 1996) e em amostras coletadas de alimento contaminado,

causador de enterite em humanos (ORSI et al., 2005a).

4

Garcia et al. (2004a) avaliaram a utilização de extrato alcoólico de própolis em

rações de coelhos, encontraram conversão alimentar e ganho de peso relativamente

melhores quando estes foram alimentados com rações contendo 0,1% do referido

extrato. A adição de própolis em pequenas quantidades à ração melhorou o

desempenho dos animais, prejudicando os mesmos quando adicionada em níveis

mais elevados (0,3%), porém, não houve alteração dos parâmetros bioquímicos

séricos dos animais quando ministrada na referida concentração. Em outro trabalho

Garcia et al. (2004b) utilizaram o extrato alcoólico de própolis em rações de coelhos

para controle da Pasteurella mutocida, e verificaram uma redução significativa da

carga bacteriana, demonstrado por meio de UFC/mL, presente no lavado

traqueobrônquico desses animais. Estes resultados podem ter interferido na melhor

conversão alimentar e ganho de peso.

A susceptibilidade in vitro da Candida albicans à própolis, foi demonstrada por

Fernandes Júnior et al. (1994). No ano seguinte, apontaram pela ordem decrescente

de susceptibilidade, os seguintes microrganismos: Staphylococcus aureus , Cândida

albicans, Cândida guilliermondi, Cândida parapsilosis, Staphylococcus typhimurium,

Escherichia coli.

Azevedo et al. (1999) utilizaram própolis em candidíase oral em humanos e

verificaram sensibilidade em 95,71% das amostras utilizadas, porém observaram

resistência para as espécies C. albicans, C. tropicalis e C. glabrata. Entretanto, sua

eficiência em C. albicans e C. tropicalis foi demonstrada mais tarde (SFORCIN et al.,

2001).

Biachini e Bedendo (1998) demonstraram seu efeito inibitório em bactérias

fitopatogênicas quando inoculadas em meio de cultura contendo 10% de extrato

aquoso de própolis.

2.2. Atividade antiinflamatória da própolis

Mirzoeva e Calder (1996) atribuíram ao ácido caféico, à quercetina, à

narigenina e ao éter fenílico do ácido caféico as propriedades antiinflamatórias da

própolis. Substâncias conhecidas capazes de inibir a inflamação como ácido salicílico,

apigenina, ácido felúrico e galangina foram identificadas na própolis por Krol et al.

(1996). A supressão de prostaglandinas e leucotrienos de macrófagos (MIRZOEVA e

CALDER, 1996; BORRELI et al., 2002) e incremento na liberação de histamina (ORSI

et al., 2005b) seriam os principais responsáveis por este efeito.

5

A síntese de prostaglandinas e óxido nítrico foram associados a processos

inflamatórios e carcinogênicos (LIANG et al., 1999). Esses autores demonstraram a

capacidade inibitória de diversos flavonóides, dentre eles a apigenina, sobre a

transcrição de RNAm na síntese de ciclooxigenase, enzima necessária à formação

desses elementos. Entretanto, Orsi et al. (2000) avaliaram o efeito da própolis sobre

ativação do sistema macrofágico pelo oxigênio, os resultados obtidos apontaram

discreta elevação de H2O2 e inibição sobre a formação de óxido nítrico, dependente de

sua concentração.

Almeida e Menezes (2002) realizaram extensa revisão sobre o efeito

antiinflamatório da própolis in vitro e verificaram a necessidade de maiores estudos in

vivo.

Sforcin (1996) comprovou ação imunoestimulante da própolis, demonstrando in

vitro, aumento da atividade lítica das células “natural killer” sobre células tumorais de

ratos tratados com extrato hidroalcoólico de própolis a 10%.

Adicionalmente, os flavonóides têm ação antioxidante, minimizando a

peroxidação lipídica e o efeito dos radicais livres, esta propriedade foi confirmada pela

inibição da oxidação do peróxido de hidrogênio no luminol, evidenciado por meio de

espectrofotometria eletrônica (MARCUCCI et al., 2005; KROL et al., 1990).

Arteriosclerose, cardiopatias e derrames são alguns problemas relacionados às

oxidações dos ácidos graxos poliinsaturados e que aparecem com menor risco

naqueles que ingerem maiores quantidades de flavonóides, como alimentos vegetais e

vinho tinto (MARCUCCI et al., 2005).

2.3. Extrato de própolis

A Instrução Normativa n0 3, de 19/01/2001, do Departamento de Inspeção de

Produtos de Origem Animal, do Ministério da Agricultura e Abastecimento (IN3),

padroniza a composição, propriedades físicas, químicas, características sensoriais,

além de regulamentar condição para comercialização e consumo dos extratos de

própolis.

A própolis bruta é obtida com auxílio de coletores ou por raspagem manual e

realizam-se a remoção de impurezas como restos de madeira, abelhas, favo, folhas,

traças e outras inclusões mais presentes, quando o processo de obtenção se dá por

meio de raspagem (GOULART, 2000; SILVA, 2003b).

A trituração ou fragmentação foi utilizada por diversos autores (SARTORI et al.,

1994; SFORCIN, 1996; GOULART, 2000, DANTAS et al., 2006) a fim de aumentar as

superfícies de contato, apressando o processo de extração. A pulverização por alta

6

rotação não é recomendada por Silva (2003a), pois partes dos componentes ativos

podem ser destruídos pelo aquecimento e atrito entre a própolis e as pás do

equipamento (liquidificador).

Com a finalidade de prevenir o crescimento de microrganismos contaminantes,

conservam-se a própolis bruta, até o momento do preparo do extrato, a uma

temperatura que varia de -4oC a -10o C (SARTORI et al., 1994; SFORCIN, 1996;

GOULART, 2000; DANTAS et al., 2006).

A própolis bruta encontra-se no estado sólido e por ser uma resina, não é

solúvel em água (KONISHI et al., 2005). Para separar a porção resinosa da balsâmica,

ou seja, extrair os princípios ativos da própolis são necessários solventes e, de

preferência, inócuos ao consumo humano. Álcool de cereais e álcool neutro purificado

(obtido da cana de açúcar) podem ser utilizados, desde que contenham no máximo

70o GL (BRASIL, 2000), ou seja, 7 partes de álcool para 3 partes de água, o

equivalente a 70% de álcool absoluto (SILVA, 2003a), etanol (SAWAYA et al., 2004),

acetona (DANTAS et al., 2006), álcool etílico isolado (FERNANDES JÚNIOR, 1994;

SFORCIN, 1996; GOULART, 2000; ORSI et al., 2005) ou em associação a outras

substâncias como propilenoglicol, polissorbato 80, lauril sulfato de sódio (KONISHI et

al., 2005), também foram utilizados como solventes.

Extrato de própolis a 30% (30g de própolis bruta para cada 100 mL de

solvente) é frequentemente utilizado (GOULART, 2000; SFORCIN et al., 2001;

KONISHI et al., 2005; ORSI et al., 2005b). Porém maiores proporções, 50%, 60%,

70% e 80% também foram testadas (PARK et al., 1998; KOO et al., 1999; CUNHA et

al., 2004; VARGAS et al., 2004; DANTAS et al., 2006), sendo que maiores proveitos

foram obtidos a partir de extratos a 50% (SAWAYA et al., 2004) e 70% (CUNHA et al.,

2004). Park et al. (1998) verificaram que os extratos etanólicos de própolis entre 60 a

80% inibiram satisfatoriamente o crescimento microbiano e apresentaram ação

antioxidante a 70 e 80%. Essa proporção deverá ser obtida pela pesagem da própolis

e solvente, volume a volume ou peso a peso.

Porém essa percentagem se refere à base da matéria natural, sendo que a

base da matéria seca pode ser determinada por evaporação em estufa à 50oC durante

24 horas (GOULART, 2000), obtendo-se a concentração em g/mL. O Ministério da

Agricultura determina que o extrato deva apresentar no mínimo 11% de extrato seco,

também denominado de sólidos solúveis totais (SILVA, 2003a).

A maneira mais precisa de se quantificar compostos fenólicos e flavonóides é

utilizando-se cromatografia líquida de alta eficiência (FUNARI,2006). Entretanto,

técnicas como espectrometria pode representar uma alternativa mais simples, de

7

menor custo e possibilitar análises rápidas, de amostras numerosas em laboratórios

mais modestos (ADELMANN, 2005).

Considerando-se que a composição química da própolis é extremamente

complexa e que pode variar em até 300 componentes (CASTRO et al., 2001 e

TEIXEIRA, et al, 2006), e considerando-se ainda que os compostos fenólicos e

flavonóides têm sido responsabilizados pelas principais atividades terapêuticas da

própolis (GHISALBERTI, 1979; GRANGE e DAVEY, 1990; MARCUCCI, 1995; PARK

et al 2000; MARCUCCI, et al. 2005; ANDRÉA, et al., 2005).

Para realizar a infusão do extrato de própolis, o frasco deve ser protegido do

calor e luz solar direta (SARTORI et al., 1994; FERNANDES JÚNIOR, 1995; GARCIA

et al., 2004a e b) a fim de se prevenir foto degradação. Entretanto, CUNHA et al.

(2004) não observaram efeito da luminosidade sobre a extração dos teores fenólicos

totais, que variou de 6,41 e 15,24% em extratos etanólicos (70% volume para volume)

obtidos pela maceração da própolis.

A agitação frequente em tempos variados foi realizada por GARCIA et al.

(2004a e b), três vezes ao dia (FERNANDES JÚNIOR, 1994) ou a cada três dias

(SILVA, 2003a). Para isso utiliza-se pá ou colher de material atóxico e inerte como

madeira, plástico (poliamida) ou aço inox (SILVA, 2003a). Esse período de infusão

pode variar de 7 dias (FERNANDES JÚNIOR, 1994; SFORCIN, 1996; GOULART,

2000), 10 a 30 dias (CUNHA et al., 2004, KONISHI et al., 2005), 35 a 45 dias (SILVA,

2003a). Após a última agitação, SILVA (2003a) recomendou deixar decantar por três

dias ou mais e remover com auxílio de sifão o sobrenadante. Realiza-se a seguir a

filtragem, embalagem e rotulagem do extrato, que deve possuir no mínimo 11% de

extrato seco (BRASIL, 2000).

Os primeiros resultados referente à qualidade da própolis foram os publicados

por Bankova et al. (1992), Bonvehi e Coll (1994) e Bonvehi et al. (1994). No Brasil,

utilizam-se as normas do “Regulamento Técnico de Identidade e Qualidade do Extrato

de Própolis”, presentes na normativa Nº. 03, de 19 de Janeiro de 2001 do Ministério da

Agricultura, Pecuária e Abastecimento - MAPA (BRASIL, 2001), que visa manter a

qualidade do extrato alcoólico de própolis brasileiro e determinar os requisitos mínimos

de qualidade destinada ao comércio nacional.

8

3. MATERIAL E METODOS

O presente estudo foi realizado na Granja Hepp, caracterizada como sistema

familiar, no município de Marechal Cândido Rondon na latitude de 24º33’40”S,

longitude 54º04’12” W e altitude média de 420m (IAPAR, 1978). A propriedade

apresenta área de 5,4 hectares destinada ao pastejo, dividida em 27 piquetes

formados por Tifton 85 (Cynodon sp).

Os trabalhos foram iniciados em Novembro de 2007 e finalizados em Fevereiro

de 2008. Avaliou-se 288 quartos mamários em 72 fêmeas pluríparas da raça Holandês

Preto e Branco e seus cruzamentos, entre três a seis lactações e em fase inicial da

lactação, até 90 dias do parto, com produção média diária de 20 litros de leite por

animal. Os animais foram ordenhados duas vezes ao dia por meio de ordenhadeira

mecânica canalizada e balde ao pé.

Foram excluídos todos os animais livres de mastite ou portadores da forma

clínica da doença. Para tanto, realizaram-se exames clínicos e complementares O

exame clínico especial foi realizado em duas etapas, antes e após a ordenha,

objetivando detectar diferenças no tamanho ou formato dos tetos, aumento de

linfonodo retro-mamário, reações inflamatórias, atrofia do aparelho mamário, entre

outros sinais

3.1. Análise do Leite

Inicialmente, foram utilizados teste da caneca de fundo preto e Califórnia

Mastite Teste (CMT) no diagnóstico da mastite clínica e subclínica respectivamente.

Optou-se pela realização do CMT por ser considerado um exame eficiente e prático

9

para ser executado durante a ordenha (VEIGA, 1998); sendo amplamente utilizado no

diagnóstico da mastite subclínica e se baseia na presença de células somáticas no

leite (SPEXOTO, 2003). O teste da caneca de fundo preto foi utilizado antes da

primeira ordenha do dia, a partir da coleta dos três primeiros jatos de leite de cada

quarto mamário, em um recipiente de fundo preto, para pesquisa de grumos, coágulos,

pus ou outras alterações.

O Califórnia Mastite Teste (CMT) foi realizado em recipiente plástico, com

quatro compartimentos iguais de 1,5cm de altura, onde foram coletados 2mL de leite

de cada quarto mamário separadamente. Foi adicionado, em igual volume, reagente

próprio (Lauril sulfato de sódio a 3%), detergente aniônico corado com Bromocresol

púrpura, e por meio de movimentos circulares realizou-se a mistura durante 20

segundos (SCHALM e NOORLANDER, 1957). O resultado foi utilizado para classificar

os animais em 4 categorias: 0( zero) representa todos os animais cujos exames não

apresentaram reação; 1 atribuído de acordo com leve reação e formação de gel

(escore +), 2 para formação mais espessa com mamilo central (escore ++) e 3

formação de gel muito espesso aderente ao fundo do recipiente (escore +++). O

quarto mamário foi considerado positivo para mastite subclínica quando apresentou

escores 1+, 2+ ou 3+ e negativo na ausência de reação.

Para as amostras de leite provenientes dos tetos que apresentaram resultados

positivos ao CMT, realizou-se a Contagem de Células Somáticas (CCS), além da

análise microbiológica individual. Para tanto, as amostras foram encaminhadas ao

Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública da Faculdade de Medicina

Veterinária e Zootecnia da Universidade Estadual Paulista Campus de Botucatu.

Para a CCS utilizou-se aparelho eletrônico Somacount 300 (Bentley), e valores

maiores ou iguais a 200 mil células somáticas por mililitro de leite foram considerados

positivos para mastite subclínica, de acordo com Ruegg (2008).

O controle microbiológico foi realizado a partir de amostras de leite de cada

quarto mamário separadamente. Para realizar a coleta de leite e posterior isolamento

dos microrganismos presentes nas amostras de leite, as mãos do coletor foram

lavadas, desinfetadas (álcool 70%) e enluvadas. As tetas foram lavadas com água

para remoção de sujidades provenientes de camas, poeira, fezes, etc. e procedeu-se

secagem pelo uso de papel toalha. Posteriormente, foi realizada a desinfecção das

extremidades das tetas com algodão embebido com álcool 70%, conforme

recomendações de Brito e Brito (1999).

As coletas de leite foram realizadas antissepticamente, em frascos estéreis,

transportadas sob refrigeração em caixa térmica à temperatura de 4-5 °C e mantidas

congeladas à -18 °C. Após o término do período de coleta, as amostras congeladas

10

foram enviadas ao laboratório para realização da cultura, de acordo com Brito e Brito

(1999).

O controle microbiológico das amostras de leite de cada quarto mamário foi

realizado separadamente e posterior isolamento dos microrganismos presentes em

cada coleta. As coletas de leite foram realizadas assepticamente, em frascos estéreis,

mantidas refrigeradas à temperatura de 4-5 oC e enviadas ao laboratório de

microbiologia do Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública da UNESP,

Botucatu – SP em 24 horas para realização da cultura de acordo com Brito e Brito

(1999).

Neste laboratório, foram realizados cultivos microbiológicos com 0,1 mL de leite

em placas de Petri contendo meios de ágar-sangue ovino a 5% e Mac Conkey ágar,

incubando-se a 37°C. Realizaram-se as leituras das placas às 24, 48 e 72 horas,

observando-se a morfologia das colônias, além da quantidade desenvolvida.

Adicionalmente as amostras foram examinadas em lâminas de vidro, coradas

pelo método de Gram, para verificar-se ao microscópio ótico, além da morfologia

bacteriana sua característica morfotintorial. Os microrganismos foram repicados para

meio de caldo cérebro-coração (BHI) para realização das provas taxonômicas,

segundo Krieg e Holt (1984), Carter e Cole Junior (1990) e Quinn et al. (1994).

Todos os exames supracitados foram realizados no momento imediatamente

anterior ao início dos tratamentos (dia zero) e posteriormente, nos dias sete e 14 após

o início dos tratamentos. A eficácia da desinfecção dos tetos foi avaliada de acordo

com National Mastitis Concil (HOGAN et al.,1990).

Realizaram-se quatro tratamentos, onde os animais do grupo (1) foram

submetidos ao tratamento da mastite subclínica pelo uso de 10mL de extrato alcoólico

de própolis (EAP) a 30%, por via oral, durante 7 dias consecutivos, após cada

ordenha. Nos animais do grupo (2), além do procedimento descrito para o grupo 1, foi

utilizado 5ml EAP adicionado à água filtrada e fervida em igual volume para imersão

dos tetos, no momento imediatamente anterior ao procedimento da ordenha. Este

procedimento repetiu-se após a ordenha, entretanto, para esse momento, substituiu-se

o veículo aquoso por glicerina líquida em igual volume (5 mL). O tempo de imersão foi

de aproximadamente 30 segundos, alcançando todo comprimento dos tetos. Para os

animais constituintes do grupo (3), administrou-se álcool de cereais (10 mL), via oral,

por sete dias consecutivos, e os animais constituintes do grupo controle-testemunha

(4) não foram submetidos a nenhum tipo de tratamento, a não ser aquele

rotineiramente utilizado pela propriedade (limpeza das tetas com água de torneira e

secagem com toalha; antes da ordenha).

11

3.1. Preparo do extrato alcoólico de própolis

A própolis bruta foi coletada por raspagem, na região do município de Marechal

Cândido Rondon – PR; foi fragmentada, pesada e mantida à temperatura de -4°C até

o momento do preparo do extrato (SARTORI et al. 1994; SFORCIN, 1996; GOULART,

2000; DANTAS et al., 2006).

Para obtenção dos princípios ativos foi utilizado como solvente, álcool de

cereais na proporção de 30%, pesando-se tanto a própolis quanto o solvente, para

(GOULART, 2000; SFORCIN, et al. 2001; KONISHI, et al., 2005; ORSI, et al. 2005b).

O extrato foi acondicionado em frascos de coloração âmbar e mantido ao abrigo da luz

(SARTORI et al., 1994; FERNANDES JÚNIOR, 1995; GARCIA et al, 2004a e b).

Durante o período de extração procedeu-se agitação diariamente, em tempo de

trinta segundos, uma vez ao dia, durante os 30 dias consecutivos. Após esse período

o extrato de própolis foi obtido por meio de filtração. As análises físico-químicas foram

executadas de acordo com Orsi et al. (2000) e realizadas no laboratório de Tecnologia

de Produtos de Origem Animal (TPOA) da Universidade Estadual do Oeste do Paraná

(UNIOESTE)

3.1.2. Compostos Fenólicos (%)

Para a determinação da porcentagem de compostos fenólicos, foram pesados

2,5mL dos EAP (P1). Em seguida adicionou-se 7mL de álcool etílico e 0,5mL de

acetato de chumbo a 10%. A solução foi agitada e deixada em repouso por 24 horas,

em temperatura ambiente. Após este período de tempo, a solução foi filtrada em papel

de filtro, previamente pesado (P2), e mantido a temperatura ambiente por 12 horas.

Em seguida, o papel de filtro foi colocado em estufa a 50ºC por uma hora e novamente

pesado (P3). A porcentagem de compostos fenólicos foi determinada através da

seguinte fórmula:

Compostos Fenólicos (%) = ((P3 – P2)/P1) x 100

3.1.3. Teor de Flavonóides em Quercetina (%)

Uma alíquota de 0,4mL foi retirada dos EAP e transferida para balão

volumétrico de 25mL. Em seguida, acrescentou-se 0,5mL de cloreto de alumínio a 5%

em metanol absoluto, completando-se o balão com metanol. A solução foi agitada e

colocada em repouso por 30 minutos ao abrigo de luz. Decorrido este período de

tempo, a solução foi colocada em espectrofotômetro de U.V. a 425nm, para leitura da

12

absorbância. Para zerar o aparelho, foi utilizado metanol absoluto. Para o preparo do

padrão, foi utilizada quercetina: 0,2mg/mL de quercetina foi transferida para balão

volumétrico de 25mL, acrescentando-se a seguir 0,5mL de cloreto de alumínio em

metanol a 5%. O balão foi completado para 25mL com metanol. A solução foi agitada

e mantida em repouso por 30 minutos ao abrigo de luz (POPOVA, 2005). O teor de

flavonóides totais em quercetina foi determinado de acordo com a fórmula:

Teor de Flavonóides (mg/mL) = Leitura da amostra x Massa do Padrão

Leitura do padrão x Volume da amostra

3.2. Análise Estatística

O delineamento experimental adotado foi o inteiramente casualizado, com

quatro tratamentos e 72 repetições ( ver se são os animais ou os tetos)

Para a análise estatística dos dados foi aplicado o teste não paramétrico Qui-

quadrado em nível de 5% de probabilidade.

A distribuição da ocorrência do CMT, segundo a intensidade nos grupos e

momento de avaliação, foi apresentada por meio da estatística descritiva envolvendo a

frequencia absoluta e percentual (ZAR, 1999).

O estudo do CMT e da CCS segundo os grupos e os tetos dos animais foi

analisado pela técnica de variância ANOVA não paramétrica para o modelo de

medidas repetidas em grupos independentes, complementada com os respectivos

testes de comparações múltiplas, no nível de 5% de significância (ZAR, 1999). A

indicação da significância foi realizada por meio de letras colocadas ao lado das

medidas descritivas [mediana (valor mínimo – máximo)]. Duas medidas seguidas de

uma mesma letra minúscula não diferem (P> 0,05) quanto aos respectivos grupos

fixados o momento de avaliação, e duas medianas seguidas de uma mesma letra

maiúscula não diferem (P> 0,05) quanto aos respectivos momentos de avaliação

dentro do grupo considerado.

A análise não paramétrica de Spearman à 5% de significância foi utilizada para

calcular a correlação entre CMT e CCS.

13

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Há muito a mastite bovina vem sendo citada como principal doença da

bovinocultura leiteira (BRITO e BRESSAN, 1996; VEIGA, 1998; PINTO et al., 2001;

CARAVIELLO, 2004). Seu impacto econômico permite considerá-la como a mais

onerosa afecção desta atividade (BRITO e BRITO, 2000; CARAVIELLO,2004),

apresentando-se amplamente disseminada nos rebanhos (BRITO e BRITO, 2000).

Corroborando com esses achados, o presente estudo avaliou 72 fêmeas bovinas em

lactação e observou incidência em 98,70% dos animais.

Esta enfermidade pode apresentar-se sob a forma clínica e subclínica, neste

estudo foram observados sinais clínicos como hiperemia, edema e dor à palpação nas

glândulas afetadas por mastite clínica diferindo das ocorrências subclínicas, onde o

diagnóstico exige exames complementares. Porém, a forma subclínica representa

maior impacto na produtividade leiteira devido a sua maior prevalência (VEIGA, 1998;

RIBAS, 1999; FONSECA e SANTOS, 2000; BRITO e BRITO, 2000; SANTOS, 2005a).

Corroborando com isso, observou-se menor prevalência da forma clínica (5,26%) em

relação à subclínica (94,73%). Ribas (1999) verificou que 20 % das fêmeas em

produção de um determinado rebanho, apresentaram mastite em um ou mais quartos

do úbere, sendo 97% sob a forma subclínica. Fonseca e Santos (2000) verificaram

que em média, 40% dos animais do rebanho brasileiro apresentam mastite subclínica

e que o ideal seria não ultrapassar 15 a 20%.

14

4.1. California Mastite Teste (CMT)

Com relação aos resultados referentes ao Califórnia Mastite Teste, para o

presente experimento, não foram demonstrados diferenças entre os grupos e o

momento de avaliação (Tabela 1). Porém, Murakami (2007) observou uma diminuição

de 45% no grau de infecção do teto através do CMT, após sete dias de tratamento.

Tabela 1. Medidas descritivas (média aritmética, desvio padrão e mediana) em

porcentagem do Califórnia Mastite Teste segundo o grupo e o momento de avaliação

(T0 - imediatamente anterior ao tratamento; T7 - sete dias e T14 - 14 dias após o início

dos tratamentos).

Momentos de avaliaçãoGrupo T0 T7 T14

Oral3,25 ± 0,89 3,00 ± 1,15 2,60 ± 1,37

4,00 aA 3,00 aA 2,00 aA

Oral e Imersão3,25 ± 0,88 3,62 ± 1,03 2,81 ± 1,28

3,50 aA 4,00 aA 3,50 aA

Álcool3,32 ± 0,85 3,04 ± 1,09 2,56 ± 1,22

4,00 aA 3,00 aA 2,00 aA

Controle3,46 ± 0,71 3,30 ± 0,92 2,84 ± 1,12

4,00 aA 4,00 aA 3,00 aAMédias com mesma letra na coluna e linha não diferem entre si

Médias com letra diferente na coluna e linha diferem entre si

4.2. Contagem de Células Somáticas

A contagem de células somáticas é parâmetro para avaliação da qualidade do

leite (BRASIL, 2002) e está diretamente relacionada ao grau de infecção da glândula

mamária. Corroborando com estas informações, o presente estudo verificou que em

174 amostras de leite que apresentaram valores de CCS acima de 200 mil células/mL,

86,20% apresentaram infecção mamária clínica.

Costa et al (2007) consideraram que animais livres de mastite apresentam

contagens de até 100 mil células/mL. Já Veiga (1998), Thiers (1999), Brito e Brito

(2000), Souza (2005) e Ruegg (2008) consideraram valores acima de 200 mil

células/ml, indicativos de mastite subclínica. Fonseca e Santos (2000), admitiram o

intervalo de 200 a 400 mil células/ml; entretanto Paschoal et al. (2003) e Spexoto

(2003), indicaram apenas valores acima de 300 mil células/mL. Desta forma, o

15

presente estudo considerou o limite de 200 mil células/mL, como limite máximo para

animais sadios.

Com relação ao diagnóstico de infecção mamária, considerou-se que a síntese

e secreção do leite nos alvéolos mamários é um processo praticamente asséptico, e

que em geral a principal via de infecção é a ascendente pelo canal do teto

(HILLERTON, 1996). Porém, uma vez alcançado o interior da glândula mamária,

pequeno número de microrganismos já é suficiente para desencadear a infecção, já

que as condições são extremamente favoráveis ao seu desenvolvimento e

proliferação. Dessa forma, assim como considerado por Sargeant et al. (2001), para o

presente estudo, o mínimo de crescimento bacteriano observado nos meios de cultivo,

foi relacionado à ocorrência de infecção.

As medidas descritivas referentes à CCS foram avaliadas entre os grupos

(Tabela 2); observando-se diminuição significativa apenas após 14 dias do tratamento,

entretanto, essa diminuição ocorreu dentro dos grupos avaliados.

Em relação ao momento anterior aos tratamentos (T0), observou-se diminuição

na contagem de células somáticas em todos os grupos, inclusive no grupo controle, e

este fato provavelmente ocorreu devido aos maiores cuidados higiênicos despendidos

pelos ordenhadores, durante o período experimental. Provavelmente este fato foi

decorrente da presença de nossa equipe no ambiente da ordenha.

Tabela 2. Medidas descritivas (média aritmética, desvio padrão e mediana) números

absolutos da contagem de células somáticas (CCS x 10³) segundo o grupo e o

momento de avaliação (T0 - imediatamente anterior ao tratamento; T7 - sete dias e

T14 - 14 dias após o início dos tratamentos).

Momentos de avaliaçãoGrupo T0 T7 T14

Oral583,60 ± 668,61 574,67 ±693,74 134,32 ± 168,76

395,50 aB 314,50 aB 67,00 aA

Oral e Imersão

514,00 ± 677,01 886,53 ± 1087,64 141,37 ± 190,60263,50 aB 482,50 aC 41,00 aA

Álcool543,08 ± 547,59 589,68 ± 696,91 158,64 ± 426,59

394,00 aB 0394,00 aB 49,00 aA

Controle535,03 ± 511,93 528,46 ± 510,03 97,96 ± 111,71

402,50 aB 445,50 aB 65,00 aAMédias com mesma letra na coluna e linha não diferem entre si

Médias com letra diferente na coluna e linha diferem entre si

16

Murakami (2007) utilizando própolis para controle da mastite bovina observou

uma diminuição na CCS de 83% dos tetos após sete dias de tratamento quando

submetidos à imersão com própolis. Corroborando com o presente estudo, que

apresentou uma diminuição de 84,45% na CCS após quatorze dias de tratamento,

porém, nenhuma diferença significativa entre os grupos foi encontrada.

O manejo de desinfecção antes e após a ordenha e medidas de higiene como

manter tetos limpos e secos são medidas que contribuem profilaticamente para

amenizar o problema. A imersão de tetos em soluções anti-sépticas pode reduzir

novas infecções em 50 a 90% dos casos (PEDRINI e MARGATHO, 2003), desta

forma, um manejo preventivo utilizando o EAP a 30% na imersão dos tetos antes e

após a ordenha, demonstrou efetivo no controle da mastite.

4.3. Correlação entre CMT e CCS

Os resultados provenientes do CMT correspondem às variáveis qualitativas

ordinárias e os da CCS são variáveis quantitativas (Tabela 3), para se efetuar os

cálculos de correlação (r), procedeu-se a codificação da CCS conforme Barbosa, et al.

(2002) e realizou-se análise não paramétrica de Spearman à 5 % de significância.

Tabela 3- Correlação do Califórnia Mastite Teste (CMT) e Contagem de Células

Somáticas (CCS) nos momentos avaliados: imediatamente anterior ao tratamento

(T0), sete dias (T7) e 14 dias (T14) após o início dos tratamentos

Associação Oral (28) Prop+Pre (32) Álcool (25) Controle (26)

CMTT0xCCST0 0,839(P<0,01) 0,814(P<0,01) 0,823(P<0,01) 0,856(P<0,01)

CMTT7xCCS T7 0,839(P<0,01) 0,580(P<0,01) 0,721(P<0,01) 0,838(P<0,01)

CMTT14xCCST14 0,532(P<0,05) 0,588(P<0,01) 0,265(P>0,05) 0,124 P>0,05)

A correlação desses exames foi demonstrada em bovinos (BRITO et al., 1997;

BARBOSA et al., 2002), bubalinos (JORGE et al., 2005), caprinos (SILVA et al., 2001),

assim como pelo presente experimento, onde apresentou valores oscilantes, conforme

o momento de avaliação. Esses valores corresponderam a 0,71, 0,61 e 0,32 para os

momentos imediatamente anterior à aplicação dos tratamentos, 7 e 14 dias após,

respectivamente.

Correlações variadas também foram registradas por Brito et al., (1997). Esses

autores relataram que, apesar do CMT ser um ótimo teste para o diagnóstico de

mastite subclínica, possui caráter subjetivo e dependente da interpretação de quem o

17

realiza. Relataram que sua classificação em escores pode ocasionar tanto resultados

falsos positivos quanto falsos negativos, sendo indicada a CCS como método

diagnóstico mais seguro.

Além disso, nem sempre foi possível demonstrar similaridade entre os

resultados do CMT e CCS (ZAFALON et al., 2005; FERREIRA et al., 2007). Zafalon et

al., (2005) observaram ainda que a eficiência diagnóstica de 81,0% e 87,1% para

ambas as provas foi maior quando a mastite subclínica era causada por

Staphylococcus aureus. Porém quando comparada com infecções causadas por

Corynebacterium bovis demonstrou eficiência de 60,5% para CMT e 76,7% para CCS.

Enquanto Ferreira et al., (2007) avaliaram 26 animais em três momentos e não

observaram correlação entre os resultados do CMT e CCS.

4.3. Análise Microbiológica do Leite

A qualidade microbiológica do leite pode indicar a qualidade sanitária do

rebanho e condições higiênicas da produção (FONSECA e SANTOS, 2000), sendo

que a identificação dos microrganismos causadores da mastite é importante tanto para

implementação de mecanismos de controle como para monitoramento do rebanho

(SANTOS, 2005c).

Brito e Brito (2000), recomendaram o acompanhamento dos rebanhos, por

meio de exames microbiológicos e testes quantitativos (CCS) como medida preventiva

à mastite, além da realização de exames bacteriológicos em animais de reposição,

antes de serem incorporados ao rebanho. A pesquisa de agentes causadores da

mastite contribui para taxa de cura, uma vez que há relação entre os microrganismos

encontrados e os locais nos quais estão presentes, possibilitando a implantação de

medidas de controle específicas e direcionadas (VEIGA, 1998).

A mastite bovina caracteriza-se por processo inflamatório da glândula mamária,

podendo ser de origem traumática, infecciosa, tóxica e alérgica (HOLANDA JÚNIOR et

al., 2005), contudo, a causa bacteriana é considerada mais frequente. Corroborando

com essas informações, no momento imediatamente anterior ao início do presente

estudo, registrou-se crescimento bacteriano em 79,81% das amostras, após análise

individual do leite proveniente de 109 tetos mamários.

Entretanto, esse crescimento bacteriano, ocorreu apenas nas amostras

inoculadas no meio de cultura Agar sangue, ressaltando que 100% das amostras

foram negativas para o cultivo em Mc Conkey ágar.

Considerando-se que o meio Agar sangue é apropriado para o crescimento de

bactérias aeróbias, principalmente enterobactérias e considerando-se ainda que o

18

meio Mac Conkey ágar destina-se à detecção e isolamento de coliformes, geralmente

presentes na mastite clínica, a ausência de crescimento neste meio concorda com os

resultados apresentados pelo CMT e teste da caneca preta; uma vez que um dos

critérios utilizados para seleção dos animais foi ausência de mastite clínica.

Os patógenos mais comuns da mastite podem ser divididos naqueles que

causam infecções subclínicas, de longa duração, como Staphylococcus aureus,

Streptococcus agalactie, Mycoplasma bovis, Corynebacterium bovis e os que estão

presentes no ambiente, por não encontrarem-se totalmente adaptados à glândula

mamária, causam mastite clínica de curta duração, como Escherichia coli, espécies de

Klebsiella, Enterobacter além de outros Streptococcus (não agalactie). Esses últimos

são os coliformes gram-negativos mais comumente associados à mastite bovina

(HILLERTON, 1996; BRITO e BRITO, 2000).

Corroborando com esses achados, a Tabela 4 apresenta os patógenos e suas

respectivas frequências, em percentagem, nos diferentes momentos experimentais, na

qual o Staphylococcus aureus continua sendo apontado como principal agente

causador de mastite bovina (SANTOS, 2000, ALBERTON, 2000). O presente estudo

observou ocorrência de Staphylococcus aureus em 47,22% das amostras, valor este

semelhante ao encontrado por Vieira-da-Motta et al. (2001), que foi de 39,7%.

Tabela 4. Principais microrganismos isolados das amostras de leite com suas

respectivas ocorrências em porcentagem nos diferentes grupos experimentais, antes

da aplicação dos tratamentos (T0), sete (T7) e 14 (T14) dias após

Momentos

Microrganismos T0 T7 T14

Staphylococcus ssp 20,19 24,03 20,19Staphylococcus aureus 42,3 33,65 40,38

Streptococcus agalctiae 19,23 3,84 3,84

Streptococcus dysgalactiae 8,65 12,5 8,65

Streptococcus uberis 14,42 8,65 3,84

Streptococcus intermedius 0,00 1,92 0,00

Corynebacterium bovis 6,73 10,57 8,65*T0 - antes da aplicação dos tratamentos, T7 - sete e T14 - 14 dias após aplicação dos tratamentos.

19

4.4. Análise Físico-química da Própolis

4.4.1. Teores de Compostos Fenólicos e Flavonóides

O presente estudo utilizou própolis, proveniente da região de Marechal Cândido

Rondon – PR, e indicou teores de 55,5% e 11,92% de compostos fenólicos e

flavonóides, respectivamente.

O mínimo de compostos fenólicos e flavonóides, exigido é 0,50% e 0,25%

respectivamente (BRASIL, 2001). Dessa forma, pode-se observar que a amostra

avaliada enquadra-se nos padrões de qualidade. Além disso, esses valores estão de

acordo com as médias encontradas por diferentes pesquisadores, embora haja

variação dependente de inúmeros fatores como: época do ano (SILVA et al., 2006;

CASTRO et al., 2007), tipo de abelha (FERNANDES JÚNIOR et al., 2001), região

onde a própolis foi produzida (KOSALEC et al., 2005; FERNANDES JUNIOR et al.,

2006; MULI et al., 2007) e procedimento utilizado no preparo do extrato (CUNHA et al.,

2004; SAWAYA et al., 2004; MULI et al., 2007).

Bonhevi e Cool (1994) encontraram valores de compostos fenólicos em torno

de 10,1% para própolis brasileira, valor semelhante ao encontrado neste estudo.

Maldonado (2000) que encontra valores de compostos fenólicos, variando entre 0,42%

a 36,04%. Massuda (2003) obteve porcentagem de compostos fenólicos, em extratos

alcoólicos de própolis, variando de 5,09 a 5,48%, e Sato (2003) observou variação

entre 0,01% e 9,30%.

Cunha et al., (2004) verificaram variação entre 6,41% e 15,24%, nos teores de

fenóis totais de extrato etanólico de própolis a 70%, proveniente de São Paulo e Minas

Gerais, enquanto Silva et al., (2006) encontraram valores de ácidos fenólicos variando

de 2,93 a 8,13% e de flavonóides 0,19 a 0,38% em amostras de própolis do Estado da

Paraíba.

Gonsales et al. (2006), verificaram variações entre 0,5 a 0,63% nos teores de

flavonóides em extrato etanólico de própolis a 70%, em São Paulo, e Pavanelli et al.

(2007), analisaram três tipos de extrato etanólico de própolis coletados em Campo

Grande – MS, e encontraram valores médios de 40,15 % para compostos fenólicos e

3,16% para flavonóides.

Souza et al. (2007) verificaram o teor de flavonóides totais em amostras de

própolis provenientes do Estado de São Paulo (região de Franca) e Minas Gerais

(região de Passo) e encontraram valores de valores de 0,06% a 0,38% para São Paulo

e entre um amplitude de variação de 0,12 a 2,11% para os teores de flavonóides

totais, também nas regiões de São Paulo e Minas Gerais.

20

Essa elevada variabilidade de compostos fenólicos na própolis deve-se

provavelmente a diferentes fontes de exsudado vegetal, bem como à localização do

apiário (MOURA, 2001). Entretanto, apesar dessa variação, verificou-se que própolis

de diferentes regiões, mantiveram suas propriedades antibacteriana (KUJUMGIEV et

al., 1999; GONSALES et al., 2006), antifúngica (KUJUMGIEV et al., 1999) e antiviral

na maioria das amostras avaliadas (KUJUMGIEV et al., 1999).

Dessa forma a ação química e biológica da própolis, depende de diferentes

combinações (FARNESI, 2007). Sforcin et al. (2005) e Scazzocchio et al. (2005), já

haviam abordado múltiplos mecanismos sinérgicos envolvidos na atividade

antimicrobiana da própolis, indicando interação entre seus constituintes. Assim, apesar

do esforço de diferentes grupos de pesquisa nesta área, a farmacodinâmica da

própolis ainda não foi completamente elucidada (SALANTINO, et al. 2005).

Dessa forma, apesar dos valores aqui determinados terem sido de médio teor,

e semelhantes às médias estabelecidas por diferentes pesquisadores, esses teores

isoladamente podem não ter sido eficientes para avaliação quanto à eficácia biológica

das amostras de própolis analisada, pois mediram a quantidade e não a qualidade

(ADELMANN, 2005) e este fato provavelmente contribuiu para os resultados aqui

alcançados.

4.4.2. Propriedade Antioxidante

Substâncias flavonóides e compostos fenólicos, presentes nos extratos de

própolis, são reconhecidos pela ação antioxidante (KROL et al., 1990, MARCUCCI, et

al., 2005, SOUZA e GONÇALVES, 2008). Para confirmar esses resultados, o presente

estudo, verificou atividade antioxidante do EAP a 30% pela solubilidade positiva para

acetato de chumbo e ao NaOH.

Atividade antioxidante para extratos alcoólicos de própolis foi confirmada na

Argentina (MALDONADO, 2000) e em diferentes estados brasileiros (GONSALES et

al., 2005). Souza et al. (2007) registraram essa atividade em amostras provenientes de

São Paulo (região de Franca) e Minas Gerais (região de Passo).

21

5. CONSIDERAÇÕES FINAIS

As atividades biológicas da própolis propiciam grandes perspectivas ao

tratamento de diferentes afecções, tanto na medicina humana como na veterinária. A

alta diversidade em sua composição química, além da complexidade dos múltiplos

mecanismos sinérgicos envolvidos em suas atividades biológicas, faz-se necessários

outros ensaios clínicos a fim de se determinar, dose, dosagem e vias da administração

capazes de determinar seus benefícios terapêuticos in vivo.

22

6. CONCLUSÃO

Para as condições avaliadas, não foi possível observar diferenças entre os

tratamentos nas atividades terapêuticas e anti-sépticas da própolis no controle da

mastite bovina.

23

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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