etiologia e sensibilidade bacteriana de mastite …
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Arapongas 2020
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU MESTRADO EM SAÚDE E PRODUÇÃO DE RUMINANTES
NOME DO CURSO
JOSIANE ITO ELEODORO
ETIOLOGIA E SENSIBILIDADE BACTERIANA DE MASTITE SUBCLÍNICA BOVINA EM PROPRIEDADES DO NOROESTE
E CENTRO-OCIDENTAL DO ESTADO DO PARANÁ
Arapongas 2020
ETIOLOGIA E SENSIBILIDADE BACTERIANA DE MASTITE SUBCLÍNICA BOVINA EM PROPRIEDADES DO NOROESTE
E CENTRO-OCIDENTAL DO ESTADO DO PARANÁ
JOSIANE ITO ELEODORO
Dissertação apresentada à UNOPAR, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Saúde e Produção de Ruminantes. Orientador: Prof. Dr. Rafael Fagnani
Ficha catalográfica elaborada, com dados fornecidos pelo (a) autor (a) Biblioteca UNOPAR / Arapongas - Maria Luci Juliani Grano CRB – 9/776
ELEODORO, Josiane Ito. Etiologia e sensibilidade bacteriana de mastite subclínica bovina em propriedades do noroeste e centro-ocidental do estado do Paraná. Arapongas: UNOPAR, 2020. 72p. Orientador: FAGNANI, Rafael. Dissertação (Mestrado) UNOPAR - Medicina Veterinária - Saúde e Produção de Ruminantes, 2020. 1. Medicina Veterinária - Dissertação de mestrado - Unopar. 2. Saúde e Produção de Ruminantes. 3. Mastite Bovina. 4. Antibiograma. I.FAGNANI, Rafael. II. Titulo. CDU: 619:636
Maria Luci Juliani Grano: CRB – 9/776
Arapongas, 06 de março de 2020.
Prof. Dr. Rafael Fagnani Universidade Pitágoras Unopar
Prof. Dr. Selwyn Arlington Headley Universidade Estadual de Londrina
Profª. Drª. Lucienne Garcia Pretto-Giordano Universidade Estadual de Londrina
JOSIANE ITO ELEODORO
ETIOLOGIA E SENSIBILIDADE BACTERIANA DE MASTITE SUBCLÍNICA BOVINA
EM PROPRIEDADES DO NOROESTE E CENTRO-OCIDENTAL DO ESTADO DO
PARANÁ
Dissertação apresentada à UNOPAR, no Mestrado em Saúde e Produção de
Ruminantes, área e concentração em Saúde Animal como requisito parcial para a
obtenção do título de Mestre conferida pela Banca Examinadora formada pelos
professores:
Dedico à todos os meus familiares por terem
sido como fontes inspiradoras para mim.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente agradeço à Deus, por ter me dado o dom da vida e
por me abençoar todos os dias com o seu amor infinito. Sem Ele nada disso seria
possível.
Agradeço à minha mãe Isabel, que tanto batalhou para me oferecer
uma educação de qualidade. Obrigada pelo seu grande amor e pelo apoio nas
minhas escolhas.
Agradeço ao meu pai José (in memoriam), que infelizmente não
pôde estar ao meu lado neste momento tão importante. Sua lembrança me inspira e
me faz persistir... Onde quer que esteja, sei que nunca deixou de me amar, nem de
confiar em mim.
Agradeço ao meu irmão Tiago e às minhas tias Adélia, Alice e
Helena, que sempre serão grandes exemplos de força, dignidade e caráter para
mim.
Agradeço ao meu namorado Erich, que muitas vezes abriu mão dos
seus compromissos para ficar ao meu lado, me apoiando e me ajudando. Obrigada
por todo amor, carinho, paciência e por estar sempre orando por mim.
Agradeço ao meu orientador Dr. Rafael Fagnani, por mais uma vez
terr me guiado com muita paciência na execução desse trabalho. Manifesto ainda
aqui a minha gratidão por ter compartilhado o seu tempo e a sua sabedoria. “Se
enxerguei mais longe, foi porque me apoiei em ombros de gigantes” (Isaac Newton).
Agradeço aos professores Lucienne Garcia Pretto-Giordano e
Selwyn Arlington Headley, por terem disponibilizado do seu tempo para participar da
banca examinadora da defesa.
Agradeço à UNOPAR, pelo excelente ambiente oferecido aos seus
alunos. Sou grata à cada membro do corpo docente e à administração dessa
instituição de ensino.
Agradeço à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível
Superior (CAPES), pela concessão da bolsa PROSUP.
Agradeço à todos que, direta ou indiretamente, contribuíram para a
realização desse trabalho. Deixo aqui о meu muito obrigada.
“Que os vossos esforços desafiem as
impossibilidades. Lembrai-vos de que as
grandes coisas do homem foram
conquistadas do que parecia impossível.”
Charles Chaplin
Charles Chaplin
ELEODORO, Josiane Ito. Etiologia e sensibilidade bacteriana de mastite subclínica bovina em propriedades do noroeste e centro-ocidental do estado do Paraná. 2020. 72p. Dissertação (Mestrado em Saúde e Produção de Ruminantes) - Universidade Pitágoras Unopar. Arapongas, 2020.
RESUMO
A mastite se caracteriza pela inflamação da glândula mamária, geralmente de
caráter infeccioso, sendo considerada a principal causa na redução da produção e
qualidade do leite, além de apresentar grandes riscos à saúde pública. Nesse
contexto, esse estudo teve como objetivo avaliar a etiologia e a sensibilidade aos
antimicrobianos de microrganismos isolados de amostras de leite oriundas de
diversas propriedades leiteiras comerciais das mesorregiões noroeste e centro-
ocidental do estado do Paraná. As amostras de leite foram coletadas a partir de
quartos mamários que apresentavam indicação de mastite subclínica. Foram
analisadas 360 amostras da mesorregião noroeste e 118 amostras do centro-
ocidental. Streptococcus mutans foi o microrganismo mais isolado nas amostras
oriundas do noroeste, totalizando 19,2% dos isolamentos. No centro-ocidental,
Streptococcus spp. foi identificado em 36,3% das amostras, totalizando a maior parte
das amostras. O antibiograma foi realizado pelo método de difusão de disco, sendo
testados os seguintes antibióticos: associação de Amoxicilina + Ácido Clavulânico
(AMC) com 30 μg/disco, associação de Gentamicina + Amoxicilina (GEN), e Ceftiofur
(CTF) com 30 μg/disco. Gentamicina + Amoxacilina foi o antimicrobiano mais efetivo
frente aos isolados testados no noroeste, com índice de sensibilidade de 85,4%. No
centro-ocidental, Ceftiofur foi o antimicrobiano mais efetivo, com índice de
sensibilidade de 90,6%. Os resultados evidenciaram a presença de bactérias
ambientais e contagiosas nos rebanhos estudados, alertando para os cuidados na
ordenha. As variações dos resultados de resistência entres os dois locais resultados
reforçam a necessidade da realização periódica de testes de sensibilidade in vitro.
Palavras-chave: antimicrobiano, antibiograma, glândula mamária, resistência bacteriana, saúde animal
ELEODORO, Josiane Ito. Etiology and bacterial sensitivity of subclinical bovine mastitis in Northwestern and Western Center properties of the state of Paraná. 2020. 72p. Dissertação (Mestrado em Saúde e Produção de Ruminantes) - Universidade Pitágoras Unopar. Arapongas, 2020.
ABSTRACT
Mastitis is characterized by inflammation of the mammary gland, usually infectious,
being considered the main cause in reducing milk production and quality and,
consequently, significant economic losses. Administration of antimicrobial
intramammary drugs is the most frequently used method for treating bovine mastitis.
However, indiscriminate use of antibiotics can lead to the emergence of resistant
strains. In this context, this study aimed to evaluate the etiology and antimicrobial
susceptibility of microorganisms isolated from milk samples from various commercial
dairy properties in the Northwest and Western Center mesoregions of the state of
Paraná. Milk samples were collected from the fourth positive breast for the CMT test,
which indicated subclinical mastitis. Three hundred and sixty samples from the
Northwest mesoregion and one hundred and eighteen samples from the Western
Center were analyzed. Streptococcus mutans was the most isolated microorganism
in samples from the northwest, totaling 19.2% of the isolates. In the western center,
Streptococcus spp. was identified in 36.3% of the samples, totaling most of the
samples. The antibiogram was performed by the disc diffusion method, and the
following antibiotics were tested: Amoxicillin + Clavulanic Acid (AMC) at 30 μg/disc,
Gentamicin + Amoxicillin (GEN), and Ceftiofur (CTF) at 30 μg/disc. Gentamicin +
Amoxacillin was the most effective antimicrobial against the isolates tested in the
Northwest, with a sensitivity index of 85.4%. In the Western Center, Ceftiofur was the
most effective antimicrobial, with a sensitivity index of 90.6%. The results showed the
presence of environmental and contagious bacteria in the studied herds, alerting for
care in milking. The variations in the resistance results between the two locations
reinforce the need for periodic sensitivity testing in vitro.
Key-words: animal health, antibiogram, antimicrobial, bacterial resistance, mammary gland
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Distribuição espacial dos municípios em que os rebanhos leiteiros foram
amostrados nas mesorregiões noroeste e centro-ocidental do estado do Paraná.....
.................................................................................................................................. 50
Figura 2. Diagrama de fluxo para identificação das espécies de Streptococcus spp.
.................................................................................................................................. 52
Figura 3. Diagrama de fluxo para identificação das espécies de Staphylococcus spp.
.................................................................................................................................. 52
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Ocorrência de cepas bacterianas resistentes à diferentes princípios de
antimicrobianos* de acordo com artigos científicos publicados de 2010 a 2018* (n=
número total de cepas testadas) ............................................................................... 31
Tabela 2. Frequências absoluta e relativa quanto aos microrganismos isolados de
amostras de leite de bovinos com mastite subclínica no noroeste e centro-ocidental
do Paraná. ................................................................................................................. 55
Tabela 3. Frequências absoluta e relativa quanto aos microrganismos isolados de
amostras de leite de bovinos com mastite subclínica no noroeste e centro-ocidental
do Paraná. ................................................................................................................. 61
Tabela 4. Resultado do teste de sensibilidade in vitro para microrganismos isolados
de amostras leite de bovinos com mastite subclínica no centro-ocidental do Paraná.
.................................................................................................................................. 63
Tabela 5. Prevalência de resistência de microrganismos isolados de amostras de
leite com mastite subclínica para três princípios ativos agrupados conforme a região
de coleta. ................................................................................................................... 65
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
mL
mm
μl
ºC
CCS
CMT
CCS/mL
AMC
GEN
CFT
CLSI
SCN
SCP
S. aureus
S. chromogenes
S. simulans
S. hyicus
S. intermedius
S. agalactiae
S. uberis
S. dysgalactiae
S. mitis
S. sanguis
S. mutans
E. coli
Mililitro
Milímetros
Microlitro
Graus centígrados
Contagem de células somáticas
California Mastitis Test
Contagem de células somáticas por mililitro
Amoxicilina + Ácido clavulânico
Gentamicina + Amoxicilina
Ceftiofur
Clinical and Laboratory Standards Institute
Staphylococcus coagulase negativa
Staphylococcus coagulase positiva
Staphylococcus aureus
Staphylococcus chromogenes
Staphylococcus simulans
Staphylococcus hyicus
Staphylococcus intermedius
Streptococcus agalactiae
Streptococcus uberis
Streptococcus dysgalactiae
Streptococcus mitis
Streptococcus sanguis
Streptococcus mutans
Escherichia coli
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 14
2 JUSTIFICATIVA ..................................................................................................... 16
3 REVISÃO SISTEMÁTICA E METANÁLISE ........................................................... 17
3.1 INTRODUÇÃO .................................................................................................... 17
3.2 MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................... 17
3.2.1 Planejamento .................................................................................................... 17
3.2.2 Objetivos ........................................................................................................... 17
3.2.3 Questões de pesquisa (escopo e especificidades) ........................................... 18
3.2.4 Estratégia de busca e seleção das fontes ........................................................ 18
3.2.5 Critérios de inclusão e exclusão dos trabalhos ................................................. 19
3.2.6 Condução do processo de seleção dos estudos .............................................. 20
3.2.7 Extração e análise dos resultados .................................................................... 20
3.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................... 21
3.3.1 Etiologia ............................................................................................................ 21
3.3.2 Resistência antimicrobiana ............................................................................... 28
3.4 CONCLUSÃO ...................................................................................................... 34
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 36
4 OBJETIVOS ........................................................................................................... 45
4.1 OBJETIVO GERAL .............................................................................................. 45
4.2 OBJETIVO ESPECÍFICOS .................................................................................. 45
ARTIGO CIENTÍFICO ............................................................................................... 46
INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 48
MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................... 50
OBTENÇÃO DAS AMOSTRAS DE LEITE ................................................................ 50
ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DOS MICRORGANISMOS ............................... 51
TESTE DE SENSIBILIDADE A ANTIMICROBIANOS (ANTIBIOGRAMA) ................ 52
ANÁLISE ESTATÍSTICA ........................................................................................... 53
RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................ 54
IDENTIFICAÇÃO DOS MICRORGANISMOS ........................................................... 55
SENSIBILIDADE E RESISTÊNCIA AOS ANTIMICROBIANOS ................................ 61
CONCLUSÃO ........................................................................................................... 66
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 67
14
1 INTRODUÇÃO 1
O rebanho leiteiro ocupa uma posição de destaque dentro do 2
cenário econômico brasileiro, estando o leite presente entre os principais produtos 3
da agropecuária nacional. De fato, o agronegócio de leite e derivados desempenha 4
um papel relevante tanto no suprimento de alimentos quanto na questão social, com 5
a geração de emprego e renda para a população brasileira (ZOCCAL, 2017). 6
Considerado um dos alimentos in natura mais completos da natureza, o leite tem em 7
sua composição elementos nutritivos como proteínas, vitaminas, carboidratos, 8
gordura e sais minerais em quantidades consideráveis, sendo esses essenciais ao 9
crescimento e à manutenção de uma vida saudável (RIBEIRO et al., 2016). 10
Entretanto, a qualidade do produto in natura é influenciada por 11
diversas variáveis, destacando-se fatores zootécnicos associados ao manejo, 12
alimentação e potencial genético dos rebanhos e fatores relacionados à obtenção e 13
armazenagem do leite (SAAB et al., 2014). Uma das causas que exerce influência 14
extremamente prejudicial sobre a produção, composição e características físico-15
químicas do leite é a mastite, tornando essa doença economicamente desafiadora 16
para a bovinocultura leiteira. 17
A palavra mastite deriva do grego “mastos”, que remete à glândula 18
mamária, e o sufixo “ite” correspondente a inflamação, caracterizando-se assim pela 19
inflamação da glândula mamária (COSTA, 1998). Trata-se de uma doença 20
multifatorial que afeta a glândula mamária, sendo caracterizada por alterações 21
físicas, químicas e normalmente microbiológicas do leite. 22
A mastite é a infecção mais frequente dos animais destinados à 23
produção de leite e que mais onera a pecuária leiteira. Isso decorre do fato de que 24
as infecções intramamárias resultam em perdas econômicas significativas que estão 25
associadas com vários motivos, dentre eles a redução na produção de leite (mais de 26
70%), custo com tratamento e encargos médico veterinários (7%), descarte de leite 27
durante o período de tratamento (9%), aumento da mão-de-obra (1%) e o descarte 28
prematuro de animais (14%) (SHARMA et al., 2012). Além disso, existem perdas 29
para os laticínios, devido à queda na qualidade do produto final, diminuição no 30
rendimento industrial para a fabricação dos derivados e pelas alterações na 31
composição do leite mastítico. 32
A inflamação da glândula mamária pode ser causada por uma ampla 33
15
variedade de microrganismos. Conforme Teixeira et al. (2014), sabe-se que existem 1
mais de 140 espécies microbianas que podem estar envolvidas com a mastite, 2
embora apenas um número relativamente pequeno seja responsável pela maioria 3
dos casos. Destacam-se Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, 4
Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus uberis, Escherichia coli e 5
Corynecbaterium bovis. 6
Para diminuir os problemas acarretados pela mastite e prevenir 7
novas infecções, uma das práticas utilizadas nas propriedades leiteiras é o uso de 8
antibióticos, tanto no período de lactação (quando se faz necessário), tanto no 9
período seco. Assim como em humanos, o uso de antibióticos em gado leiteiro 10
beneficiou muito a saúde, bem-estar e produtividade. Contudo, seu uso não é isento 11
da possibilidade de consequências adversas, principalmente a aquisição de 12
resistência bacteriana. 13
Segundo Santos et al. (2006), a resistência bacteriana está 14
associada ao uso indiscriminado de antibióticos. Na prática, o fácil acesso aos 15
medicamentos possibilita que os mesmos sejam escolhidos de maneira incorreta, 16
muitas vezes ineficazes para o patógeno a ser combatido, resultando em resistência 17
aos mesmos (SOUZA et al., 2016). Cades et al. (2017) ressaltam ainda que o uso 18
incorreto e indiscriminado causa transtornos não somente aos animais, mas também 19
prejuízos ao produtor e até riscos para a saúde humana. 20
O aparecimento de cepas multirresistentes a antibióticos tem 21
dificultado o tratamento das mastites em vacas. Diante desse cenário e da grande 22
quantidade de patógenos envolvidos que podem causar a enfermidade, existe a 23
necessidade da realização periódica do diagnóstico microbiológico das mastites, 24
visto que este é capaz de gerar resultados rápidos e seguros na identificação dos 25
problemas que estão acometendo o rebanho. De acordo com Karach et al. (2015), o 26
isolamento e a identificação do agente contribui para a escolha mais adequada do 27
medicamento a ser utilizado na terapia, evitando assim a aquisição de resistência 28
bacteriana aos antibióticos. 29
16
2 JUSTIFICATIVA 1
Assegurar a sanidade do rebanho e a produção de leite de alta 2
qualidade é objetivo primário de médicos veterinários e produtores de leite. Nesse 3
contexto, um grande desafio que envolve o rebanho leiteiro é o controle da mastite. 4
O uso indiscriminado de antibióticos na cadeia leiteira é um dos 5
principais fatores que contribuem para a resistência microbiana. Atualmente, a 6
aplicação desnecessária de antibióticos ocorre entre 30% a 50% dos casos de 7
mastite. A utilização indiscriminada de antibióticos, associada aos mecanismos de 8
resistência e a falta de exames de sensibilidade contribuem para que esta 9
enfermidade seja de difícil controle, causando grandes prejuízos aos produtores de 10
leite em todo o território nacional. 11
Uma estratégia importante para prevenir a resistência bacteriana é o 12
conhecimento de quais são os principais agentes envolvidos nas mastites e de suas 13
sensibilidades. O estudo da etiologia da mastite infecciosa merece atenção de vários 14
pesquisadores, visando a elaboração de estratégias efetivas de controle, uma vez 15
que o conhecimento dos microrganismos predominantes na etiologia dos casos de 16
mastite em um rebanho permite a detecção de pontos críticos na propriedade leiteira 17
que contribuem para a instalação e disseminação do processo infeccioso, 18
viabilizando dessa forma, a adoção de medidas específicas de controle que irão 19
reduzir a proliferação e a disseminação de cepas patogênicas que podem se tornar 20
altamente resistentes aos antibióticos. 21
Costa et al. (2013) apontaram que podem ocorrer variações nos 22
perfis de resistência dos isolados microbianos entre rebanhos e no próprio rebanho, 23
evidenciando a necessidade da realização de um monitoramento periódico do perfil 24
de sensibilidade dos diferentes microrganismos envolvidos na etiologia da mastite 25
bovina. 26
Diante desse cenário, a realização do projeto é justificada devido ao 27
fato de que fornecerá dados epidemiológicos para o melhor controle de uma das 28
principais patologias que prejudica a sanidade e a produtividade leiteira. Através dos 29
resultados, será possível construir um panorama epidemiológico sobre o cenário 30
etiológico e de sensibilidade antimicrobiana dos principais agentes causadores de 31
mastite, auxiliando a proporcionar bases para o tratamento adequado e prevenir a 32
resistência e cronicidade da afecção. 33
17
3 REVISÃO SISTEMÁTICA E METANÁLISE 1
3.1 INTRODUÇÃO 2
Diferentemente das revisões de literatura tradicionais, a revisão 3
sistemática possui um método de pesquisa claro e rigoroso que procura identificar o 4
conhecimento científico em uma determinada área por meio da coleta, combinação e 5
avaliação crítica de descobertas de diversas abordagens anteriores já realizadas 6
(BIOLCHINI et al., 2005). Juntamente, torna-se possível a realização da metanálise 7
sobre os dados obtidos, esta que é a análise estatística dos resultados de estudos 8
independentes sobre uma mesma questão de pesquisa e que tem como objetivo 9
integrá-los, combinando e resumindo seus resultados. 10
Dentro desse contexto, o objetivo dessa revisão sistemática foi 11
investigar os agentes etiológicos mais frequentes associados como causa de mastite 12
subclínica em vacas em território nacional e analisar os relatos presentes na 13
literatura sobre a resistência antimicrobiana desses agentes. 14
3.2 MATERIAL E MÉTODOS 15
3.2.1 Planejamento 16
O planejamento da seguinte revisão sistemática e da metanálise foi 17
realizado de acordo com o modelo de protocolo apresentado por Biolchini et al., 18
(2005) e por Kitchenham (2004) com o auxílio do programa StArt e Biostat. Nesta 19
seção, serão apresentados os principais pontos do plano elaborado, sendo elas: o 20
objetivo da pesquisa, questões de pesquisa, estratégia adotada para utilizar as 21
fontes de pesquisa, critérios para seleção e exclusão de estudos e procedimento 22
para extração dos resultados para a análise estatística. 23
3.2.2 Objetivos 24
Identificar na literatura a existência de estudos primários que 25
identifiquem os agentes etiológicos mais frequentes associados como causa de 26
18
mastite subclínica em vacas. Objetivou-se também analisar os relatos presentes na 1
literatura sobre a resistência antimicrobiana desses agentes para que fosse possível 2
traçar o perfil de resistência a antibióticos em casos de mastite em nível nacional. 3
3.2.3 Questões de pesquisa (escopo e especificidades) 4
a. O que há na literatura a respeito da etiologia e resistência antimicrobiana nas 5
mastites bovinas no Brasil? 6
7
b. Quais são os agentes etiológicos causadores de mastite subclínica em rebanhos 8
de bovinos leiteiros mais frequentes em território nacional? 9
10
c. Qual é o nível de resistência e de sensibilidade desses agentes diante dos 11
principais princípios ativos utilizados para o tratamento de mastites em território 12
nacional? 13
14
Controle: coleção de artigos e outros trabalhos levantados e relacionados em 15
revisões bibliográficas de monografias, dissertações de mestrado, teses de 16
doutorado e livros relacionados com o tema proposto. 17
População: bovinos leiteiros acometidos por mastite subclínica. 18
Resultados: visão da situação etiológica da mastite subclínica, bem como dos 19
aspectos relacionados à resistência e sensibilidade aos antibióticos no Brasil. 20
Aplicação: médicos veterinários e produtores de leite que estão inseridos no 21
cenário da produção leiteira brasileira. 22
3.2.4 Estratégia de busca e seleção das fontes 23
O método utilizado para a busca dos trabalhos e seleção de fontes é 24
descrito a seguir em tópicos que englobaram critério de seleção, palavras-chave, 25
data dos trabalhos, listagem das fontes e idiomas. 26
3.2.4.1 Critério de seleção 27
Foram selecionadas fontes que possuíam disponibilidade de 28
19
consulta de artigos por meio eletrônico, preferencialmente bases de dados científicas 1
da área, e que dispusessem de mecanismos de busca por meio de palavras-chave. 2
Trabalhos disponíveis em outros locais, desde que atendessem aos requisitos dessa 3
Revisão Sistemática, também foram selecionados. 4
3.2.4.2 Palavras-chave 5
“Mastite subclínica”, “Subclinical mastitis”, “Etiologia”, “Etiology” 6
“Resistência antimicrobiana”, “Antimicrobial resistance”, “Antimicrobianos”, 7
“Antimicrobials”, “Mastite bovina”, “Bovine mastitis", “Staphylococcus”, 8
“Streptococcus”, “Corynebacterium”, “Glândula mamária”, “Mammary gland”, 9
“Infecção”, “Infection”, “Leite”, “Milk”. 10
3.2.4.3 Data dos trabalhos 11
Foram selecionados apenas artigos de periódicos ou anais de 12
eventos científicos da área publicados a partir do ano de 2009. 13
3.2.4.4 Listagem das fontes 14
SciELO (http://www.scielo.org/) 15
Portal Periódicos da Capes (http://novo.periodicos.capes.gov.br/) 16
Google Acadêmico (https://scholar.google.com.br/) 17
PubMed (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/) 18
3.2.4.5 Idiomas 19
Português, por contemplar trabalhos realizados em território 20
nacional, e inglês, por ser considerado o idioma mais aceito internacionalmente para 21
redação de trabalhos científicos. 22
3.2.5 Critérios de inclusão e exclusão dos trabalhos 23
Para a seleção dos estudos, foram definidos critérios de inclusão e 24
exclusão. Esses critérios são definidos a seguir: 25
20
3.2.5.1 Critérios de inclusão: 1
a) Estudos primários relacionados com o tema proposto e com disponibilidade de 2
consulta por meio eletrônico utilizando mecanismos de busca por meio de strings de 3
palavras-chave; 4
b) Estudos primários publicados a partir de 2009 e que já possuíam aprovação pela 5
comunidade científica; 6
c) Estudos primários que abordaram a espécie bovina; 7
d) Estudos primários que foram realizados apenas em território brasileiro. 8
3.2.5.2 Critérios de exclusão: 9
a) Estudos primários que não abordaram especificamente a etiologia e a 10
resistência/sensibilidade da mastite subclínica; 11
b) Estudos primários publicados fora do limite do período estabelecido; 12
c) Estudos primários que não abordaram a espécie bovina; 13
d) Estudos primários realizados fora do território brasileiro; 14
e) Estudos secundários. 15
3.2.6 Condução do processo de seleção dos estudos 16
Nesse processo, foram realizadas buscas através de strings 17
formuladas com as palavras-chaves nas fontes de pesquisa definidas. Em seguida, 18
foi realizada a leitura dos resumos dos trabalhos encontrados juntamente com uma 19
pré-avaliação, já baseada nos critérios de inclusão e exclusão para selecionar os 20
estudos que deveriam ser lidos integralmente. Os estudos selecionados foram lidos 21
na íntegra e avaliados rigorosamente de acordo com os mesmos critérios, sendo 22
considerados válidos ou inválidos para os objetivos desta Revisão Sistemática. O 23
estudo apenas foi selecionado se confirmada a sua relevância pelo revisor. 24
3.2.7 Extração e análise dos resultados 25
Após o processo de seleção, um formulário foi elaborado e 26
preenchido para possibilitar a coleta das informações relevantes de cada artigo, de 27
acordo com as questões de pesquisa definidas. A própria estrutura do formulário de 28
21
coleta serviu como lista de verificação de informações que deveriam ser identificadas 1
nos trabalhos lidos. 2
Os dados obtidos foram tabulados e submetidos à análise estatística 3
descritiva de frequência absoluta e relativa para os achados microbiológicos através 4
do software MICROSOFT EXCEL® e ao teste de Qui-Quadrado combinado utilizando 5
o software BIOSTAT® para comparação das proporções da prevalência da 6
resistência em cada ano estudado. 7
3.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO 8
Nessa seção são apresentados os resultados obtidos com a 9
condução da revisão sistemática, de acordo com os objetivos e questões de 10
pesquisa propostos. 11
No total, 75 artigos foram recuperados das fontes de pesquisa 12
selecionadas. Esses estudos ocorreram entre 2009 e 2019 em vários lugares do 13
Brasil. Após a remoção de duplicatas, remanesceram 69 artigos únicos, dentro os 14
quais 56 artigos preencheram os critérios de seleção para inclusão e foram 15
selecionados para a extração de resultados da revisão sistemática. Do total de 16
artigos aceitos, 45 possuíam como objetivo classificar os agentes etiológicos mais 17
frequentes associados como causa de mastite subclínica em vacas e 27 relataram o 18
nível de prevalência de resistência e sensibilidade desses agentes aos diversos 19
antibióticos testados. 20
3.3.1 Etiologia 21
3.3.1.1 Staphylococcus spp. 22
Staphylococcus spp. foi descrito em todos os artigos dessa revisão, 23
sendo relatado em 39 (86,6%) estudos como o principal patógeno causador de 24
mastite. A prevalência do gênero Staphylococcus spp. variou de 9,30% a 91,0%, 25
sendo o maior valor resultante de um monitoramento de mastite em um rebanho 26
Jersey no sul do Rio Grande do Sul realizado por Kolling et al. (2012) no período de 27
janeiro a dezembro de 2011. Tomazi et al. (2017) com o objetivo de caracterizar o 28
perfil etiológico da doença em rebanhos leiteiros localizados nos estados de São 29
Paulo e Minas Gerais durante os anos de 2014 a 2016, analisaram 4214 amostras 30
22
de leite no total e obtiveram a menor porcentagem de Staphylococcus spp. desse 1
estudo (9,09%). 2
Os estafilococos estão entre os patógenos mais frequentemente 3
isolados em casos de infecção intramamária dentro do rebanho leiteiro (PYÖRÄLÄ; 4
TAPONEN, 2009) e, consequentemente, são responsáveis pelas maiores perdas 5
econômicas diante dessa condição. De acordo com Franco e Landgraf (2003), os 6
estafilococos pertencem à família Staphylococcaceae, são cocos Gram-positivos, 7
anaeróbios facultativos, mesófilos, imóveis, com temperatura de crescimento entre 8
7,0 e 47,8ºC, estando entre 30,0 e 37,0ºC a temperatura ideal de crescimento. 9
Apresentam metabolismo fermentativo com produção de ácido e não de gás e são 10
catalase positivos. São bactérias formadoras de colônias circulares de 3 a 5 mm, 11
com superfície brilhante e pigmentação comumente amarelada (DEVRIESE et al., 12
1983), além de produzirem enterotoxinas entre 10 e 46ºC (PICCININI, 2012). 13
Além de ser responsável por grandes prejuízos econômicos à 14
pecuária leiteira, o gênero Staphylococcus possui cepas com alta resistência a 15
diversos antibióticos utilizados rotineiramente no tratamento da mastite, o que 16
contribui para sua persistência na glândula mamária. Ademais, microrganismos 17
desse gênero apresentam riscos à saúde pública, visto que são capazes de produzir 18
diversos fatores de virulência, principalmente levando em consideração a sua 19
capacidade de produção de enterotoxinas termoestáveis, uma vez que estas podem 20
estar presentes no leite, causando assim distúrbios alimentares nos consumidores 21
(VIÇOSA et al., 2010), e a capacidade da transferência dos genes de resistência aos 22
seres humanos (SILVA et al., 2018). 23
Mais de 50 espécies do gênero Staphylococcus spp. já foram 24
caracterizadas e grande parte é comensal da pele e mucosas de seres humanos e 25
animais, sendo encontrada nas mucosas do trato respiratório, urogenital e digestivo. 26
Tradicionalmente, os estafilococos são classificados em Staphylococcus coagulase 27
negativa (SCN), que geralmente compõem a microbiota natural dos seres humanos 28
e animais, e em Staphylococcus coagulase positiva (SCP), que apresentam maior 29
potencial patogênico. Essa classificação é fundamentada na habilidade ou não de 30
coagular plasma (SILVA et al., 2018). 31
O grupo dos SCN é composto por mais de 20 espécies, sendo que 32
as mais comuns são Staphylococcus epidermidis, S. chromogenes, S. simulans e 33
algumas cepas de S. hyicus (LANGONI et al., 2017). São agentes que habitam 34
23
normalmente a pele de tetos e as mãos dos ordenhadores, sendo assim 1
considerados oportunistas, causando infecção via ascendente através do canal do 2
teto (TRINIDAD; NICKERSON; ALLEY, 1990). 3
A maior frequência de isolamentos de SCN está associado com 4
infecções subclínicas (SANTOS et al., 2011) e no início da lactação (GILLESPIE et 5
al., 2009). Devido a menor patogenicidade deste grupo, os SCN são considerados 6
como patógenos secundários. Entretanto, Langoni et al. (2017) destacam que é um 7
grupo que tem despertado o interesse de pesquisadores, visto que estão se 8
tornando patógenos emergentes, frequentemente encontrados em amostras de leite 9
de animais com mastite, capazes de ocasionar infecções moderadas persistentes, 10
com aumento da CCS excedendo de duas a três vezes em relação às glândulas 11
mamárias sadias e diminuição da qualidade do leite, representando perdas 12
econômicas significativas para os produtores (SILANIKOVE et al., 2014). 13
Nos quadros de mastite, os estafilococos coagulase positivas 14
apresentam maior importância clínica. As espécies que constituem o grupo SCP são 15
S. aureus e S. intermedius. 16
Dentre o grupo dos SCP, Staphylococcus aureus é a espécie que 17
merece destaque por ser um dos microrganismos mais frequentemente associados 18
às infecções intramamárias contagiosas de bovinos nos rebanhos mundiais e o 19
agente que isoladamente determina as maiores perdas na pecuária leiteira, 20
sobretudo é o agente de maior patogenicidade e contagiosidade dentro do gênero 21
dos Staphylococcus spp. (HOGEVEEN et al., 2011; CONTRERAS, RODRIGUEZ, 22
2011). Keefe (2012) destaca ainda que S. aureus podem estar relacionados como 23
causa de mastite subclínica, as quais normalmente tornam-se crônicas, com 24
consequente aumento variável de CCS. Entretanto, também são causadores de 25
mastite clínica, provocando manifestações clínicas agudas de moderadas a graves, 26
tais como a gangrena dos quartos mamários, que podem culminar com a morte do 27
animal. 28
Ribeiro et al. (2016) ressaltam ainda que o Staphylococcus aureus é 29
um agente de difícil tratamento devido à sua elevada resistência no úbere, a qual, 30
consequentemente, influencia na eficiência aos antibióticos que são administrados. 31
Isso ocorre devido à um mecanismo que o patógeno utiliza para invadir e colonizar a 32
glândula mamária do animal; o microrganismo invade a glândula mamária via canal 33
do teto e coloniza o epitélio do mesmo, fixando-se nas células epiteliais da glândula 34
24
mamária e formandos os chamados “bolsões de bactérias”. Desse modo, as 1
glândulas infectadas diminuem a produção de leite devido à destruição permanente 2
do parênquima, originando áreas de fibrose e micro abscessos, que protegem o 3
agente dos mecanismos de defesa do animal, como a fagocitose pelos neutrófilos, e 4
dificultam a ação dos antibióticos. Além do mais, o “envelopamento” das bactérias 5
pode também levar a resultados falso-negativo em exames bacteriológicos, além de 6
favorecer as infecções de longa duração, com baixa taxa de cura e grande perda na 7
produção de leite. 8
3.3.1.2 Streptococcus spp 9
.
Strepetococcus spp. foi descrito em 37 artigos consultados nessa 10
revisão, totalizando 82,2%. Foi relatado em 3 (6,66%) estudos como o principal 11
patógeno causador de mastite. A prevalência do gênero Streptococcus spp. variou 12
de 0,36% a 48,0%. O maior valor encontrado foi resultante de uma avaliação dos 13
principais agentes causadores de mastite em propriedades leiteiras na região Oeste 14
do Paraná realizado por Lange et al. (2017) no período de setembro a dezembro de 15
2012. Martins et al. (2010), com o objetivo de verificar a prevalência e etiologia 16
infecciosa da mastite bovina em propriedades leiteiras da microrregião de Cuiabá, 17
estado de Mato Grosso, analisaram 279 amostras de leite no total e obtiveram a 18
menor porcentagem de Streptococcus spp. isolados desse estudo (0,36%). 19
Os estreptococos são considerados o segundo grupo de 20
microrganismos em importância na etiologia da mastite dos ruminantes, sendo 21
precedidos apenas pelo grupo dos estafilococos. Pertencem à família 22
Streptococaceae e são cocos Gram-positivos, geralmente dispostos aos pares ou 23
em cadeias de cocos, anaeróbios facultativos ou estritos, catalase negativos (BIER, 24
1990). 25
De acordo com Santos et al. (2007), na maioria dos rebanhos, S. 26
agalactiae, S. uberis e S. dysgalactiae, são as principais espécies isoladas. 27
Entretanto, tem sido reconhecido que o gênero Streptococcus spp. é composto por 28
pelo menos 50 espécies, que por sua vez incluem muitos patógenos tanto para o 29
homem quanto para animais domésticos (QUINN, et al., 2005). 30
As bactérias desse gênero são colonizadoras transitórias da pele e 31
residentes de mucosas, podendo ser isoladas como parte integrante da microbiota 32
25
normal dos tratos respiratório, gastrointestinal e genital de várias espécies animais. 1
Os estreptococos que causam mastite bovina são classificados nos grupos dos 2
microrganismos contagiosos (S. agalactiae) e ambientais (demais espécies) 3
(DOUGLAS et al., 2000). 4
Como citado anteriormente, Streptococcus agalactiae é um 5
microrganismo contagioso, obrigatório da glândula mamária, responsável por causar 6
na maioria das vezes, mastites subclínicas que tendem à forma crônica. Sua 7
disseminação no rebanho ocorre principalmente no momento da ordenha realizada 8
sem higiene. As infecções intramamárias causadas por essa espécies, estão 9
geralmente associadas com elevadas contagens de células somáticas no leite do 10
tanque e contagem bacteriana total, além de decréscimo na quantidade e qualidade 11
do leite produzido pelo animal/rebanho infectado. Isolados de Streptococcus 12
agalactiae possuem características bioquímicas bem definidas, o que facilita sua 13
identificação empregando um pequeno número de testes. Produzem hemólise do 14
tipo beta, não hidrolisam a esculina e não crescem em presença de bile-esculina 15
(KILLIAN, 1998). 16
Streptococcus uberis é um importante agente de infecções 17
subclínicas e episódios clínicos de mastite bovina em todo o mundo. Possuem 18
grande importância como microrganismos associados ao ambiente, especialmente 19
em sistemas de confinamento, que empregam camas de palha, onde pode alcançar 20
altas concentrações (HILLERTON; BERRY, 2003). Apresentam hemólise do tipo 21
alfa, hidrolisam a esculina, porém não crescem em presença de bile-esculina 22
(KILLIAN, 1998). 23
Santos et al. (2007) ressaltam que Streptococcus dysgalactiae é um 24
dos patógenos mais comuns de mastite bovina, responsável por causar grandes 25
perdas econômicas. Essa espécie não é obrigatória da glândula mamária, podendo 26
sobreviver na boca, vagina e pele de animais saudáveis, bem como nas camas e 27
pastagens. Segundo Santos e Fonseca (2007), S. dysgalactiae pode ser isolado das 28
tonsilas e causar infecção dos tetos por lambedura, sendo este o provável motivo da 29
alta frequência de mastite em novilhas e vacas secas. 30
Outras espécies causadoras de mastite ambiental compõem o 31
gênero dos estreptococos, tais como S. mitis, S. sanguis e S. mutans, porém, em 32
frequências menores. O fato é que, além de exercerem um importante papel como 33
patógenos da mastite, os estreptococos contribuem para as altas contagens de 34
26
bactérias do leite total de rebanhos. Além do mais, Hillerton e Berry (2003) 1
destacaram que os estreptococos ambientais podem ser responsáveis por até um 2
terço dos casos clínicos de mastite nos rebanhos onde os patógenos contagiosos já 3
foram controlados. 4
3.3.1.3 Corynebacterium spp. 5
Corynebacterium spp. foi descrito em 28 artigos consultados nessa 6
revisão, totalizando 62,2%. Foi relatado em 5 (11,1%) estudos como o segundo 7
principal patógeno causador de mastite. A prevalência do gênero Corynebacterium 8
spp. variou de 3,26% a 37,40%. O maior valor encontrado provém de um estudo 9
realizado por Ruiz et al. (2011) em 11 propriedades produtoras de leite bovino no 10
estado de Pernambuco. Castro et al. (2012), com o objetivo de verificar a 11
prevalência da mastite subclínica em municípios do estado do Rio de Janeiro, bem 12
como a etiologia da enfermidade, analisaram 75 amostras de leite no total e 13
obtiveram a menor porcentagem de Corynebacterium spp. isolados desse estudo 14
(3,26%). 15
O gênero Corynebacterium spp. é composto por 112 espécies, 16
entretanto, a espécie mais isolada em mastite bovina é a Corynebacterium bovis 17
(Karach et al., 2015). Bactérias pertencentes à essa espécie, são microrganismos 18
Gram-positivos, encontrados principalmente no interior da glândula mamária e no 19
ducto do teto. Possuem forma de bastonetes pleomórficos, aeróbios ou anaeróbios 20
facultativos, catalase positivos e fermentadores (BIER, 1990). 21
Possuem baixa patogenicidade e alta contagiosidade, com a 22
transmissão ocorrendo principalmente durante o momento da ordenha, sendo 23
classificados como causadores de mastite contagiosa. Segundo Santos e Fonseca 24
(2007), é detectado principalmente na forma subclínica da doença, o que de certa 25
forma garante proteção à glândula mamária contra outras células mais patogênica. 26
Watts (2000) destaca ainda que, frequentemente, as taxas de isolamento deste 27
patógeno são mais elevadas em rebanhos nos quais existem falhas com relação à 28
assepsia de tetos, principalmente no pós-dipping. 29
27
3.3.1.4 Escherichia coli 1
Escherichia coli foi descrito em 21 artigos consultados nessa 2
revisão, totalizando 46,6%. A prevalência da espécie E. coli variou de 0,36% a 3
21,64%. O maior valor encontrado foi resultante da avaliação da etiologia infecciosa 4
da mastite bovina propriedades leiteiras do Paraná, Santa Catarina e Rio Grande do 5
Sul, conduzida por Jobim et al. (2010). Martins et al. (2010), com o objetivo de 6
verificar a prevalência e etiologia infecciosa da mastite bovina em propriedades 7
leiteiras da microrregião de Cuiabá, estado de Mato Grosso, analisaram 279 8
amostras de leite no total e obtiveram a menor porcentagem de E. coli isolados 9
desse estudo (0,36%). 10
Tomazi e Santos (2015) citam a E. Coli como o principal coliforme 11
(microrganismo ambiental) causador de mastite clínica, podendo variar de 12
sintomatologia leve (com sinais inflamatórios na glândula mamária) a aguda, com 13
sinais sistêmicos, como estase ruminal, desidratação, choque, podendo levar até a 14
morte do animal acometido. Apesar de causar mastite principalmente na sua forma 15
clínica, o microrganismo também tem sido investigado em casos de mastite 16
subclínica. 17
No geral, os coliformes são bactérias Gram-negativas que 18
normalmente habitam o solo e o intestino das vacas. Elas se acumulam e se 19
multiplicam no esterco e na cama. Coliformes podem causar mastite apenas se 20
partículas contaminadas do ambiente entrarem em contato com o úbere. São 21
geralmente infecções transitórias e associadas com quadros clínicos agudos ou 22
superagudos, que podem ser fatais. Um dado importante para se destacar é que, 23
segundo Santos e Fonseca (2007), as vacas mais susceptíveis à manifestação 24
severa de mastite por coliformes são aquelas mais velhas, no início de lactação e de 25
maiores produções. 26
3.3.1.5 Outros agentes etiológicos 27
Em 36 artigos foram descritos outros agentes etiológicos 28
relacionados com a mastite em bovinos não citados anteriormente. Esses relatos 29
incluíram: Candida spp., Micrococcus spp., Proteus spp., Alcaligenes faecalis, 30
Enterobacter aerogenes, Klebsiella spp., Citrobacter spp., Salmonella spp., Yersinia 31
28
spp., Pseudomonas spp., Nocardia spp., Trueperella spp. e Serratia spp. 1
3.3.2 Resistência antimicrobiana 2
Os antibióticos foram introduzidos pela primeira vez na década de 3
1930 para tratar doenças infecciosas de seres humanos e animais, contribuindo 4
desse modo para melhorar a saúde humana e animal. O uso de antibióticos na 5
pecuária resultou em diversos benefícios, incluindo animais mais saudáveis e mais 6
produtivos, menor incidência de doenças e redução de índices de morbidade e 7
mortalidade associadas a doenças bacterianas. 8
Os medicamentos antimicrobianos são usados em fazendas 9
produtoras de leite para o tratamento de uma variedade de doenças que afetam as 10
vacas leiteiras, onde a mastite se destaca por ser uma das principais causas de uso 11
de antibióticos dentro das propriedades. Apesar de todos os benefícios desses 12
medicamentos, existe uma preocupação das perspectivas de saúde pública e de 13
segurança alimentar sobre os resíduos de antibióticos em alimentos destinados ao 14
consumo humano a partir de animais tratados com antibióticos e sobre o potencial 15
desenvolvimento e/ou transmissão de resistência antimicrobiana que possa impactar 16
o tratamento das doenças. 17
Portanto, o monitoramento da suscetibilidade antimicrobiana em 18
bactérias patogênicas e comensais em animais é recomendado pelo OIE (ACAR & 19
ROSTEL, 2001), o que torna possível gerar dados de importância para a terapêutica, 20
além de fornecer informações sobre possíveis tendências de resistência, auxiliando 21
em intervenções relacionadas ao uso de antimicrobianos. 22
No Brasil, ao contrário de outros países, mais de 20 princípios ativos 23
estão disponíveis comercialmente para tratamento da mastite (SANTOS e 24
FONSECA, 2007). Segundo Ribeiro (2008), os princípios ativos de antimicrobianos 25
mais utilizados pertencem às classes dos Beta-Lactâmicos (Penicilinas e 26
Cefalosporinas), Aminoglicosídeos e Tetraciclinas. Em um estudo realizado no Brasil 27
por Neto et al. (2015), foi observado que a classe dos Beta-Lactâmicos é a mais 28
difundida entre os antimicrobianos utilizados no tratamento de infecções em vacas 29
leiteiras na região sul do país, representando 38,22% do total de fármacos, seguido 30
da classe dos Aminoglicosídeos (25,19%), Tetraciclinas (15,41%), Macrolídeos 31
(7,59%) e Cefalosporinas (4,19%). 32
29
Os resultados das proporções da prevalência da resistência de cada 1
ano estudado nessa revisão são apresentados na Tabela 1. Conforme observado, 2
Ampicilina, Eritromicina, Gentamicina, Penicilina e Tetraciclina foram os 3
antimicrobianos mais frequentemente testados nos estudos realizados durante o 4
período de 2010 a 2018. 5
A Penicilina pertence à classe dos antibióticos Beta-Lactâmicos. 6
Segundo Costa (2013), uma grande variedade de Beta-Lactâmicos é utilizada em 7
vacas leiteiras, estando as Penicilinas entre as mais empregadas no tratamento de 8
doenças em vacas em lactação, fazendo parte dos antimicrobianos mais utilizados 9
no tratamento da mastite subclínica na medicina veterinária (ZAFALON et al., 2009). 10
Entretanto, nos resultados obtidos, este medicamento apresentou baixa eficiência 11
com as maiores taxas de incidência de resistências encontradas, variando de 0,34 12
no ano de 2011 a 0,88 em 2017. Segundo Cazoto et al. (2011), a Penicilina e seus 13
derivados são usualmente recomendados para o tratamento da mastite bovina 14
causada por patógenos Gram-positivos. No entanto, os autores relatam que houve 15
um aumento mundial de S. aureus resistentes a esse antibiótico. Nos Estados 16
Unidos, mais de 70% dos isolados obtidos de mastite causada por S. aureus são 17
resistentes à penicilina, enquanto na Irlanda e, principalmente no Brasil, o nível de 18
resistência é de cerca de 85%. 19
Diversos estudos nacionais assimilam a predominância de 20
resistência à Penicilina como a principal consequência relacionada ao seu uso geral 21
em medicina veterinária e ao seu uso indiscriminado em todo o país (FERREIRA et 22
al., 2010; OLIVEIRA, et al., 2011; CHAGAS et al., 2012; SENHORELLO et al., 2013; 23
SOUZA et al., 2016; VESCO et al., 2017; FREITAS, et al., 2018). Países com uma 24
política de uso prudente de agentes antimicrobianos em práticas veterinárias tendem 25
a demonstrar níveis mais baixos de resistência em comparação com outros países. 26
No Brasil, por exemplo, não existe controle da venda e uso de antimicrobianos de 27
uso veterinário, o que permite a livre comercialização dessas drogas, inclusive sem 28
prescrição de médico veterinário. Isso contribui, seguramente, para o surgimento de 29
resistências, devido à escolha inadequada da droga, via de administração, dosagem 30
e duração do tratamento. Além disso, existe ainda a ação dos vendedores que 31
privilegiam a venda direta deste medicamento aos criadores em detrimento a outros. 32
Outra causa de predominância de resistência para as Penicilinas 33
está ligada à capacidade de bactérias do gênero Staphylococcus spp. de 34
30
desenvolverem resistência à maioria dos antimicrobianos. A resistência aos Beta-1
Lactâmicos, como é o caso das Penicilinas, pode ocorrer por dois mecanismos 2
principais: através da produção de Beta-Lactamases, codificada pelo gene blaZ; e 3
pela alteração do sítio de ação do antimicrobiano, pela produção de uma proteína 4
ligante de penicilina modificada (PBP2a ou PBP2´) de baixa afinidade, codificada 5
pelo gene mecA (SOARES et al., 2012). O primeiro mecanismo ocorre através da 6
hidrólise enzimática pela ação da enzima Beta-Lactamase. De acordo com Nikaido 7
(2009), essas enzimas extracelulares, codificada pelo gene blaZ, clivam o anel beta-8
lactâmico dos Beta-Lactâmicos e degradam o antibiótico. Já o segundo mecanismo 9
de resistência, é pela aquisição do gene mecA, que confere resistência à meticilina, 10
e consequentemente, tornam os microrganismos intrinsecamente resistentes 11
também a outras drogas Beta-Lactâmicas, podendo apresentar resistência adicional 12
para Aminoglicosídeos, Macrolídeos, Tetraciclinas e Quinolonas (LEE, 2003). 13
Amicacina e Ceftiofur foram as drogas antimicrobianas que não 14
apresentaram variações significativas na prevalência da resistência dentro do 15
período de tempo avaliado. A resistência para Amicacina permaneceu em 0,04 16
durante os anos de 2015 e 2016. Para o Ceftiofur, os valores obtidos foram de 0,04 17
em 2010; 0,02 em 2011 e de 0,01 em 2015. 18
O Ceftiofur é um antimicrobiano pertencente à classe dos Beta-19
Lactâmicos (TAVARES, 1996), mais especificamente do grupo das Cefalosporinas 20
de terceira geração, de uso exclusivo em medicina veterinária. É um grupo que 21
apresenta espectro de ação notadamente maior diante de bactérias Gram-negativas 22
e menor atividade diante de Gram-positivas. Entretanto, o Ceftiofur aparece como 23
uma exceção, visto que apresenta boa efetividade contra bactérias Gram-positivas 24
(incluindo linhagens de S. aureus produtoras de beta-lactamases) (FREITAS et al., 25
2005). A administração intramamária do Ceftiofur é indicada para o tratamento da 26
mastite clínica e subclínica em vacas leiteiras em lactação, causadas principalmente 27
pelos gêneros Staphylococcus, Streptococcus e Corynebacterium. 28
31
Tabela 1. Ocorrência de cepas bacterianas resistentes à diferentes princípios de antimicrobianos* de acordo com artigos 1
científicos publicados de 2010 a 2018* (n= número total de cepas testadas). (Continua). 2
3
2010
2011
2012
2013
2015
2016
2017
2018
Amica. - - - - 0,04a (n=69) 0,04a (n=56) - -
Amox. - - - 0,59a (n=453) - 0,71a (n=17) 0,05b (n=313) 0,50a (n=30)
Amp. 0,68de(n=289) 0,27ab(n=154) 0,78e (n=242) 0,68de (n=805) 0,47c (n=232) 0,67cde (n=39) 0,18a (n=313) 0,48bcd (n=62)
Bacit. 0,41b (n=188) - - 0,08a (n=194) - - 0,07a (n=846) -
Cefalex. - 0,00a (n=65) - 0,01a (n=453) - 0,13b (n=56) 0,74c (n=869) 0,19b (n=32)
Cefalot. 0,13b (n=188) 0,30b (n=50) 0,00a (n=83) 0,01a (n=546) 0,13b (n=153) - - -
Cefoper. 0,20a (n=101) - - 0,50b (n=352) - - - -
Ceftiofur 0,04a (n=101) 0,02a (n=65) - 0,01a (n=546) - - - -
Cloranf. 0,26b (n=188) - 0,14b (n=180) 0,05a (n=194) 0,00a (n=69) 0,25b (n=32) - -
Enroflox. 0,21b (n=101) 0,02a (n=66) 0,00a (n=83) 0,01a (n=453) - - 0,03a (n=36) 0,09a (n=32)
Eritrom. 0,25cd(n=227) 0,16bc(n=116) 0,08ab(n=197) 0,04a (n=275) 0,39d (n=163) 0,23abcd(n=26) 0,20bc(n=120) 0,72e (n=32)
Estrept. 0,68b (n=188) - - 0,12a (n=453) - 0,24a (n=46) - -
Gentam. 0,20d (n=101) 0,03ab(n=156) 0,06bc(n=242) 0,02a (n=805) - 0,16cd (n=92) 0,75e(n=2100) 0,87e (n=30)
Neom. 0,39b (n=101) 0,03a (n=118) - 0,03a (n=546) - 0,43b (n=56) 0,73c(n=1880) -
32
Tabela 1. Ocorrência de cepas bacterianas resistentes à diferentes princípios de antimicrobianos* de acordo com artigos 1
científicos publicados de 2010 a 2018* (n= número total de cepas testadas). (Continuação). 2
Fonte: Autoria própria (2020). 3
*Dados referentes ao ano de 2014 e à associação Amoxacilina + A.C. foram omitidos devido a apenas uma entrada; 4
a, b, c, d, e: Proporções seguidas de letras iguais não diferiram pelo teste de qui quadrado combinado à 5% de significância. 5
Amica: Amicacina, Amox: Amoxacilina, Amp: Ampicilina, Bacit: Bacitracina, Cefalex: Cefalexina, Cefalot: Cefalotina, Cefoper: Cefoperazona, Cloranf: 6
Cloranfenicol, Enroflox: Enrofloxacina, Eritrom: Eritromicina, Estrept: Estreptomicina, Gentam: Gentamicina, Neom: Neomicina, Norflox: Norfloxacina, Oxac: 7
Oxaciclina, Penic: Penicilina, Rifamp: Rifampicina, Sulfatr: Sulfazotrim, Tetrac: Tetraciclina, Trimet: Trimetoprim, Vancom: Vancomicina. 8
2010
2011
2012
2013
2015
2016
2017
2018
Norflox. 0,26b (n=188) 0,07a (n=88) - 0,03a (n=282) - 0,12ab (n=26) - 0,09ab (n=32)
Oxac. 0,24b (n=328) 0,15b (n=114) 0,44c (n=339) 0,05a (n=453) 0,01a (n=69) 0,23bc (n=39)
Penic. 0,67b (n=328) 0,34a (n=115) 0,76b (n=369) 0,69b (n=805) 0,69b (n=153) 0,72b (n=102) 0,88c(n=1903) 0,61b (n=83)
Rifamp. 0,08b (n=227) - - 0,00a (n=259) 0,00a (n=69) 0,19b (n=26) - -
Sulfatr. 0,31c (n=227) - - 0,26bc (n=194) 0,00a (n=79) - - 0,09b (n=32)
Tetrac. 0,21a (n=39) 0,17a (n=153) 0,15a (n=369) 0,19a (n=805) 0,22a (n=232) 0,24a (n=88) 0,66b(n=2256) 0,26a (n=53)
Trimet. - - - - - 0,19a (n=26) 0,39b(n=2073) -
Vancom. 0,35c (n=227) - 0,19b (n=249) 0,05a (n=194) 0,04a (n=69) 0,15ab (n=26) - -
33
Segundo Motta (2015), o grupo das Cefalosporina (principalmente 1
Cefoperazona, Cefalexina e Ceftiofur), se apresenta atualmente como um dos 2
principais grupos de antimicrobianos disponíveis comercialmente para a terapêutica 3
intramamária da mastite na lactação e/ou na secagem em animais de produção, com 4
alta efetividade e baixos índices de resistência bacteriana. Autores como Dias et al. 5
(2015) e Casanova et al. (2016), conduzindo estudos com o objetivo de investigar a 6
sensibilidade antimicrobiana frente à utilização do Ceftiofur, obtiveram bons 7
resultados de 98,5% e 96,5% dos isolados sensíveis a esse antibiótico, 8
corroborando com trecho anteriormente ressaltado por Motta (2015). Cabe ressaltar 9
que, no presente estudo, o maior valor obtido para a prevalência da resistência no 10
grupo das Cefalosporinas foi observado para a Cefalexina com 0,74, no ano de 11
2017. 12
Em relação à Amicacina, este é um antimicrobiano pertencente à 13
classe dos Aminoglicosídeos, juntamente com a Gentamicina, Neomicina e 14
Estreptomicina. Essa classe de antibióticos tem sido utilizada no tratamento de 15
mastite desde 1960 (WHITTEM; HANLON, 1997), e na maioria das vezes estão 16
combinados com os Beta-Lactâmicos. São amplamente utilizados no tratamento de 17
infecções bacterianas em bovinos leiteiros, como nos casos de mastites, atuando 18
sobre vários organismos Gram-positivos e alguns Gram-negativos. Entretanto, de 19
acordo com Júnior (2006), estão entre as drogas com o maior potencial tóxico, tendo 20
como efeitos colaterais a nefrotoxicidade e ototoxicidade. Contudo, ainda de acordo 21
com o autor, o grupo está este entre os medicamentos mais utilizados para 22
tratamento de mastite, sendo também encontrado associado aos Beta-Lactâmicos 23
na composição de muitos dos medicamentos disponíveis no comércio. 24
Nessa revisão, poucos foram os estudos que avaliaram a eficácia da 25
Amicacina sobre isolados de mastite bovina. Entretanto, autores como Júnior et al 26
(2015) e Souza et al. (2016), relataram porcentagens de sensibilidade dos isolados 27
de 92,3% e 96,0%, demonstrando assim a eficácia da Amicacina em seus 28
resultados. A escassez de trabalhos investigando o uso dessa droga antimicrobiana 29
pode estar relacionada ao fato de que, entre os Aminoglicosídeos utilizados na 30
medicina veterinária, mais especificamente no tratamento da mastite, destaca-se a 31
Gentamicina. 32
Cabe ressaltar que, dentre a classe dos Aminoglicosídeos, tanto 33
para a Neomicina quanto para a Gentamicina, ocorreram variações significativas nos 34
34
últimos anos. Para a Neomicina, no ano de 2016 a 2017 foi observado um aumento 1
da resistência, com valores de 0,43 a 0,73, respectivamente. Não houveram dados 2
para a prevalência de resistência da neomicina no ano de 2018. No caso da 3
Gentamicina, os valores emergiram de 0,16 no ano de 2016 para 0,75 em 2017, 4
finalizando com 0,87 no ano de 2018. 5
Além da Gentamicina e Neomicina, o mesmo foi observado para a 6
Eritromicina. Esses foram os antimicrobianos que passaram a apresentar valores 7
crescentes de prevalência de resistência nos últimos dois anos estudados. Para a 8
eritromicina, a prevalência foi de 0,23 em 2016, reduzindo para 0,20 em 2017 e 9
atingindo 0,72 ano de 2018. 10
Diferentemente da Gentamicina e da Neomicina que pertencem à 11
classe dos Aminoglicosídeos, a Eritromicina é pertencente à classe dos Macrolídeos. 12
No Brasil, os antibióticos Macrolídeos estão disponíveis para o tratamento de 13
diversas infecções bacterianas agudas e crônicas em animais, incluindo casos de 14
mastite e com destaque para casos de Pneumonia (SANTOS et al, 2006). São ativos 15
principalmente contra bactérias Gram-positivas e moderados contra Gram-negativas. 16
Em medicina veterinária, os principais Macrolídeos de aplicação terapêutica são a 17
Eritromicina, Tilosina e Espiramicina. Diversos autores como, por exemplo, Krewer et 18
al. (2013) no estado da Bahia, Neres et al. (2015) em Sergipe e Ulsenheimer et al. 19
(2018) também no Rio Grande do Sul, relataram em seus estudos a porcentagem da 20
resistência dos isolados diante da Eritromicina, com valores em torno de 70,0%. 21
O aumento considerável da resistência aos três princípios ativos nos 22
últimos anos, pode estar ligada ao fato de que são antibióticos que passaram a ser 23
mais utilizados nos tratamentos de doenças bacterianas que acometem os bovinos 24
leiteiros, o que acaba contribuindo na pressão seletiva de microrganismos 25
resistentes aos mesmos. Além do mais, outras razões comuns podem justificar as 26
falhas da antibioticoterapia na mastite e levar ao aumento da resistência. Mota 27
(2015) cita como principais: distribuição inadequada do fármaco pelos fluidos e 28
tecidos da mama, ação reduzida no foco infeccioso e baixa sensibilidade do 29
microrganismo frente ao antimicrobiano. 30
3.4 CONCLUSÃO 31
Conclui-se que os microrganismos pertencentes ao gênero 32
35
Staphylococcus spp. foram citados como os principais patógenos associados à 1
mastite subclínica no Brasil, seguidos dos gêneros Streptococcus spp., 2
Corynebacterium spp. e bactérias do grupo coliformes, mais especificamente 3
Escherichia coli. 4
Por ser o antimicrobiano mais utilizado no tratamento da mastite 5
subclínica na medicina veterinária, a Penicilina foi o antibiótico com a maior 6
prevalência da resistência. Faz-se necessário também um alerta constante quanto 7
ao uso da Eritromicina, Gentamicina e Neomicina, visto que são antimicrobianos 8
com ocorrência de resistência emergente, a qual pode levar ao comprometimento da 9
eficiência desses antimicrobianos no tratamento das mastites. 10
Vale ressaltar que uma forma de evitar a disseminação desta 11
resistência deve ser por meio da realização de testes de cultura e antibiograma, pois 12
estes auxiliam na identificação do agente e na escolha do tratamento correto, e 13
fornecem informações relevantes para a determinação de estratégias de manejo e 14
prevenção de novos casos. 15
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causadores de mastite e a susceptibilidade aos antimicrobianos. Expressa 22
Extensão, v.22, n.1, p.34-50. 23
24
VIÇOSA, G.N.; MORAES, P.M.; YAMAZI, A.K.; NERO, L.A. Enumeration of 25
coagulase and thermonuclease-positive Staphylococcus spp. in raw milk and fresh 26
soft cheese: An evaluation of Baird-Parker agar, Rabbit Plasma Fibrinogen agar and 27
the Petrifilm™ Staph Express count system. Food microbiology, v.27, n.4, p.447-28
452, 2010. 29
30
WATTS, J.L. Etiological agents of bovine mastitis. Veterinary microbiology, v.16, 31
p.41-66, 2000. 32
33
WHITTEM, T.; HANLON, D. Dihydrostreptomycin or streptomycin in combination with 34
44
penicillin in dairy cattle therapeutics: a review general principles and mechanisms for 1
selected classes of antibiotics. In and re-analysis of published data, Part 1: Clinical 2
pharmacology. New Zealand Veterinay Journal, v.45, p.178-184, 1997. 3
4
ZAFALON, L.F.; ARCARO, J.R.P.; NADER FILHO, A. et al. Staphylococcus aureus 5
portadores de genes de toxinas isolados em amostras de diferentes fontes de 6
transmissão durante a ordenha. Revista do Instituto Adolfo Lutz, v.68, n.2, p.269-7
277, 2009. 8
9
ZOCCAL, R. A força do agro e do leite no Brasil. 2017. Disponível em: 10
<http://www.baldebranco.com.br/>. Acesso em: 02 jul. 2019. 11
45
4 OBJETIVOS 1
4.1 OBJETIVO GERAL 2
Identificar a etiologia da mastite bovina subclínica e a sensibilidade 3
de seus agentes etiológicos aos antibióticos em propriedades leiteiras do estado do 4
Paraná. 5
6
4.2 OBJETIVO ESPECÍFICOS 7
Descrever os achados microbiológicos das amostras de leite através 8
de frequências absoluta e relativa. 9
Verificar a prevalência de resistência para diferentes antibióticos. 10
Comparar a prevalência de resistência dos isolados de acordo com a 11
mesorregião. 12
Determinar as possíveis bactérias associadas ao desenvolvimento 13
de mastite em bovinos. 14
46
ARTIGO CIENTÍFICO 1
Etiologia e sensibilidade bacteriana de mastite subclínica bovina em 2
propriedades do noroeste e centro-ocidental do estado do Paraná 3
4
Resumo 5
6
A mastite se caracteriza pela inflamação da glândula mamária, geralmente de 7
caráter infeccioso, sendo considerada a principal causa na redução da produção e 8
qualidade do leite, além de apresentar grandes riscos à saúde pública. Nesse 9
contexto, esse estudo teve como objetivo avaliar a etiologia e a sensibilidade aos 10
antimicrobianos de microrganismos isolados de amostras de leite oriundas de 11
diversas propriedades leiteiras comerciais das mesorregiões noroeste e centro-12
ocidental do estado do Paraná. As amostras de leite foram coletadas a partir de 13
quartos mamários que apresentavam indicação de mastite subclínica. Foram 14
analisadas 360 amostras da mesorregião noroeste e 118 amostras do centro-15
ocidental. Streptococcus mutans foi o microrganismo mais isolado nas amostras 16
oriundas do noroeste, totalizando 19,2% dos isolamentos. No centro-ocidental, 17
Streptococcus spp. foi identificado em 36,3% das amostras, totalizando a maior parte 18
das amostras. O antibiograma foi realizado pelo método de difusão de disco, sendo 19
testados os seguintes antibióticos: associação de Amoxicilina + Ácido Clavulânico 20
(AMC) com 30 μg/disco, associação de Gentamicina + Amoxicilina (GEN), e Ceftiofur 21
(CTF) com 30 μg/disco. Gentamicina + Amoxacilina foi o antimicrobiano mais efetivo 22
frente aos isolados testados no noroeste, com índice de sensibilidade de 85,4%. No 23
centro-ocidental, Ceftiofur foi o antimicrobiano mais efetivo, com índice de 24
sensibilidade de 90,6%. Os resultados evidenciaram a presença de bactérias 25
ambientais e contagiosas nos rebanhos estudados, alertando para os cuidados na 26
ordenha. As variações dos resultados de resistência entres os dois locais resultados 27
reforçam a necessidade da realização periódica de testes de sensibilidade in vitro. 28
29
Palavras-chave: antimicrobiano, antibiograma, glândula mamária, resistência 30
bacteriana, sanidade animal 31
47
Etiology and bacterial sensitivity of subclinical bovine mastitis in Northwestern 1
and Western Center properties of the state of Paraná 2
3
Abstract 4
5
Mastitis is characterized by inflammation of the mammary gland, usually infectious, 6
being considered the main cause in reducing milk production and quality and, 7
consequently, significant economic losses. Administration of antimicrobial 8
intramammary drugs is the most frequently used method for treating bovine mastitis. 9
However, indiscriminate use of antibiotics can lead to the emergence of resistant 10
strains. In this context, this study aimed to evaluate the etiology and antimicrobial 11
susceptibility of microorganisms isolated from milk samples from various commercial 12
dairy properties in the Northwest and Western Center mesoregions of the state of 13
Paraná. Milk samples were collected from the fourth positive breast for the CMT test, 14
which indicated subclinical mastitis. Three hundred and sixty samples from the 15
Northwest mesoregion and one hundred and eighteen samples from the Western 16
Center were analyzed. Streptococcus mutans was the most isolated microorganism 17
in samples from the northwest, totaling 19.2% of the isolates. In the western center, 18
Streptococcus spp. was identified in 36.3% of the samples, totaling most of the 19
samples. The antibiogram was performed by the disc diffusion method, and the 20
following antibiotics were tested: Amoxicillin + Clavulanic Acid (AMC) at 30 μg/disc, 21
Gentamicin + Amoxicillin (GEN), and Ceftiofur (CTF) at 30 μg/disc. Gentamicin + 22
Amoxacillin was the most effective antimicrobial against the isolates tested in the 23
Northwest, with a sensitivity index of 85.4%. In the Western Center, Ceftiofur was the 24
most effective antimicrobial, with a sensitivity index of 90.6%. The results showed the 25
presence of environmental and contagious bacteria in the studied herds, alerting for 26
care in milking. The variations in the resistance results between the two locations 27
reinforce the need for periodic sensitivity testing in vitro. 28
29
Key-words: animal health, antibiogram, antimicrobial, bacterial resistance, mammary 30
gland 31
48
INTRODUÇÃO 1
A atividade da bovinocultura leiteira é um dos principais ramos de 2
produção animal do Brasil com importante participação na economia do país. Dentro 3
dessa atividade, a inflamação da glândula mamária ou mastite está entre as 4
principais doenças que comprometem a rentabilidade da pecuária de leite pelo fato 5
de levar a redução da produção e alterar a composição físico-química do leite, 6
causando grandes prejuízos aos produtores (KREWER et al., 2013). A doença 7
constitui ainda um risco a saúde pública, devido à veiculação de patógenos e suas 8
toxinas, ou pela presença de resíduos de antibióticos no leite (COSTA et al., 2013). 9
Além da sua importância em saúde pública, fatores como custos de 10
tratamento dos casos clínicos, descarte e morte prematura dos animais, somados 11
aos prejuízos da indústria por redução na qualidade e rendimento na fabricação de 12
derivados são responsáveis pelo elevado impacto econômico das mastites (BUENO 13
et al., 2002). 14
As bactérias são as principais causas de mastite e os patógenos 15
mais comuns envolvidos são aqueles pertencentes aos gêneros Staphylococcus, 16
Streptococus e Corynebacterium (MELLO et al., 2012). Por esse motivo, diversas 17
drogas antimicrobianas tem sido amplamente utilizadas para o tratamento e controle 18
da doença. No entanto, o uso incorreto e indiscriminado desses medicamentos tem 19
contribuído para a ocorrência de cepas bacterianas resistentes aos mesmos. 20
A resistência antimicrobiana não é um fenômeno recente, mas 21
atualmente é um problema de saúde que tem preocupado a todos. Por muitas 22
décadas, as bactérias geralmente envolvidas em infecções comuns sofreram uma 23
pressão artificial de seleção devido ao uso abusivo de antimicrobianos, o que 24
contribuiu para a persistência de populações de bactérias geneticamente 25
resistentes. 26
As informações sobre a ocorrência de resistência são necessárias 27
não apenas localmente, mas também regional e internacionalmente, para que seja 28
possível detectar variações que exijam estratégias de intervenção. Para atender a 29
esses requisitos, são necessários sistemas de monitoramento contínuo para verificar 30
mudanças na ocorrência de resistência, otimizando estratégias de tratamento e 31
controlando o aumento da resistência de microrganismos a antimicrobianos 32
(AARESTRUP, 2004). 33
49
Nesse contexto, o objetivo desse trabalho foi avaliar os perfis 1
etiológicos e de suscetibilidade in vitro de cepas bacterianas isoladas de casos de 2
mastite subclínica em rebanhos leiteiros das mesorregiões noroeste e centro-3
ocidental do estado do Paraná, visando contribuir com o direcionamento para 4
medidas profiláticas e de controle específico para esses rebanhos. 5
50
MATERIAL E MÉTODOS 1
Os procedimentos utilizados nesse estudo foram aprovados pelo Comitê de Ética 2 Para Uso de Animais (CEUA) da Universidade Pitágoras Unopar sob o protocolo 3 024/19. 4
OBTENÇÃO DAS AMOSTRAS DE LEITE 5
Para este estudo, foram coletadas amostras de leite de vacas em 6
lactação diagnosticadas com mastite subclínica oriundas de diversos rebanhos de 7
propriedades comerciais produtoras de leite localizadas nas mesorregiões noroeste 8
e centro-ocidental paranaense. Foram abrangidas propriedades dos municípios de 9
Tapejara, Umuarama, Tuneiras do Oeste, Santa Cruz de Monte Castelo, Santa 10
Isabel do Ivaí, Planaltina do Paraná, Cianorte, Querência do Norte, Loanda e 11
Amaporã, pertencentes ao noroeste; e dos municípios de Janiópolis, Goioerê e 12
Moreira Sales, pertencentes ao centro-ocidental (Figura 1). 13
14
15
16
Fonte: Autoria própria (2020). 17
Figura 1. Distribuição espacial dos municípios em que os rebanhos leiteiros foram
amostrados nas mesorregiões noroeste e centro-ocidental do estado do Paraná.
51
As amostras de leite dos tetos foram colhidas de acordo com os 1
procedimentos recomendados por Oliver et al. (2004). Foram coletadas amostras de 2
aproximadamente 5 mL de leite de cada teto antes do início da ordenha. Estas 3
amostras foram acondicionadas em caixas isotérmicas com gelo e encaminhadas ao 4
laboratório de Microbiologia Veterinária da Universidade Pitágoras Unopar (campus 5
Arapongas). 6
ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DOS MICRORGANISMOS 7
O isolamento foi realizado de acordo com a metodologia proposta 8
por Koneman et al. (2018). A identificação dos gêneros isolados foi realizada através 9
de estudo morfológico das colônias, bem como por verificação ao microscópio das 10
características tintoriais e da morfologia do agente corado pela técnica de Gram 11
conforme Quinn et al. (1994). 12
A confirmação dos gêneros e a determinação de espécies 13
resultaram de provas bioquímicas complementares empregadas conforme o Oliver et 14
al. (2004) e Quinn et al. (1994). As provas das séries bioquímicas permitiram 15
identificar as espécies das bactérias por características do seu metabolismo, como a 16
capacidade de degradar determinados substratos e produzir gases. Desse modo, 17
para a identificação das espécies dos isolados pertencentes ao gênero 18
Staphylococcus spp., foram realizadas apenas as provas bioquímicas da coagulase 19
e manitol. Para o gênero Streptococcus spp. foram realizados as provas de sorbitol, 20
manitol, arginina e esculina. É importante destacar que, para isolados do gênero 21
Streptococcus spp. que apresentaram hemólise do tipo beta, não foram realizados 22
testes bioquímicos e estes foram classificados diretamente como Streptococcus 23
agalactiae. Para os isolados pertencentes ao gênero Corynebacterium spp. não 24
foram realizados testes de identificação de espécie. 25
De acordo com os resultados, as espécies foram identificadas 26
seguindo o diagrama proposto por Koneman et al. (2018) (Figuras 2 e 3). 27
52
1
Fonte: Adaptado de Koneman et al. (2018). 2
3
4
Fonte: Adaptado de Koneman et al. (2018). 5
TESTE DE SENSIBILIDADE A ANTIMICROBIANOS (ANTIBIOGRAMA) 6
Os isolados foram submetidos aos testes de sensibilidade in vitro a 7
partir da técnica de difusão em disco em placas de ágar Müeller-Hinton, seguindo os 8
padrões do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2018). Os 9
antimicrobianos testados nesse trabalho foram: associação de amoxicilina + ácido 10
Figura 2. Diagrama de fluxo para identificação das espécies de Streptococcus spp.
Figura 3. Diagrama de fluxo para identificação das espécies de Staphylococcus spp.
53
clavulânico (AMC) com 30 μg/disco, associação de gentamicina + amoxicilina (GEN), 1
e ceftiofur (CTF) com 30 μg/disco. 2
Posteriormente, as placas foram incubadas em estufa por 24h a 3
37ºC. A leitura das zonas de inibição do crescimento microbiano foi realizada por 4
meio da medição dos halos, com o auxílio de um paquímetro. Para a interpretação 5
dos resultados, foi utilizada uma tabela contendo os limites de diâmetros dos halos 6
para cada antimicrobiano estabelecidos pelo CLSI (CLSI, 2018). Conforme os 7
resultados, os isolados foram divididos em duas categorias de cepas, sendo estas 8
sensíveis ou resistentes. 9
ANÁLISE ESTATÍSTICA 10
Os dados obtidos foram tabulados, tratados e submetidos à análise 11
estatística descritiva de frequência absoluta e relativa para os achados 12
microbiológicos e de resistência antimicrobiana através do software MICROSOFT 13
EXCEL®. 14
Após tabulados, os dados de resistência antimicrobiana das duas 15
mesorregiões foram submetidos ao teste de Qui-quadrado com significância de 5%, 16
com o auxílio do software STATISTICA®. 17
Para o cálculo da prevalência de resistência aos antimicrobianos, os 18
dados descritivos foram submetidos à seguinte fórmula: 19
20
Prevalência= ___número de cepas resistentes___ 21
número total de cepas testadas 22 S 23
54
RESULTADOS E DISCUSSÃO 1
Foram analisadas 478 amostras de leite provenientes de bovinos 2
com mastite subclínica dos municípios pertencentes às mesorregiões noroeste e 3
centro-ocidental do estado do Paraná. Do total de amostras, 360 foram oriundas da 4
mesorregião noroeste e 118 da mesorregião centro-ocidental. 5
Os resultados dos exames microbiológicos das amostras estudadas 6
estão apresentados na Tabela 1 e 2. Na mesorregião noroeste, foram isolados 7
microrganismos em 63,6% (229/360) das amostras e em 36,4% (131/360) não houve 8
crescimento microbiano após o período de incubação. Quanto à mesorregião centro-9
ocidental, foram analisadas 118 amostras de leite, das quais 55,93% (66/118) 10
apresentaram crescimento bacteriológico e em 44,07% (52/118) não houve 11
crescimento microbiológico após a incubação. 12
13
Tabela 1. Frequências absoluta e relativa de amostras com e sem crescimento de 14
microrganismos isolados de amostras de leite de bovinos com mastite subclínica no 15
noroeste e centro-ocidental do Paraná. 16
Noroeste
Centro-Ocidental
Crescimento
Frequência absoluta
Frequência relativa (%)
Frequência absoluta
Frequência relativa (%)
Negativo 131 36,4 52 44,07
Positivo 229 63,6 66 55,93
Total 360 100 118 100
Fonte: Autoria própria (2020). 17
18
Aproximadamente 50,0% das culturas de mastites clínicas e 19
subclínicas podem apresentar resultados negativos (LANGONI et al., 2009). Esse 20
fato pode ser resultante do possível desaparecimento espontâneo do 21
microrganismo, destruição desse pelo processo inflamatório na glândula mamária ou 22
por resíduo de antibiótico, pela eliminação intermitente do agente em casos de 23
infecção crônica ou pela presença reduzida do agente no leite, o que dificulta o 24
crescimento in vitro em laboratório. Além disso, em alguns casos, torna-se 25
necessário a utilização de métodos especiais de cultura, visto que alguns patógenos 26
causadores de mastite exigem condições diferenciadas para a sua multiplicação e 27
identificação. 28
55
IDENTIFICAÇÃO DOS MICRORGANISMOS 1
Streptococcus e Staphylococcus spp. foram os dois principais 2
gêneros isolados nas duas mesorregiões estudadas (Tabela 2). Os principais 3
patógenos contagiosos causadores de mastite em bovinos são aqueles pertencentes 4
a esses dois gêneros (MESQUITA, 2017). Esses microrganismos podem causar 5
tanto mastite contagiosa, como é o caso de Staphylococcus aureus e Streptococcus 6
agalactiae, quanto mastite ambiental, com destaque para as demais espécies de 7
Streptococcus spp., como S. uberis, S. dysgalactiae, S. bovis e S. parauberi. 8
9
Tabela 2. Frequências absoluta e relativa quanto aos microrganismos isolados de 10 amostras de leite de bovinos com mastite subclínica no noroeste e centro-ocidental 11 do Paraná. 12
Noroeste
Centro-Ocidental
Microrganismo
Frequência absoluta
Frequência relativa (%)
Frequência absoluta
Frequência relativa (%)
Streptococcus mutans 44 19,2 0 0
Streptococcus sanguis 42 18,3 0 0
Streptococcus uberis 32 14,0 5 7,5
Streptococcus mitis 9 4,0 0 0
Streptococcus sobrinus 7 3,0 0 0
Streptococcus agalactiae 1 0,4 0 0
Streptococcus spp. 0 0 24 36,3
Staphylococcus aureus 26 11,3 5 7,5
Staphylococcus epidermidis 9 4,0 2 3,0
Staphylococcus hyicus 5 2,1 0 0
Staphylococcus spp. 0 0 22 33,3
Bacillius spp. 19 8,2 3 4,5
Trueperella spp. 9 4,0 0 0
Corynebacterium spp. 3 1,3 4 6,0
Leveduras 1 0,4
0
0
Infecção mista
Strepto. spp.+ Staphylo. spp. 19 8,3 1 1,5 Strepto. spp.+ Staphylo. spp. + Corynebacterium spp. 1 0,4
0
0
Trueperella spp. + Strepto. spp. 2 0,9 0 0
Total 229 100 66 100
Fonte: Autoria própria (2020). 13
14
Neste estudo, é importante destacar a alta frequência de isolamento 15
56
do gênero Streptococcus spp., uma vez que esta não é uma bactéria comumente 1
apontada como a principal e mais frequente causadora de mastite nos trabalhos de 2
levantamento dos patógenos causadores da doença. Em diversos outros estudos 3
realizados no Brasil, o gênero Staphylococcus spp. foi apontado como o principal 4
causador de mastite (OLIVEIRA et al, 2009; SANTOS et al, 2010; MENDONÇA et al, 5
2011; SOUZA et al, 2016; ZIMERMANN et al, 2017; VALMORBIDA et al, 2017). 6
Entretanto, Karach et al. (2016) avaliando a etiologia da mastite na 7
região sudoeste do Paraná e Tomazi et al. (2017) avaliando rebanhos de São Paulo 8
e Minas Gerais, obtiveram resultados que apontaram o gênero Streptococcus spp. 9
como o mais frequentemente observado, seguido pelo gênero Staphylococcus spp., 10
dados se assemelham aos obtidos no presente estudo. Em estudos realizados em 11
outros países, como o de Bradley et al. (2007) na Inglaterra e País de Gales, de 12
Verbek et al. (2014) na Bélgica e de Oliveira et al. (2013) nos Estados Unidos, todos 13
com o objetivo de identificar os patógenos associados à mastite em determinados 14
rebanhos desses locais, também obtiveram maiores frequências de isolamentos de 15
estreptococos quando comparados aos estafilococos. 16
A maior frequência nos isolamentos de bactérias do gênero 17
Streptococcus spp. nas duas mesorregiões do Paraná, diferentemente de outros 18
estudos citados anteriormente, sugere que um enfoque diferente na prevenção de 19
mastites é necessário para cada local (OLIVEIRA et al., 2013). 20
Segundo Wattiaux (1999), é importante ressaltar que dentre os 21
estreptococos, com exceção da espécie S. agalactiae, são bactérias que estão 22
presentes principalmente no local em que o animal vive, responsáveis por causar a 23
mastite ambiental. Desse modo, a alta taxa de isolamento deste gênero pode estar 24
relacionado com a presença de umidade e dejetos na sala de ordenha das 25
propriedades estudadas e também da escassez de práticas de antissepsia pré e pós 26
ordenha. 27
Além disso, durante o período seco, geralmente os animais 28
permanecem em locais úmidos e sujos, o que resulta em alto nível de exposição das 29
extremidades dos tetos aos patógenos do ambiente (GODDEN, 2004). Desse modo, 30
o manejo ambiental durante o período seco das vacas pode ter grande impacto na 31
incidência de mastite causada por patógenos ambientais na lactação subsequente 32
(BRADLEY; GREEN, 2000), fato esse que pode ter contribuído com os resultados 33
desse estudo. 34
57
Considerando o gênero dos estreptococos, S. mutans foi a espécie 1
mais encontrada, com 19,2% (44/229) dos isolamentos no noroeste, seguido pelas 2
espécies S. sanguis com 18,3% (42/229) e S. uberis com 14,0% (32/229). Em 3
menores porcentagens, foram isoladas as espécies S. mitis com 4,0% (9/229), S. 4
sobrinus com 3,0% (7/229) e S. agalactiae com 0,4% (1/229) (Tabela 2). No centro-5
ocidental 7,5% (5/229) das amostras foram identificadas como pertencentes à 6
espécie S. uberis 7
Bramley et al. (1996) ressaltam que é fundamental identificar vacas 8
que apresentem glândula mamária infectada por S. agalactiae para que se possa 9
estabelecer medidas de controle, uma vez que dadas as características contagiosas 10
da disseminação e infecção, esse patógeno constitui importante fonte de infecção 11
dentro dos rebanhos. 12
O achado de 19,2% de Streptococcus mutans foi surpreendente, 13
uma vez que esta não é uma bactéria ambiental comum nos trabalhos de 14
levantamento dos patógenos causadores de mastite. Diferentemente desse, em 15
outros trabalhos como o conduzido por Tomazi et al. (2017) em São Paulo e Minas 16
Gerais, o principal patógeno ambiental encontrado foi o S. uberis, em 17,4% 17
(256/2212) das amostras que apresentaram crescimento microbiano. Resultado 18
semelhante foi obtido por Valmorbida et al. (2017), onde com o objetivo de 19
determinar a prevalência de agentes causadores de mastite em bovinos no centro-20
oeste de Santa Catarina, obtiveram a frequência de 21,7% (75/345) para esse 21
mesmo microrganismo. 22
O fato é que são microrganismos ambientais, o que sugere que os 23
maiores problemas são de ordem higiênica e de manejo no intervalo entre as 24
ordenhas. Além disso, a elevada quantidade de amostras com S. mutans pode ser 25
devido à ação do próprio homem que tem combatido os patógenos clássicos 26
causadores de mastite, permitindo que outros organismos se instalem e provoquem 27
doença. Segundo Bradley (2002), para o controle da mastite ambiental, são 28
necessárias medidas higiênico-sanitárias do ambiente dos animais. 29
Em relação ao gênero dos estafilococos, três espécies foram 30
encontradas nesse estudo. Staphylococcus aureus foi o patógeno mais observado 31
na região noroeste, com 4,0% (26/229) dos isolamentos, seguido por 32
Staphylococcus epidermidis com 22,5% (9/229) e Staphylococcys hyicus com 2,1% 33
(5/229). Na mesorregião centro-ocidental, em 33,3% (22/229) das amostras não foi 34
58
possível realizar a identificação das espécies isoladas. Em 7,5% (5/229) das 1
amostras foram identificados microrganismos pertencentes à espécie 2
Staphylococcus aureus e em 3,0% (2/229) pertencentes à Staphylococcus 3
epidermidis (Tabela 2). 4
Embora muitos microrganismos possam acometer a região 5
intramamária causando infecção, o S. aureus é o principal agente etiológico 6
responsável pela mastite bovina crônica. A presença desse microrganismo nas 7
amostras de leite analisadas é condizente com a literatura e reflete a dificuldade em 8
controlá-lo. As taxas de isolamentos são variáveis de acordo com diferentes autores, 9
entretanto, o mesmo tem sido considerado como de maior significado nas infecções 10
do tipo contagiosa. Cunha et al. (2015) com o objetivo de identificar os agentes 11
etiológicos de mastite e determinar a prevalência da doença em rebanhos leiteiros 12
do município de Viçosa (MG), constataram a presença de Staphylococcus aureus 13
em 28,3% das amostras (110/388). Ao avaliar a ocorrência, etiologia infecciosa e os 14
fatores de risco associados à mastite em 16 propriedades leiteiras localizadas na 15
região de Marechal Cândido Rondon (PR), Jardim et al. (2014) obtiveram o 16
isolamento de 47,2% de S. aureus de 329 amostras testadas. Já Brito et al. (2014) 17
ao pesquisar a prevalência e a etiologia da mastite em bovinos da bacia leiteira da 18
Ilha de São Luís (MA) identificaram 14,46% (35/242) de isolados do microrganismo. 19
O isolamento de patógenos como S. aureus reforça a necessidade 20
da adoção de medidas de profilaxia e controle de mastite e boas práticas para 21
obtenção de ordenha higiênica, visto que a principal via de veiculação dessa 22
bactéria são as mãos dos ordenhadores, utensílios e equipamentos utilizados em 23
comum durante a ordenha. Além do mais, indica que dentro do rebanho existem 24
animais portadores de mastite, tornando os animais sadios susceptíveis a uma 25
possível contaminação por este microrganismo (RIBEIRO et al., 2014). 26
Staphylococcus coagulase negativo (SCN) tais como S. epidermidis 27
e S. hyicus são frequentemente isolados de rebanhos leiteiros e estão geralmente 28
associados a casos subclínicos ou clínicos de intensidade leve (OLIVEIRA et al. 29
2011). Santos et al. (2010), destacaram que SCN fazem parte de um grupo muito 30
heterogêneo de microrganismos, frequentemente encontrados no ambiente e 31
equipamentos dos estabelecimentos de ordenha. Embora as espécies de SCN 32
sejam menos virulentas que S. aureus, elas geralmente exibem maior resistência 33
antimicrobiana e frequentemente apresentam multirresistência aos antibióticos 34
59
(BANSAL et al., 2015). 1
A frequência dos SCN nos diversos estudos pesquisados é bastante 2
variável. Martins et al. (2010) verificando a prevalência e etiologia infecciosa da 3
mastite bovina em propriedades leiteiras da microrregião de Cuiabá (MT), obtiveram 4
o resultado de apenas 0,7% de estafilococos coagulase negativo (2/279). 5
Diferentemente desse estudo, Brito et al. (2014) ao avaliarem a etiologia da mastite 6
em bovinos da bacia leiteira da Ilha de São Luís (MA), constaram a porcentagem de 7
26,8% (65/242) de SCN. 8
Outros gêneros de importância em quadros de mastite também 9
foram encontrados nesse estudo. Na mesorregião noroeste, em 4,0% (9/229) e em 10
1,3% (3/229) das amostras foi possível identificar os gêneros Trueperella spp. e 11
Corynebacterium spp., respectivamente. Leveduras também foram observadas, 12
entretanto em uma única amostra, totalizando 0,4% (1/229) (Tabela 2). 13
Diferentemente da mesorregião noroeste, no centro-ocidental não 14
foram observados isolamentos do gênero Trueperella spp. e de Leveduras, apenas 15
Corynebacterium spp. foi isolado em 6,0% (4/229) das amostras em sequência aos 16
estreptococos e estafilococos (Tabela 2). 17
Em estudos de prevalência em rebanhos de microrganismos 18
causadores de mastite, outro patógeno frequentemente isolado é o Corynebacterium 19
spp. Esse gênero é composto por 112 espécies, entretanto, a espécie mais isolada 20
em mastite bovina é a Corynebacterium bovis (KARACH et al., 2015), responsável 21
por causar mastite contagiosa nos rebanhos. 22
Filho et al. (2006) avaliando os principais agentes etiológicos 23
envolvidos com a mastite em 90 amostras de leite oriundas de uma propriedade na 24
cidade de Tamarana/PR, obtiveram a frequência de 6,6% (6/90) isolamentos de 25
Corynebacterium spp., assemelhando-se com os resultados encontrados no centro-26
ocidental. Oliveira et al. (2009) com o objetivo de determinar a ocorrência da mastite 27
bovina nos rebanhos dos Tabuleiros Costeiros de Sergipe, avaliando 433 28
microrganismos isolados de amostras de leite, obtiveram a porcentagem de 1,68% 29
(16/433) de Corynebacterium spp., resultado que se assemelha ao encontrado na 30
mesorregião noroeste desse estudo. 31
Em estudos conduzidos por outros autores como Martins et al. 32
(2010), Melo et al. (2013), Senhorelo et al. (2013), Jardim et al. (2014), Zimermann e 33
Araújo (2017) e por Assis et al. (2017), o isolamento de cepas de Corynebacterium 34
60
spp. foi maior do que o encontrado nesse estudo, com valores que variaram de 1
10,2% a 27,6%. 2
Todos esses estudos demonstraram a presença de mastite 3
subclínica contagiosa no rebanho com o isolamento dessa bactéria das amostras 4
testadas. A propagação do Corynebacterium bovis é rápida durante a ordenha 5
quando não há antissepsia adequada dos tetos antes ou depois da ordenha. Por 6
esse motivo, pode ser considerado como indicador da eficiência dos procedimentos 7
de imersão dos tetos, sendo um valioso indicador dos procedimentos de desinfecção 8
nas ordenhas (RADOSTITS et al., 2002). Portanto, o isolamento deste agente pode 9
ser justificado pela ausência de medidas higiênico-sanitárias na ordenha dos 10
animais com mastite (VANDERLEI et al., 2011). 11
Dentre o gênero Trueperella spp., a espécie causadora de mastite 12
em vacas é a Trueperella pyogenes. São bactérias encontradas nas membranas 13
mucosas dos animais domésticos responsáveis por causar infecções mamárias 14
caracterizadas por processos purulentos de difícil tratamento, entretanto não são 15
microrganismos frequentemente isolados em casos de mastites nos diversos 16
estudos no Brasil. A frequência de 3,9% (9/229) desse microrganismo no noroeste 17
paranaense pode estar relacionado a falta de higienização na sala de ordenha, visto 18
que a infecção mamária por essa espécie é mais frequente em locais com excesso 19
de umidade, acúmulo de sujidades e matéria orgânica, particularmente no ambiente 20
da pré e pós ordenha (DOMINGUES et al., 2008), o que caracteriza o microrganismo 21
como agente ambiental na casuística da mastite bovina (RADOSTITS et al., 2007). 22
Ainda de acordo com Radostits et al. (2007), as mastites em vacas 23
por Trueperella pyogenes são popularmente reconhecidas como "mastite de verão", 24
em virtude da veiculação do agente para as vacas por moscas, cuja proliferação é 25
favorecida em períodos do ano com altas temperatura e pluviosidade. 26
Em 9,6% (22/229) das amostras do noroeste, ocorreram casos de 27
infecção mista, gerados pela associação de dois ou três agentes etiológicos 28
causadores de mastite. Em 8,3% (19/229) houve o crescimento de Streptococcus 29
spp. + Staphylococcus spp.; em 0,9% (2/229) foram isolados Trueperella spp. + 30
Streptococcus spp. e em 0,4% (1/229) das amostras constatou-se associação dos 31
três agentes etiológicos Streptococcus spp. + Staphylococcus spp. + 32
Corynebacterium spp. Em uma única amostra da mesorregião centro-ocidental foi 33
observado ocorrência de infecção mista, ocasionada pela associação de dois 34
61
microrganismos, sendo estes Streptococcus spp. + Staphylococcus spp, totalizando 1
1,52% (1/66) (Tabela 2). 2
SENSIBILIDADE E RESISTÊNCIA AOS ANTIMICROBIANOS 3
Os resultados dos testes de sensibilidade in vitro a antimicrobianos 4
dos agentes isolados estão descritos nas Tabelas 3 e 4. 5
Considerando apenas a mesorregião noroeste, foram realizados 540 6
antibiogramas no total, sendo 181 amostras testadas para o Ceftiofur, 180 para a 7
Amoxicilina + Ácido Clavulânico e 179 para a associação de Gentamicina + 8
Amoxacilina (Tabela 3). 9
10
Tabela 3. Frequências absoluta e relativa quanto aos microrganismos isolados de 11
amostras de leite de bovinos com mastite subclínica no noroeste e centro-ocidental 12
do Paraná. 13
Fonte: Autoria própria (2020). 14
15
Conforme descrito, a associação de Gentamicina + Amoxacilina foi o 16
antimicrobiano mais efetivo frente aos isolados testados com o maior índice de 17
sensibilidade de 85,4% (153/179) e menor índice de resistência de 14,6% (26/179). 18
Ceftiofur foi o antimicrobiano que apresentou a maior taxa de resistência com 26,0% 19
(47/181) dos isolados resistentes ao princípio ativo, entretanto, uma alta 20
porcentagem dos isolados testados (74,0% - 134/181) foram sensíveis ao mesmo. 21
Os valores obtidos com a utilização de Amoxacilina + Ácido Clavulânico foram de 22
75,6% (136/180) dos isolados sensíveis ao antibiótico e de 24,4% (44/180) dos 23
isolados resistentes. 24
A associação de um Aminoglicosídeo com um Beta-Lactâmico, como 25
é o caso da associação de Gentamicina e Amoxicilina, tem por objetivo buscar a 26
ação sinérgica entre os mesmos e ampliar o espectro de ação. Uma característica 27
relevante dos Aminoglicosídeos é a sua capacidade de desenvolver atividade 28
Antimicrobiano
Amostras testadas
Sensíveis Sensíveis
(%)
Resistentes Resistentes
(%)
Ceftiofur 181 134 74,0 47 26,0 Amox. + A.C. 180 136 75,6 44 24,4 Genta + Amox 179 153 85,4 26 14,6
Total 540 423 117
62
bactericida sinérgica em associação com outros agentes antimicrobianos, 1
nomeadamente aqueles que inibem a biossíntese da parede celular, como por 2
exemplo os antibióticos β-lactâmicos (VAKULENKO et al., 2003). De acordo com 3
Eliopoulos e Moellering (1996), este sinergismo que ocorre entre as duas classes de 4
antibióticos pode surgir como resultado de uma maior concentração intracelular de 5
Aminoglicosídeos provocada por uma maior permeabilidade das bactérias após o 6
efeito dos inibidores da síntese da parede celular. 7
Entretanto, Vakulenko et al. (2003) destacam que o efeito sinérgico 8
entre Aminoglicosídeos e antibióticos β-lactâmicos é claramente estabelecido para 9
os enterococos, porém o efeito é menos claro perante outros microrganismos. 10
Apesar de ter sido demonstrado este efeito sinérgico para algumas estirpes de 11
Staphylococcus spp., incluindo estirpes de Staphylococcus aureus resistentes à 12
meticilina (MRSA), e outros microrganismos, muitos desses microrganismos não 13
foram inibidos pela associação de antibióticos Aminoglicosídeos com inibidores da 14
parede celular. 15
No presente estudo, foi constatado que a ação sinérgica entre os 16
dois antibióticos foi a melhor opção de tratamento frente aos isolados da região 17
noroeste, demonstrando a viabilidade destes no tratamento das mastites, 18
ressaltando-se a melhor ação quando os dois princípios medicamentosos estão 19
associados por melhorar o espectro de ação, fato relevante por se tratar de uma 20
afecção de etiologia múltipla, com o envolvimento de microrganismos Gram positivos 21
e Gram negativos, muitas vezes com acentuado perfil de resistência. 22
Ceftiofur é um antimicrobiano pertencente à classe dos Beta-23
Lactâmicos (TAVARES, 1996), indicado para o tratamento da mastite clínica e 24
subclínica em vacas leiteiras em lactação, causada principalmente pelos gêneros 25
Staphylococcus, Streptococcus e Corynebacterium. Embora a taxa de resistência 26
encontrada nesse estudo não tenha sido tão elevada, Ceftiofur foi o antimicrobiano 27
menos efetivo frente aos isolados. Esse fato pode estar associado ao uso 28
indiscriminado e inadequado na prática veterinária, o que possibilita a seleção de 29
cepas resistentes e, pela presença da enzima Beta-Lactamase que consegue 30
romper o anel betalactâmico, uma estrutura molecular fundamental para a ação 31
deste antibiótico (SANTOS et al., 2007). 32
Motta (2015) em um estudo com o objetivo de investigar a eficácia 33
do Ceftiofur no tratamento em casos de mastite subclínica em propriedades leiteiras 34
63
do município de Dois Vizinhos, região Sudoeste do Estado do Paraná, obteve 77,7% 1
de isolados sensíveis ao Ceftiofur e 23,0% distribuídos entre parcialmente sensíveis 2
e resistentes, estando esses resultados próximos aos encontrados nesse trabalho. 3
Em relação a mesorregião centro-ocidental, foram realizados 75 4
antibiogramas no total, sendo 32 amostras testadas para o Ceftiofur, 17 para a 5
Amoxicilina + Ácido Clavulânico e 26 para a associação de Gentamicina + 6
Amoxicilina (Tabela 4). 7
8
Tabela 4. Resultado do teste de sensibilidade in vitro para microrganismos isolados 9
de amostras leite de bovinos com mastite subclínica no centro-ocidental do Paraná. 10
Fonte: Autoria própria (2020). 11
12
Diferentemente do observado no noroeste, Ceftiofur foi o 13
antimicrobiano mais efetivo frente aos isolados testados, com índice de sensibilidade 14
de 90,7% (29/32) e de resistência de apenas 9,3% (3/32). A associação de 15
Gentamicina + Amoxicilina foi o antimicrobiano que apresentou a maior taxa de 16
resistência em todo o estudo, com 50,0% (13/26) dos isolados resistentes ao 17
princípio ativo, contrário ao resultado anteriormente observado na região noroeste 18
desse mesmo estudo, onde a associação desses dois antimicrobianos apresentou o 19
menor índice de resistência dos isolados. Os valores obtidos com a utilização de 20
Amoxacilina + Ácido Clavulânico foram de 76,4% (13/17) dos isolados sensíveis ao 21
antibiótico e de 23,6% (4/17) dos isolados resistentes. 22
É provável que nas propriedades avaliadas do centro-ocidental, 23
tanto a Gentamicina quanto a Amoxicilina tem sido utilizados com grande frequência 24
para tratar animais com mastite. Essa condição aliada ao uso não racional de 25
antimicrobianos em animais pode aumentar a pressão seletiva para linhagens 26
multirresistentes (GUIGUERE et al., 2010), em razão do uso contínuo de 27
antimicrobianos no tratamento por via intramamária, parenteral e/ou na profilaxia da 28
vaca seca (RIBEIRO, 2008). Este fato reflete ainda mais a importância dos exames 29
Antimicrobiano
Amostras testadas
Sensíveis
Sensíveis (%)
Resistentes
Resistentes (%)
Ceftiofur 32 29 90,7 3 9,3 Amox. + A.C. 17 13 76,4 4 23,6 Genta. + Amox 26 13 50,0 13 50,0
Total 75 55 20
64
laboratoriais e como o uso indiscriminado de um determinado antibiótico seleciona 1
bactérias resistentes. 2
Os resultados obtidos nesta parte do estudo ressaltam a importância 3
da avaliação da sensibilidade antimicrobiana in vitro para cepas isoladas de casos 4
de mastite bovina antes da indicação do tratamento para os animais, em virtude de 5
que antibióticos associados, como a Gentamicina e Amoxicilina, que geralmente 6
apresentam alta eficácia, como visto na região anterior, podem apresentar-se 7
ineficazes, principalmente naquelas propriedades onde seu uso é frequente e 8
inadequado, aumentando os custos da produção. Além do mais, muitas vezes torna-9
se difícil predizer qual microrganismo vai ser influenciado por um determinado 10
antibiótico, visto que nem sempre ocorre a aquisição da resistência com o patógeno 11
que está sendo focado no tratamento. Guimarães et al. (2010) citam como exemplo 12
um caso ocorrido em humanos, onde foi constatada a aquisição da resistência de 13
enterococcus frente à vancomicina utilizada inicialmente para o tratamento do 14
patógeno Staphylococcus aureus resistente à meticilina. 15
Em ambas mesorregiões, a utilização da associação de Amoxicilina 16
com Ácido Clavulânico apresentou resultados de eficácia próximos. O Ácido 17
clavulânico é um fármaco utilizado associado à um antibiótico Beta-Lactâmico que 18
age inibindo a ação da enzima Beta-lactamase produzida pelo microrganismo, 19
responsável pela perda de ação dessa classe de antibiótico. A ação inibitória da 20
enzima pelo Ácido Clavulânico estende o espectro da Amoxicilina, abrangendo uma 21
variedade maior de microrganismos, inclusive aqueles resistentes a outros 22
antibióticos Beta-Lactâmicos (RADOSTITS et al., 2007). Aires (2010), com o objetivo 23
de identificar os perfis de sensibilidades para alguns antibióticos em fazendas 24
leiteiras de Portugal, obteve a porcentagem de 82,0% de isolados sensíveis a 25
Amoxicilina associada ao Ácido Clavulânico. Vasil (2009), avaliando a incidência e o 26
curso de mastite ambiental em 177 vacas leiteiras na Eslováquia, constatou que 27
todos os microrganismos testados foram sensíveis a Amoxicilina + Ácido 28
Clavulânico, obtendo a porcentagem de 100% de eficácia em seu estudo. Todos 29
esses resultados estão acima daqueles encontrados na presente pesquisa. 30
Considerando a disparidade de resultados entre as duas regiões, 31
indica que a provável utilização empírica e indiscriminada dos antibióticos esteja 32
contribuindo para o surgimento de diferentes linhagens resistentes de acordo com o 33
local e antimicrobianos utilizados, o que pode ser comprovado na Tabela 5. 34
65
Tabela 5. Prevalência de resistência de microrganismos isolados de amostras de 1
leite com mastite subclínica para três princípios ativos agrupados conforme a região 2
de coleta. 3
Fonte: Autoria própria (2020). 4
5
A prevalência da resistência ao Ceftiofur e a Gentamicina associada 6
com a Amoxicilina diferiu (p<0,05) entre as duas mesorregiões. Esse resultado já era 7
esperado, visto que ocorreu uma notável inversão na eficiência das drogas 8
antimicrobianas nos resultados anteriores. Isso acontece devido ao fato de que o 9
uso dos princípios dos antibióticos utilizados tanto na terapia de vacas secas bem 10
como no tratamento de casos clínicos de mastite, diferem entre as propriedades e 11
entre regiões. Por outro lado, a grande diversidade de agentes etiológicos que 12
podem estar envolvidos com a mastite nos rebanhos, também pode influenciar 13
diretamente na prevalência da resistência. Bactérias como Staphylococcus aureus 14
que podem apresentar mecanismos de resistência frente aos antibióticos, são 15
caracterizadas por serem de difícil tratamento, influenciando negativamente na 16
eficiência aos antibióticos que são administrados. 17
Outros fatores in vivo também podem ser associados com a baixa 18
eficiência dos antimicrobianos utilizados, como por exemplo, a falha na distribuição 19
dos ativos dentro da glândula mamária, o estado fisiológico do animal e a 20
precocidade com que a terapêutica de tratamento é estabelecida (COSTA, et al., 21
2013). 22
Prevalência de resistência
Noroeste
Centro-Ocidental
X²
p-valor
Ceftiofur 0,25b 0,09a 4,17 0,04 Amox. + A.C. 0,24a 0,23a 0,01 1,00 Genta. + Amox 0,14a 0,50b 18,55 0,00
66
CONCLUSÃO 1
Os resultados obtidos contribuem para o esclarecimento dos 2
aspectos epidemiológicos dos patógenos e são importantes para amparar as ações 3
de monitoramento e direcionar as ações, buscando o controle da infecções 4
mamárias nas propriedades. Esses resultados evidenciaram a presença de bactérias 5
ambientais e contagiosas nos rebanhos estudados das duas regiões, alertando para 6
os cuidados antes, durante e após a ordenha. Ademais, houveram variações dos 7
resultados de resistência entres os dois locais, o que reforça a necessidade da 8
realização periódica de testes de sensibilidade in vitro, visto que podem ocorrer 9
mudanças no perfil de resistência entre os rebanhos, comprometendo assim o 10
tratamento do animal, bem como os programas de controle da mastite bovina. 11
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