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UNIVERSIDADE TUIUTI DO PARANÁ
FACULDADE DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
CURSO DE MEDICINA VETERINÁRIA
Fernanda Cristina Hümmelgen
DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO DO HERPESVÍRUS BOVINO 1 E 4.
CURITIBA
2010
DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO DO HERPESVÍRUS BOVINO 1 E 4.
CURITIBA
2010
Fernanda Cristina Hümmelgen
DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO DE HERPESVIRUS BOVINO 1 E 4
CURITIBA
2010
Trabalho de conclusão de curso apresentado ao Curso de Medicina Veterinária da Faculdade de Ciência s Biológicas e da Saúde da Universidade Tuiuti do Paraná, como requisito parcial para obtenção do título de Médica Veterinária.
Orientador Acadêmico: Prof. Dr. Uriel V. Cotarelli Andrade
Orientador profissional: Jorge V. Bacila Agottani
TERMO DE APROVAÇÃO
Fernanda Cristina Hümmelgen
TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO
Este trabalho de conclusão de curso foi julgado e aprovado para a obtenção do título
de Médico Veterinário por uma banca examinadora do curso de Medicina Veterinária
da Universidade Tuiuti do Paraná.
Curitiba, 06 de dezembro de 2010
Medicina Veterinária
Universidade Tuiuti do Paraná
Orientador: Profº Uriel V. Cotarelli Andrade
Universidade Tuiuti do Paraná
Profª Gisele Ludwig Tesseroli
Universidade Tuiuti do Paraná
Profº Welington Hartmann
Universidade Tuiuti do Paraná
Reitor
Prof. Luiz Guilherme Rangel Santos
Pró Reitor Administrativo
Sr. Carlos Eduardo Rangel Santos
Pró Reitora Acadêmica
Prof.ª Carmem Luiza da Silva
Pró Reitor de Planejamento
Sr. Afonso Celso Rangel dos Santos
Pró Reitor de Pós Graduação, Pesquisa e Extensão
Prof. Roberval Eloy Pereira
Diretor da Faculdade de Ciências Biológicas e da Saúde
Prof. João Henrique Faryniuk
Coordenadora do Curso de Medicina Veterinária
Prof.ª Ana Laura Angeli
Campus Prof. Sidney Lima Santos
Rua Sidney A. Rangel dos Santos 238 - Santo Inácio
Cep 82010-330- Curitiba- Paraná
APRESENTAÇÃO
Este trabalho de Conclusão de Curso (T.C.C.) apresentado ao curso de
Medicina Veterinária da Faculdade de Ciências Biológicas e da Saúde da
Universidade Tuiuti do Paraná, com requisito parcial para obtenção do título de
Médica Veterinária, é composto de um Relatório de Estágio nos quais são descritas
as atividades realizadas por Fernanda Cristina Hümmelgen, no Instituto de
Tecnologia do Paraná na área de produção de antígenos, com o objetivo de
conhecer as técnicas utilizadas para o diagnóstico sorológico de Herpesvírus
Bovino, no período de 27 de Julho a 01 de outubro de 2010, perfazendo o total de
368 horas.
DEDICATÓRIA
Dedico esse trabalho aos meus pais Wivian e Eduardo, aos meus irmãos Luiz
Henrique e Larissa, aos meus amigos de verdade, e a todos os responsáveis pela
realização deste trabalho.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus por estar ao meu lado em todos os momentos da
minha vida, por todas suas bênçãos estarem sobre mim, e por ter sempre sido
minha fonte inesgotável de amor e força.
Aos meus pais amados Eduardo Hümmelgen e Wivian, por nunca terem
desistido de mim, pelo amor, pela confiança, força e principalmente pela educação
que me deram.
Aos meus irmãos pelos momentos de descontração, conselhos e apoio.
A Mel e ao Sushi que mostraram sempre o verdadeiro significado do
companheirismo e do amor incondicional.
Aos meus padrinhos, minha melhor amiga Juliana, tios e tias, primos e primas
por fazerem parte da minha vida.
A todos meus amigos ( Liedge, Hellen, Carol, Gabi, Joyce, Tio, Fabricio e
Roni) que sempre estiveram comigo, obrigado pelo apoio, pela compreensão, pelas
ajudas, pelas risadas,festas e até pelos desentendimentos que de alguma forma nos
fizeram crescer.
Ao meu orientador, Professor Uriel, pelos conhecimentos compartilhados,
pela paciência, e dedicação.
A todos os professores os outros professores que tiveram paciência comigo e
com todos os meus colegas sempre, por mostrar os caminhos que devemos seguir,
pela amizade e dedicação por todos nós.
Ao meu orientador profissional Jorge V. Bacila Agottani, por todas as vezes
ter me atendido quando precisei, ao meu Co- Orientador Ernesto Renato Krüger por
que sem a ajuda dele não teria aprendido tudo o que aprendi, e a todos os amigos
que tive grande alegria em fazer durante meu período de estágio.
Obrigada A TODOS!
-te também no senhor, e ele te concederá o que deseja teu
coração. Entrega o
Salmos 37:5-6
RESUMO
O diagnóstico sorológico do Herpesvírus Bovino (BoHV) apesar de não
representar uma ferramenta de diagnóstico etiológico em animais com sinais
clínicos, é uma estratégia fundamental para demonstrar a presença do vírus no
rebanho, e também para quantificar o número de animais infectados.E além disso
diferencia os tipos de BoHV existentes. A sorologia para o Herpesvírus Bovino
também é importante para o monitoramento da infecção em rebanhos bovinos tanto
para a definição de estratégias de controle e profilaxia, como a vacinação, quanto
para a erradicação das enfermidades.
No presente trabalho serão apresentadas as técnicas de detecção de
anticorpos do Herpesvirus1 e 4 em soros bovinos mais utilizadas: soroneutralização
(SN), ensaio imunoenzimático (ELISA) indireto e Imunofluorescência indireta. Para a
comparação de resultado entre tais testes, foram coletados 80 soros de bovinos da
Colônia Penal Agrícola localizada no município de Piraquara-PR, que foram testados
segundo os procedimentos operacionais padrões do TECPAR de cada teste
sorológico citado acima.
Palavra-chave: Herpesvírus bovino1, Herpesvirus bovino 4, diagnóstico
sorológico.
LISTA DE ABREVEATURAS
- Graus Celsius.
µL Microlitros.
Ac. Anticorpos.
Ag.- Antígeno.
AIHV Vírus da Febre Catarral Maligna.
BoHV- Herpesvírus bovino.
BSA Albumina Bovina.
CO2 Dióxido de Carbono.
ELISA Ensaio imuno enzimático.
Fc Fragmento cristalizável.
FITC - Isotiocianato de Fluoresceína.
- Gama.
IBR Rinotraqueite Infecciosa Bovina.
ICTV - Comitê internacional sobre taxonomia de vírus
IFI Imunofluorescência indireta.
IgG - Imunoglobulina G.
IPV Vulvovaginite pustular infecciosa.
M Molar.
MC Meio de crescimento.
mL. Mililitro.
MM Meio de manutenção.
Na2HPO4 Sódio Dibásico.
NaHCO3 Bicarbonato de sódio.
Na2CO3 Carbonato de sódio.
NaN3 Azida Sódica.
NaCl Cloreto de sódio.
NaH2PO4 Sódio Monobásico.
PCR Reação em cadeia de polimerase.
PNCEBT Programa nacional de controle e erradicação da Bruclose e tuberculose.
SFB Soro fetal bovino.
SN Soroneutralização.
SNC Sistema Nervoso Central.
TECPAR Instituto de Tecnologia do Paraná.
TPB - Caldo triptose fosfato.
TR Região terminal.
U.V. Ultra violeta.
UI Unidades internacionais.
- Alfa.
Beta.
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1- Localização do TECPAR em fotografia via satélite...................................5
FIGURA 2- Frascos de Antígenos produzidos pelo TECPAR......................................6
FIGURA 3- Estrutura viral............................................................................................8
FIGURA 4- Estrutura dos Herpesvírus.......................................................................17
FIGURA 5- 2 e garrafas de cultivo celular......................31
FIGURA 6- Centrífuga para clarificação.....................................................................33
FIGURA 7- Garrafa de cultivo celular de 150cm2......................................................33
FIGURA 8- Garrafa Roller de cultivo celular de 890cm2............................................34
FIGURA 9- Distribuição de diluições para Titulação viral em SN..............................36
FIGURA 10 Direção de diluição do Antígeno..........................................................38
FIGURA11- Lavadora de placas de ELISA (Elx50 Automated Strip Washer-
BioTEK Instruments, INC)..........................................................................................38
FIGURA 12 Direção da diluição do conjugado........................................................40
FIGURA 13 Fluxograma da soroneutralização.......................................................42
FIGURA 14- Microscópio invertido.............................................................................43
FIGURA 15 Esquema Ilustrativo do ELISA.............................................................45
FIGURA 16 Fluxograma da IFI...............................................................................47
FIGURA 17- Célula com efeito citopático (Soro negativo).........................................48
FIGURA 18- Monocamada celular intacta (Soro positivo).........................................48
FIGURA 19- Espectrofotômetro (µQuant BioTEK Instruments, INC)......................49
FIGURA 20- Células com efeito citopático com coloração fluorescente (Soro
positivo)......................................................................................................................50
FIGURA 21- Células com efeito citopático com coloração verde fosco ( Soro
negativo)....................................................................................................................50
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 Titulação viral para soroneutralização pelo método Reed and Muench......................................................................................................................37
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO..........................................................................................................1
2 DESCRIÇÃO DO LOCAL DE ESTÁGIO..................................................................5
2.1 DIVISÃO DE ANTÍGENOS.....................................................................................5
3 ATIVIDADES DESENVOLVIDAS.............................................................................7
4 REVISÃO DE LITERATURA....................................................................................8
4.1 VÍRUS....................................................................................................................8
4.1.1 Classificação.......................................................................................................9
4.1.1.1 Estrutura geral taxonômica.............................................................................10
4.1.2 Taxonomia dos vírus.........................................................................................10
4.1.2 1 Famílias de DNA vírus....................................................................................10
4.1.2.2 Famílias de RNA vírus....................................................................................12
4.2 HERPESVÍRUS....................................................................................................16
4.2.1 Herpesvirus bovino............................................................................................17
4.3 HERPESVÍRUS BOVINO 1..................................................................................18
4.3.1 Histórico.............................................................................................................18
4.3.2 Descrição do agente..........................................................................................18
4.3.3 Patogenia e patologia........................................................................................19
4.3.4 Sinais clínicos....................................................................................................20
4.3.4.1 Características clínicas do sistema reprodutor...............................................20
4.3.4.2 Características clínicas do sistema respiratório e olhos.................................21
4.3.5 Aspectos econômicos........................................................................................22
4.3.6 Epidemiologia....................................................................................................22
4.3.7 Diagnósticos......................................................................................................22
4.3.7.1 Testes Sorológicos.........................................................................................23
4.4 HERPESVÍRUS BOVINO 4..................................................................................26
4.4.1 Histórico............................................................................................................26
4.4.2 Descrição do agente.........................................................................................26
4.4.3 Patogenia e patologia........................................................................................26
4.4.4 Sinais clínicos....................................................................................................27
4.4.5 Aspectos econômicos........................................................................................27
4.4.6 Epidemiologia....................................................................................................28
4.4.7 Diagnósticos......................................................................................................29
5 MATERIAL E MÉTODOS.......................................................................................30
5.1 CULTIVO DE CÉLULAS DE TRAQUÉIA DE FETO BOVINO..............................30
5.2 AMPLIAÇÃO CELULAR.......................................................................................37
5.3 PRODUÇÃO DE ANTÍGENOS.............................................................................32
5.3.1 Produção de BoHV-1 para uso em SN..............................................................32
5.3.2 Produção de BoHV-1 e BoHV-4 para uso em ELISA........................................33
5.3.3 Titulação viral para SN......................................................................................35
5.3.4 Titulação de Ag. e conjugado para teste de ELISA...........................................37
5.4 DESENVOLVIMENTO DOS TESTES..................................................................41
5.4.1 SN. para detecção de anticorpos Anti- BoHV-1................................................41
5.4.2 ELISA para detecção de anticorpos Anti-BoHV-1 e BoHV-4............................44
5.4.3 IFI para detecção de anticorpos Anti-BoHV-1 e BoHV-4..................................46
6 RESULTADOS.......................................................................................................48
6.1 SORONEUTRALIZAÇÃO.....................................................................................48
6.2 ELISA..................................................................................................................49
6.3 IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA.................................................................50
7 DISCUSSÕES........................................................................................................51
8 CONSIDERAÇÕES FINAIS...................................................................................53
9 CONCLUSÃO.........................................................................................................54
10 REFERÊNCIAS.....................................................................................................55
1
1 INTRODUÇÃO
A família Herpesviridae contém mais de 100 vírus, que foram isolados de uma
ampla gama de espécies animais: anfíbios, peixes, répteis, aves, mamíferos e do
homem. São vírus de especial importância, pois possuem ampla ocorrência,
diversidade evolucionária e estão envolvidos em muitas doenças importantes que
acometem animais domésticos e humanos (QUINN et al.,2002).
Os vírus pertencentes a esta família tem grande variação em suas
propriedades biológicas, incluindo patogenicidade, e propenção para formar
infecções latentes. Os Herpesvirus são morfologicamente similares, envelopados e
variam de 120 a 200nm de diâmetro. Contém DNA em dupla fita em um capsídeo
icosaédrico de 162 capsômetros, circundado por uma zona granular composta de
proteínas globulares (tegumento) e circundado por um envoltório lipídico (QUINN et
al., 2002). Além disso, o virus da herpes contém mais de 30 proteínas, das quais
seis estão presentes no nucleo capsideo, dois sendo associados ao DNA. As
glicoproteínas que são no total de 10, estão localizadas no envelope, algumas delas
projetadas como peplomeros, e uma das glicoproteínas dos pepilomeros possuem
atividade de receptores Fc (Fragmento cristalizável) (FENNER et al.,1993)..
A divisão da família em subfamília foi baseada inicialmente pelas
propriedades biológicas e mais tarde precisamente baseados nos atributos
- -Herpesvirinae e -
Herpesvirinae.
O Herpesvirus é um dos agentes etiologicos causador de uma série de
doenças infecciosas de rebanhos bovinos. Dentre eles estão o BoHV(Herpesvírus
Bovino) 1, BoHV 2, BoHV 4, e BoHV 5.(FENNER et al., 1993)
2
O BoHV -1 tem uma ampla distribuição, estando presente em quase todos
os países de bovinocultura expressiva. E tem custado a industria de gado cerca de 3
bilhoês de dólares anualmente Pertence à subfamília Alphaherpesvirinae ,e gênero
Varicellovirus, e é o agente etiológico da IBR/IPV (Rinotraqueíte infecciosa
bovina/Vulvovaginite pustular infecciosa), conjuntivites,balanopostite pustular,
encefalite, doenças sistêmica do recém nascido, enterites e abortos. Suas cepas são
divididas em três subtipos: BoHV 1.1 está associado à doença respiratória; BoHV-
1.2a e BoHV- 1.2b está associado com doença genital; e o BoHV- 1.3 está
associado a encefalites (VIDOR et al., 1995).
O BoHV 2 possue distribuição mundial e foi identificado no Brasil na
década de 70. Nota-se que os maiores prejuízos ocasionados por este vírus ocorrem
em gado leiteiro, mas também tem sido diagnosticada em bovinos de corte.
Pertence à subfamília Alphaherpesvirinae e gênero Simplexvirus. A infecção pelo
BoHV 2 apresenta duas formas clínicas: Mamilite Herpética (Lesões vesiculares e
erosivas nos tetos ou no úbere), e Pseudolumpy skin disease ( Lesões nodulares
disseminada pela pele) (JONES et al.,1998).
O BoHV- 4 está distribuído mundialmente e pertence à subfamília
Gammaherpesvirinae e ao Gênero Rhadinovirus. Tem apresentado uma variedade
de enfermidades, e dentre elas as principais são aborto, metrite, vaginite, enterites e
pneumonia (GILLET et al.,2003)
O BoHV 5, devido à reatividade sorológica que tem com o BoHV 1,não
tem sua distribuição geográfica muito conhecida. Este é um vírus pertencente à
subfamília Alphaherpesvirinae, e gênero Varicellovirus, que tem como principal
3
doença a meningoencefalite, devido à facilidade deste vírus se replicar no sistema
nervoso central (SNC) dos animais (KUNRATH et al., 2004).
Devido à diversidade dos sinais clínicos de todos os Herpesvírus,bem como a
presença dos mesmos sinais em outras doenças infecciosas e parasitárias, não
permite a elaboração de um diagnóstico clínico conclusivo da infecção ocasionada
pelos Herpesvirus. Até mesmo nos casos de vulvovaginite no BoHV - -1, por
exemplo, onde as lesões são características, o diagnóstico é apenas presuntivo.
Sendo assim necessário o diagnóstico sorológico (RUHNKE et al.,1984).
Atualmente as técnicas sorológicas mais utilizadas na detecção de anticorpos
incluem a soroneutralização (SN) os ensaios imunoenzimático (ELISA), e a
Imunofluorescência. Para minimizar o risco da introdução de animais infectados em
rebanhos ou em centrais de inseminação, os testes sorológicos devem ser sensíveis
o suficiente para evitar resultados falso-negativos, principalmente quando os títulos
de anticorpos específicos para o vírus são baixos. A detecção de animais portadores
do vírus em latência também é de extrema importância nos programas de controle e
erradicação da doença e, em algumas situações, essa identificação não é possível
de ser realizada por meio de métodos sorológicos tradicionais uma vez que os
animais podem apresentar baixo título de anticorpos (TAKIUCHI et al.,2001).
O procedimento do ensaio imunoadsorvente ligado à enzima (ELISA) tem
como objetivo detectar anticorpos, Aonde há a ligação de um antígeno viral à uma
fase sólida(poços de poliestireno), depois são adicionadas diluições de soro-teste,
permitindo a interação com os antígenos. Após lavagem antiglobulinas conjugadas a
enzimas são adicionadas e após incubação e lavagem, um substrato apropriado é
4
adicionado. A intensidade da alteração de cor é proporcional à quantidade de
anticorpos no soro-teste (QUINN et al.,2002) .
Usando-se imunofluorescência indireta o soro teste é adicionado a um
conhecido antígeno viral fixado em uma lâmina de microscopia. Após a incubação, a
lâmina é lavada, e após a adição da antiglobulina conjugada a um fluorocromo,
então é incubada para um período posterior. A lâmina é novamente lavada,para
posterior leitura a luz Ultra Violeta (QUINN et al., 2002).
O teste de soroneutralização é considerado o padrão definitivo quando
comparados a outros testes sorológicos. Os anticorpos neutralizantes em geral se
relacionam estritamente com a proteção imunológica. Neste teste que é tipicamente
realizado em placas de micro tubulação, uma quantidade constante de vírus com
infectividade conhecida é adicionado a diluições de um soro. teste. Células
suscetíveis ao Vírus são adicionadas aos poços. A presença de anticorpos
neutralizantes do soro previne a infecção das células e efeitos citopáticos. O titulo do
soro é a mais alta diluição na qual o vírus é neutralizado. Nos animais recuperados,
anticorpos neutralizantes tendem a persistir por períodos longos, com freqüência
durante anos (QUINN et al.,2002).
Associado ao que precede, o seguinte trabalho discorrerá detalhadamente
sobre os meios de diagnósticos sorológicos realizados para Herpesvírus bovino 1 e
4, assim como seus materiais e métodos. A apresentação destes herpesvírus bovino
no trabalho deve-se ao fato de serem agentes etiológicos de doenças que hoje em
dia apresentam-se em uma significativa quantidade nos rebanhos de bovinos de
todo o mundo.
5
2 DESCRIÇÃO DO LOCAL DE ESTÁGIO
O Estágio Pré-Profissional Obrigatório foi realizado no Instituto de Tecnologia
do Paraná (TECPAR), na Divisão de Antígenos (DAN), localizado na cidade de
Curitiba, no bairro Juvevê.
FIGURA 1 Localização do TECPAR em fotografia via satélite
Fonte: Google Maps, 2010
2.1 DIVISÃO DE ANTÍGENOS
Por solicitação do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, desde
1989 o TECPAR vem produzindo reativos para o diagnóstico de tuberculose e
brucelose nos animais domésticos (Antígenos estes que são distribuídos para todo o
território nacional, para atender ao Programa Nacional de Controle e Erradicação da
Brucelose e Tuberculose PNCEBT). Além disso, produz também conjugado para
imunofluorescência, imunoperoxidase e ELISA, Anti IgG Bovino, Kits para
diagnóstico de Brucella ovis e Leucose enzoótica Bovina.
6
FIGURA 2: Frascos de Antígenos produzidos pelo TECPAR.
Atualmente, encontram-se em andamento no laboratório de
desenvolvimento de Novos Produtos, Kits para diagnósticos sorológicos de:
Herpesvírus Bovino 1, Herpesvírus Bovino 4, Neospora Caninum e Kit para
determinação de título humoral induzido pela vacina antirábica em cães.
7
3 ATIVIDADES DESENVOLVIDAS
De segunda a sexta-feira o horário respectivo para o estagiário assim como
para os funcionários, é das 8:00 às 17:00 horas. A função do estagiário foi auxiliar
na coleta e organização de soros para todos os tipos de testes diagnósticos, auxiliar
na padronização dos testes assim como: imunodifusão em Ágar gel, contagem de
volume celular, verificação de pH dos antígenos produzidos, testes de prova lenta
em tubo e ring test, montagem de lâminas de imunofluorescência indireta para
diagnóstico de Neospora caninum, desenvolvimento de teste de ELISA e
soroneutralização
8
4 REVISÃO DE LITERATURA
4.1 VÍRUS
O termo vírus vem do latim, e significa veneno (QUINN et.al., 2002). São
agentes infecciosos, extremamente pequenos. Que parasitam células para replicar-
se. Estas partículas virais conhecidas também como vírions, são constituídas de
duas ou três partes: material genético (ácido nucléico), podendo ser DNA ou RNA,
mas nunca os dois em simultâneo (FENNER, 1993), uma camada protéica que
protege o material genético (FIGURA 3), que segundo TIZARD, 2008 é denominada
capsídeo(composto de subunidades chamadas capsômeros), e alguns vírus também
podem estar envoltos por um envelope contendo lipoproteínas e glicoproteínas.
FIGURA 3 Estrutura viral.
Fonte: SOFI 2010
As proteínas do capsídeo são ótimos antígenos, altamente capazes de
estimular a formação de anticorpos. Quando um vírus infecta um animal, as
proteínas dos vírions atuam como antígenos e desencadeiam uma resposta imune
9
adquirida. Os vírus, entretanto, não são sempre encontrados livres na circulação,
mas vivem dentro de células, onde estão protegidos das atenções inoportunas dos
anticorpos. De fato, o acido nucléico viral pode ser integrado ao genoma da célula.
Nessa condição, os genes virais codificam novas proteínas, algumas das quais são
transportadas para a superfície celular das células infectadas. Essas proteínas
embora sejam sintetizadas dentro das células animais, ainda são consideradas
estranhas. Essas proteínas estranhas recém sintetizadas são denominadas
antígenos endógenos, para distingui-los dos antígenos estranhos que entram de fora
e são chamados de antígenos exógenos (TIZARD, 2008)
4.1.1 Classificação
Classificar os vírus tem como objetivo descrever a diversidade dos vírus por
nomeação e agrupá-los com base em semelhanças. André Lwoff, Robert Horne, e
Paul Tournier em 1962 desenvolveram um meio de classificação de vírus, baseado
no sistema de Taxonomia de Lineu, aonde os vírus são classificados em uma
hierarquia, que consiste em filo, classe, ordem, família, gênero e espécie
(SUBRAMANYA e GRIVAS, 2008) Posteriormente, o Comitê Internacional de
Taxonomia de Vírus foi formado. No entanto, os vírus não são classificados com
base em filo ou classe, pois devido ao seu pequeno genoma e sua alta taxa de
mutação torna-se difícil determinar a sua ascendência para além da ordem. O
Comitê Internacional sobre Taxonomia de Vírus (ICTV) desenvolveu o sistema de
classificação atual e escreveu as diretrizes que dão um peso maior sobre as
propriedades de determinados vírus para manter a uniformidade da família.
Os principais critérios para a delimitação das famílias são o tipo de ácido
nucléico que constitui o genoma, a estratégia de replicação viral, e a morfologia do
10
vírus.A subdivisão das famílias em gêneros é baseada em critérios que variam de
famílias diferentes. Gêneros, geralmente são definidos por diferenças substanciais
em seu genoma, contendo de um a mais de uma centena de espécies. A definição
de espécies é mais arbitrária, virologistas ainda discutem os critérios para a
designação das espécies (FENNER,1993)
É provável que no futuro outros grupos de famílias com comprovada
afinidades filogenéticas serão agrupados para formar ordens
No total, há 5 ordens, 82 famílias, 11 subfamílias, 307 gêneros, 2.083 espécies e
cerca de 3.000 tipos ainda não classificados
4.1.1.1 Estrutura geral taxonômica
Ordem(-virales)
Família(viridae)
Subfamília(virinae)
Gênero(vírus)
Espécie (vírus)
4.1.2 Taxonomia dos vírus
4.1.2.1 Famílias de DNA vírus
Família: Circoviridae
Família: Parvoviridae
Gênero: Parvovírus
Gênero: Dependovírus
11
Família: Hepadnaviridae
Gênero: Orthohepadnavírus
Gênero: Avihepadnavirus
Família: Paponaviridae
Gênero: Papillomavirus
Gênero: Polyomavírus
Família: Adenoviridae
Gênero: Mastadenovírus
Gênero: Aviadenovírus
Família: Herpesviridae
Subfamília: Alphaherpesvirinae
Gênero: Simplexvírus
Gênero: Varicellovírus
Subfamília: Betaherpesvirinae
Gênero: Cytomegalovírus
Gênero: Murocytomegalovirus
Subfamília: Gammaherpesvirinae
Gênero: Lymphocryptovirus
Gênero: Rhadinovírus
12
Família: Iridoviridae
Gênero: Ranavírus
Gênero: Lymphocystivírus
Família sem nome: African Swine Fever Virus
Família: Poxviridae
Subfamília: Chordopoxvirinae
Gênero: Orthopoxvírus
Gênero: Parapoxvírus
Gênero: Avipoxvírus
Gênero: Capripoxvírus
Gênero: Leporipoxvírus
Gênero: Suipoxvírus
Gênero: Molluscipoxvírus
Gênero: Yatapoxvírus
Subfamília: Entomopoxvirinae
4.1.2.2 Famílias de RNA vírus
Família: Picornaviridae
Gênero: Enterovírus
Gênero: Cardiovírus
13
Gênero: Rhinovírus
Gênero: Aphthovírus
Gênero: Hepatovírus
Família: Calciviridae
Gênero: Calicivírus
Família: Togaviridae
Gênero: Alphavírus
Gênero: Rubivírus
Família: Flaviviridae
Gênero: Flavivírus
Gênero: Pestivírus
Gênero sem nome: vírus da Hepatite C
Família: Coronaviridae
Gênero: Coronavírus
Família: Paramyxoviridae
Subfamília: Paramyxovirinae
Gênero: Paramyxovírus
Gênero: Morbillivírus
Subfamília: Pneumovirinae
14
Gênero: Pneumovírus
Família: Rhabdoviridae
Gênero: Vesiculovírus
Gênero: Lyssavírus
Família: Filoviridae
Gênero: Filovírus
Família: Orthomyxoviridae
Gênero:Influenza vírus A e B
Gênero: Influenza vírus C
Família: Arenaviridae
Gênero: Arenavírus
Família: Bunyaviridae
Gênero: Bunyavírus
Gênero: Phlebovírus
Gênero: Nairovírus
Gênero: Uukuvírus
Gênero: Hantavírus
Família: Reoviridae
Gênero: Orthoreovírus
15
Gênero: Orbivírus
Gênero: Rotavírus
Gênero: Coltivírus
Gênero: Aquareovírus
Família: Birnaviridae
Gênero: Birnavírus
Família: Retroviridae
Gênero: Lentivírus
Gênero: Spumavírus
Gênero sem nome: Retrovírus de mamíferos tipo B
Gênero sem nome: Retrovírus de mamíferos tipo C
Gênero sem nome: Retrovírus aviário tipo C
Gênero sem nome: Retrovírus de mamíferos tipo D
Gênero sem nome: HTLV/BLV virus
FONTE: Adaptado de FENNER, 1993.
16
4.2 HERPESVÍRUS
A família Herpesviridae é uma família numerosa, composta por DNA vírus que
possuem como hospedeiros naturais, humanos, outros mamíferos e vertebrados, e
em um caso descrito, um invertebrado (McGEOCH ET al., 2000).
As partículas virais dos Herpesvírus apresentam baixa resistência ao meio
ambiente e, não possuem resistência fora do organismo infectado e, geralmente sua
transmissão requer contato direto para que ocorra a infecção viral.
A divisão das famílias se baseia nas propriedades biológicas, enquanto a
classificação em gêneros baseia-se na disposição genômica e sorológica
respectivamente. Assim os herpesvírus são classificados em -herpesvirinae, -
herpesvirinae, e -herpesvirinae (FENNER et al., 1993).
Os vírus pertencentes à família Alphaherpesvirinae, possuem um amplo
espectro de hospedeiros, um ciclo replicativo curto, uma disseminação em cultivo
celular rápida, uma eficiente destruição das células, e estabelecem latência
principalmente em neurônios dos gânglios sensoriais (VAN ENGELEMBURG et
al.,1994; WINKLER et al., 1998; VOGEL, 2004).
Os membros da subfamília Betaherpesvirinae replicam-se de forma lenta,
induzindo um aumento de volume das células infectadas e possuem um número
restrito de hospedeiros.
Os outros vírus que pertencem a subfamília Gammaherpesvirinae podem
replicar-se ou estabelecer latência em células linfóides e causar infecção lítica em
células epiteliais e fibroblásticas (VAN ENGELEMBURG et al.,1994; WINKLER et al.,
1998; VOGEL, 2004).
17
FIGURA 4 Estrutura dos Herpesvírus
Fonte: STDGEN, 2010
4.2.1 Herpesvírus Bovino
A espécie bovina é hospedeira primária de diversos Herpesvírus, distribuídos
entre as diferentes subfamílias.
Dentre elas estão o Herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1), Herpesvírus bovino
tipo 2 (BoHV-2), Herpesvírus bovino tipo 4 (BoHV-4), o Herpesvírus bovino tipo 5
(BoHV-5) e o Herpesvírus alcelafino tipo 1 ou vírus da febre catarral maligna (AIHV-
1) ( ROIZMANN e PELLETT, 2001).
18
4.3 HERPESVÍRUS BOVINO TIPO 1
4.3.1 Histórico
O Herpesvírus Bovino Tipo 1 (BoHV-1) é um importante patógeno que
provoca alterações nos sistemas respiratório e reprodutivo de bovinos. Foi
primeiramente isolado no ano de 1956 por MADIN et. al, e desde então tem sido
descrito em vários países.
No Brasil o BoHV-1 já foi isolado de diferentes manifestações da enfermidade.
No Estado do Rio Grande do sul foram relatados isolamentos do vírus de casos de
balanopostite infecciosa (WEIBLEN et al.1991) e vulvovaginite pustular infecciosa
(LOVATO et al., 1995). Foram realizados também em alguns estados brasileiros
inquéritos sorológicos que comprovam que o BoHV-1 está bastante distribuído na
população bovina no país (WIZIGMANN et al. 1972; RAVAZZOLO et al., 1989;
ROSA et al., 1992; DE STEFANO et al., 1993; PITUCO et al., 1993).
4.3.2 Descrição do agente
O Herpesvírus bovino tipo 1 pertence a família Herpesviridae,
subfamília Alphaherpesvirinae e gênero Varicellovirus (TEIXEIRA et al., 2001;
MURPHY et al., 1999). Apresenta genoma constituído por 1 molécula de DNA linear
dupla fita, com cerca de 130.000 a 150.000 pares de bases. O genoma pode ser
dividido em uma região longa (UL) e uma curta (US) cercado por duas regiões
repetidas e invertidas, sendo uma interna (IR) e outra terminal (TR), arranjo típico do
gênero Varicellovírus.(SCHWYZER e ACKERMANN, 1996).
É o agente etiológico da IBR/IPV (Rinotraqueite infecciosa bovina/
Vulvovaginite pustular infecciosa), infecções contagiosas de rebanhos bovinos, que
19
afetam principalmente o trato respiratório e genital podendo provocar aborto, e
também balanopostite pustular, conjuntivite, encefalite, doença sistêmica do recém
nascido e enterite (VIDOR et al., 1995).
As cepas de BoHV-1 foram divididas em três subtipos, conforme análise dos
perfis de restrição enzimática do genoma de várias amostras do vírus: BoHV-1.1,
que está associado com doença do trato respiratório; BoHV-1.2a e BoHV-1.2b
associados com doença genital.; mais tarde as amostras encefálicas foram
classificadas como BoHV-1.3 (VIDOR et al., 1995). QUINN et al., 2002, relata que os
subtipos 1.1 e 1.2a, raramente causam aborto;e o subtipo menos virulento, o 1.2b,
não tem sido associado a aborto.
4.3.3 Patogenia e patologia
Após contato com a mucosa nasofaríngea ou genital de um animal
contaminado, o vírus estabelece uma replicação inicial nas células epiteliais locais,
causando a lise destas, o que leva ao surgimento dos primeiros sinais clínicos que
consistem em congestão local, presença de secreção e lesões vesiculares a
erosivas na mucosa. (WYLER et al., 1989; VOGEL et al., 2004; SPILKI et al., 2004).
Durante esta fase da doença, devido a replicação do vírus nas membranas mucosas
do trato respiratório superior, o vírus se apresenta em grande quantidade e é
eliminado nas secreções nasais (QUINN et al., 2002), assim sendo uma fonte de
infecção para outros animais. Após a replicação primária, o vírus invade terminações
nervosas e é transportado intra axonalmente até o gânglio trigemial, onde
permanece latente. Durante esta fase de latência, não há replicação viral ou
expressão de antígenos virais (WYLER et al., 1989; PASTORET et al., 1982).
Algumas vezes pode haver necrose tecidual facilitando a entrada de bactérias
20
podendo causar uma infecção secundária, com complicações importantes e
possivelmente, morte. Raramente uma viremia associada ao linfócito em vacas
prenhes pode ocasionar infecção fetal e aborto. Nos fetos abortados é possível
encontrar focos necróticos em vários órgãos (QUINN et al., 2002).
Nas infecções do trato reprodutivo, ocasionado pelos subtipos 1.2a e 1.2b, os
vírus fazem replicação na mucosa da vagina ou prepúcio, e no gânglio sacral pode
se estabelecer infecções latentes. Podem ser observadas lesões necróticas focais
na mucosa genital, que ocasionarão a formação de úlceras. Pode também haver
uma reação inflamatória intensa no trato reprodutivo com infecção secundária
bacteriana e possivelmente levar a uma endometrite.
Eventualmente, sob influência de fatores externos, como estresse ou
tratamento com corticóides, pode ocorrer a reativação da infecção latente, quando
ocorre síntese de novas partículas virais infecciosas na célula nervosa e transporte
destas via axonal anterógrada até o sítio inicial da infecção. Neste, se estabelece
novamente um ciclo lítico de infecção, com manifestação de sinais clínicos e re-
excreção viral (VAN OIRSCHOT, 1995).
4.3.4 Sinais Clínicos
4.3.4.1 Características clínicas do sistema reprodutor
A vulvovaginite pustular infecciosa é geralmente reconhecida em vacas
leiteiras.as quais desenvolvem sinais clínicos como febre, depressão, anorexia, se
mantem afastadas, e muitas vezes com a cauda afastada da vulva, e a micção é
freqüente e dolorosa. Os lábios da vulva ficam edemaciadas,com secreção vaginal,
mucosa vestibular avermelhada e com pequenas pústulas que posteriormente irão
21
formar úlceras. O estágio agudo da doença dura de 4 a 5 dias, e as lesões não
complicadas acabam dentro de 10 a 14 dias (FENNER,1996).
Nos machos lesões similares às das fêmeas aparecem no pênis e no
prepúcio (JONES e CHOWDHURY,2007).
4.3.4.2 Características clínicas do sistema respiratório
Os sinais iniciais incluem febre, depressão, inapetência e secreção nasal
abundante, inicialmente serosa e, mais tarde mucupurulenta. A mucosa nasal pode
estar hiperemica, e as lesões podem ser de difícil identificação, e assim pode iniciar
um processo de necrose focal pustular,a mucosa pode estar ulcerada e
hemorrágica. Hálito fétido, dispnéia, respiração pela boca, sialorréia e tosse de
origem brônquica é muito comum. Casos agudos, e casos simples podem cessar
dentro de 5 a 10 dias.
Conjuntivite uni e bilateral, frequentemente com lacrimejamento abundante, é
um sinal clínico comum em bovinos com a rinotraqueíte infecciosa bovina, mas pode
ocorrer em um rebanho como um sinal quase que exclusivamente clínico. Gatro
enterite pode ocorrer em bovinos adultos e é um sinal clínico predominante na
doença generalizada dos bezerros, que muitas vezes é fatal. O aborto pode ocorrer
em 4-7 meses de gestação (FENNER,1996)
22
4.3.5 Aspectos econômicos
As enfermidades causadas pelo BoHV-1 provocam sérios prejuízos à
pecuária nacional, especialmente em bovinos de especialidade leiteira, onde há
queda da produção de leite e diminuição no índice de fertilidade.Particularmente nos
sistemas de criação mais tecnificados, que exigem maiores custos de produção
(DEL FAVA et al., 1998)..
Baixos índices reprodutivos nos rebanhos bovinos podem ser responsáveis
pela inviabilidade de exploração e também restringem o comércio internacional de
animais vivos e seus produtos como sêmem e embriões (DEL FAVA et al., 1998).
4.3.6 Epidemiologia
O BoHV-1 é um dos principais patógenos de bovinos jovens e adultos
(ALFIERRI,1998) e está distribuído de forma significativa em quase todos os países
criadores de bovinos (TEIXEIRA, 2001). De acordo com KUNRATH et al., 2004
alguns países europeus já erradicaram a infecção.
No Brasil, grande parte das propriedades apresentam animais
sorologicamente positivos para BoHV-1. Assim, mostra-se a importância da adoção
de medidas utilizando a identificação destes animais que são grandes
disseminadores da infecção (FENNER, 1993).
4.3.7 Diagnóstico
O diagnóstico na fase aguda da doença tem sido feito através do isolamento
em cultivo celular utilizando-se swab nasal, órgãos de fetos abortados, placentas e
sêmem. Para o isolamento viral, vários tipos de cultura celular de origem bovina são
utilizadas, como células de rim fetal, células de traquéia de feto bovino, ou linhagem
23
celular de rim bovino. O vírus produz efeito citopático em 2- 4 dias, e é identificado
através da neutralização ou método de detecção do antígeno usando anti-soro
monoespecífico ou anticorpos monoclonais (OIE, 2002).
Métodos de identificação viral tem sido desenvolvidos, como a reação da
polimerase em cadeia (PcR) que tem sido particularmente útil no exame de amostras
de sêmem. Pode-se ainda fazer a detecção direta do agente a partir de cortes
congelados de órgãos, utilizando o conjugado policlonal ou monoclonal específico
acoplado à imunofluorescência (OIE, 2002)..
4.3.7.1 Testes sorológicos
O teste de soroneutralzação e vários testes de ELISA são os mais
amplamente usados para a detecção de anticorpos séricos. (OIE, 2002)
A seguir estão relacionados métodos de diagnóstico do BHV, tanto por
isolamento viral quanto por testes sorológicos.
A Microscopia eletrônica
Alternativa para um diagnóstico rápido, contudo necessita de confirmação por
Imunomicroscopia eletrônica (WYLER, 1989).
B- Imunofluorescência
Técnica muito empregada, cuja principal vantagem é a rapidez do
diagnóstico, no qual não há necessidade de posterior caracterização viral. Pode em
desvantagem ser algo menos sensível que o isolamento (WYLER, 1989).
24
C- Imunohistoquímica
Este procedimento, fundamentalmente empregando anticorpos monoclonais,
é provável o mais sensível dentre as técnicas convencionais e reúne algumas
vantagens tais como: rapidez no diagnóstico e no requerimento de cultivos celulares
(GIAVEDONI, et al. 1988).
D- Hibridação de ácidos nucléicos
Esta técnica tem sido investigada por Giavedoni e demonstrou ser específica
e altamente sensível (GIAVEDONI, et al. 1988).
E- Hemoaglutinação passiva (HAP)
Esta prova evita a utilização de cultivos celulares e permite uma rápida
resolução (GONZÁLES, et al. 1985). No entanto, é importante mencionar que com
esta técnica existem problemas de especificidade e por isso são mais aconselháveis
os testes imunológicos.
F- ELISA
Técnica que vem substituindo rapidamente os demais testes sorológicos,
devido ter mostrado maior sensibilidade, rapidez e economia. Já existem muitos
estudos que variam desta técnica: ELISA competitivo, ELISA indireto, e o
desenvolvimento de um ELISA para a detecção de antígenos em amostras de leite
(WYLER, 1989).
G- Soroneutralização
É a técnica mais comum utilizada para a detecção de anticorpos específicos
do BoHV (WYLER, 1989).
25
H- Reação em cadeia da Polimerase (PCR)
Diferentes autores concluíram que este teste é tão sensível como o
isolamento viral e é uma prática alternativa interessante para a localização rápida do
BoHV (XIA et al., 1995).
O desenvolvimento destas e outras técnicas de diagnóstico são fundamentais
para a prevenção controle e erradicação dos herpesvirus bovino.
26
4.4 HERPESVÍRUS BOVINO TIPO 4
4.4.1 Histórico
O Herpesvírus Bovino Tipo 4 (BoHV-4) foi primeiramente isolado na Europa
de animais com enfermidades respiratórias e oculares por Bartha e colaboradores
em 1966. Mais tarde no ano de 1971 Mohanty e colaboradores isolaram o vírus nos
Estados unidos (DONOFRIO et al., 2000).
Atualmente tem sido isolado de rebanhos saudáveis assim como de rebanhos
apresentando diversas enfermidades pelo mundo inteiro (GILLET et al., 2003).
4.4.2 Descrição do agente
O BoHV-4 pertence a família Herpesviridae, subfamília
Gammaherpesvirinae e gênero Rhadinovírus (GILLET et al. 2005)
Possui genoma constituído por 1 molécula de DNA linear dupla fita,
com aproximadamente 144Kb e estrutura tipo B que consiste em uma única região
longa (L-DNA). (BOERNER et al, 1999).
A replicação da maioria dos - herpesvirus acontece somente no seu
hospedeiro natural, mas o BoHV-4 é capaz de se replicar em uma grande variedade
de espécies de hospedeiros. O ciclo biológico de vida destes vírus baseia-se, assim
como em todos os Herpesvírus, na existência de dois tipos de infecção: Lítica (ou
replicativa)e infecção latente (GILLET et al., 2003).
4.4.3 Patogenia e patologia
O BoHV-4 replica-se ativamente no baço e nos leucócitos do sangue
periférico, mas não há multiplicação viral em outros órgãos. É provável que o BoHV4
27
entre no organismo através da via oronasal. O vírus se multiplica, e em seguida ele
é disseminado por todo o organismo através destas células mononucleares.
Também pode haver a multiplicação na conjuntiva, trato respiratório anterior e
mucosa genital, produzindo excreção ocular, nasal ou vaginal, e metrite em vacas
pós parturiente. Destacando que nenhum sinal foi observado após a infecção
primária (THIRY et al., 1989).
4.4.4 Sinais Clínicos
Cepas do BoHV-4 foram isoladas de animais com uma variedade de sinais
clínicos. No entanto, o vírus também foi isolado em animais aparentemente
saudáveis.
Em contraste com o herpesvírus bovino tipo 1, o herpesvírus bovino tipo 4
até o momento não foi estabelecido como o agente etiológico de uma doença
específica (YAMAMOTO et al., 2000). Assim, é possível citar diversas doenças
relacionadas à infecção por herpesvírus como: conjuntivite, pneumonia, metrite,
lesão de pele, mamilite ulcerativa, enterite, tumor na bexiga urinária e rúmem.
(YAMAMOTO et al., 2000).
4.4.5 Aspectos econômicos
O aborto pode ser seguido de infecção com uma variedade de alfa, beta e
gama herpesvírus, mas as causas virais da doença uterina raramente são
investigadas em bovinos. Embora a metrite pós-parto afete até 40% do gado,
causando infertilidade e perdas econômicas consideráveis, foi assumido que as
maiorias das doenças são de origem bacteriana e isolamento viral ou sorologia
raramente é considerada (DONOFRIO et al., 2007).
28
4.4.6 Epidemiologia
O vírus tem sido identificado por todo o mundo, mas principalmente na
Europa, Africa, América do Norte, e Ásia. Na Bélgica, em três diferentes estudos, as
prevalências foram de 28,7%, 15% e 38%. Na Holanda 4% das amostras de leite
foram positivas em um total de 54 vacas com mamilite. Em 1986, 18,4% dos soros
foram positivos na região oeste da Alemanha, e de 0 - 69% de soros pertencentes a
centrais de distribuições. No norte da Itália 50% das explorações estão infectadas,
na Suíça 4,2% dos animais destinados ao abate estão infectados. Na Escócia, em
um estudo com 109 touros destinados à reprodução não houve detecção de Ac. ao
BoHV-4. No Quênia, Tanzânia e África do Sul, diferentes amostras de BoHV-4 tem
sido isolados de infecções cutânea, Epididimite e vaginite. No Zaire, um estudo
sorológico revelou que 70% dos bovinos são soro positivo. Em Gana, e na Etiópia,
os relatórios de sorologia revelam que 14 e 22,3% respectivamente são soro
positivo. Na região Oeste da África 93,6% dos búfalos africanos são soros positivo.
Na América do Norte, a soro prevalência difere de região para região. Em um estudo
sorológico de animais de corte e leiteiro de Idaho, Oregon e Washington detectou
86% dos animais positivos. Em um outro estudo realizado em Minessota permitiu por
em evidência Anticorpos para BoHV-4 em 17% dos animais de exploração sem
problemas. No Kansas a prevalência para a infecção é de 12,4% dos animais de
corte e 24,2% dos animais de leite. Na Geórgia há um relatório de soro prevalência
de 36% de animais leiteiros com problemas de endometrite. Em Taiwan, 23,3% e no
Japão 8,9% dos animais são infectados (GORIAYNOFF et al ,2003).
29
4.4.7 Diagnóstico
Os meios diagnósticos do BoHV-4 são quase os mesmo do BoHV-1. Apenas
o teste de soroneutralzação não pode ser feito para este vírus, devido à
ambigüidade dos dados sorológicos para níveis não detectáveis de anticorpos
neutralizantes, e reação cruzada de BHV-4 com outros herpesvírus bovino
(BOERNER et al, 1999).
30
5 MATERIAL E MÉTODOS
5.1 CULTIVO DE CÉLULAS DE TRAQUÉIA DE FETO BOVINO
No desenvolvimento deste trabalho, para realização dos testes diagnósticos
do BoHV-1 e BoHV-4, utilizou-se protocolo padrão do TECPAR de cultivo celular
para a produção dos antígenos para o desenvolvimento dos testes.
A linhagem de células de Traquéia de feto bovino utilizada foi proveniente do
Centro de diagnóstico Marcos Enrietti (CDME), sendo armazenada no banco de
células do TECPAR. Uma ampola de células de Traquéia de feto bovino foi retirada
do botijão de nitrogênio líquido (- -maria, à
, para descongelamento rápido das células. O conteúdo da
ampola foi transferido para um tubo de centrífuga contendo 10 ml de meio de
crescimento (MC) (Composição: F-10/199, 5% SFB, 10% TPB, Fungison, Penincilina
G potassica, estreptomicina) e centrifugado a 2.500 rpm por 5 minutos para a
formação de sedimento celular. O sobrenadante contendo Dimetilsufóxido (DMSO),
reagente de congelamento e tóxico para as células em meio de cultura, foi
descartado. O sedimento foi ressuspendido com 10mL de MC, e transferido para
garrafa de 75cm² de superfície contendo 10 mL de MC. A cultura foi mantida em
estufa 5% CO2
48 horas após o início do processo de incubação. Todos os cultivos celulares foram
incubados nas mesmas condições.
31
5.2 AMPLIAÇÃO CELULAR
Estando a camada celular formada no fundo da garrafa (monocamada
confluente) coletou-se o sobrenadante e em seguida foram adicionados 3 mL de
tripsina (Composição: Tripsina 2,5% e EDTA 10%) e com movimentos de inclinação
da garrafa por 2 ou 3 vezes com finalidade de lavagem da monocamada.
Descartou-se o sobrenadante e adicionou-se mais 3 mL de tripsina seguido de 5 a
10 minutos de incuba (FIGURA 5), até o desprendimento
completo das células da garrafa e individualização destas.
As células foram homogeneizadas com 10mL de MC com 5% de SFB para
neutralização da tripsina e dissociação dos grumos celulares, foram adicionadas em
garrafa de 150cm² e o meio foi completado até o volume final de 50 mL. Este
processo de ampliação celular foi realizado por vezes consecutivo até a obtenção do
volume celular desejado.
FIGURA 5 2, e garrafas cultivo celular.
32
5.3 PRODUÇÃO DE ANTÍGENOS
5.3.1 Produção de herpesvírus 1 para uso em soroneutralização.
Uma garrafa de 150 cm² (FIGURA 7), com camada celular confluente, foi
utilizadada para iniciar a produção do antígeno.
Primeiramente o meio de crescimento da garrafa foi descartado. Em seguida,
de uma ampola contendo BoHV-1 com título 10-7 TCID50/50µL foi feita uma diluição
10-3 em um volume total de 10 mL. Foi colocado tal diluição na garrafa para
inoculação do vírus, então, colocado para incubação por 1 hora em estuf
com agitações da garrafa a cada 15 minutos. Ao fim da incubação adicionou-se a
garrafa mais 15 mL de meio de manutenção.
por 48 a 72 horas. Foi feita uma avaliação diária da monocamada celular, e quando
esta com efeito citopático generalizado, a garrafa foi submetida a 3 congelamentos e
descongelamento (-
3.000 rpm por 20 minutos para clarificação. (FIGURA 6)
33
FIGURA 6 Centrífuga para clarificação.
Após este procedimento o sobrenadante foi fracionado em volumes de 1 mL,
em criotubos, congelados a - feridos para nitrogênio líquido (-
FIGURA 7 Garrafa de cultivo celular 150cm2.
5.3.2 Produção de BoHV-1 e BoHV-4 para uso em ELISA
A partir de 3 garrafas de 150cm² foi preparado uma garrafa Roller de 890cm²
(FIGURA 8)
34
estivesse confluente. Então as células foram infectadas com 10mL de uma
suspensão viral de 10-3
monocamada mostrou 100% de efeito citopático, foram feitos 3 ciclos de
congelamento e descongelamento (-
foi feita uma clarificação na centrifuga a 5.000 rpm por 20 minutos. O sobrenadante
da clarificação foi concentrado em ultra filtro até 10% do volume original.
FIGURA 8 - Garrafa Roller de cultivo celular de 890cm².
Depois distribui-se a suspensão viral concentrada igualmente em seis tubos
de ultra centrífuga contendo 3ml de solução de sacarose a 30% (Composição:
Tampão TEN e Sacarose), pesados para distribuição adequada de pesos, e então
colocados na ultracentrífuga a 25.000 rpm por 90 minutos, para a semipurificação.
Resuspendeu-se o pellet em tampãoTEN (Composição: Tampão TRIS, EDTA,
Cloreto de Sódio e água ultra pura) aproximadamente 200µL por tubo, e tratou-se
esta suspensão em ultra som com potência de 75,80 Watts, 20Hz em 3 ciclos com
15 segundos cada. O antígeno obtido foi fracionado em tubos eppendorf e colocados
em freezer a - -
35
5.3.3 Titulação viral para Soroneutralização
Foi removido do botijão de nitrogênio líquido (-
amostra viral conforme descrito o item 5.3.1.
Foram então utilizados oito tubos de diluição, e em cada tubo foram
adicionados 2,7 mL de meio de manutenção, onde em seguida no primeiro tubo foi
adicionado 0,l mL da amostra viral (diluição 10-1 Vírus/ meio de manutenção),
homogeneizado10/199, Fungison, Penincilina G potassica, estreptomicina) e então
transferido 0,3 mL ao segundo tubo (10-2 Vírus/ meio de manutenção (Composição:
F-) e assim sucessivamente até obter uma diluição 10-8 Vírus/ meio de manutenção.
Sempre trocando as ponteiras da micropipeta a cada transferência de um tubo para
outro.
Em uma placa para cultivo de células com 96 poços (FIGURA 9), foram
adicionados 50µl de meio de manutenção em todos os poços. Em seguida foi
colocado nas colunas 11 e 12 de A a H 50µl da diluição 10-8, nas colunas 9 e 10 foi
colocado 50µl da diluição 10-7 , 50µl da diluição 10-6 nas colunas 7 e 8, 50µl da
diluição 10-5 nas colunas 5 e 6, 50µl da diluição 10-4 na coluna 4, 50µl da diluição
10-3 na coluna 3, 50µl da diluição 10-2 na coluna 2 e 50µl da diluição 10-1 na coluna
1.
36
FIGURA 9 Distribuição de diluições virais para titulação viral em SN.
Feito isso a placa foi colocada 2 durante 1
hora para incubação. Após a incubação, foram adicionados 100µl de uma
suspenção de células, contendo 4x105 células por mL de meio de crescimento.
Leituras diárias da placa foram feitas até o 5º dia com intuito de acompanhar
os efeitos citopáticos, e após o 5º dia foi calculado o título viral por Reed and
Muench ou Sperman- Karber.
Método de Sperman Karber
Porcentagem da menor diluição 50 = X + diluição da menor %
Porcentagem da menor diluição 0
Método de Reed and Muench
Porcentagem maior - 50
Porcentagem da maior porcentagem menor
37
Diluição
do vírus
Poços
inoculados
Efeito
Citopático
Poços com
infecções
(Acumuladas)
Poços não
infectados
(Acumulados)
Resultado
da taxa %
-1 8 8 50 0 100
-2 8 8 42 0 100
-3 8 8 34 0 100
-4 8 8 26 0 100
-5 8 8 18 0 100
-6 8 6 10 2 83
-7 8 3 4 7 36
-8 8 1 1 14 6
TABELA 1 Organização de dados para titulação viral pelo Método Reed and
Muench.
5.3.4 Titulação de antígeno e conjugado para o teste de ELISA
Nesta etapa, foi utilizada uma placa de polietileno com alta adsorção
(Imunolon Greiner) contendo 96 poços com fundo chato. Para Iniciar a diluição do
antígeno, cada poço foi preenchido com 50µL de Tampão de adsorção
(Composição: NaHCO3, Na2CO3, NaN3, e água ultra pura) e depois foi adicionado
50µL/ poço do antígeno viral produzido conforme descrito anteriormente na
produção de BoHV-1 e BoHV-4 para teste de ELISA, com diluição 1:50, na coluna 1,
que foi homogeneizado e transferido 50 µL para a coluna seguinte e assim
sucessivamente até a coluna 12 e os últimos 50 µL foram desprezados, seguida de
incubação de 4 (FIGURA 10).
38
FIGURA 10 Direção de diluição do Antígeno.
Depois, da adsorção do antígeno, foi feita a primeira lavagem com a
finalidade de remover o excesso de antígeno que não se fixou na placa. Utilizou-se
300µL/poço de solução de lavagem (Composição: NaCl), com auxÍlio do aparelho
para lavagem de placas (ELX50® Automated Strip Washer Bio-Tek Instruments,
INC) (FIGURA 11). A operação de lavagem foi repetida por cinco vezes. E a solução
ainda restante nos poços foi retirada invertendo-se a placa sobre papel absorvente.
FIGURA 11 Lavadora de placas de ELISA. (ELX50® Automated Strip
Washer Bio-Tek Instruments, INC)
39
Em seguida foi feito o bloqueio dos poços com o objetivo de bloquear os sítios
de ligação não específicos. Este bloqueio foi feito utilizando 100µL/ poço de solução
de bloqueio (Composição: Tampão TRIS, BSA, Azida sódica). Incubou-se a mesma
60 minutos, em seguida verteu-se a placa para retirada do
tampão e incubação do soro.
Diluiu-se 1:25 em tampão de bloqueio o soro de bovino sabidamente positivo
para uma placa e outro soro sabidamente negativo para outra placa, e depois a
diluição foi dis
durante 60 minutos. Após a incubação, a placa foi lavada como descrito no item
5.3.4, para a retirada dos anticorpos que não se ligaram ao antígeno adsorvido na
placa.
Adicionou-se 50µL/poço de tampão de diluição (Composição: Tampão TRIS,
BSA, Azida sódica). O segundo anticorpo a ser adicionado na placa foi
imunoglobulina anti-IgG de bovino, conjugado com a enzima peroxidase (Sigma
Chemical Company- A9044). De forma semelhante ao antígeno, foi feita a diluição
seriada de conjgado, sendo distribuida na linha A de 1 a 12 , 50µL de conjugado
diluído 1:400, assim a diluição ficou 1:800, pois já haviam os 50µL de tampão de
diluição.E assim com uma micropipeta multicanal foram feitas diluiçoes sucessivas
da linha A até H (FIGURA 12)
de lavagem.
40
FIGURA 12 Direção da diluição do Conjugado.
A atividade enzimática foi revelada usando-se 50µL/poço da solução
reveladora (Composição: Cromógeno OPD, Tampão Citrato). A placa foi incubada a
, a reação foi
interrompida pela adição de 50µL/ poço de ácido sulfúrico 1N.
A diluição do antígeno e conjugado foi escolhida a partir da leitura da placa,
comparando resultados do soro positivo com soro negativo. Uma densidade ótica de
0,800 a 1,0 para soro positivo e de 0,100 a 0,150 para soro negativo, para posições
equivalentes na placa, são diluições de reagentes adequadas.
41
5.4 DESENVOLVIMENTO DOS TESTES
5.4.1 Soroneutralização para detecção de Anticorpos anti BoHV-1
Para a realização do teste de soroneutralização, primeiramente foi feita a
inativação dos soros teste em banho maria
descongelamento dos soros.
Foram utilizadas duas placas de cultivo de células com 96 poços, onde cada
poço foi preenchido com 50µL de meio de manutenção (ANEXO), e posteriormente
foi adicionado 50µL de cada soro a testar, e os soros de referencia ( um positivo e
um negativo para posterior comparação de resultados), em duplicata (Ex: A1 e A2),
fazendo assim uma diluição 1:2, em seguida foi feita uma diluição 1:4 passando
50µL da diluição 1:2 para os próximos poços da segunda linha. (Ex: 50µL de A1 para
B1 e A2 para B2).
Depois, em todos os poços foram colocados 50µL de suspensão viral
100TCID50 , e então as placas foram colocadas para incubação por 24 horas à
Uma terceira placa de cultivo celular foi utilizada para a realização de uma
retrotitulação viral para verificar a eficiência do 100TCID50, Nesta placa foi adicionado
50µL de meio de manutenção em cada um dos 96 dos poços. Nas colunas 11 e 12
foram adicionados 50 µL de suspensão viral zero TCID50, nas colunas 9 e 10 com
1TCID50, nas 7 e 8 com 10TCID50, nas 5 e 6 com 100TCID50, e as colunas 1,2,3 e 4
foram utilizadas para controle celular. Depois de feitas estas distribuições as placas
42
Passadas as 24 horas, foram adicionadas às placas 100µL de uma
suspensão celular com 4 x 105
dias.
FIGURA 13 Fluxograma da Soroneutralização.
Foi feito um acompanhamento diário em microscópio invertido (FIGURA 14)
das placas até o 5º dia, quando foi feita a leitura para interpretação de resultados.
43
FIGURA 14 Microscópio invertido.
Os soros contaminados e/ ou hemolizados tiveram monocamada avaliada no
teste para ver sua integridade e os que deixaram dúvidas foram coletados e valiados
novamente.
44
5.4.2 ELISA para detecção de anticorpos anti -BoHV-1 e BoHV-4..
Para a execução do ELISA, microplacas de polietileno de 96 poços foram
sensibilizadas com 50µL/ poço de Ag. em uma diluição 1:200 como pré determinada
na etapa de titulação de antígeno citado no item 5.3.4.
úmida. No dia seguinte à sensibilização foi retirada a diluição da placa invertendo-a.
Em seguida foram feitas cinco lavagens com tampão de lavagem em um
equipamento próprio para lavagem de placas de ELISA, e invertidas em papel
absorvente para retirar o líquido restante de lavagem.
Depois de lavadas, as placas foram bloqueadas com 100µL de tampão de
bloqueio
de CO2 por 1 hora
Retirado então o tampão de bloqueio dos poços invertendo as placas, foram
distribuídos 50µL de soros teste diluídos 1:25 nos poços em duplicata, e foram
2 por 1 hora novamente.
Após a incubação dos soros, as placas foram invertidas para retirada do soro,
e então cinco lavagens das placas foram feitas, e estas foram invertidas em papel
absorvente para serem secas.
De acordo com a diluição do conjugado (1:3200) pré determinada como cita o
item 5.3.4 , foi feita a distribuição de 50µL desta diluição do conjugado em todos os
Feita a incubação do conjugado, as placas foram lavadas da mesma forma
que já foi descrita anteriormente e foram então adicionados 50µL de solução
45
reveladora em todos os poços para revelar a atividade enzimática. As placas foram
5 minutos de incubação a
reação foi interrompida pela adição de 50µL/ poço de Solução de Parada.
FIGURA 15 Esquema ilustrativo do ELISA.
Fonte: UNESP, 2010.
46
5.4.3 IFI para detecção de anticorpos anti BoHV-1 e BoHV-4.
Para a realização do teste de imunofluorescência foi utilizada uma placa com
96 poços para cultivo celular. Em cada poço foi adicionada 100µL de uma
suspensão celular contendo 4x105 Células/ ml.
2 por 48 horas. Após as 48
horas o meio foi removido, e a camada celular que ficou na placa foi lavada com
100µL de salina Tamponada (Composição: NaCl, PBS50x, água ultra pura) e em
seguida inoculada às células uma suspensão viral contendo 100 TCID50/50µL e para
inoculação colocou-
100µL de meio de crescimento foram colocados em cada poço. Vinte e quatro horas
após a infecção, já era possível observar os efeitos citopáticos, e então foi removido
o meio de cultura, e novamente as placas foram lavada com salina tamponada,
sendo 50µL do mesmo por poço, e a placa foi invertida para retirar a solução, depois
lavou-se as placas com 50µL de acetona 80% por poço e invertidas para a retirada
da mesma da placa.
As células adsorvidas nas placas foram fixadas com 50µL por poço de
acetona 80%, e deixadas em temperatura ambiente por 30 minutos.
Os soros a serem testados foram diluídos 1:10, assim como os soros controle
positivo e negativo, e foram distribuídos 50µL por poço, sendo 2 poços para cada
com 50µL de Salina Tamponada.
47
Lavadas as placas, foi adicionado 50µL por poço de conjugado anti IgG
Bovino com FITC (Isotiocianato de Fluoresceína) e depois colocadas para incubar
Após a incubação as placas foram lavadas com salina tamponada por mais 2
vezes, com 50 µL por poço, e uma ultima lavagem foi feita com água ultra pura. E
em seguida foi feita leitura em microscópio invertido com U.V.
FIGURA 16 Fluxograma da IFI.
48
6 RESULTADOS
6.1 SORONEUTRALIZAÇÃO
A ausência de efeito citopático era indicativo de que o soro era positivo para
BoHV-1, e se fosse possível observar focos de efeito citopático o soro era negativo
(FIGURAS 17 e 18). Em casos que para a diluição 1:2 o soro era positivo e na
diluição 1:4 era negativo, determinou-se que o soro seria postivo.
FIGURA 17 Célula com efeito citopático ( Soro Negativo)
FIGURA 18 Monocamada celular intacta (Soro positivo)
49
6.2 ELISA
A leitura dos resultados foi obtida com base na densidade óptica (D.O.)
determinada em espectrofotômetro (FIGURA 19) com comprimento de onda de 490
nm. Após a leitura, foram determinadas as médias das D.O. de cada soro em teste,
dos soros controle positivo e negativo e orifícios nos quais foram adicionados soros
bovinos.
FIGURA 19 Espectofotômetro (µQuant Bio- Tek Instruments, INC)
A deter
expresso em densidade ótica, aquem do qual os soros são considerados negativo.
Para isso, foram utilizados soros provenientes de uma propriedade cuja prevalência
de BoHV-1 foi considerada zero. Estabeleceu-se a média das densidades óticas e o
desvio padrão. Este procedimento utilizado já foi previamente estabelecido em
trabalhos anteriores.
50
6.3 IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA
Os soros positivos apresentavam células com efeitos citopáticos com
coloração fluorescente (FIGURA 20).
FIGURA 20 Células com efeitos citopáticos fluorescentes (Soro Positivo)
Os soros negativos apresentavam células infectadas porém com coloração verde
fosco (FIGURA 21).
FIGURA 21 Efeito citopático com coloração verde fosco (Soro Negativo)
51
7 DISCUSSÃO
Descreve-se no presente trabalho um conjunto de metodologias aplicáveis ao
diagnóstico sorológico de um grupo de vírus pertencentes a família Herpesviridae,
com ocorrência em rebanhos bovinos brasileiros, documentada por inquéritos
sorológicos e ou isolamento viral, e frequentemente associados a patologias dos
aparelhos respiratório, digestório e reprodutivo. Outros, com manifestações cutâneas
e nervosas.
Das atividades desenvolvidas, que compões um repertório de abordagens
que visam evidenciar a interação patógeno-hospedeiro, que tenha como alvo a
caracterização bioquímica de proteínas e ácidos nucléicos virais nos tecidos
animais, isolamento viral em cultivo de células in vitro, quer destine-se a avaliação
da imunidade humoral (Anticorpos) e ou celular (blastogênise, linfocinas, etc.),
buscou-se aqueles instrumentos que permitissem uma contribuição pedagógica e
que ao mesmo tempo fossem estratégicas ao conhecimento da epidemiologia e
controle das doenças.
Das metodologias trabalhadas, a soroneutralização, considerado o teste de
referência ao desenvolvimento de outros, oferece a possibilidade de diagnóstico
binomial, positivo-negativo, mas também quantitativo, expressão de um título, e que
tem a capacidade única de evidenciar anticorpos neutralizantes. GIBBS e
RWEYEMAMU (1977) citam que o teste de SN. É altamente específico e confiável
para a detecção de anticorpos contra BoHV-1, e que os animais positivos
apresentam títulos entre 8 e 64.
ELISA, uma metodologia com ampla aceitação, pela sua praticidade, rapidez,
e independência de cultivo de células, contitui-se em uma opção com elevada
52
sensibilidade para diagnóstico precoce de infecções e também para discriminar
resposta imune e vírus materno daquelas para vírus vacinais.O teste de ensaio
imunoenzimático, apresenta uma elevada concordância com a soroneutralização, e
pode ser automatizada, simplificando os inquéritos epidemiológicos (CORTEZ, A. et
al., 2001)
Imunofluorescência, apesar da dependência intensa, e as vezes penosa da
microscopia. Constituiu-se em alternativa de diagnóstico e também para referenciar
outros testes, em que anticorpos neutralizantes não são produzidos ou então em
baixos títulos.
A aplicação e uso das metodologias descritas teve como objeto de estudos
soros bovinos procedentes de uma propriedade sabidamente com prevalência
elevada de BoHV-4 em que se pretendia estudar possíveis relações sorológicas
entre este vírus e o BoHV-1.
No que tange ao diagnóstico sorológico do BoHV-1, um único animal foi
revelado positivo pelas três metodologias e os demais negativos, revelando que para
os níveis de anticorpos presentes no soro apresentaram sensibilidade equivalente.
Com este trabalho teve início um estudo que pretende avaliar relações
sorológicas entre o BoHV-1 e BoHV-4, com informações discrepantes na estrutura
internacional e fundamental para o desenvolvimento de insumos e reagentes para
diagnóstico. Os resultados jurados obtidos serão objeto de publicação por isso não
constam no presente trabalho.
53
8 CONSIDERAÇÕES FINAIS
O estágio curricular obrigatório foi de fundamental importância para a minha
formação profissional e para aplicação prática de conhecimentos adquiridos na
universidade. A experiência comprova que certos conhecimentos só podem ser
adquiridos quando são realizados na prática.
Foi durante o estágio curricular obrigatório que tive contato com novas
tecnologias e novas maneiras de trabalho, aprendendo muito sobre disciplina,
relação inter-pessoal, responsabilidade e postura profissional.
54
9 CONCLUSÃO
A importância da avaliação sorológica no diagnóstico das infecções pelo
BoHV 1 e 4 é evidente pois demonstra a distribuição geográfica do vírus
principalmente. A implantação de um programa de erradicação destas enfermidades
está diretamente ligada a prevalência da infecção em determinadas regiões. Por isso
é importante a informação de surtos destas infecções com isolamento do vírus e o
conhecimento da situação sorológica dos rebanhos, que traduz o nível de infecção
dos bovinos.
Com o desenvolvimento deste trabalho foi possível observar que existem
diversas maneiras de se realizar estes diagnósticos sorológicos, obtendo os
mesmos resultados em todos eles, tendo como diferenças, a sua rapidez de
resolução, facilidade de obtenção de resultados e também o custo-benefício.
55
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