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UNIVERSIDADE NOVE DE JULHO – UNINOVE
PROGRAMA DE MESTRADO E DOUTORADO EM CIÊNCIAS DA
REABILITAÇÃO
DIRETORIA DE SAÚDE
BEATRIZ GUIMARÃES RIBEIRO CARDOSO
EFEITO DA LASERTERAPIA PRÉVIA SOBRE O REPARO MÚSCULO
ESQUELÉTICO DE RATO
SÃO PAULO
2013
BEATRIZ GUIMARÃES RIBEIRO CARDOSO
EFEITO DA LASERTERAPIA PRÉVIA SOBRE O REPARO MÚSCULO
ESQUELÉTICO DE RATO
Orientadora: Raquel Agnelli Mesquita Ferrari
SÃO PAULO
2013
Dissertação de Mestrado
apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Ciências da
Reabilitação da Universidade
Nove de Julho, para obtenção
do título de mestre.
DEDICATÓRIA
Aos meus pais, Maria e Luiz, por serem minha base;
À minha irmã, Maria Fernanda, por ser meu pilar;
E ao meu filho, Felipe, por ser a minha força.
Obrigada, amo vocês!
AGRADECIMENTOS
À Deus, por permitir que eu traçasse novos caminhos e, mesmo com todas as
dificuldades, encerrasse mais esse ciclo.
À minha família, especialmente aos meus pais, irmã e filho, por estarem ao
meu lado em todos os momentos.
Aos meus amigos, em especial à Deise Araújo, Fernanda Colella, Luiz
Henrique Carvalho, Marcelo Paiva, Raphael Cardoso, por permanecerem
em minha vida mesmo quando tudo resolvia dar errado.
À minha Orientadora Raquel Agnelli Mesquita Ferrari, por todo o
ensinamento, paciência e dedicação nesses dois anos de Mestrado.
Aos alunos Iniciação Científica, especialmente a Mariana Gomes e Tatiane
Matarazzo Cantero, por toda a ajuda e auxílio, independente do dia e da hora
estavam comigo no laboratório firmes e animadas.
Aos colegas do laboratório, em especial ao Agnelo Neves Alves, Ana
Franco, Elis Victor, Gabriela Cardoso, Vinicius Cardoso, por esses dois
anos de convivência e aprendizado.
À Universidade Nove de Julho (UNINOVE), por proporcionar essa
oportunidade e a infraestrutura necessária para realização desse trabalho.
À Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP),
pela concessão da bolsa (2012/11461-5) que permitiu minha dedicação durante
esse período, além da viabilização desse trabalho.
“Talvez não tenha conseguido fazer o melhor, mas lutei
para que o melhor fosse feito. Não sou o que deveria
ser, mas Graças a Deus não sou o que era antes”.
(Marthin Luther King)
RESUMO
O laser de baixa potência (LBP) tem sido utilizado por promover um
reparo muscular de melhor qualidade, porém, pouco se sabe sobre seus efeitos
quando aplicado previamente. O objetivo do presente estudo foi avaliar os
efeitos do LBP previamente a lesão muscular sobre o processo de reparo,
atividade da metaloprotease de matriz MMP-2 e deposição do colágeno. Foram
utilizados 40 ratos Wistar, divididos em 5 grupos: (G1) Controle; (G2) Sham;
(G3) Somente irradiação com laser; (G4) LBP previamente à lesão; (G5)
Somente lesão. A criolesão consistiu de duas aplicações de bastão resfriado
em nitrogênio líquido no músculo tibial anterior (TA). Os grupos 4 e 5 foram
avaliados em 1, 3 e 7 dias após a lesão. A irradiação prévia foi realizada com o
laser AsGaAl (λ 780nm; 10 J/cm²; 40 mW; 10 segundos por ponto; 8 pontos;
3.2 J) e ao término do protocolo, os músculos TA foram removidos para análise
morfológica (coloração com hematoxilina-eosina), colágeno (coloração de
Picrosirius) e atividade de MMP-2 pela técnica de Zimografia. Os resultados
demonstraram que o LBP aplicado previamente a lesão reduziu o infiltrado
inflamatório após 3 dias, mionecrose após 1 e 3 dias, aumentou o número de
vasos sanguíneos após 3 e 7 dias e de fibras imaturas após 7 dias. Também
aumentou a atividade da MMP-2 e reduziu a deposição de colágeno após 7
dias. Concluindo, o LBP previamente à lesão modulou positivamente o
processo inflamatório e reparo muscular, atividade da MMP-2 e organização e
deposição do colágeno durante a regeneração muscular.
Palavras-chave: Terapia a laser de baixa potência; Músculo tibial anterior;
Regeneração.
ABSTRACT
The low level laser therapy (LLLT) is widely used in order to promote
faster and better repair muscle with reference to different types of injury,
however, studies on the prior application of the laser are scarce. The aim of this
study is to evaluate the effect of LLLT prior to injury on the repair process and
the matrix metalloproteinase MMP-2. For that, were used 40 Wistar rats divided
into 5 groups: (G1) Control, (G2) Sham; (G3) No lesion with LLLT immediately
prior to sacrifice; (G4) LLLT immediately prior to muscle injury TAD; (G5) Only
injury without treatment with LLLT. The cryoinjury applications consist of two rod
cooled in liquid nitrogen directly into the TA muscle. Groups 4 and 5 were
assessed at 1, 3 and 7 days after injury. The LLLT were performed using the
GaAlAs laser (λ 780nm) with the density energy of 10 J/cm², output power of 40
mW, time of 10 seconds per point, with 8 points of application and total energy
3.2 J. After treatment, the TA muscles were removed and sections were
obtained with the assistance of a microtome for morphology analysis using
hematoxylin-eosin and collagen using Picrosirius staining. To assess the activity
of MMP-2 is used technique Zymography in the different groups and its
characterization technique was used for Western blotting. The results
demonstrate that LBP applied prior to induction of the injury caused a reduction
of inflammatory cells after 3 days, myonecrosis after 1 and 3 days, an increase
of blood vessels after 3 and 7 days and after 7 days immature fibers. There was
increased activity of MMP-2 after 7 days and reduced collagen deposition in the
same period, with better organization of your arrangement tissue. In conclusion,
LBP applied immediately before the injury induced positive effects on the
modulation of inflammation and repair muscle activity of MMP-2 and
organization and collagen deposition during muscle regeneration.
Keywords: Laser Therapy, Low-Level; Muscle, Skeletal; Regeneration.
ÍNDICE
1. CONTEXTUALIZAÇÃO ....................................................................... 12
1.1. Regeneração muscular e células satélites ................................. 12
1.2. Matriz extracelular – importância de seu remodelamento e das
metaloproteases de matriz na regeneração muscular ................ 13
1.3. Importância do colágeno no tecido muscular ............................. 14
1.4. Laser de baixa potência .............................................................. 15
1.5. Justificativa ................................................................................. 16
2. OBJETIVOS ......................................................................................... 17
2.1. Geral ........................................................................................... 17
2.2. Específicos ................................................................................. 17
3. MATERIAL E MÉTODOS .................................................................... 18
3.1. Animais ....................................................................................... 18
3.2. Grupos experimentais ................................................................. 18
3.3. Procedimento de criolesão ......................................................... 19
3.4. Irradiação laser de baixa potência .............................................. 20
3.5. Análise morfológica .................................................................... 22
3.6. Análise de colágeno ................................................................... 23
3.7. Zimografia ................................................................................... 23
3.8. Análise dos resultados ................................................................ 24
4. RESULTADOS ..................................................................................... 25
4.1. Artigo 1 ....................................................................................... 25
5. CONSIDERAÇÕES FINAIS ................................................................. 46
6. REFERÊNCIAS .................................................................................... 47
7. APÊNDICES ......................................................................................... 54
7.1. Comprovante de submissão de artigo para a Revista
Fisioterapia e Pesquisa .............................................................. 54
7.2. Comprovante de submissão de artigo para a Revista Lasers in
Medical Science .......................................................................... 55
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Demonstração do procedimento de criolesão ............................ 20
Figura 2. Procedimento de irradiação com LBP da região lesionada ....... 22
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Parâmetros dosimétricos do laser de baixa potência ................ 21
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
µg Micrograma
µl Microlitros
µm Micrometro
AsGaAl Arseneto de Gálio e Alumínio
CaCl2 Cloreto de cálcio
cDNA DNA complementar
CK Creatina quinase
cm2 Centímetro ao quadrado
CO2 Dióxido de carbono
COX-2 Ciclooxigenase 2
CS Célula satélite
DEPC Dimetil pirocarbonato
DNA Ácido desoxirribonucleico
dNTP Deoxinucleotídeos trifosfatos
EDTA Ácido etilenodiamino tetra -acético
eV Eletrón-volt
GAPDH Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase
HCl Ácido clorídrico
J Joules
J/cm2 Joules por centímetro ao quadrado
LBP Laser de baixa potência
LDH Lactato desidrogenase
MEC Matriz extracelular
mg Miligrama
mg/ml Miligrama por mililitro
ml Mililitro
mM Milimolar
mm Milímetro
MMP-2 Metaloproteinase de matriz 2
MMP-9 Metaloprotease de matriz 9
MMPs Metaloproteases de matriz
MRF4 Fator regulatório miogênico 4
MRFs Fatores regulatórios miogênicos
mW Miliwatts
Myf5 Fator miogênico 5
MyoD Fator de determinação miogênico 1
NaCl Cloreto de sódio
NaN3 Azida de sódio
nM Nanomolar
nm Nanômetros
ºC Grau Celsius
PCR Reação em cadeia polimerase
PCR Proteína C-reativa
pH Potencial de hidrogênio
RNA Ácido ribonucleico
RNAm Ácido ribonucleico mensageiro
ROS Espécie reativa de oxigênio
rpm Rotações por minuto
SDS Dodecil sulfato de sódio
TA Tibial anterior
TAD Tibial anterior direito
TAE Tibial anterior esquerdo
TGF- β Fator de crescimento transformador β
TNF- α Fator de necrose tumoral α
W/cm² Watts por centímetro ao quadrado
ZnCl2 Cloreto de zinco
λ Comprimento de onda
12
1. CONTEXTUALIZAÇÃO
O músculo esquelético é um tecido dinâmico (Muñoz-Cánoves et al,
2013) composto por fibras musculares e células satélites (CS) embebidas em
uma matriz extracelular (Shi & Garry, 2006) que apresenta excelente
capacidade de regeneração após uma lesão (Souza & Gottfried, 2013).
As lesões musculares são comuns, principalmente em atletas (Souza &
Gottfried, 2013) e representam de 10 a 55% de todas as lesões no meio
esportivo (Kääriäinen et al, 2000), resultando em afastamento aos treinos e
competições por longas semanas e comprometendo o desempenho dos atletas
(Almekinders, 1999). Essas lesões são causadas, em sua maioria, por traumas
diretos (Palacio et al, 2009; Almeida et al, 2013), sendo 90% delas, contusões
ou estiramentos (Järvinen et al, 1993; Fernandes et al, 2011),
1.1. Regeneração muscular e Células Satélites (CS)
A regeneração muscular envolve a reação inflamatória, ativação e
proliferação de células precursoras, síntese e degradação de elementos que
constituem a matriz extracelular, degradação de tecido necrótico, deposição de
colágeno e remodelamento (Tidball, 2005; Baptista et al, 2011; Souza et al,
2011). Durante o processo inflamatório, ocorre vasodilatação, aumento da
permeabilidade vascular, estase sanguínea, aderência das células
inflamatórias através de moléculas de adesão e recrutamento de citocinas
devido ativação inflamatória das células endoteliais (Sprague et al, 2009). Além
disso, há infiltração de neutrófilos que fagocitam detritos celulares e fibras
necróticas induzindo a ativação de CS (Grounds et al, 2002; Tidball, 2010).
As CS são células precursoras miogênicas indiferenciadas que
permanecem quiescentes entre a lâmina basal e o sarcolema das fibras
musculares (Zammit et al, 2004; Buckingham & Montarras, 2008) e estão
diretamente envolvidas com o crescimento e a regeneração muscular
(Lindstrom, 2010; Tidball, 2010). Após uma lesão, as CS são ativadas e uma
pequena quantidade de células regressa ao estado quiescente para
restabelecer a população de CS (auto-renovação) (Hawke et al, 2001; Chargé
13
& Rudnicki, 2004; Tedesco et al, 2010), enquanto a maioria migra para o local
da lesão (Tidball et al, 2010). Então elas se proliferam, sendo denominadas
mioblastos (Muñoz-Cánoves et al, 2013), que se diferenciam e se fundem
gerando células musculares multinucleadas (miotubos) jovens que se
diferenciam para formar fibras musculares funcionais ou se fundirem a fibras
pré-existentes (Pallafacchiana et al, 2010), reparando o tecido muscular
lesionado (Yin et al, 2013). As CS, quando ativadas, expressam diversos
fatores regulatórios miogênicos (MRFs) durante os diferentes estágios da
miogênese, envolvidos no processo de proliferação e diferenciação celular
(Assis et al, 2013). Os MRFs primários (MyoD e Myf5) são necessários para
determinação e proliferação dos mioblastos e são expressos em estágio inicial
(Chargé & Rudnicki, 2004; Buckingham et al, 2006; Shi & Garry, 2006;
Vatansever et al, 2012). Já os MRFs secundários miogenina e MRF4 são
importantes para a diferenciação terminal das células satélites e a fusão
celular, sendo expressos nos estágios mais tardios (Chargé & Rudnicki, 2004;
Relaix et al, 2006; Zammit et al, 2006; Vatansever et al, 2012).
1.2. Matriz extracelular - Importância de seu remodelamento e das
metaloproteases de matriz na regeneração muscular
A matriz extracelular (MEC) é uma estrutura dinâmica que fornece
suporte e proteção para as fibras musculares, estabilização para o tecido
muscular (Carmignac & Durbeej, 2012) e permite a transmissão da força de
contração muscular (Kragstrup et al, 2011), desempenhando um papel
importante na regeneração muscular (Kjaer et al, 2004; Washington et al,
2011). A MEC é composta por colágenos, fibronectina, elastina, proteoglicanos
e laminina (Cornelison et al, 2008; Mann et al, 2011) e seu remodelamento, que
é um processo que envolve a síntese e degradação de seus componentes
(Zimowska et al, 2008), é realizado por enzimas dependentes de cálcio e zinco
chamadas metaloproteases de matriz (MMPs) (Nelson et al, 2000; Barnes et al,
2009; Rodríguez et al, 2010; Hadler-Olsen et al, 2011).
No músculo esquelético, é demonstrada uma específica participação
da MMP-2 (gelatinase A) e MMP-9 (gelatinase B) no remodelamento da MEC
14
(Chen et al, 2009). A MMP-2 está diretamente relacionada à regeneração e
maturação das fibras musculares esqueléticas (Alameddine et al, 2012) uma
vez que atua na degradação de colágeno do tipo IV modulando sua deposição
e permitindo sua melhor organização no tecido (Chang et al, 2001; Kjaer et al,
2004; Prakobwong et al, 2007; Chen et al, 2009). Já a MMP-9, além de
degradar a matriz durante a reação inflamatória, ativa as CS no início da
regeneração muscular (Chen et al, 2009). Dessa forma, as MMPs são
importantes durante a regeneração muscular por degradarem os componentes
da lâmina basal, facilitando a migração, proliferação e diferenciação das CS
(Zimowska et al, 2008), além de permitirem a angiogênese, importante para um
reparo muscular de melhor qualidade (Mann et al, 2011; Assis et al, 2013).
1.3. Importância do colágeno no tecido muscular
O colágeno é um dos componentes da MEC e seu tipo é classificado
de acordo com sua localização e função. O colágeno do tipo I é encontrado no
tecido conjuntivo denso (epimísio) e tem como função estabilizar a arquitetura
do tecido. Já o colágeno do tipo III é abundante no tecido conjuntivo frouxo
(perimísio) e tem importante função elástica (Souza et al, 2011). O colágeno do
tipo IV é o principal componente da lamina basal (Visse et al, 2003) e tem um
papel importante no arranjo tecidual (Kjaer et al, 2004, Lampe & Bubhby,
2005). No músculo esquelético, o colágeno mantém a integridade funcional das
fibras musculares e auxilia na transmissão da força durante a contração
muscular, por isso a correta organização e distribuição das fibras colágenas
são necessárias para uma melhor funcionalidade do tecido muscular (Gillies et
al, 2011).
Quando há uma lesão, uma rápida resolução do dano tecidual requer
uma sequencia bem organizada dos eventos que ocorrem durante a reação
inflamatória e qualquer perturbação em um desses eventos resulta em
ineficiência da regeneração muscular caracterizada pela persistência da
degeneração das fibras musculares, inflamação e fibrose (Mann et al, 2011). A
fibrose é uma condição patológica onde há acumulo excessivo de
componentes da MEC, especialmente de colágeno, resultando em permanente
15
cicatriz tecidual que reduz a capacidade e desempenho muscular (Mann et al,
2011; Souza & Gottfried, 2013).
1.4. Laser de baixa potência
Na prática clínica, o laser de baixa potência (LBP) é um recurso
terapêutico muito utilizado para promover de forma mais rápida e de melhor
qualidade o reparo muscular frente aos diferentes tipos de lesão (Peplow et al,
2010). Existem diversos tipos de laser, sendo os mais usados os que se
encontram na porção óptica do espectro vermelho (400 a 780 nm) e do
infravermelho (780 a 1 mm), sendo que seus fótons de energia são inferiores a
2,0 elétron-volt (eV) e, por isso, não são capazes de induzir mutação e
carcinogênese por não atingirem a energia necessária para quebrar a ligação
das moléculas biológicas e do DNA (Moore et al, 2005).
Estudos utilizando o LBP demonstram efeitos positivos na modulação
da resposta inflamatória, reparo muscular e deposição de colágeno em
excesso, além de aumento da atividade de MMP-2 quando aplicado após a
indução da lesão (Mesquita-Ferrari et al, 2011(a); Baptista et al, 2011; Souza et
al, 2011; Assis 2012; Assis, 2013; Alves, 2013). No estudo de Baptista et al
(2011) foi demonstrado que a irradiação com LBP após lesão muscular
promoveu incremento no processo de reparo evidenciado pelo aumento de
colágeno IV após 7 dias. No estudo de Souza et al, (2011) foi verificado
aumento significativo de fibras colágenas dos tipos I e III após 7 dias no grupo
tratado com laser após criolesão além de aumento da angiogênese e redução
da mionecrose. Utilizando também o LBP, Mesquita-Ferrari et al (2011(a))
verificaram que houve uma modulação na expressão de citocinas uma vez que
este causou diminuição na expressão de TNF-α após 1 e 7 dias, e de TGF- β
após 7 dias. Alves et al (2013) verificaram que a aplicação do LBP após a
criolesão teve um efeito positivo no processo inflamatório, na atividade da
MMP-2 e na organização e distribuição do colágeno na regeneração muscular.
Contudo há poucos estudos que avaliaram os efeitos do LBP quando aplicado
previamente a uma lesão. Esta situação é de extrema relevância
especialmente quando consideramos indivíduos nos quais o risco de lesão é
16
sempre eminente, como ocorre na prática desportiva. Estudos em animais
(Lopes-Martins et al, 2006; Almeida et al, 2011) e humanos (Leal-Junior et al,
2009(a); Leal-Junior(b) et al, 2009; Baroni et al, 2010, Marchi et al, 2012) têm
demonstrado que o uso do laser previamente a indução de fadiga muscular tem
diminuído o nível de lactato sanguíneo por melhorar sua remoção, além de
redução do processo inflamatório, proteína C-reativa (PCR) e Creatina Kinase
(CK). Lopes-Martins et al (2006) demonstraram que o laser aplicado antes da
indução de fadiga muscular por meio de estimulação elétrica previne seu
desenvolvimento no músculo TA de ratos durantes as repetições tetânicas.
Almeida et al (2011) demonstrou que o LBP aplicado imediatamente antes à
indução de fadiga muscular melhorou o desempenho muscular e reduziu a
expressão de ciclooxigenase-2 (COX-2). Leal-Junior et al (2009(a)) avaliaram o
feito do LBP infravermelho aplicado imediatamente antes da indução de fadiga
em atletas e observaram redução de CK e de lactato sanguíneo. Baroni et al
(2010) observaram que o tratamento com LBP antes do exercício reduziu CK e
LDH e atenuou a diminuição da força muscular. Marchi et al (2012)
demonstraram que o LBP antes do exercício de corrida aumentou o
desempenho muscular e reduziu o estresse oxidativo e o dano muscular.
1.5. JUSTIFICATIVA
Há grande interesse no estabelecimento de recursos e terapias a
serem utilizados na tentativa de proporcionar uma regeneração muscular de
melhor qualidade e menor duração e, com esse intuito, muitos estudos sobre a
utilização do LBP foram realizados. Contudo, até o momento, foi avaliado o
efeito do laser somente após a lesão muscular e, os estudos sobre aplicação
prévia do laser foram, na sua maioria, em humanos e na condição de estudar a
fadiga muscular. Desta forma, com o presente estudo, objetivamos verificar se
o LBP pode ser um importante recurso terapêutico a ser utilizado previamente
em indivíduos que, frequentemente, estão sujeitos a lesão muscular como os
atletas, minimizando os danos causados por essas lesões.
17
2. OBJETIVOS
2.1. Geral
Analisar efeitos da irradiação com LBP (λ 780nm) previamente à
criolesão do músculo esquelético de rato.
2.2. Específicos
Avaliar os efeitos da aplicação do LBP previamente à lesão
sobre os aspectos morfológicos durante o processo de reparo do
músculo esquelético de rato após criolesão.
Avaliar os efeitos da irradiação prévia do LBP na deposição e
organização de colágeno no músculo esquelético.
Avaliar os efeitos da irradiação prévia do LBP sobre o
remodelamento da MEC por meio da análise da atividade de
MMP-2 no músculo esquelético de rato em processo de reparo,
após criolesão.
18
3. MATERIAL E MÉTODOS
Os experimentos foram realizados em conformidade com as diretrizes
do Conselho Nacional para o Controle de Experimentação Animal (CONCEA) e
Comitê de Ética em Pesquisa Animal da Universidade Nove de Julho
(UNINOVE) (aprovação AN0016/2012).
3.1. Animais
Foram utilizados 40 ratos (Rattus norvegicus) Wistar machos mantidos
no biotério da UNINOVE em caixas plásticas apropriadas, temperatura
ambiente de 22°C, umidade relativa de 40%, luminosidade controlada com ciclo
de 12h (claro/escuro) e comida e água ad libitum.
3.2. Grupos experimentais
Os animais foram distribuídos aleatoriamente em 5 grupos
experimentais:
I. Grupo controle: os animais não foram submetidos a nenhum
procedimento, com remoção bilateral do músculo tibial anterior
(TA) (n= 5);
II. Grupo Sham: submetidos ao procedimento de exposição do
músculo TA (n= 5);
III. Grupo irradiado com LBP: irradiação com LBP imediatamente
antes à eutanásia, no músculo TA esquerdo (TAE) sem
criolesão dos animais que compõem o Grupo irradiado com
LBP e lesionado (n= 5);
IV. Grupo somente lesão: foi realizada a criolesão no músculo TA
direito (TAD) sem a irradiação prévia com LBP (n= 15);
V. Grupo irradiado com LBP e lesionado: Foi realizada
irradiação com LBP imediatamente antes da criolesão no
músculo TAD (n= 15).
19
Os animais do Grupo somente lesão e Grupo irradiado com LBP e
lesionado foram eutanasiados em 1, 3 e 7 dias. Os animais do Grupo
Controle e Grupo Sham foram eutanasiados no primeiro dia do experimento
e, os animais do Grupo irradiado com LBP foram eutanasiados
imediatamente após a irradiação com laser. As amostras musculares foram
destinadas a análise morfológica por análise histológica (HE - coloração com
Hematoxilina e Eosina), deposição de colágeno pela coloração de Picrosirius,
além da atividade da MMP-2 utilizando a técnica de Zimografia.
3.3. Procedimento de criolesão
O procedimento de criolesão foi realizado após os animais serem
anestesiados com injeção intraperitonial de anestésico geral injetável a base de
Ketamina 10% (0,2 ml/100 gramas do animal) e de Xilazina 2% (0,1 ml/100
gramas do animal). Para aplicação da anestesia foram utilizadas seringas da
marca BD 100 Unidades com Agulha BD Ultra-Fine®, modelo insulina com a
agulha Ultra-Fine® (regular), comprimento: 12,7 mm, calibre: 0,33 mm e bisel
trifacetado. Após a anestesia, foi realizada a tricotomia (Figura 1) e, em
seguida, a irradiação com LBP imediatamente antes da realização da criolesão
(Figura 2).
O músculo TA foi exposto cirurgicamente e a criolesão realizada por
meio de duas aplicações (duração de 10 segundos cada), utilizando bastão
metálico (3 mm com extremidade plana) previamente resfriado em nitrogênio
liquido, diretamente na superfície ventral do músculo. Após o procedimento, foi
realizada a sutura das áreas incisadas utilizando-se fio de poliamida (5.0) e os
animais foram mantidos em gaiolas com aquecimento para prevenir a
hipotermia, conforme figura 1. O modelo de criolesão utilizado está de acordo
com o descrito na literatura (Miyabara et al, 2005; Baptista et al, 2011; Souza et
al, 2011; Alves et al, 2013).
20
Figura 1: Demonstração do procedimento de criolesão desde a tricotomia e
exposição do TA até a sutura.
A criolesão foi o modelo de lesão escolhido por ser bem conhecido e
altamente reprodutível, capaz de reproduzir a resposta natural do músculo
frente a lesões, bem como a sua capacidade de regeneração. Dessa forma,
esse modelo para indução da lesão muscular foi o escolhido para este estudo
por produzir lesões com características homogêneas, com área bem definida,
de forma limpa, além de visualização macroscópica observada pela cor branca
que se desenvolve na superfície ventral do músculo, causando menor
variabilidade na severidade da lesão (Baptista et al., 2011, Assis et al, 2012;
Alves et al, 2013).
3.4. Irradiação laser de baixa potência
A irradiação laser foi realizada com base nos parâmetros (Tabela 1)
descritos por Alves et al, 2013; sendo utilizado o Twin Laser® (MM Optics, São
Carlos – SP, Brasil).
21
Tabela 1: Parâmetros do laser de baixa potência.
Meio ativo Arseneto de Gálio e Alumínio (AsGaAl)
Comprimento de onda 780 nm
Área do feixe 0,04 cm2
Potência média 40 mW
Densidade de potência 1 W/cm2
Densidade de energia 10 J/cm2
Energia por ponto 0.4 J
Total de pontos 8 pontos
Tempo por ponto 10 segundos
Tempo total 80 segundos
Energia total 3.2 J
Foi realizada a irradiação do laser imediatamente antes da criolesão no
Grupo irradiado com LBP e lesionado e imediatamente antes da eutanásia
no Grupo irradiado com LBP, sendo realizada a eutanásia dos grupos
experimentais nos períodos determinados.
Os animais do Grupo irradiado com LBP receberam irradiação
diretamente sobre a área correspondente ao local dos animais do Grupo
irradiado com LBP e lesionado, sendo oito pontos de irradiação na região do
músculo TA na área lesionada, conforme descrito previamente (Mesquita-
Ferrari et al, 2011(a); Baptista et al, 2011). Utilizamos a técnica de irradiação
pontual diretamente sobre a pele que recobre o músculo TA (Figura 2). Para
evitar refração do feixe, o laser foi aplicado em ângulo de 90 graus entre o
emissor e a pele do animal. No início e final do procedimento experimental, a
potência de emissão de luz do laser foi aferida utilizando o “LaserCheck power
meter” (Coherent, Santa Clara,CA, USA).
22
Figura 2. Irradiação com LBP realizada previamente à criolesão. (A)
Equipamento utilizado; (B) Pontos irradiados; (C) Realização da irradiação.
Ao término do protocolo proposto, os animais foram submetidos à
eutanásia por superdose de anestésico e os músculos TA foram removidos e
seccionados transversalmente em duas partes no centro da lesão (Durigan et
al, 2008) para a análise morfológica, de deposição e distribuição de colágeno e
detecção da atividade da MMP-2.
3.5. Análise morfológica
Amostras dos músculos foram coletadas, fixadas em formol tamponado
10%, incluídas em parafina e espécimes foram cortados transversalmente com
10 µm de espessura por meio de um micrótomo (Leica RM2125, Nussloch,
Alemanha). Foi utilizada a coloração com hematoxilina-eosina (HE) para
exame histológico de rotina realizada sob microscopia de luz convencional
(Zeiss Axioplan 2, Alemanha). A análise qualitativa dos cortes histológicos
corados com HE incluiu uma descrição das fases da reparação de tecidos,
envolvendo a presença de infiltrado inflamatório, mionecrose, fibras musculares
imaturas (núcleo centralizado) e vasos sanguíneos maduros (Alves et al, 2013).
Para análise quantitativa, cinco áreas correspondentes à região da
lesão foram fotografadas com auxílio de microscópio de luz convencional (Zeis
s Axioplan 2, Alemanha). As imagens foram analisadas utilizando o plug-in
“Count Cells” do software Image J (National Institute of Health - NIH, EUA).
Foram contabilizadas as células inflamatórias totais, mionecrose, vasos
sanguíneos maduros e fibras musculares imaturas (núcleo centralizado), por
23
área. Três cortes de cada animal foram examinados e os dados foram
submetidos à análise estatística.
3.6. Análise de colágeno
Cortes adicionais foram corados com Picrosirius Red (Sigma, St. Louis,
MO, EUA), seguindo o método descrito por Junqueira et al (1982) e foram
examinados com auxílio de microscópio de luz polarizada Pol-Interferencial
Photomicroscope (Modelo 61282, Carl Zeiss, Alemanha). As imagens também
foram analisadas pelo programa Image J (NIH, EUA), no qual a área relativa
ocupada pelo colágeno foi calculada em relação à área total do corte, conforme
descrito por Hadi et al (2011) e Alves et al (2013).
3.7. Zimografia
O extrato tecidual do músculo TA foi testado quanto à presença de
atividade proteolítica, conforme descrito por Cleutjens et al (1995). As amostras
musculares de aproximadamente 50 mg foram lavadas duas vezes em solução
salina e, então, homogeneizadas em 2ml de tampão de extração (10 mM de
ácido cacodílico, pH 5,0, 150 mM de NaCl, 1 μM de ZnCl2, 20 mM de CaCl2,
1.5 mM de NaN3, e 0.01% de Triton X-100) com contínua homogeneização no
gelo por um período de aproximadamente 5 minutos. O conteúdo proteico total
foi estimado usando o reagente Bradford (BioRad Laboratories, Hercules, CA,
EUA) de acordo com o método descrito por Bradford (1976).
Para o ensaio enzimático, 100 µg de proteínas foram resolvidas por
eletroforese em gel de poliacrilamida (10%) com 1 mg/ml de gelatina bovina
(SigmaAldrich, St Louis, EUA). Após a eletroforese, o gel foi lavado 3 vezes
durante 20 minutos em solução 2,5 % de Triton X-100 para remoção do SDS e
incubado no tampão de substrato (50 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 5 mM de CaCl2,
10 mM de ZnCl2 e 0,02 % de NaN3), a 37ºC, durante aproximadamente 20
horas. Após este tempo, o gel foi corado com Coomassie Blue por 30 minutos,
descorado com ácido acético: metanol: água (1: 4: 5) para visualização das
bandas de atividade. Para documentação, o gel foi escaneado e analisado. Foi
utilizado o software Image J (NIH) para a quantificação das bandas de
24
atividade proteolítica do gel por densitometria (quantidade em pixels). Em
seguida, esses valores foram convertidos em unidades arbitrárias a partir do
valor obtido no grupo controle.
3.8. Análise dos resultados
Os valores foram testados quanto a sua normalidade pelo teste
Kolmogorov-Smirnov e os dados foram expressos em média e desvio-padrão,
pois aderiram à curva de Gauss. A comparação entre os grupos foi realizada
pela ANOVA, por serem dados paramétricos. O Teste de contraste (Pós-Hoc)
utilizado foi o Tukey. Os resultados foram considerados estatisticamente
significantes se p≤ 0,05. Os dados foram analisados por meio do programa
BioStat 5.0.
25
4. RESULTADOS
4.1. Artigo 1
Laserterapia prévia sobre o reparo músculo esquelético de rato
Ribeiro-Cardoso BG1, Alves AN2, Cantero TM3, Fernandes KPS4, França CM5,
Teixeira DF6, Bussadori SK4, Mesquita-Ferrari RA4
1 Mestranda em Ciências da Reabilitação, Universidade Nove de Julho –
UNINOVE, São Paulo – SP, Brasil.
2 Doutorando em Ciências da Reabilitação, Universidade Nove de Julho –
UNINOVE, São Paulo – SP, Brasil.
3 Aluna de graduação, Universidade Nove de Julho – UNINOVE, São Paulo –
SP, Brasil.
4 Docente dos Programa de Mestrado e Doutorado em Ciências da
Reabilitação e em Biofotônica aplicada as Ciências da Saúde, Universidade
Nove de Julho – UNINOVE, São Paulo – SP, Brasil.
5 Docente do Programa de Mestrado e Doutorado em Biofotônica aplicada às
Ciências da Saúde, Universidade Nove de Julho – UNINOVE, São Paulo – SP,
Brasil.
6 Docente do Departamento de Exatas, Universidade Nove de Julho –
UNINOVE, São Paulo – SP, Brasil.
Autor para correspondência:
Raquel Agnelli Mesquita-Ferrari
Departamento de Pós Graduação, Mestrado em Ciências da Reabilitação;
Universidade Nove de Julho – UNINOVE
Rua Vergueiro, 349,
CEP 01504001, São Paulo – SP, Brasil
Tel (11) 3385-9222
Título para as páginas: Laser prévio e reparo muscular
26
RESUMO
O laser de baixa potência (LBP) é muito utilizado com intuito de
promover de forma mais rápida e de melhor qualidade o reparo muscular frente
aos diferentes tipos de lesão, porém, os estudos sobre a aplicação prévia do
laser ainda são escassos. O objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos
do LBP aplicado previamente a lesão muscular sobre o processo de reparo,
atividade da metaloprotease de matriz MMP-2 e deposição do colágeno. Foram
utilizados 40 ratos Wistar, divididos em 5 grupos: (G1) Controle; (G2) Sham;
(G3) Sem lesão com LBP imediatamente antes ao sacrifício; (G4) LBP
imediatamente antes da lesão; (G5) Somente lesão sem tratamento com LBP.
A criolesão consistiu de duas aplicações de bastão resfriado em nitrogênio
líquido diretamente no músculo tibial anterior (TA). Os grupos 4 e 5 foram
avaliados em 1, 3 e 7 dias após a lesão. Foi utilizado para o tratamento o laser
AsGaAl (λ 780nm) com densidade de energia de 10 J/cm², potência de 40 mW,
tempo de 10 segundos por ponto, sendo 8 pontos de aplicação e energia total
de 3.2 J. Ao término do tratamento, os músculos TA foram removidos e cortes
histológicos foram obtidos com auxílio de micrótomo para análise da morfologia
utilizando a coloração com hematoxilina-eosina e de colágeno utilizando
coloração de Picrosirius. Para a avaliação da atividade de MMP-2 nos
diferentes grupos avaliados foi utilizada a técnica de Zimografia. Os resultados
demonstram que o LBP aplicado previamente a indução da lesão causou
redução de células inflamatórias após 3 dias, mionecrose após 1 e 3 dias,
aumento de vasos sanguíneos após 3 e 7 dias e de fibras imaturas após 7 dias.
Houve aumento da atividade da MMP-2 após 7 dias e redução da deposição de
colágeno nesse mesmo período, com melhor organização de seu arranjo
tecidual. Em conclusão, o LBP aplicado imediatamente antes da lesão induziu
efeitos positivos sobre a modulação do processo inflamatório e reparo
muscular, atividade da MMP-2 e organização e deposição do colágeno durante
a regeneração muscular.
Palavras-chave: Terapia a laser de baixa potência; Músculo tibial anterior;
Regeneração.
27
INTRODUÇÃO
As lesões musculares representam de 10 a 55% de todas as lesões no
meio esportivo1, sendo 90% delas causadas por contusões ou estiramentos2,3,
resultando em afastamento dos atletas aos treinos e competições por um longo
período4,5.
Após uma lesão muscular, as células satélites (CS) são ativadas,
migram para o local da lesão6 e se proliferam, sendo denominadas mioblastos7,
que se diferenciam e se fundem gerando células musculares multinucleadas
(miotubos) jovens que se diferenciam para formar fibras musculares funcionais
ou se fundirem a fibras pré-existentes8, reparando o tecido muscular
lesionado9. As CS são células precursoras miogênicas indiferenciadas que
permanecem quiescentes entre a lâmina basal e o sarcolema das fibras
musculares10 e estão diretamente envolvidas com o crescimento e a
regeneração muscular6,11.
A matriz extracelular (MEC) é uma estrutura dinamica que fornece
suporte e proteção para as fibras musculares, estabilização para o tecido
muscular12, e a transmissão da força de contração muscular13. A MEC é
composta por colágenos, fibronectina, elastina, proteoglicanos e laminina14,15 e
seu remodelamento é realizado por enzimas dependentes de cálcio e zinco
chamadas metaloproteases de matriz (MMPs)16,17,18, sendo que no músculo
esquelético há específica participação das enzimas MMP-2 (gelatinase A) e
MMP-9 (gelatinase B)19. Dessa forma, as MMPs são importantes durante a
regeneração muscular por degradarem os componentes da lâmina basal,
facilitando a migração, proliferação e diferenciação das CS20,21, além de
permitirem a angiogênese, importante para um reparo muscular de melhor
qualidade15,22.
E na busca por recursos terapêuticos que modulem o processo
inflamatório e melhore o reparo muscular, temos hoje vários estudos com o
laser de baixa potência (LBP) demonstrando efeitos positivos na modulação da
resposta inflamatória, reparo muscular, deposição de colágeno em excesso e
atividade da MMP-2 quando aplicado após a indução da lesão22,23,24,25,26,27.
Contudo, poucos estudos avaliaram os efeitos do LBP quando aplicado
28
previamente a uma lesão. Esta situação é de extrema relevância,
especialmente quando consideramos indivíduos nos quais o risco de lesão é
sempre eminente, como ocorre na prática desportiva. Estudos em animais28,29
e humanos30,31,32,33 têm demonstrado que o uso do laser previamente a indução
de fadiga muscular causou diminuição do nível de lactato sanguíneo por
melhorar sua remoção, redução do processo inflamatório e dano muscular.
Dessa forma, o objetivo do presente estudo foi investigar os efeitos da
aplicação prévia deste recurso sobre os aspectos morfológicos do tecido
muscular após a criolesão, além da quantificação de colágeno e análise da
atividade gelatinolítica da MMP-2.
MATERIAIS E MÉTODOS
Os experimentos foram realizados em conformidade com as diretrizes
do Conselho Nacional para o Controle de Experimentação Animal (CONCEA) e
Comitê de Ética em Pesquisa Animal da Universidade Nove de Julho
(UNINOVE) (aprovação AN0016/2012). Foram utilizados 40 Wistar machos
mantidos no biotério da UNINOVE em caixas plásticas apropriadas,
temperatura ambiente de 22°C, umidade relativa de 40%, luminosidade
controlada com ciclo de 12h (claro/escuro) e comida e água ad libitum.
Durante o período experimental, os animais foram divididos em 5
grupos experimentais: Grupo controle (n=5); Grupo Sham - apenas
submetidos ao procedimento de exposição do músculo tibial anterior direito
(TAD) (n=5); Grupo irradiado com LBP - irradiação com LBP no músculo tibial
anterior esquerdo (TAE) imediatamente antes a eutanásia dos animais que
compõem o Grupo irradiado com LBP e lesionado; Grupo somente lesão (n=
15); Grupo irradiado com LBP e lesionado (n=15). O grupo controle foi
eutanasiado no primeiro dia após o início do experimento. O Grupo irradiado
com LBP foi eutanasiado imediatamente após a aplicação do recurso. O
Grupo somente lesão e o Grupo irradiado com LBP e lesionado foram
eutanasiados nos períodos de 1, 3 e 7 dias após a indução da lesão.
29
Procedimento de criolesão
Os animais foram anestesiados com administração intraperitoneal de 1
ml/kg de 10% ketamina e 2% xilazina. Então, foi realizada incisão cirúrgica e
exposição do músculo TA seguida da criolesão que foi realizada por meio de
duas aplicações (duração de 10 segundos cada com intervalo de 30 segundos
entre elas) com bastão metálico de 3 mm e extremidade plana resfriado em
nitrogênio liquido, na superfície ventral do músculo TA23,24,27,34. Após o
procedimento, foi realizada a sutura das áreas incisadas utilizando-se fio de
poliamida (5.0) e os animais mantidos em gaiolas com aquecimento para
prevenir a hipotermia.
Irradiação laser de baixa potência
A irradiação laser foi realizada com base nos parâmetros (Tabela 1)
descritos por Alves et al (2013)27, sendo utilizado o Twin Laser® (MM Optics,
São Carlos – SP, Brasil). Foi realizada a irradiação do laser imediatamente
antes da criolesão no Grupo irradiado com LBP e lesionado e imediatamente
antes da eutanásia no Grupo irradiado com LBP.
Tabela 1: Parâmetros do laser de baixa potência.
Meio ativo Arseneto de Gálio e Alumínio (AsGaAl)
Comprimento de onda 780 nm
Área do feixe 0,04 cm2
Potência de saída 40 Mw
Densidade de potência 1 W/cm2
Densidade de energia 10 J/cm2
Energia por ponto 0.4 J
Total de pontos 8 pontos
Tempo por ponto 10 segundos
Tempo total 80 segundos
Energia total 3.2 J
30
Utilizamos a técnica pontual diretamente sobre a pele que recobre o
músculo TA. Para evitar refração do feixe, o laser foi aplicado em ângulo de 90
graus entre o emissor e a pele do animal. No início e final do procedimento
experimental, a potência de emissão de luz do laser foi aferida utilizando o
“LaserCheck power meter” (Coherent, Santa Clara, CA, USA). Ao término do
protocolo proposto, os animais foram submetidos à eutanásia por superdose de
anestésico e os músculos TA removidos para análise.
Análise morfológica
As amostras musculares do TA foram fixadas em formol e incluídas em
parafina, na sequência foram obtidos cortes transversais utilizando micrótomo
(Leica RM2125, Nussloch, Alemanha). Os cortes foram submetidos à coloração
com hematoxilina-eosina (HE) e analisados com microscopia de luz
convencional (Zeiss Axioplan 2, Alemanha). Foram realizadas análises
qualitativas e quantitativas dos aspectos relacionados à inflamação e reparo do
tecido muscular. Na análise qualitativa foi dado enfoque a presença de
infiltrado inflamatório, mionecrose, fibras musculares imaturas e vasos
sanguíneos. Para a quantificação destes aspectos, foi realizado o registro
fotográfico de cinco áreas de cada corte, conforme descrito por Alves et al
(2013)27, e contagem do número de células inflamatórias totais, mionecrose,
vasos sanguíneos e fibras musculares imaturas com auxílio do software Image
J (National Institute of Health - NIH, EUA). Os resultados das cinco áreas do
mesmo corte foram somados; três cortes de cada animal foram examinados.
Os dados foram submetidos à análise estatística.
Análise de colágeno por coloração com Picrosirius
Os cortes obtidos das amostras musculares foram corados com
Picrosirius Red (Sigma, St. Louis, MO, EUA)35 e examinados e fotografados
com auxílio de microscópio de luz polarizada Pol-Interferencial
Photomicroscope (Modelo 61282, Carl Zeiss, Alemanha). As imagens também
foram analisadas pelo programa Image J (NIH, EUA), conforme descrito por
Hadi et al (2011)36 e Alves et al (2013)27.
31
Análise de atividade gelatinolítica pela técnica de Zimografia
O tecido muscular (50 mg) foi submetido a homogeneização em
tampão de extração contendo ácido cacodílico conforme descrito por Alves et
al (2013). O conteúdo proteico total foi estimado usando o reagente Bradford
(BioRad Laboratories, Hercules, CA, EUA) de acordo com o método descrito
por Bradford (1976)37. O extrato tecidual do músculo TA foi testado quanto à
presença de atividade proteolítica, conforme descrito por Cleutjens et al
(1995)38. As amostras musculares foram resolvidas por eletroforese em gel de
poliacrilamida (10%) com 1 mg/ml de gelatina bovina (SigmaAldrich, St Louis,
EUA). Em seguida, o gel foi lavado com Triton X-100 para remoção do SDS e
incubado em tampão de substrato a 37ºC, durante 20 horas sendo na
sequência corado (Coomassie Blue) e descorado (ácido acético: metanol:
água) para visualização das bandas líticas. O gel foi escaneado e a
quantificação das bandas de atividade proteolítica foi realizada utilizando o
software Image J (NIH). Os valores foram convertidos em unidades arbitrárias
considerando o Grupo Controle igual a um27.
RESULTADOS
Análise morfológica qualitativa e quantitativa
A quantificação dos achados permitiu verificar que a irradiação prévia
com LBP induziu uma redução significativa no número total de células
inflamatórias e mionecrose após três dias (p≤0,01) (Figura 1A e B) e uma
redução da mionecrose após um dia (p≤0,01) (Figura 1B) quando comparado
aos grupos criolesionados sem irradiação prévia nos respectivos períodos.
Observou-se, também que após 3 e 7 dias (p≤0,01), houve um aumento
significativo no número de vasos sanguíneos (Figura 1C) e após 7 dias
(p≤0,01) um aumento no número de fibras musculares imaturas (Figura 1D) no
grupo lesionando que recebeu foi irradiado previamente com LBP. Com base
nos achados histológicos foi possível verificar que nos músculos do Grupo
Controle não foram evidenciados sinais de inflamação e alterações na
localização de mionúcleos e formato das fibras. Estes aspectos também foram
32
verificados para o Grupo irradiado com LBP sem lesão (dados não mostrados)
e sham. Já nos grupos Lesão (1 e 3 dias) foram evidenciados moderado
infiltrado inflamatório e mionecrose. Na presença da irradiação prévia com LBP,
os músculos destes mesmos períodos de análise apresentaram uma redução
da mionecrose, além de redução do infiltrado inflamatório após 3 dias. Após 7
dias, o grupo irradiado previamente à lesão apresentou aumento de vasos
sanguíneos e de fibras imaturas em relação ao grupo somente lesão (Figura 2).
33
Figura 1. Análise quantitativa dos aspectos morfológicos do tecido muscular
nos diferentes grupos experimentais: (A) número total de células inflamatórias
(B); mionecrose (C); número de vasos sanguíneos (D); número de fibras
imaturas. Os valores estão expressos em média e desvio padrão
(ANOVA/Tukey). #p≤0,01 comparado com o grupo criolesionado sem
irradiação prévia com LBP.
34
Figura 2. Cortes histológicos dos músculos TA, irradiados ou não com LPB
prévio, corados por HE nos diferentes períodos avaliados.
35
Análise qualitativa e quantitativa das fibras colágenas
A análise dos cortes corados por Picrosirius permitiu verificar uma
distribuição uniforme e organizada das fibras colágenas no grupo controle,
especialmente em região de perimísio e endomísio, sendo evidenciados estes
mesmos aspectos no grupo somente irradiado com LBP e grupo sham. A
irradiação prévia não alterou a organização e distribuição deste após 1 e 3 dias
não havendo diferença estatística quando realizada a quantificação da
concentração do colágeno (Figura 3). Após 7 dias, houve uma melhor
distribuição e organização das fibras de colágeno no grupo que recebeu
irradiação prévia com LBP em comparação ao grupo que somente foi
submetido a lesão (Figura 4), sendo este fato comprovado pela quantificação
do colágeno (p≤0,01) (Figura 3) que evidenciou redução significativa na
concentração de colágeno no grupo irradiado previamente com LBP e avaliado
neste período.
Figura 3. Quantificação da área de fibras colágenas em porcentagem. Os
valores foram expressos em média e desvio padrão (ANOVA/ Tukey). *p≤0,01
quando comparado ao grupo controle. # p≤0,01 quando comparado ao grupo
somente lesão.
36
Figura 4. Cortes histológicos dos músculos TA, irradiados ou não com LPB prévio, corados
por Picrosirius.
37
Análise da atividade da MMP-2
Foram detectadas pela técnica de zimografia duas bandas líticas
correspondentes as formas pró (72 kDa) e ativa (64 kDa) da MMP-2 nas
amostras musculares analisadas (Figura 5A). Os resultados permitiram verificar
que houve um aumento significativo na atividade da banda Pró nos grupos
lesionados com e sem irradiação prévia (p≤0,05) em comparação aos grupos
controle, sham e LBP nos períodos de 1, 3 e 7 dias. Após 1 dia, foi possível
verificar uma redução significativa na atividade da MMP-2 Pró no grupo
irradiado previamente com LBP e lesionado quando comparado ao grupo
somente lesionado (p≤0,05). Após 7 dias observou-se a presença de duas
bandas líticas da MMP-2 nos grupos lesionados com e sem irradiação prévia,
sendo que o grupo irradiado com LBP e lesionado apresentou um aumento
significativo tanto na atividade da banda lítica Pró quanto da banda Ativa
quando comparado ao grupo somente lesionado, respectivamente (p≤0,05)
(Figura 5B).
Figura 5. Detecção da atividade gelatinolítica em amostras musculares (100ug)
dos diferentes grupos experimentais analisados utilizando Zimografia. (A)
Detecção das bandas referentes às formas Pró e Ativa da MMP-2 (~72 e 64
38
kDa, respectivamente) nos diferentes grupos experimentais. Padrão de peso
molecular (P), Grupo controle (C), grupo sham (Sh), grupo somente irradiação
laser (LBP); grupo lesionado sem tratamento (L) e grupo irradiado com LBP e
lesionado (LBP+L). (B) Quantificação das bandas líticas por densitometria
após 1 dia, 3 e 7 dias. Os dados foram expressos em média e desvio padrão
(ANOVA/Tukey). *p≤0,05 comparados ao grupo controle, sham e LBP;
#p≤0,05 comparados ao grupo somente lesão.
DISCUSSÂO E CONCLUSÃO
As lesões musculares, comuns no esporte, frequentemente levam a
perda de função muscular e queda da qualidade de vida em atletas39. Desta
forma, a busca por recursos terapêuticos que favoreçam o reparo muscular
torna-se cada vez mais evidente.
Estudos analisando os efeitos do LBP durante o processo de
regeneração muscular frente a diferentes tipos de lesão, tais como por veneno
de serpente40, trauma41, criolesão24,25,27 têm sido descritos na literatura
demonstrando efeitos positivos para o reparo muscular. Dourado et al (2011)40
avaliaram o efeito dos lasers vermelho e infravermelho (comprimento de onda
632,8 nm (HeNe) e 904 nm (GaAs), densidade de energia 4 J/cm²) aplicado
após indução da lesão com veneno de serpente e observaram aumento da
angiogênese e diminuição de neutrófilos após 3 dias. Souza et al (2011)25
utilizou o LBP após a criolesão (comprimento de onda 660 nm, potência de
saída 20 mW, densidade de energia 5 J/cm²) e demonstraram aumento da
angiogênese e redução da mionecrose no músculo esquelético de rato após 7
dias. Almeida et al (2013)41 demonstraram que o LBP (comprimento de onda
810 nm, potência de saída 100 mW, energia 1, 3 e 9 J) aplicado após trauma
em músculo esquelético de rato diminuiu os danos morfológicos causados pela
lesão após 6, 12 e 24 horas. Nosso grupo de pesquisa demonstrou em estudo
prévio27 utilizando os mesmos parâmetros dosimétricos adotados no presente
estudo que o LBP após criolesão reduziu o infiltrado inflamatório e a
mionecrose após 1 dia, aumentou o número de vasos sanguíneos após 3
e 7 dias assim como aumentou o número de fibras musculares imaturas e da
atividade gelatinolítica da MMP-2 após 7 dias, além de melhorar a
organização e distribuição das fibras colágenas após 7 dias.
39
No presente estudo, que utilizou o LBP previamente a lesão aguda,
foram encontrados resultados semelhantes aqueles verificados pela aplicação
pós lesão, uma vez que foi demonstrada uma redução do infiltrado inflamatório
após 3 dias e da mionecrose após 1 e 3 dias, aumento de vasos sanguíneos
após 3 e 7 dias e de fibras imaturas após 7 dias, além de aumento da atividade
de MMP-2 e redução na deposição de colágeno após 7 dias, sugerindo que a
irradiação com LBP prévio pode promover um reparo muscular mais eficiente e
de melhor qualidade.
Mais especificamente com relação ao remodelamento da MEC e
participação das MMPs foi demonstrado que o LBP (comprimento de onda 660
nm, potência de saída 20 mW, densidade de energia 5 J/cm²) aplicado após
criolesão em músculo esquelético de rato reduziu a expressão de TNF-α após
1 e 7 dias e de TGF-β após 7 dias23, sendo o TGF-β associado a formação de
tecido cicatricial durante a regeneração muscular e regulação da produção de
enzimas que inibem a degradação da MEC15. No presente estudo, houve
melhor organização das fibras colágenas com redução significante de sua
deposição no grupo irradiado com LBP e lesionado após 7 dias associado com
o aumento da atividade da MMP-2 após esse mesmo período, demonstrando
que a irradiação com LBP imediatamente antes da criolesão pode ser um útil
recurso terapêutico para prevenção de fibrose. A MMP-2 está diretamente
relacionada com a regeneração muscular por estar envolvida com a síntese e
degradação da MEC20, principalmente colágeno15, facilitando a migração,
proliferação e fusão de mioblastos e promovendo a formação de novos vasos
sanguíneos19, além de evitar uma deposição excessiva dos componentes da
MEC (fibrose). Esse resultado é importante, principalmente no meio esportivo,
uma vez que o acúmulo excessivo de componentes da MEC, especialmente de
colágeno, pode resultar em redução de desempenho muscular15.
O LBP aplicado previamente possui efeito protetor em músculo
saudável por influenciar a atividade celular por meio da estimulação ou inibição
de funções químicas e fisiológicas39. Esse efeito protetor possivelmente ocorre
por aumento da atividade mitocondrial e dos componentes da cadeia
respiratória que induz a aumento na síntese de ATP e AMPc39,42,43. Dias et al
(2011)44 utilizaram diferentes doses de LBP no músculo masseter de rato e
demonstraram um aumento de metabolismo oxidativo e de MMP-2 e
40
relacionaram estes achados ao aumento na quantidade de mitocôndria e
síntese de ATP. No estudo de Wagatsuma et al (2011)45 foi realizado um
bloqueio mitocondrial em músculo de rato seguido de criolesão e constatou-se
que houve retardo na regeneração muscular evidenciando a importância da
biogênese mitocondrial para este processo.
Alguns estudos demonstraram efeitos positivos da aplicação prévia do
LBP em situação de fadiga muscular sendo evidenciados efeitos como redução
de creatina quinase (CK)29,30,32,33,46, de lactato sanguíneo30,46, de lactato
desidrogenase (LDH)32,33, do estresse oxidativo33, aumento do desempenho
muscular29,47,48, além de atenuação na diminuição da força32 e da fadiga
muscular28,31,48. Além disso, foi verificado que o LBP aplicado previamente a
indução de fadiga causou redução do processo inflamatório por diminuição na
expressão de mRNA da ciclooxigenase 2 (COX-2)29.
A modulação positiva da inflamação e enzimas relacionadas ao dano
muscular pela aplicação do LBP previamente pode explicar os achados
evidenciados no presente estudo. O LBP estimula a atividade da mitocôndria
que sintetiza ATP e espécies reativas de oxigênio (ROS)43, sendo que ROS em
combinação com fatores de crescimento e quimiocinas, participa de uma
cascata de eventos relacionada a regeneração muscular redirecionando as
células satélites para o local lesionado, mas se níveis elevados de ROS
permanecem por longo período no local da lesão, levam a dano oxidativo e
interferem negativamente na diferenciação de células musculares49. Dessa
forma, os resultados obtidos no estudo sugerem que o LBP tenha modulado
positivamente a atividade mitocondrial e síntese de ATP e ROS.
Em conclusão, os resultados do presente estudo demonstram que o
LBP aplicado previamente à indução da lesão modulou positivamente o
processo inflamatório e de reparo muscular, a atividade da MMP-2 e a
organização e deposição do colágeno durante a regeneração muscular,
sugerindo que esse recurso possa ser um grande aliado como intervenção
terapêutica principalmente no meio esportivo onde o risco de lesão muscular é
iminente.
Agradecimentos: à FAPESP pelo apoio financeiro (2011/17638-2;
2012/11461-6).
41
REFERÊNCIAS
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Relation between myofibers and connective tissue during muscle injury
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2. Järvinen MJ, Lehto MU (1993) The effects of early mobilisation and
immobilisation on the healing process following muscle injuries. Sports Med
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3. Fernandes TL, Pedrinelli A, Hernandez AJ (2011) Lesão muscular -
fisiopatologia, diagnóstico, tratamento e apresentação clínica. Rev Bras
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5. CONSIDERAÇÕES FINAIS
O presente estudo avaliou os efeitos do laser de baixa potência
previamente a lesão muscular sobre a regeneração do músculo esquelético e o
remodelamento da matriz extracelular e demonstrou que o LBP reduziu o
número de células inflamatórias totais e a mionecrose, aumentou o número de
vasos sanguíneos, fibras imaturas e a atividade da MMP-2, além de promover
melhor organização de fibras colágenos no tecido muscular e reduzir sua
deposição, sugerindo que o laser aplicado previamente à lesão proporciona
uma regeneração muscular eficaz e de melhor qualidade. Contudo, como são
poucos os estudos sobre os efeitos do LBP quando aplicado previamente, são
necessários mais estudos sobre seu efeito na regeneração muscular para
maior entendimento dos mecanismos envolvidos nesse processo, além de
avaliação se há alterações nesses fatores devido à diferença entre o tempo de
aplicação prévia do laser e indução da lesão.
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54
7. APÊNDICES
7.1. Comprovante de submissão de artigo à Revista Fisioterapia e
Pesquisa
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7.2. Comprovante de submissão de artigo Revista Lasers in Medical
Science.