universidade federal dos vales do jequitinhonha...

UNIVERSIDADE FEDERAL DOS VALES DO JEQUITINHONHA E MUCURI

Bethânia Alves de Avelar

DETECÇÃO IN VITRO DE CITOCINAS INTRACITOPLASMÁTICAS (INTERFERON

GAMA, FATOR DE NECROSE TUMORAL, INTERLEUCINA 4 E INTERLEUCINA

10) EM LEUCÓCITOS HUMANOS TRATADOS COM EXTRATO BRUTO DILUÍDO

DE Euphorbia tirucalli

Diamantina

2010

Bethânia Alves de Avelar

DETECÇÃO IN VITRO DE CITOCINAS INTRACITOPLASMÁTICAS

(INTERFERON GAMA, FATOR DE NECROSE TUMORAL,

INTERLEUCINA 4 E INTERLEUCINA 10) EM LEUCÓCITOS

HUMANOS TRATADOS COM EXTRATO BRUTO DILUÍDO DE

Euphorbia tirucalli

Dissertação apresentada ao curso de Mestrado do Programa Multicêntrico em Ciências Fisiológicas da Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Ciências Fisiológicas. Área de concentração: Farmacologia de produtos naturais e plantas medicinais. Orientador: Dr. Gustavo Eustáquio Brito Alvim de Melo - UFVJM Coorientador: Dra. Miriam Tereza da Paz Lopes - UFMG

Diamantina

2010

AGRADECIMENTOS

A Deus, pelo cuidado;

Ao meu pai Américo e minha mãe Lúcia, pelo exemplo de perseverança, amizade, apoio e

dedicação;

Ao meu irmão Américo, pelo companheirismo;

Aos meus tios, Lucimar, Lucinéia, Lucilene, Estanislau e Luciano, pela bondade, incentivo e

prontidão em ajudar;

Ao Professor Dr. Gustavo Eustáquio Brito Alvim de Melo, pelo auxílio na formação

acadêmica, pela amizade e o exemplo de Pesquisador;

À Professora Dra. Miriam Tereza da Paz Lopes, pela disposição em coorientar;

Ao Professor Dr. Herton Helder Rocha Pires (Tim), pelo incentivo e confiança desde a

iniciação científica;

À equipe do Programa Multicêntrico em Ciências Fisiológicas da UFVJM pelos conselhos e

apoio;

Ao Dr. Olindo Martins Filho, pelas contribuições ao trabalho;

Aos funcionários da Pró-reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação, pelo comprometimento;

À equipe do laboratório de Imunologia da UFVJM, pelo incentivo e apoio, e trabalho em

equipe;

A todos que contribuíram de alguma forma para a realização deste trabalho.

“Uma paixão forte por qualquer objeto

assegurará o sucesso, porque o desejo

pelo objetivo mostrará os meios.”

William Hazlitt

http://www.pensador.info/autor/William_Hazlitt/

RESUMO

O uso de plantas da família Euphorbiaceae, principalmente do gênero Euphorbia, tem sido

popularmente difundido para o tratamento de uma variedade de doenças de natureza

infecciosa, tumoral e inflamatória. Entre as espécies desse gênero, a Euphorbia tirucalli é

uma planta de uso difundido no Brasil e em algumas regiões, tal como a do Vale do

Jequitinhonha. Há indícios de que o látex de E. tirucalli tenha atividade antitumoral e

antiviral, porém, pouco se sabe sobre os mecanismos envolvidos nessa ação. É provável que o

mecanismo de ação para tais atividades envolva a ativação de leucócitos e a produção de

citocinas para o direcionamento de uma resposta antiviral e antitumoral efetivas. Diante disso,

o presente trabalho avaliou a produção de citocinas TNF-α, IFN-γ, IL-4 e IL-10 nas

populações e subpopulações leucócitárias do sangue periférico estimulados com o látex bruto

da referida planta. Para tal, leucócitos do sangue periférico de vinte indivíduos hígidos foram

incubados por 4 horas com o látex bruto de E. tirucalli diluído em Dimetilsulfoxido (DMSO)

e constituiu o grupo látex (Lt). Culturas celulares incubadas com salina e DMSO, utilizando-

se o mesmo período de incubação, constituíram as culturas controle não estimuladas (CC) e

controle de solvente (DMSO), respectivamente. Após o período de incubação, as células

foram marcadas com anticorpos monoclonais específicos para receptores de superfície celular

CD4, CD8 e CD14, bem como para as citocinas intracitoplasmáticas TNF-α, IFN-γ, IL-4 e IL-

10. A aquisição e análise dos dados foram realizadas por citometria de fluxo. Os resultados

demonstraram um aumento significativo (p < 0,05) no percentual de linfócitos T e sua

subpopulação T CD4 positivos para as citocinas do tipo 1, TNF-α e IFN-γ. Essas citocinas são

responsáveis por ativar o sistema imune para respostas imunoprotetoras frente às infecções

virais e processos tumorais. Já os neutrófilos e linfócitos T CD8, nas culturas estimuladas com

o látex da planta, apresentaram um perfil misto de produção de citocinas do tipo 1 e 2. Esses

resultados evidenciaram uma resposta do tipo 1 predominante, in vitro, e uma provável

ativação de mecanismos moduladores, mediados por linfócitos T CD8 e neutrófilos. Este

estudo sugere que a utilização popular da planta em infecções virais e processos tumorais

pode ter algum fundamento, tendo em vista a produção preferencial de citocinas do tipo 1 em

células estratégicas da resposta imune celular, fundamental no combate às patologias

mencionadas. No entanto, os estudos in vitro aqui realizados não são suficientes para garantir

que a utilização da planta no contexto in vivo possa, de fato, apresentar tais propriedades.

Assim, estudos adicionais, incluindo outros ensaios in vitro, bem como ensaios pré-clínicos,

são fundamentais para o avanço das pesquisas envolvendo a utilização de E. tirucalli para fins

terapêuticos.

Palavras-chave: Euphorbia tirucalli, imunomodulação, planta medicinal, pro-

inflamatória.

ABSTRACT

The use of plants in the family Euphorbiaceae, especially of the genus Euphorbia, has been

popularly circulated for the treatment of a variety of infectious, tumoral and inflammatory

illnesses. Among the species of this genus, Euphorbia tirucalli is a the plant with widespread

use in Brasil and in some regions, such as the Vale do Jequitinhonha. There is evidence that

the latex of E. tirucalli has antiviral and antitumor activity, but little is known about the

mechanisms involved in this action. It is likely that the mechanism of action for such

activities involves leukocyte activation and cytokine production for directing an effective

antitumor and antiviral response. Thus, the present study evaluated the production of

cytokines TNF-α, IFN-γ, IL-4 and IL-10 in the populations and subpopulations in peripheral

blood leukocytes stimulated with crude latex of this plant. For such, peripheral blood

leukocytes of twenty healthy subjects were incubated for 4 hours with crude latex of E.

tirucalli diluted in dimethyl sulfoxide (DMSO) and was the latex group (Lt). Cell cultures

incubated with saline and DMSO, using the same incubation period, represent the control

cultures that were not stimulated (CC) and solvent control (DMSO), respectively. After the

incubation period, cells were stained with monoclonal antibodies specific to cell surface

receptors CD4, CD8 and CD14, as well as for TNF-α intracytoplasmic cytokines, IFN-γ, IL-4

and IL-10. The acquisition and analysis were performed by flow cytometry. The results

showed a significant increase (p <0.05) in the percentage of T lymphocytes and their

subpopulation T CD4 positive for type 1 cytokines, TNF-α and IFN-γ. These cytokines are

responsible for activating the immune system to immunoprotective responses against viral

infections and tumor processes. However the neutrophils and T CD8 lymphocytes, in cultures

stimulated with the latex of the plant, showed a mixed profile of cytokine production of type 1

and 2.These results showed a response of the type 1 predominant, in vitro, and a probable

activation of modulatory mechanisms mediated by T CD8 lymphocytes and neutrophils.This

study suggests that the popular use of plant in viral infections and tumor processes may have

some foundation, in order to preferential production of type 1cytokines in strategic cells of

the cellular immune response, that is essential in combating the diseases mentioned. However,

in vitro studies conducted here are not sufficient to ensure that the use of the plant in vivo

context may, in fact, possesses such properties.

Thus, further studies including other in vitro tests and preclinical trials are fundamental to the

advancement of research involving the use of E. tirucalli for therapeutic purposes.

Keywords: Euphorbia tirucalli, Immunomodulation, Medicinal plant, Pro-inflammatory.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1- Etapas do desenvolvimento de um novo fármaco .............................. 2

Figura 2- Imagens da E. tirucalli ....................................................................... 9

Figura 3- Principais funções atribuídas à citocina INF-γ ................................... 14

Figura 4- Principais funções atribuídas à citocina TNF-α ................................. 14

Figura 5- Coleta do látex .................................................................................... 20

Figura 6- Estratégia de análise por citometria de fluxo ..................................... 24

Figura 7- Percentual de células viáveis em leucócitos mononucleares circulantes

do sangue periférico de indivíduos hígidos nos tempos 24 horas, 48 horas

e 72 horas e estimulados com deve ficar salina, DMSO, e Látex de E.

tirucalli nas concentrações de deve ficar 5%, 10%, 20% e 30%

................................................................................

26

Figura 8- Análise do percentual médio de neutrófilos-IFN-γ+ e neutrófilos-TNF-

α+ de culturas de leucócitos totais dos grupos CC, DMSO e Lt

.............................................................................................................

27

Figura 9- Análise do percentual médio de neutrófilos-IL-4+ e neutrófilos-IL-10+ de

culturas de leucócitos totais dos grupos CC, DMSO e Lt

.............................................................................................................

28

Figura 10- Análise do percentual médio de monócitos-TNF-α+ de culturas de

leucócitos totais dos grupos CC, DMSO e Lt ....................................

29

Figura 11- Análise do percentual médio de monócitos-IL-4+ e monócitos-IL-10+ de


.............................................................................................................

30

Figura 12- Análise do percentual médio de linfócitos-IFN-γ+ e linfócitos-TNF-α+ de


.............................................................................................................

31

Figura 13- Análise do percentual médio de linfócitos-IL-4+ e linfócitos-IL-10+ de

culturas de leucócitos totais dos grupos CC, DMSO e Lt ............

32

Figura 14- Análise do percentual médio de linfócitos T CD8-IFN-γ+ e linfócitosT

CD8-TNF-α+ de culturas de leucócitos totais dos grupos CC, DMSO e Lt

.................................................................................

33

Figura 15- Análise do percentual médio de linfócitos T CD8-IL-4+ e linfócitosT

CD8-IL-10+ de culturas de leucócitos totais dos grupos CC, DMSO e Lt

.................................................................................

34

Figura 16- Análise do percentual médio de linfócitos T CD4-IFN-γ+ e linfócitosT

CD4-TNF-α+ de culturas de leucócitos totais dos grupos CC, DMSO e Lt

.................................................................................

35

Figura 17- Análise do percentual médio de linfócitos T CD4-IL-4+ e linfócitosT

CD4-IL-10+ de culturas de leucócitos totais dos grupos CC, DMSO e Lt

.................................................................................

36

Figura 18- Resumo dos resultados obtidos na expressão de citocinas nas populações e

subpopulações estudadas, quando estimulados com o látex bruto de E.

tirucalli diluído á 10% em DMSO ..........................

37

Figura 19- Vias envolvidas na transcrição gênica para síntese de citocinas pró-

inflamatórias .......................................................................................

42

LISTA DE TABELAS

1 - Espécies do gênero Euphorbia com atividade citotóxica/ antitumoral ........... 6

2 - Posição sistemática da Euphorbia tirucalli ..................................................... 9

3 - Anticorpos monoclonais marcados com fluorocromos utilizados para análise de

populações leucocitárias e marcação de citocinas ......................................

23

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ...............................................................................

1

2 REVISÃO DE LITERATURA .................................................... 2

2.1 O estudo de plantas medicinais ............................................................. 2

2.2 A família Euphorbiaceae ...................................................................... 4

2.3 O gênero Euphorbia .............................................................................. 4

2.3.1 Estudos das atividades biológicas de plantas do gênero Euphorbia ..... 5

2.3.1.1 Atividade antitumoral ........................................................................... 5

2.3.1.2 Atividade antimicrobiana ...................................................................... 6

2.3.1.3 Ação antiviral ........................................................................................ 7

2.3.1.4 Ações que interferem em processos alérgicos e inflamatórios ............. 7

2.3.1.5 Atividade antiinflamatória .................................................................... 7

2.3.1.6 Modulação das Proteínas associadas à múltipla resistência à drogas ... 8

2.4 Euphorbia tirucalli ............................................................................... 8

2.4.1 Constituintes químicos do látex de E. tirucalli ..................................... 10

2.4.2 Toxicologia associada à E. tirucalli ...................................................... 10

2.4.3 Atividades atribuídas ao látex de E. tirucalli ........................................ 11

2.5 Sistema imune contra infecções virais .................................................. 12

2.6 Sistema imune no combate à células tumorais ..................................... 15

2.7 Resposta imune do tipo 1 e do tipo 2 .................................................... 16

3 JUSTIFICATIVA ............................................................................ 17

4 OBJETIVO......................................................................................... 18

4.1 Objetivo geral ....................................................................................... 18

4.2 Objetivos Específicos ........................................................................... 18

5 MATERIAIS E MÉTODOS ......................................................... 19

5.1 População estudada ............................................................................... 19

5.2 Amostras de sangue .............................................................................. 19

5.3 Certificação botânica ............................................................................ 19

5.4 Coleta das amostras de látex de Euphorbia tirucalli ............................ 19

5.5 Triagem da citotoxicidade in vitro do látex bruto de E. tirucalli à leucócitos

mononucleares do sangue periférico ...................................

20

5.6 Análise de citocinas intracitolasmáticas por citometria de fluxo ......... 21

5.7 Estratégia de Análise ............................................................................ 23

5.8 Análise Estatística ................................................................................. 24

6 RESULTADOS ................................................................................ 26

6.1 Análise da viabilidade de células mononucleares do sangue periférico

humano in vitro após estimulação com o látex bruto de Euphorbia tirucalli

..................................................................................................

26

6.2 Perfil de citocinas intracitoplasmáticas em leucócitos do sangue periférico

estimulados com látex bruto de E. tirucalli ..........................

27

6.2.1 Análise de citocinas intracitoplasmáticas em neutrófilos do sangue

periférico estimulados com látex bruto de E. tirucalli ..........................

27

6.2.2 Análise de citocinas intracitoplasmáticas em monócitos do sangue

periférico estimulados com látex bruto de E. tirucalli ..........................

29

6.2.3 Análise de citocinas intracitoplasmáticas em linfócitos e subpopulações

linfocitárias T CD8 e T CD4 do sangue periférico estimulados com látex

bruto de E. tirucalli ..........................................

31

7 DISCUSSÃO DOS RESULTADOS .......................................... 38

8 CONCLUSÃO ................................................................................. 44

REFERÊNCIAS ...............................................................................

45

ANEXO ................................................................................ 54

1 INTRODUÇÃO

As plantas da família Euphorbiaceae são amplamente utilizadas na cultura tradicional

popular para fins terapêuticos. Algumas espécies identificadas contêm compostos bioativos

que conferem a essas plantas potencial para o tratamento de doenças (PUSZTAI et al., 2007;

LAGE et al., 2009). Alguns desses compostos demonstraram ter atividade sobre o

comportamento funcional de leucócitos do sangue periférico. Porém, embora seja possível

sugerir que extratos de plantas do gênero Euphorbia interfiram na funcionalidade de

populações e subpopulações leucocitárias, os mecanismos moleculares envolvidos nesses

processos ainda não estão bem elucidados (BANI et al., 2007).

Estudos prévios têm mostrado que as plantas do gênero Euphorbia apresentam a

capacidade de alterar alguns parâmetros celulares e moleculares do sistema imunológico.

Amirghofran e colaboradores (2008) demonstraram um aumento da citocina mitogênica

Interleucina-2 (IL-2) no sobrenadante de culturas de leucócitos do sangue humano

estimuladas com extrato metanólico de Euphorbia cheiradenia. Essa capacidade de alterar a

produção de citocinas também foi demonstrada em estudos que avaliaram a capacidade

antialérgica de Euphorbia hirta L.. Segundo Singh e colaboradores (2006), o extrato da planta

foi capaz de aumentar a produção de Interferon-gamma (IFN-γ) e diminuir a produção de IL-

4, e regular negativamente a resposta imune humoral, prevenindo os efeitos indesejáveis da

resposta alérgica. As citocinas são fatores solúveis que, uma vez liberadas no meio

extracelular, promovem a ativação de vários componentes do sistema imune tais como a

produção de anticorpos e citotoxicidade. Nenhum estudo até então verificou o perfil de

produção de citocinas nas populações específicas de leucócitos estimulados com o látex bruto

de Euphorbia tirucalli numa análise celular individualizada.

Tendo em vista a utilização popular de E. tirucalli no tratamento de algumas doenças

que necessitam da participação efetiva do sistema imunológico, tais como tumores e infecções

virais, o presente estudo avaliou o perfil de produção de citocinas do tipo 1 (pró-

inflamatórias: IFN-γ e Fator de Necrose Tumoral-alfa (TNF-α)) e do tipo 2 (IL-4 e IL-10) em

populações e subpopulações leucocitárias do sangue periférico humano, submetidos à

estimulação rápida (4 horas) com o látex bruto de E. tirucalli.

2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 O estudo de plantas medicinais

O conhecimento tradicional sobre as propriedades curativas de plantas medicinais

contribui para a formulação de fármacos e auxilia as práticas terapêuticas (SCHMIDT et al.,

2008). Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), 80% da população mundial fazem

uso de plantas medicinais na atenção primária à saúde (OMS, 2002). No entanto, muitas

dessas plantas ainda não foram estudadas, nem o seu uso foi padronizado. Isto impede o uso

racional e seguro de muitas destas plantas medicinais.

Uma vez que o uso popular das plantas medicinais fornece evidências de algumas

atividades biológicas, a investigação científica através de modelos experimentais adequados

torna-se necessária em todas as etapas envolvidas na formulação de um novo fármaco. Por

meio do desenvolvimento dessas etapas experimentais é possível validar o uso tradicional de

algumas plantas, bem como indicar os parâmetros que permitam a sistematização do uso

(HEINRICH e GIBBONS, 2001).

O relato de experiências bem sucedidas do uso de plantas no tratamento e cura de doenças

pela população instiga a pesquisa científica na formulação de fármacos, contribuindo para a

fase de descoberta. Esta fase envolve triagens experimentais na pesquisa básica. Na FIG. 1

estão apresentadas as fases de desenvolvimento de um novo fármaco (CHIN e FERREIRA,

1999).

Pesquisa básica

•Triagem e

Descoberta

Pesquisa Pré-

clínica

•Modelos

animais,

ensaios in

vitro

Pesquisa Clínica

•Fase I

•Fase II

•Fase III

Pesquisa pós-

comercializaçãp

•Farmacovigi-

lância (Fase IV)

FIGURA 1- Etapas do desenvolvimento de um novo fármaco

Muitos compostos bioativos foram descobertos e isolados a partir de fontes naturais e

são hoje utilizados nas formulações alopáticas (ITOKAWA et al., 2008). Dos medicamentos

utilizados na clínica médica, 25% têm sua origem nas plantas (PHILLIPSON et al., 2007).

Embora a descoberta de muitas moléculas com propriedades curativas tenha se originado de

investigações com produtos naturais de origem vegetal, a produção em larga escala de muitos

desses fármacos requer processos de obtenção de princípios ativos além de modelagem

molecular e síntese química.

Como exemplo disso, o uso popular dos extratos da Catharanthus roseus, conhecida

como Pervinca ou Vinca rósea, no tratamento da Diabetes mellitus, levou a investigação de

suas ações terapêuticas. Ensaios em modelos animais demonstraram que os extratos causavam

a granulocitopenia e a supressão da medula óssea, bloqueando células em mitose (HANSEN

& NISSEN, 1972). Esses extratos produziram quatro alcalóides diméricos ativos conhecidos

como alcalóides da vinca: a vimblastina, a vincristina, a vinleurosina e a vinrosidina. Os

alcalóides purificados causaram regressão da leucemia linfocítica aguda em camundongos. A

vimblastina e a vincristina são agentes clínicos importantes no tratamento de leucemias,

linfomas e do câncer testicular (NOBLE et al., 2009).

O Brasil, um país tropical, possui uma biodiversidade em sua flora com plantas

nativas e exóticas adaptadas que lhe conferem um grande potencial para desenvolvimento de

fitoterápicos e outros fármacos a partir de insumos vegetais. As culturas tradicionais

brasileiras utilizam com frequência as plantas medicinais com propriedades curativas, e esse

conhecimento é transmitido ao longo de gerações. Na atualidade, o Sistema Único de Saúde

brasileiro (SUS) busca o fortalecimento do uso dos fitoterápicos na atenção básica da saúde

(Brasil, 2006).

Considerando o uso de plantas medicinais e a fitoterapia como práticas terapêuticas

complementares à saúde, em 2006, o governo federal brasileiro aprovou junto ao ministério

da saúde a Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos (PNPMF) que visa propor

formas alternativas à terapêutica e incentivar o desenvolvimento comunitário, a solidariedade

e a participação social na saúde. Uma das diretrizes dessa política é incentivar grupos de

pesquisa com atuação voltada para a farmacologia de plantas medicinais, principalmente no

enfrentamento das principais necessidades epidemiológicas identificadas no país.

2.2 A família Euphorbiaceae

A família compreende plantas com cerca de 300 gêneros e 6000 espécies, distribuídas

predominantemente em regiões tropicais. No Brasil, ocorrem cerca de 70 gêneros e 1000

espécies, o que a torna uma família comum na formação da flora brasileira e uma das mais

complexas do ponto de vista taxonômico (SOUZA e LORENZI, 2008). Em geral, as espécies

apresentam látex cáustico que, quando em contato direto com mucosas, principalmente dos

olhos, pode causar lesões graves (SHLAMOVITZ et al., 2009).

Algumas plantas da família Euphorbiaceae têm importância econômica como a

mamona, espécie africana Ricinus communis L, cujas sementes são utilizadas na produção do

óleo de rícino e de biodiesel, e a seringueira da Amazônia, Hevea brasiliensis, importante na

produção de borracha e extensamente cultivada na Malásia e Indonésia (SOUZA e LORENZI,

2008).

Espécies dessa família são conhecidas também pelo seu potencial terapêutico.

Destacam-se o quebra-pedras, designação comum a várias espécies do gênero Phyllantthus

reconhecidas, popularmente, por suas propriedades diuréticas, sendo utilizadas na eliminação

de litíases renais (BAGALKOTKAR et al., 2006; KARUA et al., 2009). As plantas do gênero

Euphorbia apresentam diversas atividades terapêuticas, e entre tais atividades destacam-se as

atividades antivirais e antitumorais.

2.3 O gênero Euphorbia

O gênero Euphorbia é o maior gênero da família Euphorbiaceae (SHLAMOVITZ et

al., 2009). As Euphorbias são encontradas nos continentes africano, asiático e na América do

Sul. Como possuem uma predileção por regiões áridas, não são comuns em lugares de clima

frio (RAVIKANTH et al., 2003). Algumas espécies do gênero são encontradas como ervas

daninhas, em jardins, ou como elementos decorativos, em casas.

Uma vez que possuem vários compostos bioativos em suas constituições, tais como

alcalóides, flavonóides, taninos e terpenos (PUSTZTAI et al., 2007; ZHANG et al., 2008;

WANG et al., 2006), as plantas do gênero Euphorbia são tradicionalmente utilizadas pela

cultura popular como plantas medicinais. Como exemplos, a espécie E. hirta é utilizada em

doenças respiratórias (SINGH et al., 2006), e a E. tirucalli é comumente utilizada no

tratamento de doenças virais (BENTACUR-GALVIS et al., 2002). Muitos estudos têm sido

conduzidos no sentido de comprovar as atividades de plantas do gênero Euphorbia e validar

seu uso.

2.3.1 Estudos das atividades biológicas de plantas do gênero Euphorbia

2.3.1.1 Atividade antitumoral

Muitas espécies do gênero Euphorbia têm demonstrado atividade citotóxica a diversas

linhagens tumorais. A TAB. 1 apresenta algumas dessas espécies. O extrato metanólico de E.

cheradenia pulverizado e diluído em Dimetilsulfóxido (DMSO) foi capaz de induzir a

apoptose de células leucêmicas das linhagens K562 e Jurkat (AMIRGHOFRAN et al., 2006).

A apoptose foi analisada por meio de testes de viabilidade celular e por fragmentação do

DNA.

O Putranjivain, um tanino extraído de E. jolkini inibiu a proliferação do

adenocarcinoma de mama humano da linhagem MCF-7, bloqueando a divisão celular,

mantendo as células estacionárias nas fases G0 ou G1 do ciclo celular (KUO et al., 2006).

Uma fração de E. peplus induziu apoptose em células de melanoma humano, linhagens Me

4405 e Me 1007 (GILLESPIE et al., 2004). Essa apoptose foi observada por ativação das vias

mitocondrial e caspase dependente. Um diterpeno extraído de E. fischeriana demostrou ser

um inibidor da via NF-КB (Fator Nuclear Kappa-B) (YAN et al., 2008). O fator de

transcrição NF-КB apresenta, entre outras funções, a ativação de genes necessários para o

processo de angiogênese, necessário para a sobrevida e metástase do tumor. Assim, com a

inibição dessa via, possivelmente o tumor não terá progressão.

Para a avaliação da ação antimutagênica do látex de E. tirucalli, foi utilizado um

modelo do sistema metionina no fungo filamentoso Aspergillus nidulans. O tratamento com o

látex de E. tirucalli diminuiu a taxa de mutação (REZENDE et al., 2004). A ação

antimutagênica do látex é positiva porque minimiza o surgimento espontâneo de células

tumorais.

O extrato de E. tirucalli diluído em salina exibiu uma atividade mielomoduladora e

inibiu crescimento tumoral em animais com células de tumor ascítico. O tratamento com

extrato de E. tirucalli também aumentou a sobrevida dos ratos (VALADARES et al., 2006).

O aumento da mielopoiese pode ser um possível mecanismo para a atividade antitumoral da

planta, uma vez que aumenta a produção de granulócitos, bem como sua atividade funcional

importante na imunovigilância.

TABELA 1

Espécies de Euphorbias com atividade citotóxica/ antitumoral.

Espécie Linhagem tumoral e/ou tipo

de tumor*

Referência

E. peplus Me 4405 e Me 1007 (GILLESPIE et al., 2004)

E. jolkini MCF-7 (KUO et al., 2006)

E. fischeriana U937, Jurkat, CoLo205, HGc,

MCF-7, A549, H460, HepG2

(YAN et al., 2008; Wang et al.,

2006)

E. cheiradenia Jurkat, K562 (AMIRGHOFRAN et al., 2006)

E. tirucalli Ehrlich ascite (VALADARES et al., 2006)

E. helioscopia HL-60 (TAO et al., 2008)

E. salicifolia L5178, L5178Y (HOHMANN et al., 2002)

E. serrulata L5178, L5178Y (HOHMANN et al., 2002)

E. poisonii A-498, MCF-7, PACA-2, A-

549, PC-3

(FATOPE et al., 1996)

* Me 4405 e Me 1007: Linhagem de células de melanoma humano/ MCF-7: Linhagem celular

de adenocarcinoma mamário humano/ U937: Linhagem celular leucêmica monocítica

humana/ Jurkat: Linhagem celular leucêmica de células T humana/ CoLo20: Linhagem

celular de câncer coloretal humano/ HGc: Linhagem celular de carcinoma gástrico humano/

A549: Linhagem celular de adenocarcinoma alveolar humano/ H460: Linhagem celular de

câncer pulmonar humano/ HepG2: Linhagem celular de hepatocarcinoma humano/ K562:

Linhagem celular leucêmica eritroblástica humana/ HL-60: Linhagem celular leucêmica

eritroblástica humana/ L5118, L5118Y: Linhagens de células leucêmicas linfoblásticas

murinas/ A-498: Linhagem de células de carcinoma renal humano/ PACA-2: Linhagem

celular de tumor pancreático humano/ PC-3: Linhagem celular de câncer de próstata humano.

2.3.1.2 Atividade antimicrobiana

O extrato etanólico das partes aéreas de E. hirta exibiu atividade antimicrobiana

contra Escherichia coli, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa pelo método de difusão

(SUDHAKAR et al., 2006) . Já a mistura complexa de quatro glicocerebrosídeos extraídos de

E. peplis tiveram atividade antifúngica contra Candida spp. E. Cryptococcus neoformans

(CATENI et al., 2003). Utilizando o método de difusão, pesquisadores observaram que o

extrato aquoso das partes frescas de E. tirucalli teve ação antimicrobiana contra Erwinia

carotovora pv carotovoea, Xanthomonas campestris pv campestris, e Pseudomonas

solanacearum (LIRIO et al., 1998).

2.3.1.3 Ação antiviral

As euphorbias E. cotinifolia e E. tirucalli exibiram ação antiherpética (BENTACUR-

GALVIS et al., 2002), em que a eficiência desses extratos diluídos em água/metanol foi sete

vezes superior ao fármaco Aciclovir tratado no grupo controle, usualmente utilizado no

tratamento de herpes simples. O extrato etanólico de E. thimifolia também apresentou

atividade antiherpética por inativar o vírus Herpes simplex 2 e diminuir sua infectividade

(YANG et al., 2005). Já diterpenoides isolados de E. paralias demonstraram moderada

atividade contra a replicação do vírus da imunodeficiência humana (HIV-1) em culturas

celulares (ABDELGALEIL et al., 2001).

2.3.1.4 Ações que interferem em processos alérgicos e inflamatórios

Euphorbia hirta tem a capacidade de evitar reações alérgicas do tipo tardias

(hipersensibilidade do tipo 4). Isso foi observado em modelo animal de ratos sensibilizados

com ovalbumina em que o tratamento com E. hirta atenuou a liberação de (IL-4) e aumentou

a secreção de INF-γ (SINGH et al., 2006). Isso demonstra que constituintes químicos de E.

hirta favorece uma resposta imune do tipo celular em detrimento da resposta imune humoral.

Além disso, ésteres extraídos de E. tirucalli exibiram efeito inflamatório em orelha de

ratos, e essa inflamação foi caracterizada por uma irritação e aumento do rubor, que é um

sinal clássico da inflamação (KINGHORN et al., 1979). De forma semelhante, dierpenos

isolados de E. peplus tiveram um efeito inflamatório em orelha de ratos, caracterizado pelo

rubor (HOHMANN et al., 1999).

2.3.1.5 Atividade anti-inflamatória

Já a fração biopolimérica de polissacarídeos presentes no látex de E. tirucalli inibiu a

inflamação provocada pela artrite em modelo animal. Os sinais para essa ação anti-

inflamatória foram: redução da permeabilidade vascular e migração leucocitária, supressão

dos linfócitos T CD4+ e T CD8+ e suas citocinas intracitoplasmáticas pró-inflamatórias INF-γ

e IL-2 (BANI et al., 2007). De forma semelhante, uma fração do extrato de E. royleana

também exibiu ação anti-inflamatória em modelo animal, caracterizada pela redução do

edema e da migração leucocitária (BANI et al., 2000). O tratamento com extrato etanólico de

E. hirta em modelo animal de anafilaxia, uma reação inflamatória exacerbada ocasionada pela

liberação de mediadores inflamatórios, dentre os quais se destaca a histamina liberada por

mastócitos e basófilos, foi capaz de diminuir a gravidade da reação, reduzindo o edema e os

níveis plasmáticos das citocinas pró-inflamatórias, IL-6 e o TNF-α (YOUSSOUF et al.,

2007). Já a aplicação tópica de tirucallol, um triterpeno isolado do látex de E. láctea, diminuiu

o edema e inibiu a expressão da enzima óxido nítrico sintetase (iNOS), de forma semelhante à

dexametasona, um potente anti-inflamatório (FERNANDEZ-ARCHE et al., 2010).

2.3.1.6 Modulação das Proteínas associadas à múltipla resistência a drogas (MDR)

Produtos de algumas plantas do gênero Euphorbia parecem ter a capacidade de

modular a expressão dos MDRs, proteínas que diminuem a concentração intracelular de

fármacos antibióticos e quimioterápicos, e assim promovem um prejuízo à eficácia terapêutica

(HOHMANN et al., 2002; LAGE et al., 2010). O tratamento com compostos isolados de E.

lagascae e E. tuckeyana reduziu a expressão dos genes que comandam a síntese de MDRs,

porém, os mecanismos para essa modulação ainda não foram descritos. Dessa forma, tais

plantas poderiam ser úteis no campo quimioterápico de diversas doenças, uma vez que

proporcionariam a manutenção dos fármacos no interior das células (WESOLOWSKA et al.,

2007).

2.4 Euphorbia tirucalli

A planta, também conhecida como árvore-lápis, aveloz, mata-verruga e cega-olho, tem

como sinonímia botânica o nome Euphorbia rhipsaloides Lem. A planta é originária da

África e foi trazida para os países tropicais, incluindo o Brasil, onde é encontrada no estado

do Amazonas, em Minas Gerais, na região Nordeste e também na costa do Estado de São

Paulo (CORREIA, 1984). A TAB. 2 estabelece a posição sistemática da E. tirucalli.

TABELA 2

Posição sistemática da Euphorbia tirucalli

A Euphorbia tirucalli é um arbusto, semilenhoso, medindo em torno de 4 metros de

altura, lactescente, com inúmeros ramos verdes, suculentos, cilíndricos, com poucas folhas e

flores pequenas e raras (FIG. 2). O arbusto é bem adaptado em solos pobres e secos e é

frenquetemente encontrado em regiões de clima quente e solo arenoso. No Brasil, o látex da

planta é utilizado na cultura popular como agente laxante, para controle de parasitoses

intestinais, para tratar asma, verrugas e câncer (BENTACUR-GALVIS et al., 2002).

A B

FIGURA 2 - Imagens da E. tirucalli. (A) Planta inteira (B) Detalhamento dos ramos

Reino Plantae

Divisão Magnoliophyta

Classe Magnoliopsida

Subclasse Magnoliidae

Ordem Malpighiales

Família Euphorbiaceae

Gênero Euphorbia

Espécie Euphorbia tirucalli

http://pt.wikipedia.org/wiki/Reino_(biologia)

http://pt.wikipedia.org/wiki/Plantae

http://pt.wikipedia.org/wiki/Divis%C3%A3o_(biologia)

http://pt.wikipedia.org/wiki/Magnoliophyta

http://pt.wikipedia.org/wiki/Classe_(biologia)

http://pt.wikipedia.org/wiki/Magnoliopsida

http://pt.wikipedia.org/wiki/Classe_(biologia)

http://pt.wikipedia.org/wiki/Magnoliidae

http://pt.wikipedia.org/wiki/Ordem_(biologia)

http://pt.wikipedia.org/wiki/Malpighiales

http://pt.wikipedia.org/wiki/Fam%C3%ADlia_(biologia)

http://pt.wikipedia.org/wiki/Euphorbiaceae

http://pt.wikipedia.org/wiki/G%C3%A9nero_(biologia)

http://pt.wikipedia.org/wiki/Euphorbia

http://pt.wikipedia.org/wiki/Esp%C3%A9cie

2.4.1 Constituintes químicos do látex de E. tirucalli

O látex bruto de E. tirucalli contém em torno de 53,8 a 79,9% de água e seus

principais constituintes químicos são: 12-0-22-octadieno-4-deoxiforbol-13-acetato, ácido

metil elágico; β-sitosterol; ácido cítrico; eufol; euforona, glicose; hentriacontanol; isoeuforal;

ácido málico; sapogenina; ácido succínico; taraxasterol; e tirucalol (FURTENBERGER et al.,

1986). Achados posteriores caracterizaram quatro terpenos (KHAN et al., 1987) extraídos do

látex e do caule da planta, um triterpeno pentaciclico euphorcinol (KHAN et al., 1989), bem

como um novo diterpeno macrocíclico (KHAN et al., 1990). Esses constituintes químicos são

biologicamente ativos. Outros ésteres de phorbol sabidamente têm ação em processos

biológicos como a inflamação e a modulação da expressão de citocinas (BISHAYI et al.,

2002; KERR et al., 1987; SIERAKOWSKI et al., 1988; SMITH et al., 1998). Alguns

terpenos têm também a ação biológica estudada na indução da apoptose de células tumorais,

bem como na modulação da expressão das MDRs (ABDELGALEI et al, 2001; DUARTE et

al., 2009).

2.4.2 Toxicologia associada à E. tirucalli

E. tirucalli é uma fonte de acidentes tóxicos. Devido à natureza cáustica do látex, uma

vez ingerido em grandes quantidades, pode causar irritação gastrintestinal. Além disso, uma

vez em contato com a pele ou mucosas, o látex pode provocar lesões do tipo eritematosas com

processo inflamatório associado. Há relatos na literatura de lesões oculares provocadas pela E.

tirucalli em que é comum a ceratoconjutivite com irritação inicial e posterior perda da

acuidade visual (HSUEH et al, 2004; SHLAMOVITZ et al., 2009).

Estudos com ratas grávidas demonstraram que o tratamento por via oral com extrato

de E. tirucalli, diluído em salina, durante 15 dias, não alterou parâmetros como a sobrevida,

sinais clínicos, e o peso dos animais e seus órgãos internos. O tratamento nem mesmo afetou a

implantação e desenvolvimento do embrião (SILVA et al., 2007). Tais resultados

demonstraram que, nas concentrações testadas, o látex da planta não exibiu toxicidade aos

embriões.

Avaliando a atividade antiherpética in vitro de E. tirucalli, foi observado que o extrato

inibiu o crescimento viral e seu ciclo lítico na concentração de 100mg/mL diluído em

água/metanol sem apresentar toxicidade às células não infectadas. Esse resultado demonstrou

um bom índice terapêutico do extrato, uma vez que a dose que exibiu atividade antiviral foi

muito inferior à menor dose tóxica da ordem de 1000 mg/mL (BENTACUR-GALVIS et al.,

2002)

2.4.3 Atividades atribuídas ao látex de E. tirucalli

O látex de E. tirucalli apresenta diversas atividades biológicas já estudadas e relatadas

na literatura, como atividades moluscicida e larvicida, que conferem à planta potencial

controle vetorial de doenças endêmicas de países tropicais (JURBERG et al., 1985;

RAHUMA et al., 2008; RAMOS et al., 2009; YADAV et al., 2002). Os autores sugerem que

o controle vetorial com utilização do extrato seria menos agressivo ao ambiente do que as

substâncias utilizadas para o controle atualmente. As ações com futuras aplicações

terapêuticas incluem a atividade antimicrobiana (LIRIO et al., 1998), antiviral (BENTACUR-

GALVIS et al., 2002), pró-inflamatória (KINGHORN et al., 1979) e anti-inflamatória (BANI

et al., 2007), conforme relatado no texto.

De acordo com os trabalhos relatados até então, é possível verificar que, embora a E.

tirucalli seja utilizada em diversos modelos experimentais que possam comprovar a sua

utilidade terapêutica contra doenças de natureza infecciosa, inflamatória ou tumoral, os

mecanismos moleculares envolvidos em tais processos ainda não foram devidamente

esclarecidos. As investigações realizadas limitam-se, na maioria das vezes, à apresentação

descritiva dos resultados obtidos com produtos da planta em comparação a controles

experimentais. Pouco se sabe em que vias metabólicas os princípios ativos da planta poderiam

estar atuando. Por isso, alguns questionamentos poderiam ser levantados: será que os

componentes bioativos da planta estariam atuando diretamente nos processos relacionados à

perpetuação dos agentes infecciosos? Será que tais substâncias também poderiam atuar em

mecanismos que levam à regressão ou controle de tumores? Ou será que tais princípios ativos

poderiam atuar de maneira indireta, alterando os elementos da resposta imunológica e

proporcionando assim uma resposta eficiente contra agentes infecciosos e células tumorais?

Tendo em vista que o presente trabalho pretende demonstrar se os princípios ativos do látex

bruto de E. tirucalli alteram alguns parâmetros imunológicos, faz-se necessário realizar uma

breve exposição das bases celulares e moleculares relacionadas ao estabelecimento de uma

resposta imune durante as infecções virais e durante os processos tumorais.

2.5 Sistema imune contra infecções virais

Os vírus são organismos intracelulares obrigatórios, que se replicam dentro das

células. Os mecanismos da imunidade inata contra os vírus envolvem basicamente a inibição

da replicação viral pelas células infectadas e a morte das células infectadas pelas células

Natural Killer (NK). As células NK lisam as células infectadas e são importantes no início e

no decorrer da infecção (BIRON et al., 1999; BIRON & BROSSAY, 2001;). Já a resposta da

imunidade adquirida aos vírus é mediada principalmente pelos linfócitos T CD8, também

conhecidos como linfócito T citotóxicos. As células infectadas por vírus são especificamente

reconhecidas por linfócitos T citotóxicos que, após se tornarem ativados, lisam diretamente as

células infectadas por meio da liberação dos seus grânulos (ZHOU, 2010). O mecanismo de

lise envolve ativação de enzimas conhecidas como caspases, que culminam com a clivagem

do DNA viral e também da célula hospedeira.

O efeito dos linfócitos T é dependente das interações com as células alvos que

desencadeiam respostas antígenos específicas (CHAVEZ-GALAN et al., 2009). Essa

interação ocorre entre o receptor de célula T e o Complexo Principal de Histocompatibilidade

(MHC) da célula alvo. O MHC é composto por proteínas de membrana cujos domínios

extracelulares formam uma fenda na qual se liga o fragmento de peptídeo, que será

reconhecido pelo receptor do linfócito T. As moléculas de MHC de classe I recrutam

peptídeos derivados de proteínas sintetizadas no citosol celular (GOULDER & WATKINS,

2008). Dessa forma, em infecções intracelulares, como infecções virais, o MHC de classe I é

capaz de expor os peptídeos virais aos linfócitos T citotóxicos na superfície celular (DEL-

VAL & LOPEZ, 2002). Para que os peptídeos se liguem à fenda do MHC I no citosol da

célula, as proteínas precisam ser degradadas em um complexo enzimático conhecido como

proteossoma. Existe também a apresentação cruzada de antígeno, quando partículas virais

podem ser endocitadas e, ainda assim, se unirem às vesículas contendo o MHC I (SNYDER

et al., 2010). O linfócito T citotóxico reconhece os peptídeos vírais nas células-alvo

associados às moléculas de MHC I, desencadeando a morte da célula infectada. Já a molécula

de MHC II se liga a peptídeos derivados de vesículas intracelulares, e assim expõe peptídeos

de patógenos que foram endocitados por células fagocíticas, que são os macrófagos, as células

dendríticas e os linfócitos B (BANGHAM et al., 2009). O MHC II apresenta os antígenos aos

linfócitos T CD4 (Th), também conhecidos como linfócitos T auxiliares. Clones Th1 são

efetivos em potencializar respostas protetoras contra as infecções virais, por liberarem

citocinas que farão predominar uma resposta pró-inflamatória caracterizada por ser uma

resposta imune celular.

As citocinas do tipo 1 são importantes nesses processos de ativação da resposta imune

ao combate aos patógenos intracelulares, bem como no reconhecimento de moléculas

consideradas “estranhas” no interior de células. O IFN-γ favorece o aumento da apresentação

de antígeno, uma vez que induz uma modificação no proteossoma que permite o aumento da

produção de peptídeos antigênicos. Células tratadas com a IFN-γ aumentam a transcrição de

cadeias do MHC I (SELIGER et al., 2008). Os linfócitos T CD4 realizam suas funções

efetoras por meio da liberação de citocinas. O IFN- γ liberados por linfócitos Th1 ativam

macrófagos e ativam células Natural Killer (NK) (LEVY & GARCIA-SASTRE, 2001). A

FIG. 3 apresenta as principais funções atribuídas à citocina IFN- γ. O TNF-α é também um

mediador importante da resposta imune celular, sendo os macrófagos sua principal fonte

celular (YAMAUCHI & NIITSU, 1997). Além disso, o TNF-α favorece o recrutamento de

leucócitos para o sítio da infecção, por estimular o endotélio a expressar moléculas de adesão

e também por estimular os macrófagos e células endoteliais a secretarem quimiocinas,

importantes no recrutamento tecidual de leucócitos (APOSTOLAKI et al., 2010; WAJANT,

2009). Os receptores de TNF-α pertencem a uma família que ativa proteínas intracelulares

associadas que induzem apoptose celular (SCREATON & XU, 2000). As principais funções

do TNF-α estão ilustradas na FIG. 4.

NK

TNF-α

NO

Granzimas e Perforinas

Ativação de células NK

Ativação de Macrófagos

Aumento da expressão de moléculas de MHC

Th1 Diferenciação de linfócitos Th em Th1

FIGURA 3 - Principais funções atribuídas à citocina IFN- γ.

TNF-α

Aumento da expressão de moléculas de adesão do endotélio

Aumento da permeabilidade do endotélio

Apoptose via estimulação de receptores

FIGURA 4 - Principais funções atribuídas à citocina TNF-α.

2.6 Sistema imune no combate a células tumorais

Os tumores desencadeiam respostas imunes específicas que inibem a sua existência ou

suprimem seu crescimento. Os mecanismos para controle e combate de células tumorais são

conhecidos como imunovigilância. Os tumores expressam antígenos que podem desencadear

uma resposta do sistema imune (WHITESIDE et al., 2010). Em alguns casos, proteínas que

são expressas somente em fases embrionárias são expressas por células tumorais. Tais

proteínas ao serem apresentadas, via MHC I, aos linfócitos T citotóxicos não tolerantes a

esses autoantígenos respondem a eles como se fossem moléculas estranhas ou não próprias

(BEATTY & VONDERHEIDE, 2008). Há casos em que proteínas próprias são expressas e

apresentadas em quantidades excessivas e levam ao que chamamos de quebra da tolerâncias

dos linfócitos T e, então, desencadeiam uma resposta citotóxica. Porém, as células tumorais

apresentam mecanismos de escape do sistema imune, tais como a inibição direta de células T

e a perda da expressão de antígenos que desencadeiam o escape dos tumores ao sistema imune

(GARCIA-LORA et al., 2003).

O principal mecanismo da imunidade contra células tumorais é a morte destas células

pelos linfócitos citotóxicos (BENCHETRIT et al., 2003; JAGER et al., 2001). Os linfócitos

T CD4, conhecidos como Linfócitos T auxiliares, fornecem por meio da produção de

citocinas específicas, tais como IFN-γ e TNF-α, um microambiente de citocinas que favorece

o recrutamento celular e até mesmo o aumento da expressão do MHC I nas células tumorais.

Os linfócitos T auxiliares (Th) também podem propiciar a morte de células tumorais por meio

da secreção de TNF-α, e sua ação direta sobre tais células (HOLOCH E GRIFFITH, 2009). O

TNF-α secretado em grandes quantidades provoca alterações sistêmicas como a queda de

glicose e a trombose vascular (CHEN et al., 2009; ZHANG et. al, 2009). As citocinas do

tipo 2, como IL-4 e IL-10 que antagonizam o TNF-α, são importantes por fornecerem um

equilíbrio da resposta imune, de forma que a resposta do tipo 1 seja predominante, porém não

exacerbada (FIORENTINO et al., 1991; HOLUB et al., 2009).

As células NK são potencialmente ativadas pelo IFN-γ e podem destruir células

tumorais que possuam a expressão reduzida de moléculas de MHC I ou que estejam

opsonizadas por anticorpos tumor-específicos (PEGRAM et al., 2010). Estudos mostraram

que animais que tinham a expressão de IFN-γ deficiente ou não apresentavam o receptor para

a citocina não respondiam ao tratamento antitumoral quimioterápico (GHIRINGHELLI et al.,

2009), indicando a necessidade da citocina para o êxito do tratamento antitumoral.

2.7 Resposta Imune do tipo 1 e do tipo 2

Uma resposta imune do tipo 1, também conhecida como resposta celular, é

caracterizada principalmente pela diferenciação de linfócitos T helper (Th0) em linfócitos

Th1 (ZINFANG et al., 2010). Esses linfócitos produzem citocinas conhecidas como citocinas

do tipo 1, das quais podem ser citadas o IFN-γ, TNF-α e IL-1. O IFN- γ é a citocina que

caracteriza uma célula Th1, e por consequência a resposta do tipo 1 (ELYAMAN et al.,

2009). Além de linfócitos Th, outros leucócitos também contribuem para o predomínio da

resposta imune do tipo 1 com a produção de citocinas que irão compor o microambiente. A

produção e liberação de citocinas do tipo 1 leva à imunidade mediada por células, com

ativação de macrófagos, linfócitos T citotóxicos e à produção de anticorpos

predominantemente do isotipo IgG pelos linfócitos B. Esses anticorpos são opsonizantes,

favorecendo a resposta citotóxica (DUFFIELD et al., 2003). Esta resposta é necessária para

combate efetivo de patógenos intracelulares.

Citocinas do tipo 2, como IL-4, IL-5 e IL-10, que podem ser liberadas por linfócitos

Th2 e outros leucócitos, são inibidoras da resposta do tipo 1, e úteis no controle da resposta

citotóxica (MCCOY et al., 2010). Porém, uma resposta predominantemente do tipo 2 será um

resposta humoral, em que anticorpos produzidos por células B desencadeiam a destruição de

patógenos extracelulares (GARSIDE et al., 1998). E o direcionamento de uma resposta Th2,

em infecções intracelulares, pode constituir um mecanismo de escape de patógenos como

bactérias intracelulares e vírus (WIGGINTON et al.,2001).

3 JUSTIFICATIVA

A Euphorbia tirucalli é uma planta abundante no Vale do Jequitinhonha e amplamente

conhecida na região como uma planta com propriedades anti-helmínticas, cicatrizante e anti-

inflamatória. A planta também tem seu uso popular difundido para fins terapêuticos contra

infecções virais e doenças tumorais, além do uso no tratamento local de verrugas. De fato,

algumas dessas propriedades têm sido estudadas por diversos pesquisadores, no entanto,

pouco se sabe se as ações desempenhadas pelos princípios ativos da planta agem de maneira

direta sobre os mecanismos envolvidos nos processos patológicos, anteriormente citados, ou

se tais princípios ativos poderiam alterar a resposta imune do hospedeiro frente ao estímulo,

seja ele de natureza infecciosa ou tumoral.

Tendo em vista os altos níveis de compostos bioativos presentes nas plantas do gênero

Euphorbia, é provável que algumas espécies possam realmente apresentar atividades

biológicas capazes de promover uma melhora clínica em algumas situações patológicas

(LAGE et al, 2009; PUSZTAI et al, 2007). Considerando a importância da produção de

citocinas no desenvolvimento de uma resposta imune eficaz contra os processos patológicos

associados à infecção, a tumores e a processos inflamatórios, é possível que muitas das

funções terapêuticas atribuídas às Euphorbiáceaes possam ser consequência da ação dos

princípios ativos das plantas sobre o sistema imune, e não somente derivar de uma ação direta

dos mesmos elementos causadores de tais patologias.

Como as ações do sistema imune no combate às infecções virais e nos processos de

eliminação de tumores possuem mecanismos semelhantes, tais como a citotoxicidade

antígeno-dependente e citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), características

de uma resposta imune do tipo celular (tipo 1), o presente trabalho buscou avaliar a ação in

vitro do látex bruto de E. tirucalli na produção de citocinas em populações e subpopulações

específicas de leucócitos do sangue periférico.

4 OBJETIVO

4.1 Objetivo geral

Analisar o perfil de citocinas intracitoplasmáticas em leucócitos do sangue periférico

de indivíduos estimulados in vitro com o látex bruto de Euphorbia tirucalli.

4.2 Objetivos específicos

- Construir uma curva dose-resposta da viabilidade das células monucleares do sangue

periférico estimuladas pelo látex bruto de E. tirucalli diluído em DMSO nas concentrações de

5, 10, 20 e 30% in vitro nos tempos de incubação de 24, 48 e 72 horas.

- Analisar o perfil das citocinas intracitoplasmáticas IFN-γ, TNF-α, IL-4 e IL-10 in

vitro nas populações de neutrófilos, monócitos, linfócitos e nas subpopulações de linfócitos T

CD4+ e T CD8+ do sangue periférico de indivíduos estimulados com o látex bruto de

Euphorbia tirucalli 10% diluído em DMSO.

5 MATERIAL E MÉTODOS

5.1. População estudada

Para o estudo funcional dos leucócitos circulantes, foram coletadas amostras de sangue

venoso de 20 indivíduos voluntários com idade variando de 21 a 56 anos (37 ± 12), sendo 6

mulheres e 14 homens. Os voluntários foram submetidos à triagem na clínica hematológica

Romeu Ibrahim de Carvalho, tendo sorologia negativa para hepatite B e C, HIV, sífilis,

doença de Chagas e HTLV e estando, assim, aptos à doação de sangue. As culturas celulares e

as análises fenotípicas foram realizadas no laboratório de Imunologia da UFVJM e no

Laboratório de Biomarcadores de Diagnóstico e Monitoramento do Centro de Pesquisa René

Rachou – FIOCRUZ. Todos os indivíduos incluídos neste estudo assinaram o termo de

consentimento aprovado pelo Comitê de Ética da UFVJM, sob registro permanente 002/09.

5.2 Amostras de sangue

A amostra biológica constituiu-se de 8 a 15 mL de sangue total, utilizando-se a

heparina como anticoagulante. Após a coleta, num prazo máximo de 24 horas, foram feitas as

culturas celulares e posteriores análises da produção de citocinas intracitoplasmáticas em

populações e subpopulações de leucócitos periféricos, por citometria de fluxo.

5.3 Certificação botânica Euphorbia tirucalli

A identificação botânica do exemplar utilizado nos experimentos foi realizada por

botânicos da Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri – UFVJM por meio

de estudos anatômicos. O material testemunho foi depositado no herbário da referida

instituição número de registro 1897.

5.4 Coleta das amostras de látex de Euphorbia tirucalli

O látex de Euphorbia tirucalli foi coletado por meio de pipeta automática com

ponteira descartável, após incisão na base do ramo da planta adulta, com altura mínima de 2

metros. O material foi coletado pela manhã, entre 8 e 9 horas, e diluído imediatamente em

DMSO, nas concentrações de 5, 10, 20 e 30% v/v. Nessas concentrações, foi possível obter

boa diluição em DMSO, além de baixa toxicidade em leucócitos mononucleares nas primeiras

24 horas. A qualidade da solução foi determinada pela ausência de coágulos e pela sua

homogeneidade.

FIGURA 5 - Coleta do látex de E. tirucalli

5.5 Análise da viabilidade de células mononucleares do sangue periférico estimuladas in

vitro com o látex bruto de E. tirucalli

Tendo em vista o conhecimento prévio sobre a toxicidade do látex de E. tirucalli, foi

realizado um teste de viabilidade celular a fim de indicar a concentração ideal a ser utilizada

nos ensaios de análise das citocinas intracitoplasmáticas, sem prejuízo às células em cultura.

Para a realização desse teste, foram coletados 15mL de sangue venoso de três indivíduos

jovens, aptos à doação. O sangue foi centrifugado utilizando-se um gradiente de concentração

de Ficoll-Paque (Pharmacia, Upsalla - Sweeden), na proporção de 2/1, por 20 minutos a 600g.

Posteriormente, retirou-se o anel de leucócitos mononucleares que foram depositados em

tubos cônicos de 50mL. O volume do tubo foi completado para 40 mL de salina tamponada -

PBS (PBS 0,015 M pH 7,4) e a solução foi então centrifugada novamente. Essa etapa de

lavagem foi repetida. Após a centrifugação, o sobrenadante foi descartado, mantendo-se um

volume de 1mL, seguido de ressuspensão das células. 10µL dessa suspensão celular foram

incubados por cinco minutos com 190µL de azul de tripam a 0,4% em PBS. Para ajustar a

concentração da suspensão celular para 1 x 107 células/mL, foi feita a contagem das células

viáveis utilizando-se Câmara de Neubauer. 50µL da suspensão celular, totalizando 500000

células/poço, foram incubados com 1925µL de RPMI completo e 25µL das soluções estoque

de látex diluídas em DMSO, em diferentes concentrações, sendo elas: Látex a 5% (Lt 5%),

Látex a 10% (Lt 10%), Látex a 20% (Lt 20%) e Látex a 30% (Lt 30%). Como o volume em

cada poço foi 2mL nas culturas chamadas de Lt 5%, Lt 10%, Lt 20% e Lt30%, o látex de E.

tirucalli estaria na concentração final, em cada poço, de 0,0625%, 0,125%, 0,25% e 0,5%

respectivamente. Culturas celulares estimuladas com salina e DMSO foram realizadas e

constituíram os grupos controle (CC) e controle do solvente (DMSO, respectivamente. As

culturas foram realizadas em triplicata, utilizando placas de 24 poços, sendo cada replicata

reservada para a análise dos tempos 24, 48 e 72 horas de incubação. Ao fim da incubação, as

células foram colocadas em tubos de fundo redondo de 5mL e lavadas com 2mL de PBS.

10µL das suspensões celulares foram incubados com 190µL de azul de tripam por 5 minutos.

Foi feita, então, a contagem das células viáveis e inviáveis utilizando-se Câmara de Neubauer.

A viabilidade celular foi determinada pelo percentual de células viáveis não coradas no

universo de células totais, coradas (inviáveis) e não coradas (viáveis).

5.6 Análise de citocinas intracitoplasmáticas por citometria de fluxo

A detecção de citocinas intracelulares por citometria de fluxo é um método rápido,

fácil e semiquantitativo, que permite a detecção de citocinas em uma única célula, sendo um

instrumento muito útil para o estudo da contribuição de células imunocompetentes na

produção de citocinas em populações celulares heterogêneas, bem como para o estudo do

padrão de citocinas em populações celulares homogêneas (FOSTER et al., 2007).

Para avaliação do potencial de produção de citocinas em diferentes populações

celulares, foi utilizado o seguinte protocolo: alíquotas de 500µL de sangue total foram

adicionadas a 500µL de RPMI-1640, em quatro tubos distintos. O tubos utilizados nas

culturas eram de fundo em U e de polipropileno. O primeiro tubo correspondeu à cultura

controle não estimulada (CC). Ao segundo tubo foram adicionados 25µL de Dimetilsulfoxido,

correspondendo ao grupo controle do solvente (DMSO). Ao terceiro tubo foram adicionados

25µL de látex da Euphorbia tirucalli diluído a 10% v/v em DMSO (Lt). Como o volume final

no tubo corresponde a 1mL, a concentração do extrato no tubo foi de 0,25% v/v. Essa

concentração foi escolhida tendo em vista resultados prévios que demonstraram ser essa a

concentração ótima para uso experimental. Em todos os tubos foram adicionados 10µL de

Brefeldina-A a 1mg/mL, para interromper o processo de transporte de proteínas, mantendo-as

no citosol celular. As culturas celulares foram então incubadas por 4 horas, em estufa úmida a

37oC, contendo 5% CO2. Após esse tempo, as amostras foram lavadas com 6mL de PBS-W

(PBS 0,015 M pH 7,4 contendo 0,5% de BSA e 0,1% de azida sódica) e centrifugadas a 600g

por 10 minutos a 18oC. Um volume de 1mL das culturas CC, DMSO e Lt foi adicionado a 4

tubos contendo 5µL de anticorpos monoclonais específicos para os receptores celulares CD4,

CD8, CD14 para a análise de linfócitos T auxiliares (Th), linfócitos T citotóxicos e

monócitos, respectivamente. As amostras foram incubadas por 30 minutos, à temperatura

ambiente, ao abrigo da luz. Após incubação, as culturas foram submetidas à lise por adição de

4,5ml de solução de lise eritrocitária (Optilyse-B, Immunotec-USA) e incubadas por 10

minutos à temperatura ambiente, ao abrigo da luz. Em seguida, as amostras foram

centrifugadas a 600g por 10 minutos a 18oC, o sobrenadante aspirado e as células

ressuspendidas em 4ml de PBS-W, e o volume completado até 12ml com PBS-P (PBS 0,015

M pH 7,4 contendo 0,5% de BSA, 0,1% de azida sódica e 0,5% de saponina). Após incubação

por 10 minutos à temperatura ambiente e ao abrigo da luz, a suspensão de células foi

novamente centrifugada. O sobrenadante foi aspirado e as células ressuspendidas em 3ml de

PBS-W. Fez-se nova centrifugação, aspiração do sobrenadante e ressuspensão celular em

250µl de PBS-W. Após a homogeneização da suspensão celular, o volume de cada tubo foi

distribuído em quatro novos tubos contendo 20µl de anticorpos anti-IFN-γ, anti-TNF-α, anti-

IL-4 e anti-IL-10 (diluídos 1/20 em PBS-P), seguido de incubação por 30 minutos, à

temperatura ambiente e ao abrigo da luz. Terminada a incubação, as células foram

ressuspensas em 3 ml de PBS-P e centrifugadas. O sobrenadante foi desprezado e o pellet

ressuspensas em PBS-W. Após essa etapa foram adicionados aos tubos 2ml de PBS-W

seguido de centrifugação a 400g por 10 minutos a 18oC. Após o descarte do sobrenadante, as

células foram ressusas em 300µl de solução fixadora “FACS fix solution”(10 g/L

paraformaldeído, 1% de cacodilato sódico, 6,65 g/L cloreto de sódio e 0,01% de azida

sódica). As amostras foram avaliadas quanto aos parâmetros fenotípicos celulares e produção

de citocinas, por citometria de fluxo (FACScan – Becton-Dickinson USA), procedendo-se a

aquisição de 30.000 eventos por tubo utilizando o programa Cell-Quest para o estoque dos

dados. Os anticorpos utilizados para a identificação das populações leucocitárias, bem como

para a marcação das citocinas por citometria de fluxo e suas especificidades estão listados na

TAB. 3.

TABELA 3

Anticorpos monoclonais marcados com fluorocromos utilizados para análise de populações

leucocitárias e marcação de citocinas.

Anticorpos monoclonais Especificidade

Anti-CD4 humano marcado com PerCP1 Subpopulação de Linfócitos T

Anti-CD8 humano marcado com PerCP Subpopulação de Linfócitos T

Anti-CD14 humano marcado com PerCP População de monócitos

Anti-INF-γ humano marcado com PE2 Interferon gamma

Anti TNF-α humano marcado com PE Fator de necrose tumoral alfa

Anti IL-4 humano marcado com PE Interleucina 4

Anti IL-10 humano marcado com PE Interleucina 10

Anticorpos monoclonais (Becton-Dickinson, USA). 1PerCP: Proteína Clorofila Peridina

2PE: Ficoeritrina

5.7 Estratégia de análise

As populações leucocitárias de interesse foram selecionadas mediante a análise de

gráficos de distribuição pontual em função do tamanho e granulosidade (FSC x SSC),

conforme FIG. 6A e 6C . Para a análise das populações de monócitos e as subpopulações de

linfócitos T CD4 e T CD8 foram utilizados anticorpos anti-CD14, anti-CD4 e anti-CD8,

respectivamente, todos marcados com PerCP (FL3). Uma vez que a população de neutrófilos

é negativa para o marcador anti-CD14, essa população foi selecionada com base no perfil de

tamanho e granulosidade, bem como na negatividade para a marcação com anti-CD14.Após a

seleção das células de interesse, por meio de gráficos de tamanho versus granulosidade, foi

realizada a análise das citocinas intracitoplasmáticas em gráficos de distribuição pontual de

fluorescência 3 (FL3) versus fluorescência 2 (FL2), tanto nas culturas controle quanto nas

culturas estimuladas com látex de E. tirucalli, conforme exemplificado nas figuras 6B e 6D,

respectivamente. Os dados primários obtidos em cada quadrante dos gráficos de dispersão

FL3 x FL2 corresponderam aos valores percentuais, tendo como referência a população

selecionada nos gráficos de dispersão SSC x FSC (FIG. 6B e 6D).

CD4-PerCP

CD4-PerCP

TNF-

alp

ha-

PE

Gra

nu

losi

dad

e-S

SCG

ran

ulo

sid

ade

-SSC

Tamanho - FSC

TNF-

alp

ha-

PE

Tamanho - FSC

A B

C D

1 3

5440

15 13

4527

FIGURA 6 - Estratégia de análise por citometria de fluxo. Sequência de procedimentos

utilizados para as análises dos percentuais de populações celulares por citometria de fluxo.

Gráfico de distribuição pontual FSC x SSC são utilizados para a seleção das populações

desejadas nas culturas do grupo controle CC (A) e grupo Lt (C). Em seguida são utilizados

gráficos de distribuição pontual FL3 x FL2 para avaliar a expressão de citocinas nas

populações e subpopulações específicas (B) CC, (D) Lt.

5.5 Análise estatística

Para verificar a diferença entre os grupos, utilizou-se a análise de variância, seguida

pelo teste de múltipla comparação de média de Tukey. A tabulação e análise dos dados foi

realizada utilizando-se o Software GraphPad Prism 5 (GraphPad Software Inc., San Diego,

CA, USA). Adotou-se como nível de significância um p < 0,05.

6 RESULTADOS

6.1 Análise da viabilidade de células mononucleares do sangue periférico humano in

vitro após estimulação com látex bruto de Euphorbia tirucalli

A FIG. 7 representa a análise de viabilidade em valores percentuais dos leucócitos

mononucleares incubados com o látex de E. tirucalli diluído em DMSO nas concentrações de

5, 10, 20 e 30%, nos tempos 24 (A), 48 (B) e 72 horas (C). Os dados obtidos revelaram que o

tratamento com o látex de E. tirucalli, na concentração de 5%, não alterou o percentual de

células viáveis e inviáveis em nenhum dos tempos avaliados, quando comparados aos grupos

CC e DMSO. O látex nas concentrações 10 e 20% reduziu a viabilidade celular a partir das 48

horas de incubação. Já o extrato da planta na concentração de 30% apresentou citotoxicidade

desde as primeiras 24 horas. Esses dados evidenciam que a citotoxicidade aumenta em função

do tempo de exposição ao látex nas concentrações acima de 5%. De acordo com os dados

apresentados, o látex bruto da planta parece não interferir nos processos citotóxicos na

concentração de 5% em todos os tempos avaliados e nas concentrações de 10 e 20% em

tempos inferiores a 24 horas, porém, são necessários outros estudos para a confirmação da

toxicidade do extrato, uma vez que o ensaio com o azul de tripam avalia apenas a perda da

seletividade da membrana celular, um evento tardio da célula em processo de morte.

50

100 a

aaa

aaa

50

100

Via

bili

da

de %

CC DMSO Lt 5% Lt 10% Lt 20% Lt 30%

50

100

A

B

C

FIGURA 7 - Percentual de células viáveis em leucócitos mononucleares circulantes do sangue

periférico de indivíduos hígidos nos tempos 24 horas (A), 48 horas (B) e 72 horas (C) e

estimulados com salina (grupo controle) , DMSO e Látex de E. tirucalli nas concentrações

de 5 , 10 , 20 e 30% . A contagem das células foi feita com auxílio da câmara de

neubauer, segundo o protocolo de viabilidade celular descrito no material e métodos. Os

resultados foram expressos com a dispersão dos dados e o valor médio da viabilidade nos

diferentes grupos. Diferença estatisticamente significativa: a = em relação ao grupo controle.

Método estatístico utilizado – ANOVA seguida de Tukey.

0

0.15

0.3

0.45

0.6

0

0.25

0.5

0.75

1

% N

eu

tró

filo

s+ C

ito

cin

a +

/Ne

utr

ófi

los

+

a, b

a, b

A B

6.2 Perfil de citocinas intracitoplasmáticas em leucócitos do sangue periférico

estimulados com látex bruto de E. tirucalli

6.2.1 Análise de citocinas intracitoplasmáticas em neutrófilos do sangue periférico


O percentual de neutrófilos positivos para as citocinas IFN-γ, TNF-α, IL-4 e IL-10

está apresentado nas figuras 8 e 9. De acordo com os resultados, o percentual de neutrófilos-

IFN-γ+ (FIG. 8A) e neutrófilos-TNF-α+ (FIG. 8B) das culturas celulares do grupo Lt

apresentou um aumento significativo em relação aos grupos CC e DMSO (IFN-γ: Lt: 0,25 ±

0,25, CC 0,05 ± 0,02, DMSO: 0,45 ± 0,03 e TNF-α: Lt: 0,50 ± 0,29, CC: 0,2 ± 0,11, DMSO:

0,15 ± 0,08).

FIGURA 8 - Análise do percentual médio de neutrófilos-IFN-γ+ (A) e neutrófilos-TNF-α+

(B) de culturas de leucócitos totais dos grupos CC , DMSO e Lt . A população

celular foi identificada através dos parâmetros de tamanho e granulosidade e as citocinas

intracitoplasmáticas por marcação utilizando-se anticorpos anticitocinas conjugados com PE,

segundo o protocolo de imunofenotipagem descrito no material e métodos. Os resultados

foram expressos como percentual médio de células positivas para as citocinas mais os valores

de desvio padrão. Diferença estatisticamente significativa: a = em relação ao grupo controle, b

= em relação ao grupo DMSO. Método estatístico utilizado – ANOVA seguida de Tukey.

IFN-γ TNF-α

0

3

6

9

12

0

0.1

0.2

0.3

0.4

% N

eu

tró

filo

s+ C

ito

cin

a +

/Ne

utr

ófi

los

+ a, b

A B

A análise das citocinas do tipo 2 revelou que o grupo Lt apresentou um aumento no

percentual de neutrófilos-IL-4+ quando comparado aos grupos CC e DMSO (Lt: 7,18 ± 3,02,

CC 2,26 ± 1,17, 3,60 ± 1,77) (FIG. 9A). Nenhuma diferença foi observada nos valores

percentuais de neutrófilos-IL-10+ entre os grupos avaliados (FIG. 9B).

.

FIGURA 9 - Análise do percentual médio de neutrófilos-IL-4+ (A) e neutrófilos-IL-10+ (B)

de culturas de leucócitos totais dos grupos CC , DMSO e Lt . A população celular

foi identificada através dos parâmetros de tamanho e granulosidade e as citocinas






IL-4

IL-4 IL-10

6.2.2 Análise de citocinas intracitoplasmáticas em monócitos do sangue periférico


Nas FIG. 10 e 11 estão expressos os valores percentuais médios de monócitos

positivos para a expressão das citocinas estudadas. De acordo com os resultados, os grupos

analisados não apresentaram diferenças estatisticamente significativas para os monócitos

positivos, tanto para as citocinas do tipo 1 (TNF- α), quanto para as citocinas do tipo 2 (IL-4 e

IL-10), respectivamente.

0

15

30

45

60

% M

on

ócito

s+ C

ito

cin

a +

/Mo

nó

cito

s+

A

FIGURA 10 - Análise do percentual médio de monócitos-TNF-α+ (A) de culturas de

leucócitos totais dos grupos CC , DMSO e Lt . A população celular foi

identificada através dos parâmetros de tamanho e granulosidade e marcação com anticorpo

anti-CD14 e as citocinas intracitoplasmáticas por marcação utilizando-se anticorpos

anticitocinas conjugados com PE, segundo o protocolo de imunofenotipagem descrito no

material e métodos. Os resultados foram expressos como percentual médio de células

positivas para as citocinas mais os valores de desvio padrão. Diferença estatisticamente

significativa: a = em relação ao grupo controle, b = em relação ao grupo DMSO. Método

estatístico utilizado – ANOVA seguida de Tukey.

TNF-α

0

3

6

9

12

0

3

6

9

12

% M

on

ócito

s+ C

ito

cin

a +

/Mo

nó

cito

s+

A B

FIGURA 11 - Análise do percentual médio de monócitos-IL-4+ (A) e monócitos-IL-10+ (B)


foi identificada através dos parâmetros de tamanho e granulosidade e marcação com anticorpo

anti-CD14 e as citocinas intracitoplasmáticas por marcação utilizando-se anticorpos

anticitocinas conjugados com PE, segundo o protocolo de imunofenotipagem descrito no

material e métodos. Os resultados foram expressos como percentual médio de células

positivas para as citocinas mais os valores de desvio padrão. Diferença estatisticamente

significativa: a = em relação ao grupo controle, b = em relação ao grupo DMSO. Método

estatístico utilizado – ANOVA seguida de Tukey.

IL-4 IL-10

6.2.3 Análise de citocinas intracitoplasmáticas em linfócitos e subpopulações linfocitárias

T CD8+ e T CD4+ do sangue periférico estimulados com látex bruto de E. tirucalli

A FIG. 12 apresenta os valores percentuais de linfócitos positivos para as citocinas do

tipo 1 INF-γ (A), TNF-α (B). A expressão de linfócitos positivos para INF-γ TNF-α quando

estimulados com o látex de E. tirucall foram cerca de 11 e 16 vezes maiores comparados ao

grupo controle CC (INF-γ: Lt: 5,17 ± 2,09, CC: 0,44 ± 0,31, DMSO: 0,33 ± 0,27 e TNF: Lt:

8,60 ± 3,75, CC: 0,51 ±0,31, DMSO: 0,38 ± 0,28), mostrando uma polarização da expressão

de citocinas do tipo 1 na população linfocitária.

0

2

4

6

8

0

4

8

12

16

% L

info

cito

sT

ota

is+ C

ito

cin

a +

/Lin

focito

sTo

tais

+

a, b

a, b

A B

FIGURA 12 - Análise do percentual médio de linfócitos-IFN-γ+ (A) e linfócitos-TNF-α+ (B)


foi identificada através dos parâmetros de tamanho e granulosidade e as citocinas






IFN-γ TNF-α

Os resultados apresentados na FIG. 13 expressam os valores percentuais de linfócitos

positivos para as citocinas IL-4 (A) e IL-10 (B). A análise entre os grupos revelou que o látex

da planta não foi um estímulo para o aumento da expressão de citocinas do tipo 2.

0

0.7

1.4

2.1

2.8

0

1

2

3

4

% L

info

cito

sT

ota

is+ C

ito

cin

a +

/Lin

focito

sTo

tais

+

a

A B

FIGURA 13 - Análise do percentual médio de linfócitos-IL-4+ (A) e linfócitos-IL-10+ (B) de

culturas de leucócitos totais dos grupos CC , DMSO e Lt . A população celular foi

identificada através dos parâmetros de tamanho e granulosidade e as citocinas






IL-4 IL-10

Nas FIG. 14 e 15 observamos que a subpopulação de linfócito T CD8+ quando

estimulados com o látex de E. tirucalli, apresentou um perfil misto na expressão de citocinas,

dado que os valores de linfócitos TCD8+ positivos para as citocinas avaliadas, INF-γ, TNF-α,

IL-4 e IL-10, foi superior aos grupos CC e DMSO, respectivamente. Foram estes os valores

de média e desvio para os respectivos grupos: INF-γ: CC: 0,76 ± 0,77, DMSO: 070 ± 0,64, Lt:

17,57 ± 15,29; TNF-α: CC: 1,24 ± 1,62, DMSO: 0,82 ± 0,67, Lt: 18,86 ± 19,18; IL-4: CC:

1,03 ± 0,96, DMSO: 1,25 ± 0,82, Lt: 4,52 ± 4,93; e IL-10: CC: 1,97 ± 1,92, DMSO: 2,67 ±

2,09, Lt: 7,83 ± 9,88.

0

10

20

30

40

% L

info

cito

sT

CD

8+ C

ito

cin

a+ /L

info

cito

sT

CD

8+ a, b

0

12.5

25

37.5

50

a, b

A B

FIGURA 14 - Análise do percentual médio de linfócitos T CD8-IFN-γ+ (A) e linfócitosT

CD8-TNF-α+ (B) de culturas de leucócitos totais dos grupos CC , DMSO e Lt . A

população celular foi identificada através dos parâmetros de tamanho e granulosidade e

marcação com anti-CD8 e as citocinas intracitoplasmáticas por marcação utilizando-se

anticorpos anticitocinas conjugados com PE, segundo o protocolo de imunofenotipagem

descrito no material e métodos. Os resultados foram expressos como percentual médio de

células positivas para as citocinas mais os valores de desvio padrão. Diferença

estatisticamente significativa: a = em relação ao grupo controle, b = em relação ao grupo

DMSO. Método estatístico utilizado – ANOVA seguida de Tukey.

IFN-γ TNF-α

0

3

6

9

12

% L

info

cito

sT

CD

8+ C

ito

cin

a+ /L

info

cito

sT

CD

8+

0

6

12

18

24

a, ba, b

A B

FIGURA 15 - Análise do percentual médio de linfócitos T CD8-IL-4+ (A) e linfócitosT CD8-

IL-10+ (B) de culturas de leucócitos totais dos grupos CC , DMSO e Lt . A








IL-4 IL-10

A FIG. 16 mostra o resultado dos valores percentuais de linfócitos T CD4-INF-γ+ (A)

e T CD4-TNF-α+ (B). A análise dos dados indicou que quando estimulados com o látex da

planta estudada, o percentual de linfócitos T CD4-INF-γ+ T CD4-TNF-α+ teve um aumento,

sendo este cerca de 8,5 e 11 vezes superior respectivamente (INF-γ: Lt: 3,23 ± 1,33, CC: 0,37

± 0,43, DMSO: 0,29 ± 0,29 e TNF-α: Lt: 13,68 ± 4,77, CC: 1,23 ± 3,19, DMSO: 0,33 ± 0,26).

0

1.5

3

4.5

6

0

4

8

12

16

% L

info

cito

sT

CD

4+ C

ito

cin

a +

/Lin

focito

sT

CD

4+

a, b

a, bA B

FIGURA 16 - Análise do percentual médio de linfócitos T CD4-IFN-γ+ (A) e linfócitosT

CD4-TNF-α+ (B) de culturas de leucócitos totais dos grupos CC , DMSO e Lt . A








IFN-γ TNF-α

Já a FIG. 17 mostra o resultado dos valores percentuais de linfócitos T CD4- IL-4+

(A) e T CD4-IL-10+ (B). Nenhuma diferença significativa foi observada no percentual de

linfócitos T CD4 positivos para as citocinas do tipo 2 avaliadas, demonstrando que, assim

como os linfócitos totais, os linfócitos T CD4+

contribuem para a polarização da resposta

imune para um perfil celular, conhecido também como pró-inflamatório.

0

1.5

3

4.5

6

% L

info

cito

sT

CD

4+ C

ito

cin

a +

/Lin

focito

sT

CD

4+

0

0.7

1.4

2.1

2.8A B

FIGURA 17 - Análise do percentual médio de linfócitos T CD4-IL-4+ (A) e linfócitosT CD4-

IL-10+ (B) de culturas de leucócitos totais dos grupos CC , DMSO e Lt . A








IL-4 IL-10

A figura abaixo (FIG. 18) sintetiza os resultados. Os dados apresentados

demonstraram que o estímulo do látex bruto de E. tirucalli induziu o aumento do percentual

positivo para as citocinas do tipo 1, INF-γ, TNF-α, nas populações de neutrófilos e linfócitos,

bem como nas subpopulações de linfócitos TCD4+ e TCD8+. Já os monócitos neste estudo

não responderam ao estimulo do látex da planta com o aumento da expressão de citocinas em

nenhum dos perfis. O látex de E. tirucalli também foi um estímulo para o aumento do

percentual de neutrófilos IL-4+ e também linfócitos TCD8-IL-4+

e TCD8-IL-10+.

T CD8+

T CD4+

Monócitos

Neutrófilos

Linfócitos

FIGURA 18 - Resumo dos resultados obtidos na expressão de citocinas nas populações e

subpopulações estudadas, quando estimulados com o látex bruto de E. tirucalli diluído a 10%

em DMSO.

7 DISCUSSÃO DOS RESULTADOS

Embora diversas funções biológicas de E. tirucalli tenham sido mencionadas em

diversos trabalhos da literatura científica, é também sabido que o látex bruto da planta possui

propriedades cáusticas que podem promover lesões graves quando em contato direto com

tecidos humanos (SHLAMOVITZ et al., 2009). Diante disso, ao iniciarmos o presente estudo,

fez-se necessário saber qual seria a concentração ótima a ser utilizada nos experimentos com

culturas de leucócitos humanos. Além de determinar a concentração ideal, foi preciso

verificar se o tempo de exposição ao látex poderia interferir na viabilidade dos leucócitos

submetidos a tais culturas celulares. Para tanto, leucócitos do sangue periférico de indivíduos

foram submetidos a culturas celulares na presença de diferentes concentrações do látex, bem

como a diferentes tempos de incubação (Figura 6).

A análise dos dados do teste de viabilidade com o azul de tripam revelou que as

concentrações do látex a 5, 10 e 20% diluído em DMSO, correspondendo a 0,0625%, 0,125%

e 0,25% no volume final das culturas celulares, não foram tóxicas aos leucócitos

mononucleares do sangue periférico (monócitos e linfócitos) nas primeiras 24 horas. Uma vez

que o tempo de incubação com o látex no protocolo de análise do perfil de citocinas

intracitoplasmáticas em leucócitos do sangue periférico foi de 4 horas, as concentrações de

5,10 e 20% em DMSO poderiam ser utilizadas, uma vez que não alteraram de forma

significativa a viabilidade dos leucócitos avaliados. Além da análise quantitativa aqui

apresentada, foi possível também acompanhar, qualitativamente, os parâmetros de tamanho e

granulosidade das células, em gráficos de dispersão (FSC x SSC), no momento da aquisição

de dados pela citometria de fluxo. A escolha da concentração do látex diluído a 10% em

DMSO, neste ensaio correspondendo a 0,25% no volume final da cultura, para a realização

das culturas celulares baseou-se em estudos preliminares realizados no laboratório, onde tal

concentração mostrou-se como a concentração mínima ótima, capaz de levar a ativação e

produção de citocinas intracitoplasmáticas demonstradas no presente estudo.

As plantas da família Euphorbiacea têm sido relatadas como plantas medicinais com

atividade antiviral e antitumoral (AMIRGHOFRAN et al., 2006; KUO et al., 2006; YANG et

al., 2005; LAGE et al., 2009). No entanto, os mecanismos moleculares envolvidos nesses

processos ainda não estão bem elucidados. A análise das citocinas intracitoplasmáticas em

leucócitos do sangue periférico revelou um aumento estatisticamente significativo no

percentual de neutrófilos e linfócitos positivos para as citocinas do tipo1 quando estimulados

pelo látex bruto de E. tirucalli (FIG. 8 e 12). Esse resultado condiz com algumas propriedades

biológicas atribuídas a essa planta. A respeito das atividades antitumoral e antiviral atribuídas

a algumas espécies da família Euphorbiaceae, estudos sugerem que os princípios ativos

envolvidos em tais processos podem atuar diretamente sobre o ciclo de replicação de alguns

vírus e nos mecanismos moleculares envolvidos na manutenção de tumores (YANG et al.,

2005; BETANCUR-GALVIS et al., 2002; TAO et al., 2008). No entanto, há relatos na

literatura que sugerem que tais princípios ativos poderiam também interferir na resposta

imunológica e, dessa forma, favorecer a eliminação viral e tumoral por meio de uma ação

indireta desses princípios sobre o sistema imune (DIAS-BARUFFI et al., 2000;

AMIRGHOFRAN et al., 2008).

De acordo com os dados obtidos em nosso estudo, as populações específicas de

leucócitos humanos do sangue periférico comportam-se de maneira diferenciada quando

submetidas à estimulação com o látex bruto de E. tirucalli. Os linfócitos T apresentaram um

perfil de produção de citocinas predominantemente do tipo 1, demonstrado pelo aumento no

percentual de células positivas para as citocinas IFN-γ e TNF-α (pró-inflamatórias) quando

estimulados com o látex da planta. O aumento de linfócitos T produtores de citocinas do tipo

1 poderia favorecer elementos da resposta imune responsáveis pela cicatrização, fagocitose e

aumento da citotoxicidade mediada por linfócitos T CD8 citotóxicos e células Natural Killer,

importantes nas respostas antiviral e antitumoral, como descrito anteriormente,bem como por

Sasaki e colaboradores (2010). Essa capacidade de estimular a resposta imune do tipo 1,

conhecida como resposta celular, também foi demonstrada por Kinghom e colaboradores

(1979) quandoestudos utilizando ésteres de forbol extraídos de E. tirucalli exacerbaram o

processo inflamatório em orelhas de ratos.

Na análise das subpopulações de linfócitos T, observamos que os linfócitos T CD4+ e

T CD8+ apresentaram o mesmo perfil de produção de citocinas do tipo 1. Os linfócitos T

CD4+, conhecidos como linfócitos T helper, são responsáveis por conduzir a resposta imune

celular (tipo 1) ou humoral (tipo 2). A condução predominante de uma ou outra resposta

depende do perfil de citocinas produzidas pelos linfócitos T CD4 e pela predominância dessas

citocinas no microambiente do foco da lesão (ZINFANG et al., 2010).

A indução de citocinas do tipo 1 com o objetivo de modular a resposta imune

utilizando plantas do gênero Euphorbia foi descrita por Singh (2006). No estudo, o

tratamento com extrato etanólico de Euphorbia hirta em animais com reação alérgica

promoveu um aumento de IFN-γ e atenuação da resposta humoral. O IFN-γ tem a capacidade

de ativar macrófagos, células Natural Killer e linfócitos T CD8 e induzir a apresentação de

antígenos por meio do aumento da expressão do complexo maior de histocompatibilidade do

tipo I - MHC-I. Essa citocina também apresenta a capacidade de induzir a produção de

subclasses de anticorpos tipo IgG2 e IgG3 (LEVY & GARCIA-SASTRE, 2001; SNAPPER &

PAUL, 1987; DUFFIELD et al., 2003), uma característica marcante em infecções virais. A

ativação desses processos torna o IFN-γ imprescindível na resposta antiviral e antitumoral. Os

animais com tumor induzido por linhagens celulares EL4 ou EG7, e Knockout para o rIFN-γ,

ou deficientes na produção de IFN-γ não respondiam ao tratamento quimioterápico ao

contrário dos animais do grupo controle que apresentavam a produção normal de tal citocina e

do seu receptor (GHIRINGHELLI et al., 2009). Esse estudo aponta a importância do IFN-γ

para uma resposta quimioterápica efetiva.

Tendo em vista que as respostas antitumoral e antiviral são dependentes da ativação da

resposta imune celular, é provável que a produção de IFN-γ em linfócitos T helper, induzida

pelo látex de E. tirucalli, possa favorecer a apresentação de antígenos e assim contribuir para

a eliminação de células tumorais, ou infectadas por vírus, por meio da ação antígeno

específica de linfócitos T CD8. Os trabalhos realizados por Valadares (2006) evidenciam uma

ação antitumoral de E. tirucalli. Nesse estudo, o extrato da massa seca de Euphorbia tirucalli,

diluída em salina, foi capaz de prolongar a sobrevida de animais com tumor ascítico, além de

restabelecer a hematopoiese a valores normais e recuperar a esplenomegalia. No entanto, esse

trabalho não avaliou a participação de citocinas ou outro parâmetro imunológico como

mediador dessa resposta.

A ação antitumoral de plantas do gênero Euphorbia foi também demonstrada na

modulação da expressão de proteínas associadas à múltipla resistência a drogas (MDR). Os

MDR diminuem a concentração intracelular de quimioterápicos promovendo a resistência do

tumor e de células infectadas (HOHMANN et al., 2002; LAGE et al., 2009). Dessa forma, a

redução da expressão de MDRs é um forte auxílio à quimioterapia por permitirem a ação

terapêutica efetiva dos fármacos. As citocinas foram descritas como moléculas importantes

nessa regulação negativa de MDRs (STEIN e WALTHER, 1998). As citocinas IL-1 e TNF-α,

por exemplo, reduzem a expressão do gene mdr1 (STEIN et al., 1996). Tendo em vista os

resultados deste trabalho, é possível que os princípios ativos encontrados nas plantas do

gênero Euphorbia modulem a expressão de MDRs através do aumento na produção de TNF-

α.

O linfócito T CD8+ induz apoptose de células alvo por meio da liberação das

proteínas, tais como perforina, granzimas e granulisina contidas em grânulos. Os linfócitos T

CD8+ também são fontes secretoras de citocinas, que podem potencializar a resposta imune

(JAGER et al., 2001). Como observado em nossos resultados, os linfócitos T CD8+

estimulados com látex bruto de E. tirucalli apresentaram um aumento na produção das

citocinas do tipo 1 (FIG. 14) o que favorece suas funções efetoras, principalmente a

citotoxicidade. Outra citocina fundamental na resposta imune celular é o TNF-α. Essa

citocina é capaz de ativar macrófagos, induzindo a produção de óxido nítrico (NO) e induzir a

expressão de moléculas de adesão no endotélio, favorecendo o recrutamento celular

(WAJANT et al., 2009; APOSTOLAKI et al., 2010). O TNF-α também pode ser uma

molécula efetora na apoptose de células tumorais, bem como em células infectadas, por meio

da ligação aos receptores que possuem domínios de morte que sinalizaram os eventos

apoptóticos (SCREATON e XU, 2000).

O aumento percentual de linfócitos TCD4+TNF+ e TCD8+TNF+ reforçam a hipótese

de que os princípios ativos de E. tirucalli conduzem a resposta predominantemente do tipo 1.

Alguns estudos realizados evidenciaram a participação de princípios ativos encontrados em

plantas do gênero Euphorbia sobre diversos processos biológicos mediados por TNF-α. Foi

demonstrado que a fração ativa do extrato de Euphorbia peplus induziu apoptose em células

de melanoma por vias dependentes da ligação do TNF em receptores que se ligam aos

domínios de morte (GILLESPIE et al., 2004). Já a lectina Euphorbin, extraída do latex de

Euphorbia milii, induziu a migração de neutrófilos em ratos (DIAS-BARUFFI et al., 2000).

Embora a produção de citocinas não tenha sido avaliada no referido estudo, muito

provavelmente houve a participação dessas moléculas nesse recrutamento celular.

Tendo em vista que a E. tirucalli possui, dentre outras substâncias, ésteres de forbol

em sua constituição, sendo esses capazes de ativar a proteína quinase C, as possíveis vias para

a produção de citocinas pró-inflamatórias envolveriam os fatores de transcrição NF-kB, Elk e

a junção de Jun e Fos, conhecido como AP1(DUMONT et al., 1998). Além dessas, a via

JAK/STAT também tem uma importância na produção de citocinas do tipo 1. A figura 19

sintetiza as possíveis vias de sinalização para a transcrição das citocinas pró-inflamatórias.

Uma perspectiva futura seria a análise das vias de sinalização e dos fatores de transcrição

envolvidos nesse aumento da expressão de citocinas frente à estimulação com o látex bruto de

E. tirucalli. No entanto, faz-se necessário realizar tal investigação utilizando substâncias

isoladas ou frações ricas em determinados compostos bioativos.

RNAm citocinaspró-inflamatórias

FIGURA 19 - vias envolvidas na transcrição de RNAm para síntese de citocinas pro-

inflamatórias

Os neutrófilos apresentaram um aumento de IL-4, concomitantemente com o aumento

das citocinas IFN-γ e TNF-α (TAB. 2). No fígado tem sido descrita a importância dos

neutrófilos em moderar a resposta inflamatória dos monócitos em condições de infecção

bacteriana sistêmica (HOLUB et al., 2009). A importância da IL-10 em inibir e modular a

ativação de células da inflamação também já foi descrita (FIORENTINO et al., 1991). O

aumento expressivo da IL-4 pelos neutrófilos, assim como o aumento de IL-10 e IL-4 em

linfócitos TCD8+ se encaixa no contexto da moderação da resposta inflamatória estimulada

pelo látex de E. tirucalli, de forma que a resposta seja predominantemente inflamatória,

porém moderada. Tais mecanismos de controle fazem parte da fisiologia da resposta imune e

são necessários para evitar uma resposta inflamatória exacerbada e prejudicial ao organismo.

Os monócitos demonstraram não contribuir para o aumento de citocinas em nenhum dos dois

perfis e portanto, parecem não serem alvos para a ação do látex de E. tirucalli na produção de

citocinas.

É possível que a ação antitumoral e antiviral observada pelos extratos de E. tirucalli

seja mediada pelo sistema imune. Estudos pré-clínicos realizados já demonstraram que, além

de baixa toxicidade em ratos (SILVA et al., 2007), o extrato de E. tirucalli apresentou um

bom índice terapêutico para ação antiviral (BETANCUR-GALVIS et al., 2002), sugerindo-o

como uma perspectiva para futuros ensaios clínicos.

8 CONCLUSÃO

Este estudo permitiu identificar, seletivamente, as populações celulares nas quais o

látex bruto de E. tirucalli diluído em DMSO atuou promovendo o aumento da síntese de

citocinas. O estímulo com látex bruto da planta Euphorbia tirucalli sobre leucócitos do

sangue periférico, submetidos à cultura rápida, in vitro, induziu um perfil de resposta imune

predominantemente do tipo 1 por meio do aumento percentual de linfócitos T positivos para

as citocinas IFN-γ e TNF-α, principalmente em linfócitos T-CD4, Esse padrão de resposta

imune, conhecido como resposta imune celular poderia ter aplicações futuras no campo da

imunoterapia de tumores e infecções por patógenos intracelulares, uma vez que tais citocinas

são importantes mediadores em tais processos.

Estudos adicionais, utilizando-se substâncias isoladas, preferencialmente, são

necessários para elucidar em que nível metabólico os princípios ativos estariam atuando para

proporcionar os resultados aqui apresentados. Além disso, investigações in vivo, utilizando

modelos de desenvolvimento tumoral, associados ao tratamento com a planta, serão essenciais

para avaliar se a produção de citocinas observadas no contexto in vitro, poderia, no contexto

in vivo, provocar alguma alteração em processos carcinogênicos.

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ANEXO

Anexo A – Artigo científico

The crude latex of Euphorbia tirucalli L. (Euphorbiaceae) modulates the

cytokine response of leukocytes, especially CD4+ T lymphocytes.

1 Bethânia A Avelar,

1 Felipe JN Lélis,

2 Renato S Avelar,

1 Mathias Weber,

3 Elaine M. Souza-

Fagundes, 2 Olindo A Martins-Filho,

3 Miriam TP Lopes,

1 Gustavo EA Brito-Melo

*,1

1 Immunology laboratory – Federal University of Jequitinhonha and Mucuri Valleys (UFVJM),

2

Biomarkers laboratory – René Rachou Institute/Oswaldo Cruz Foundation (CPqRR/FIOCRUZ), 3

Biological Sciences Institute – Federal University of Minas Gerais (UFMG)

RESUMO: “O latex bruto de Euphorbia tirucalli L (Euphorbiaceae) modula a produção de

citocinas por leucócitos, principalmente em linfócitos T CD4+”.

O uso de plantas da família Euphorbiaceae, principalmente do gênero Euphorbia, tem sido

popularmente difundido para o tratamento de uma variedade de doenças de natureza infecciosa,

tumoral e inflamatória. Entre as espécies desse gênero, a Euphorbia tirucalli é uma planta de uso

difundido em algumas regiões brasileiras, tal como o Vale do Jequitinhonha. Há indícios de que o

látex de E. tirucalli tenha atividade antitumoral e antiviral, porém, pouco se sabe sobre os

mecanismos envolvidos nessa ação. É provável que o mecanismo de ação para tais atividades

envolva a ativação de leucócitos e a produção de citocinas para o direcionamento de uma resposta

antiviral e antitumoral efetivas. Diante disso, o presente trabalho avaliou a produção das citocinas

TNF-α, IFN-γ, IL-4 e IL-10 nas populações e subpopulações leucócitárias do sangue periférico

estimulado com o látex bruto da referida planta. Para tal, leucócitos do sangue periférico de vinte

indivíduos saudáveis foram incubados por 4 horas com o látex bruto de E. tirucalli diluído em

dimetilsulfoxido (DMSO). Culturas celulares incubadas com salina e DMSO constituíram as

culturas controle e controle de solvente, respectivamente. Após o período de incubação, as células

foram marcadas com anticorpos monoclonais específicos para receptores de superfície celular CD4,

CD8 e CD14, conjugados com FITC, bem como para as citocinas TNF-α, IFN-γ, IL-4 e IL-10,

conjugados com PE. A aquisição e análise dos dados foram realizadas por citometria de fluxo. Os

resultados demonstraram um aumento significativo (p<0,05) no T CD4+ positivos para as citocinas

TNF-α e IFN-γ. Já os neutrófilos e linfócitos T CD8+ apresentaram um perfil misto de produção de

citocinas, caracterizado por aumento na frequência de células positivas para IFN-γ, TNF-α e IL-10.

Os resultados evidenciam uma resposta predominante do tipo 1. Diante dos achados é possível

sugerir que a ação atribuída a Euphorbia pelo uso popular possa estar relacionado a seu efeito sobre

a produção preferencial das citocinas TNF-α e IFN-γ. Contudo é preciso investigar se o efeito in

vitro de E. tirucali sobre a produção de citocinas está relacionado com sua potencial ação in vivo.

Unitermos: Euphorbia tirucalli, planta medicinal, citocinas tipo 1.

ABSTRACT: The plants of the Euphorbiaceae family, especially those of the genus Euphorbia, are

frequently used by Brazilian folk communities to treat a wide variety of infectious, tumoral and

inflammatory illnesses. Among the species of this genus, Euphorbia tirucalli is widely used in

some Brazilian regions, such as the Jequitinhonha River Valley. There is evidence that the latex

produced by E. tirucalli has antiviral and antitumor activities, but little is known about the

mechanisms involved in these actions. It is likely that the mechanism for such activities involves

leukocyte activation and cytokine production. Here we aimed to evaluate the production of type 1

(TNF-α and IFN-γ) and type 2 (IL-4 and IL-10) cytokines by circulating leukocyte subsets

submitted to brief stimulation with the crude latex of E. tirucalli. Peripheral blood leukocytes of 20

healthy subjects were submitted to three conditions: i) four-hour incubation with crude E. tirucalli

latex diluted in dimethylsulfoxide (DMSO) (EUP group), ii) four-hour incubation in the presence of

DMSO alone as the solvent control group (DMSO group) and iii) and four-hour incubation in the

presence of saline as the saline control group (CC group). After the incubation period, the cells were

stained with FITC-conjugated monoclonal antibodies specific to the cell surface receptors CD4,

CD8 and CD14 and PE-conjugated monoclonal antibodies specific to the cytokines TNF-α, IFN-γ,

IL-4 and IL-10. The acquisition and analysis of data were performed by flow cytometry. The results

showed a significant increase (p<0.05) in the percentage of CD4+ T lymphocytes positive for the

type 1 cytokines TNF-α and IFN-γ. Neutrophils and CD8+ T lymphocytes showed a mixed profile

of cytokine production, characterized by an increase in the percentage of cells positive for IFN-γ,

TNF-α and IL-10. The data indicate a predominant type 1 cytokine response. The findings

presented suggest that the effect popularly attributed to Euphorbia usage may be attributed to its

effect on the production of TNF-α and IFN-γ. However, the relationship between the in vitro and in

vivo effects of Euphorbia needs to be investigated.

Keywords: Euphorbia tirucalli, medicinal plant, type 1 cytokines.

*E-mail: [email protected]; Tel. +55 38 3532 1235 Fax: +55 38 3532 6000

mailto:[email protected]

INTRODUCTION

Plants from the Euphorbiaceae family, mainly from the Euphorbia genus, have been

used by some Brazilian folk communities for the treatment of injuries, infectious

illnesses, tumors and inflammatory diseases (Zhang et al., 2008; Yang et al., 2005;

Uzair et al., 2009; Amirghofran et al., 2006; Fernandez-Arche et al., 2010). Regarding

the high concentrations of terpenoid compounds in specific plants within this family, it

is probable that some species have medicinal properties that can be exploited for

therapeutic purposes (Pusztai et al., 2007; Lage et al., 2009).

Euphorbia tirucalli is commonly used in popular medicine in the Jequitinhonha River

Valley, one of the poorest regions of Minas Gerais, for therapeutic purposes to treat

illness and tumors (Valadares et al., 2006; Betancur-Galvis et al., 2002; Lage et al.,

2009). The in vivo antitumor effect of E. tirucalli has been demonstrated (Valadares et

al., 2006), although the mechanisms responsible for such an effect have not been

investigated.

Cytokines are important mediators in the development of efficient and adequate

immunological responses against pathogens and pathological processes. Studies have

shown that plants from the Euphorbia genus can alter the molecular and cellular

parameters of the immune system (Amirghofran et al., 2008; Singh et al., 2006),

suggesting that the therapeutic actions attributed to E. tirucalli could be the

consequence of immune response changes evoked by the plant and not its direct action

on the elements that promote the disease. In the present study, we investigated the in

vitro effect of the crude latex of E. tirucalli on the production of the type 1 cytokines

IFN-γ and TNF-α and the type 2 cytokines IL-4 and IL-10 by human leukocyte

populations.

MATERIALS AND METHODS

Plant material

Euphorbia tirucalli L. (Euphorbiaceae) latex was collected from a specimen on the

campus of the Federal University of Jequitinhonha and Mucuri Valleys (UFVJM),

located at MGT-367 road, Km-583, N° 5000, Diamantina, Minas Gerais state, Brazil,

(18°12.152’S, 43°34.667’W, 1.345 m alt) in January. The plant was identified by

Fabiane Nepomuceno Costa. The collected samples were deposited in the UFVJM

herbarium under the registration number 1897. E. tirucalli latex was collected in the

morning by incision at the base of a branch. The latex was diluted immediately in

dimethylsulfoxide (DMSO) at 10% v/v. The quality of the solution was determined by

homogeneity and the absence of precipitates.

Specific monoclonal antibodies used in flow cytometry analysis

The specific monoclonal antibodies (MoAbs) used were purchased from Pharmingen

(San Diego, CA, USA), including anti-human IgG1-fluorescein isothiocyanate (FITC)

clone 679·1Mc7, anti-human IgG2a-phycoerythrin (PE) clone U7·27, anti-human CD4-

FITC clone 13B8·2, anti-human CD8-FITC clone B9·11, and anti-human CD14-FITC

(clone M0P9). The PE-labeled (PE) anti-human cytokine MoAbs included anti-TNF-α

(clone MOAB11), anti-IFN-γ (clone B27), anti-IL-4 (clone MP4–25D2) and anti-IL-10

(clone JES3–9D7).

Biological samples and short-term whole-blood culture

Leukocytes were obtained from the blood of 20 volunteers capable of blood donation

with negative serology for relevant blood-borne pathogens, including HIV, hepatitis C

virus, hepatitis B virus, syphilis and Chagas disease. Volunteers using corticosteroids or

other immunosuppressive drugs were not considered for blood donation. Informed

written consent was obtained from all participants. The study was approved by the

Ethical Committee at the UFVJM, Diamantina, Minas Gerais, Brazil (protocol 02/009).

Blood samples were collected in vacuum tubes containing sodium heparin (Vacutainer;

Becton Dickinson, San Jose, CA, USA), and 500-µl aliquots were dispensed into

individual 17 x 100mm polypropylene tubes (Falcon 2059, Becton Dickinson, San Jose,

CA, USA). Samples were incubated for 4 h at 37°C in a 5% CO2 humidified atmosphere

in the presence of 500 µl of RPMI-1640 (Gibco, Grand Island, NY, USA) and Brefeldin

A (BFA) (Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA) at a final concentration of 10

µg/ml. The stimulation with crude E. tirucalli latex was performed by the addition of 25

µl of 10% crude E. tirucalli latex diluted in DMSO (EUP group) to the cultures. A

solvent control, i.e., cells treated on with DMSO (25 µL), was performed in parallel

(DMSO group). After solvent or latex treatment, the cultures were treated with 2 mM

ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) (Sigma Chemical Co. and incubated at room

temperature for 15 min.

Flow cytometric immunostaining for surface markers and intracellular cytokines

Samples were washed with 6 mL of phosphate-buffered saline (PBS) (0.015 M)

containing 0.5% bovine serum albumin (BSA) and 0.1% sodium azide (Sigma). Cells

were centrifuged (600 g, room temperature, 7 min) and then resuspended in

PBS/BSA/sodium azide. Aliquots (200 L) were distributed into two 12 x 75-mm

polystyrene tubes (Falcon 2052), and cells were individually stained with MoAbs

directed against CD4, CD8 and CD14 for 30 min at room temperature in the dark.

Stained samples were treated with 2 mL of FACS lysing solution (Becton Dickinson,

San Jose, CA) by gentle vortexing. After re-incubation for an additional 10 min, the

samples were centrifuged (600 g, room temperature, 7 min), and the supernatant was

discarded. The pellet was dissolved in 2 ml FACS permeabilizing solution, which

contains PBS/BSA/sodium azide and 0.5% saponin (Sigma), and was incubated in the

dark for 10 min at room temperature. After incubation, the samples were washed twice

in PBS/BSA/sodium azide. Then 20 L of PE-labeled anti-cytokine MoAb was added to

cells (20 L) in a 96-well U-bottom microplate (Thomas 9383-A90) for 30 min at room

temperature. Cells were subsequently washed with 150 L of FACS permeabilizing

solution followed by 200 l of FACS buffer. Samples were then fixed in 200 mL of

FACS fixing solution containing 10 g/l paraformaldehyde, 10.2 g/l sodium cacodylate

and 6.63 g/l sodium chloride (Sigma) at pH 7.2. The samples were stored at 4°C in the

dark and analyzed by flow cytometry within 24 h.

Flow cytometry

A total of 30,000 events were acquired using a FACScan flow cytometer (Becton

Dickinson) correctly set up to measure forward (FSC) and side (SSC) light scattering

and FITC (FL-1) and PE (FL-2) fluorescence. CellQuestTM

software was used for data

acquisition and analysis. Identification of the lymphocyte subsets was performed by the

dual-color immunophenotyping method using specific FITC-labeled anti-surface

MoAbs and PE-labeled anti-cytokine MoAbs (BRITO-MELO et al., 2006).

Initially, a lymphocyte scatter gate was set up, using FSC versus SSC dot plots,

followed by the identification of cytokine-positive cells using FL-1/FITC-anti-cell

marker versus FL-2/PE-anti-cytokine dot plots. All results were expressed as the

percentage of cytokine-positive cells for the different gated leukocyte subpopulations

analyzed in this study, selected as described above. The numbers of subjects displayed

in the figures may differ due to methodological restrictions, including insufficient

numbers of cells and autofluorescence interference in the flow cytometry data.

Statistical analysis

Statistical analysis was performed using analysis of variance (ANOVA) followed by

Tukey’s multiple comparison test using the GraphPad Prism 5 (GraphPad Software Inc.,

San Diego, CA, USA). Difference were considered statistically significant when

P<0.05.

RESULTS AND DISCUSSION

Plants from the Euphorbiaceae family have been reportedly used as medicinal plants

because of their antiviral and antitumor proprieties (Kuo et al., 2006; Yan et al., 2008;

Amirghofran, 2006; Yang et al., 2005; Lage et al., 2009). However, the biological

pathways involved in these processes have not been identified.

In this study, we demonstrated that the expression profiles of human peripheral blood

leukocytes changed after they were stimulated with crude E. tirucalli latex. As

demonstrated in Table 1, lymphocytes predominantly expressed type 1 cytokines, and

the IFN-γ and TNF-α expression levels in this cell population were 11 and 8 times

higher than those of the control group, respectively. Studies have shown that phorbol

esters obtained from E. tirucalli have an inflammatory effect in rat ears (Kinghorn,

1979). The CD4+ and CD8+ T lymphocyte subsets similarly presented increased

expression of TNF-α and IFN-γ (FIGURES 1 and 2). CD4+ T lymphocytes are key cells

involved in antiviral and antitumor immune responses. This cell population secretes

cytokines that improve the recognition and cell-mediated elimination of virus-infected

cells and tumor cells (Sasaki et al., 2010).

The increase of type 1 cytokines mediated by plants of the Euphorbia genus was

recently described. Singh et al. (2006) demonstrated that treatment with an ethanolic

extract of E. hirta in allergic rats promoted an increase in the level of IFN-γ and

decreased the severity of the allergic reactions. IFN-γ is an important type 1 cytokine

because of its roles in macrophage and killer cell activation, in antigen presentation and

cytotoxicity mediated by CD8+ T cells. Additionally, IFN-γ induces IgG1 and IgG3

production by B cells. Together, these immunological elements are able to efficiently

eliminate and destroy infected and tumor cells (Levy & Garcia-Sastre, 2001; Duffield,

2003; Snapper & Paul, 1987).

Euphorbia tirucalli extract diluted in saline was able to increase the survival of animals

with ascitic tumors. Additionally, the hematopoiesis and spleen size of these animals

returned to normal after treatment with the plant extract. However, the study conducted

neither a cytokine analysis nor a detailed evaluation of the molecular mechanisms

involved in the process (Valadares et al., 2006). In another study, the author suggested

that treatment with plants from the Euphorbia genus changes the expression of multi-

drug resistance (MDR) factors. These factors down-regulate the intracellular

concentrations of drugs used in chemotherapy to improve tumoral resistance (Hohmann

et al., 2002; Lage et al., 2009). It seems that some antitumor mechanisms are cytokine

dependent, primarily on IFN-γ (Stein et al., 1998). Ghiringhelli (2009) demonstrated

that animals injected with EL4 or EG7 tumor cells and deficient in IFN-γ production

could not be effectively treated with chemotherapy, whereas the wild-type control group

responded to treatment.

The increased percentages of CD4+TNF+ and CD8+TNF+ T cells support our

hypothesis that bioactive compounds from E. tirucalli improve the type 1 immune

response (FIGURES 1 AND 2). TNF-α is a cytokine that activates improved

phagocytosis mediated by macrophages and that increases the expression of adhesion

molecules on endothelial cells (Wajant, 2009; Apostolaki et al., 2010). Moreover, TNF-

α may also be an effector molecule for the apoptosis of tumor or infected cells by

binding to death domains that signal apoptotic events (Screaton & Xu, 2000).

Previous studies have demonstrated that plants from the Euphorbia genus have

biological activities that could be mediated by TNF-α. A lectin extracted from

Euphorbia milii latex induced leukocyte migration (Dias-Baruffi et al., 2000), and an

active fraction of a Euphorbia peplus extract induced apoptosis in melanoma cells via

TNF family receptor-dependent pathways (Gillespie et al., 2004).

Neutrophils presented an increase in IL-4, IFN-γ and TNF-α expression (TABLE 1).

The increase of IL-4 expression by neutrophils, along with the increase of type 2

cytokine expression by CD8+ T lymphocytes, could modulate inflammatory responses.

Type 2 cytokines inhibit the activation of inflammatory cells (Fiorentino et al., 1999).

Monocytes did not contribute to the increase in cytokine production in either of the two

profiles (TABLE 1).

Crude E. tirucalli latex extract is potentially useful in antitumor and antiviral

treatments. Pre-clinical studies indicate that the plant has low toxicity in mice (Silva et

al., 2007) and a good therapeutic index for antiviral activity (Betancur-Galvis et al.,

2002). Our data suggest that the antitumor protection provided by E. tirucalli extract

observed by Valadares et al., (2006) may be mediated by type 1 cytokine (TNF-α and

INF-γ) expression in neutrophils and lymphocytes, mainly CD4+ T lymphocytes.

ACKNOWLEDGMENTS

The authors thank Prof. Dr. Etel Vieira for contributing to the writing of this

manuscript.

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FIGURE

FIGURE 1. Percentages of CD4+ T lymphocytes positive for TNF-α, INF-γ, IL-4 and

IL-10. CC – control group, DMSO – solvent control group, EUP – E. tirucalli latex-

stimulated group.

p < 0,05 p < 0,05

FIGURE 2. Percentages of CD8+ T lymphocytes positive for TNF-α, INF-γ, IL-4 and

IL-10. CC – control group, DMSO – solvent control group, EUP – E. tirucalli latex-

stimulated group.

Table 1: Percentages of neutrophils and monocytes and lymphocytes positive for TNF-

α, INF-γ, IL-4 and IL-10. CC DMSO EUP

Neutrophils TNF- + 0.05 ± 0.02 0.05 ± 0.03 0.24 ± 0.28a,b

IFN- + 0.16 ± 0.05 0.15 ± 0.08 0.50 ± 0.29a,b

IL-4+ 2.26 ± 1.18 3.60 ± 1.77 7.18 ± 3.02a,b

IL-10+ 0.17 ± 0.16 0.11 ± 0.12 0.17 ± 0.11

Monocytes TNF- + 28.75 ± 20.20 24.29 ± 18,42 16.56 ± 14.60

IL-4 + 4.27 ± 2.40 4.26 ± 2.42 6.38 ± 3.22

IL-10+ 4.16 ± 2.83 4.25 ± 3.55 5.18 ± 3.48

Lymphocytes TNF- + 1.05 ± 2.39 0.38± 0.28 8.59± 3.75a,b

IFN- + 0.45± 0.31 0.33±0.27 5.16± 2.08a,b

IL-4+ 0.56± 0.27 1.19± 0.91a 1.05± 0.73

IL-10+ 1.72± 1.79 1.80± 1.53 1.17± 0.61

Data are presented as the mean ± SD for n= 20. CC – control group, DMSO – solvent

control group, EUP – E. tirucalli latex-stimulated group.

Statistically significant differences are denoted by “a” for comparison with the CC

group and by “b” for comparison with the DMSO group.

p < 0,05 p < 0,05

universidade federal dos vales do jequitinhonha...

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